CN1110681A - 一种新型的蛋白质及多肽巯基聚乙二醇(peg)化试剂 - Google Patents

一种新型的蛋白质及多肽巯基聚乙二醇(peg)化试剂 Download PDF

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刘新垣
唐微
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Abstract

本发明为一种新型的蛋白质及多肽巯基PEG 化试剂,N-马来酰亚胺氨基正己酸-mPEG酯,用于 改造蛋白质及多肽的溶解性,稳定性和免疫原性等。 随着生物医学及基因工程技术的发展,大量的药用 PEG化蛋白、多肽等的制备和生产,本发明提供的 PEG代试剂,方法简便,成本低,具有广阔的应用前 景。

Description

近年来,聚乙二醇(PEG)被广泛用于对天然蛋白或重组蛋白的化学修饰,以期改造蛋白的溶解性,稳定性和免疫原性等。双功能试剂N-马来酰亚胺基正己基酸邻硝基对磺酸基苯酯(Mal-sac-NHSA)常用来连接蛋白或多肽与PEG-NH2[Aldwin lois,Danute E.Nitecki:Analytical Biochem.1987 164,494.Robert J.Goodson,NandiniV.Katre:Bio/Technology 1990,8,343]。
使用符号说明:
PEG
Figure 941121291_IMG3
聚乙二醇,长链高分子聚合物。
mPEG-OH    PEG一端已甲基化,另一端是羟基。
mPEG-NH2PEG一端已甲基化,另一端是氨基。
本发明中称PEG化,是指mPEG化。
DCC    二环己基碳二亚胺。
DMAP    二甲氨基吡啶。
现有技术是这样的:
Figure 941121291_IMG4
Figure 941121291_IMG5
上述试剂制备以及由PEG合成PEG-NH2等步骤繁杂,条件苛刻[Manfred Mutter:Tetrahedron Letters 1987,31,2839。A.F.Buchmann,et al:Makromolekular Chemie,1981,182(4-6),1379。Michele Leonard et al:Makromolekular.Chemie 1988,189,1809。Norbert Dereu:Synthetic Communitions 1991,21(1),85。Ruth King:J.Chem.Soe,1921,119,2105]。
本发明设计的一条路线,可方便地合成另一种新的蛋白巯基PEG化试剂,步骤如下:
Figure 941121291_IMG6
本发明的特点是合成的N-马来酰至胺基正己酸直接与mPEG-OH缩合反应,从而避开了HNSA及mPEG-NH2的合成,使步骤大为简化,反应条件温和,且产率高,产物纯化方便,大大降低了生产成本。将本发明合成的PEG化试剂用于牛血清白蛋白(BSA)及基因重组γ-干扰素(rIFN-γ)的反应的结果表明,该试剂的活性高,选择性强,可广泛用于蛋白、多肽的巯基PEG化修饰,尤其是用于定点修饰。随着生物医学及基因工程技术的发展和深入,大量的药用PEG化蛋白、多肽的制备和生产,本发明的巯基PEG化试剂具有很好的应用价值。
本发明的具体步骤在下述实施例中详细描述:
附图说明:
图1.Mal-Sac-PEG紫外吸收。
图2.PEG-BSA的SDS-PAGE电泳图。
M.标准分子量蛋白
1.BSA对照样品
2.3.低修饰PEG-BSA混合样品。
4.高修饰PEG-BSA混合样品。
图3.PEG-IFN-γ的SDS-PAGE电泳图。
M.标准分子量蛋白
1.97CyS-IFN-γ包涵体。
2.修饰PEG-97CyS-IFN-γ样品。
3.131CyS-IFN-γ包涵体。
4.修饰PEG-131CyS-IFN-γ样品。
5.修饰PEG-97CyS-IFN-γ样品[含二巯基苏糖醇(DTT)30毫克分子]。
实施例1.N-马来酰亚胺基正己酸的制备
马来酸酐10克(0.1克分子)和氨基正己酸13.1克(0.1克分子)在100ml醋酸中,室温下回流4小时,补加200ml醋酸,用水分离器分去水份,继续回流过夜。然后真空抽去醋酸,油状物用15ml氯仿溶解,过滤,浓缩,上硅胶柱层分离(以氯仿∶醋酸=95∶5液平衡),得N-马来酰亚胺氨基正己酸10克。
实施例2.N-马来酰亚胺氨基正己酸-mPEG酯的制备
取1克马来酰亚胺氨基正己酸和5克mPEG-OH(分子量5000)0.001克分子缩合;以二氯甲烷作溶剂,在二甲氨基吡啶(DMAP)与DCCI存在下,温度-20-10℃,反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀,乙醇重结晶,再经Sephadex  G-25柱进一步纯化,可得纯品冻干粉5克,置-20℃保存。
实施例3.N-马来酰亚胺氨基正己酸-mPEG酯的鉴定
产物鉴定:
产品经紫外光谱(图1)扫描分析,符合结构式。根据其数据定量计算,PEG活性产率可达90%以上,产物溶于水及二氯甲烷,-20℃保存2个月,活性稳定。
实施例4.N-马来酰亚胺氨基正己酸-mPEG酯的应用
牛血清白蛋白(BSA)经DTT处理后,与新合成的试剂在pH6.0,室温下反应。产物的SDS-PAGE电泳图谱(图2)表明,有一条或多条修饰带。
另外,通过基因突变方法,在r-IFN中引入一个半胱氨酸,用上述方法修饰,可得50%-80%率的修饰产物IPEG-IFN-γ(数据见图3)。

Claims (3)

1、一种新型的蛋白质及多肽巯基的聚乙二醇(PEG)化试剂,其特征在于:
a.由N-马来酰亚胺基正己酸与聚乙二醇(mPEG-OH)的羟基直接缩合成N-马来酰亚胺基正己酸-mPEG酯,结构式:
Figure 941121291_IMG2
b.缩合反应的温度为-20-10℃;
c.二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂;DCC为缩合剂。
2、根据权利要求1a所述合成的N-马来酰亚胺基正己酸-mPEG酯,其特征在于它能直接使用于蛋白质、多肽、氨基酸巯基的PEG化,并包括用于含巯基的其它化合物的PEG化。
3、根据权利要求1a所述的使用的聚乙二醇(mPEG-OH),它的分子量为2000-20000。
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