CN101045164A - 双链结构的聚乙二醇活性衍生物及与其他分子的结合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法以及与其他分子的结合物，所述其他分子特别是指具有药用价值的蛋白质和多肽等大分子。

Description

双链结构的聚乙二醇活性衍生物及与其他分子的结合物

技术领域

本发明涉及具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法以及与药物分子的结合物，所述药物分子特别是蛋白质和多肽等大分子，本发明还涉及包含所述结合物的药物组合物。

背景技术

众多具有生物活性的药物分子，尤其是蛋白质和肽类等生物大分子，已在治疗中广泛应用，并获得成功。但这些生物大分子在临床应用中也有许多不利之处，例如易产生免疫排斥反应、稳定性及可溶性较差、清除速率较快。因此，人们采用了各种方法消除上述不利因素，其中聚乙二醇化技术是近年来发展起来的一种非常有效的改善生物大分子药代动力学性质的方法。

聚乙二醇化技术(PEGylation PEG化)又称为化学修饰，是目前分子变构化学(molecule altering structure chemistry，MASC)中最重要的技术之一。PEG化技术的研究始于20世纪80年代，Abuchowski等第一次将聚乙二醇共价结合到蛋白质上，以保护蛋白质免遭破坏，结果发现聚乙二醇修饰不仅可以增加蛋白质的水溶性，还能减少肾脏的清除，改变了蛋白质的药代动力学和药效学性质。经过近几十年的发展，PEG化技术不仅在蛋白质类药物的开发中得到普遍的应用，而且已扩展到新型药物载体、控释制剂等各个领域。

在聚乙二醇化技术中，需要对聚乙二醇的端基进行活化，引入适当的活性基团，此活性基团对要结合的药物分子中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的化学键。

许多制备聚乙二醇活性衍生物的方法已被报道，Davis等人在美国专利4,179,337种公开了将聚乙二醇结合到蛋白质上，从而得到一种免疫原性较低，且能保持大部分生理活性的结合物。Nakagawa等人公开了将PEG结合到小岛活化蛋白质上以减少其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.AndBiotech，11：141-152(1985)上公开了用氯甲酸苯酯类活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人在美国专利4,766,106和4,917,888上也公开了通过聚合物结合使蛋白质增溶，将聚乙二醇同重组蛋白质结合以减弱蛋白质的免疫原性和提高他们的半衰期。

目前，聚乙二醇衍生物广泛的用于与蛋白质、多肽以及其他治疗药物的结合以延长所述药物的半衰期，降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将PEG结合到药物分子上的技术也在许多批准药品中被广泛的使用。如PEG-intron，一种干扰素和聚乙二醇的结合物就表现出了更长的半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的结合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。上述形成PEG-蛋白质结合物的方法以及由所述方法得到的结合物存在几个问题，其一是形成这些结合物的方法会使蛋白质失活。另外，在形成这些PEG-蛋白质结合物时所用的某些连接基团易在体内水解，断裂，当给药以后发生这样的断裂时，这些结合物便失去了由PEG带来的有利性能。

中国专利01144310.3中公开了一种双链聚乙二醇的结构及与蛋白质的结合物，其双链聚乙二醇能与蛋白质形成稳定的共价键连接。但是这种化合物结构的活性基团非常活泼，会在水溶液中迅速水解，只有少部分能和蛋白质结合，所以制备蛋白质结合物时要求很高的蛋白浓度。本发明提供的双链聚乙二醇在活性基团和双链核心分子间加入了连接基团，使得其结构更加稳定，在水溶液中水解速度较慢，和蛋白质反应产率更高。

发明内容

本发明提供一种新型的，具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物，具有以下结构通式：

其中R1，R2为PEG本身的羟基或一个官能团，选自由C1~C12烷氧基、环烷氧基和芳烷基组成的基团。Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基。m＝0~6；X为连接基团，选自由烷基、酰胺基、羰基、酯基、醚基或硫醚基组成的基团；n为大于等于1的正整数；当n＝1时，m的值须大于1。F为活性功能基团，选自由琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基或丙醛基组成的基团，可以与药物或基体上的氨基或巯基形成共价键连接。

根据本发明，这种活性衍生物优选分子具有以下结构，但不仅限于以下结构：

本发明还提供了制备上述活性衍生物的方法，包括以下步骤：

(1)将N，N-双聚乙二醇乙酰胺和4-氯丁酸溶解于二氯甲烷中室温下回流，将混合物减压浓缩后加入冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丁酸。取N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丁酸和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丁酸琥珀酰亚胺酯，置-20℃保存。(结构I)

(2)将N，N-双聚乙二醇乙酰胺和1-甲基4-氯丁酸溶解于二氯甲烷中室温下回流，将混合物减压浓缩后加入冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基甲基丁酸。取N，N-双聚乙二醇乙酰胺基甲基丁酸和N-羟基马来酰亚胺溶解于二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基甲基丁酸马来酰亚胺酯，置-20℃保存。(结构II)

(3)取N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸，氨基正己酸和二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，所得滤液减压浓缩后加入冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸。取N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸和N-羟基马来酰亚胺溶解于二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸马来酰亚胺酯，置-20℃保存。(结构III)

(4)将N，N-双聚乙二醇乙酰胺和3-氯二乙基丙缩醛溶解于二氯甲烷中，加入适量吡啶，室温下回流6小时后加入醋酸，继续回流过夜，然后真空抽去醋酸及二氯甲烷，所得物质用氯仿溶解，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经SephadexG-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丙醛，置-20℃保存。(结构IV)

根据本发明的另一个方面，提供上述活性衍生物通过F基团与其他分子形成的结合物以及包含这种结合物的药物组合物。上述聚乙二醇活性衍生物可以在温和的生理条件下(反应pH值在4~9之间，反应温度0~20℃)与具有自由氨基或巯基的分子结合，形成复合物。这种复合物具有以下结构通式：

以上所述其他分子可以是蛋白质或多肽，优选但不限于：干扰素、红细胞生成素、胰岛素、尿酸氧化酶、G-CSF、白介素、抗体、胸腺五肽(TP-5)、胸腺肽α1、肌肽、亮丙瑞林、戈那瑞林、阿拉瑞林、舍莫瑞林、奥曲肽、生长抑素、血管紧张素、阿基瑞林等。

除了蛋白质或多肽以外，其他分子还可以是具有自由氨基或巯基的氨基酸、糖类、有机酸、生物碱、黄酮类、甙类、醌类、萜类等药物分子中具有自由氨基或巯基的分子。

实施例

实施例1：N，N-双聚乙二醇乙酰胺基-丁酸琥珀酰亚胺酯1000的制备

将2g N，N-双聚乙二醇乙酰胺1000(0.002mol)和0.53g 4-氯丁酸(0.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，室温下回流2小时，将混合物减压浓缩至20ml，加入200ml冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丁酸1000 1.75g。

取上述所得产物及0.58g N-羟基琥珀酰亚胺(0.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丁酸琥珀酰亚胺酯1000冻干粉1.7g，置-20℃保存。测定产品的红外光谱，有如下特征峰：1812，1789(C＝O，琥珀酰亚胺)；1742(C＝O，酯羰基)；1642，1675(C＝O，酰胺羰基)；1114(CH₂OCH₂)

实施例2：N，N-双聚乙二醇乙酰胺基-丁酸马来酰亚胺酯20000的制备

将2g N，N-双聚乙二醇乙酰胺1000(0.002mol)和0.53g 1-甲基-4-氯丁酸(0.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，室温下回流2小时，将混合物减压浓缩至20ml，加入200ml冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基甲基丁酸1000 1.75g。将上述产物和0.57g N-羟基马来酰亚胺(0.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基甲基丁酸马来酰亚胺酯20000冻干粉16.5g，置-20℃保存。测定产品的红外光谱，有如下特征峰：1834，1823(C＝O，马来酰亚胺)；1740(C＝O，酯羰基基)；1644，1673(C＝O，酰胺羰基)；1104(CH₂OCH₂)

实施例3：N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸琥珀酰亚胺酯60000的制备

取60g N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸40000(0.001mol)，0.65g氨基正己酸(O.005mol)和1.03g二环己基碳二亚胺(DCC，O.005mol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，所得滤液减压浓缩至20ml，加入200ml冷却乙醚，将所得沉淀物过滤后减压干燥，得产物N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸40000 52.5g。

取上述所得产物及O.58g N-羟基琥珀酰亚胺(O.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，温度-20～10℃，反应4小时或过夜。混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基乙酸-6-氨基己酸琥珀酰亚胺酯60000冻干粉48.5g，置-20℃保存。测定产品的红外光谱，有如下特征峰：1816，1788(C＝O，琥珀酰亚胺)；1739(C＝O，酯羰基基)；1644，1652，1675(C＝O，酰胺羰基)；1109(CH₂OCH₂)

实施例4：N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丙醛60000的制备

将40g N，N-双聚乙二醇乙酰胺60000(O.001mol)和0.83g 3-氯二乙基丙缩醛(O.005mol)溶解于50ml二氯甲烷中，加入适量吡啶，室温下回流6小时后加入醋酸25ml，继续回流过夜，然后真空抽去醋酸及二氯甲烷，所得物质用20ml氯仿溶解，混合物经200ml乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品N，N-双聚乙二醇乙酰胺基丙醛60000冻干粉34.5g，置-20℃保存。测定产品的红外光谱，有如下特征峰：1724(C＝O，醛基)；1648，1657(C＝O，酰胺羰基)；1116(CH₂OCH₂)

实施例5：双链聚乙二醇-干扰素的制备

取10mg/ml的干扰素硼酸缓冲液，pH＝9.0，加入N，N-双聚乙二醇乙酰胺基-丁酸琥珀酰亚胺酯2000干粉200mg，4℃条件下反应8小时，经阴离子交换柱纯化，可得PEG-IFN样品。

Claims (9)

1、具有下列结构通式的聚乙二醇活性衍生物

其中R1，R2为PEG本身的羟基或一个官能团，选自由C₁～C₁₂烷氧基、环烷氧基和芳烷基组成的基团；

Ri为H、C_1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基，m＝0～6；

X为连接基团，选自由烷基、酰胺基、羰基、酯基、醚基或硫醚基组成的基团；

n为大于等于1的正整数；当n＝1时，m的值须大于1；

F为活性功能基团，选自由琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基或丙醛基组成的基团，可以与药物或基体上的氨基或巯基形成共价键连接。

2、如权利要求1所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇的分子量为1,000～60,000。

3、如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为：

4、如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为：

5、如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为：

6、如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为：

7、一种如权利要求1～6之一所述的化合物通过其活性端基与其他分子所形成的复合物，该复合物具有如下结构通式：

8、如权利要求7所述的复合物，其中其他分子选自具有自由氨基或巯基的蛋白质或多肽，优选但不限于：干扰素、红细胞生成素、胰岛素、尿酸氧化酶、G-CSF、白介素、抗体、胸腺五肽(TP-5)、胸腺肽α1、肌肽、亮丙瑞林、戈那瑞林、阿拉瑞林、舍莫瑞林、奥曲肽、生长抑素、血管紧张素、阿基瑞林等。

9、如权利要求7所述的复合物，其中其他分子选自具有自由氨基或巯基的氨基酸、糖类、有机酸、生物碱、黄酮类、甙类、醌类、萜类分子。