ES2745772T3 - Agentes de unión al receptor muscarínico de la acetilcolina y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformacion activa que esta dirigido contra (y es capaz de unirse especificamente a) una conformacion activa de un receptor muscarinico M2 (M2R), donde el anticuerpo VHH comprende una secuencia de aminoacidos que comprende cuatro regiones marco (FR1 a FR4) y tres regiones determinantes complementarias (CDR1 a CDR3) de acuerdo con la formula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4, donde CDR1 es la SEQ ID N.o: 31, y CDR2 es la SEQ ID N.o: 53, y CDR3 es la SEQ ID N.o: 75; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.o: 32, y CDR2 es la SEQ ID N.o: 54, y CDR3 es la SEQ ID N.o: 76; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.o: 41, y CDR2 es la SEQ ID N.o: 63, y CDR3 es la SEQ ID N.o: 85.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes de unión al receptor muscarínico de la acetilcolina y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] Muchos receptores transmembrana tales como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) existen en muchas conformaciones tridimensionales interconvertibles dependiendo de su actividad o estado de unión al ligando. Los agentes que se unen específicamente a un receptor transmembrana de una manera conformacionalmente específica pueden usarse para inducir un cambio conformacional en el receptor transmembrana. Dichos agentes tienen aplicaciones terapéuticas y pueden usarse en estudios de cristalografía de rayos X del receptor transmembrana. Dichos agentes también pueden usarse para mejorar el descubrimiento de fármacos a través del cribado de compuestos y/o el diseño de fármacos basado en la estructura.

ANTECEDENTES

[0002] Los receptores de acetilcolina muscarínicos (M1 - M5) son miembros de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que regulan la actividad de una amplia gama de funciones centrales y periféricas en el cuerpo humano, incluidas las acciones parasimpáticas de la acetilcolina (Wess et al. 2007 ) El subtipo de receptor muscarínico M2 desempeña un papel clave en la modulación de la función cardíaca y muchos procesos centrales importantes como la cognición y la percepción del dolor (Wess et al. 2007). Ya que se encontraba entre los primeros GPCR en ser purificados (Peterson et al. 1984) y clonados (Kubo et al. 1986), el receptor M2 ha servido durante mucho tiempo como un sistema modelo en biología y farmacología GPCR. Los receptores muscarínicos han atraído un interés particular debido a su capacidad para unirse a moduladores alostéricos de moléculas pequeñas (Mohr et al. 2003). Dado que los sitios alostéricos pueden comprender regiones receptoras que están menos conservadas en secuencia y estructura que el sitio de unión ortostérica, algunos ligandos que se unen a sitios alostéricos en receptores muscarínicos muestran una selectividad de subtipo sustancial (Digby et al. 2010; Keov et al. 2011). Dichos agentes son muy prometedores para el desarrollo de nuevos fármacos muscarínicos para el tratamiento de diversas afecciones clínicas, incluidas enfermedades del sistema nervioso central y trastornos metabólicos. Aunque recientemente se obtuvieron estructuras cristalinas para los estados inactivos de los receptores muscarínicos M2 y M3 (Haga et al. 2012; Kruse et al.

2012), no se han presentado los datos experimentales relativos a la base estructural para la activación del receptor muscarínico y la modulación alostérica por moléculas tipo fármaco. Dicha información podría facilitar en gran medida el desarrollo de nuevos agentes con mayor potencia y selectividad.

[0003] La unión de un ligando activador (agonista) al lado extracelular de un GPCR da como resultado cambios conformacionales que permiten al receptor activar las proteínas G heterotriméricas. A pesar de la importancia de este proceso, solo el receptor p-adrenérgico y la rodopsina se han cristalizado y sus estructuras se han disuelto en conformaciones de estado activo unidas al agonista (Choe et al. 2011; Rasmussen et al. 2011a; Rasmussen et al. 2011b; Deupi et al. 2012; Scheerer et al. 2008). La cristalización de los GPCR de estado activo unidos al agonista ha sido extremadamente difícil debido a su flexibilidad conformacional inherente. Los experimentos de fluorescencia y RMN han demostrado que la estabilización conformacional de la conformación de estado activo unida al agonista requiere que el receptor debe formar un complejo con un agonista y su proteína G, o alguna otra proteína de unión que estabilice la conformación activa (Yao et al. 2009, Nygaard et al.2013).

[0004] Por lo tanto, se necesita el desarrollo de nuevas herramientas sencillas para el análisis estructural y farmacológico de las dianas farmacológicas de los GPCR.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformación activa que está dirigido contra (y es capaz de unirse específicamente a) una conformación activa de un receptor muscarínico M2 (M2R), donde el que el anticuerpo VHH comprende una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones marco (FR1 a FR4) y tres regiones determinantes complementarias (CDR1 a CDR3) de acuerdo con la fórmula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 31, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 53, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 75; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 32, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 54, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 76; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 41, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 63, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 85. Se apreciará que M2R puede ser de cualquier origen, preferiblemente de origen mamífero, en particular de origen humano.

[0006] La presente invención prevé particularmente que el anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformación activa sea capaz de estabilizar M2R en una conformación activa. El anticuerpo VHH descrito anteriormente se une a un epítopo conformacional del receptor. El anticuerpo VHH se une a un epítopo conformacional intracelular del receptor. En una realización específica, el anticuerpo VHH descrito anteriormente es un mimético de proteína G.

[0007] También se contempla un polipéptido que comprende el anticuerpo VHH descrito anteriormente.

[0008] En una realización, el anticuerpo VHH descrito anteriormente también puede inmovilizarse sobre un soporte sólido.

[0009] En otro aspecto, la invención se refiere a un complejo que comprende el receptor muscarínico M2 (M2R) y un anticuerpo v Hh de M2R selectivo en cuanto a conformación activa como se describió anteriormente. El complejo puede comprender además al menos otro ligando de receptor selectivo en cuanto a conformación. Además, el complejo puede ser cristalino. En otro aspecto, la invención también abarca una composición no celular que comprende el complejo descrito anteriormente. Tal composición no celular puede ser una composición de membrana. Otro aspecto se refiere a una composición celular aislada que comprende el complejo descrito anteriormente.

[0010] Además, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los anticuerpos VHH descritos anteriormente. También se prevé una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención.

[0011] Los compuestos selectivos en cuanto a conformación activa descritos anteriormente que tienen como diana el receptor muscarínico M2 se pueden usar en una variedad de aplicaciones, incluyendo la captura y/o purificación del receptor en una conformación activa, el cribado de ligandos y el descubrimiento de fármacos (basados en la estructura) y los estudios de cristalización, pero también como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Otras aplicaciones y usos quedarán claros para los expertos a partir de la descripción adicional en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0012] El experto en la técnica entenderá que los dibujos, descritos a continuación, son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

Figura 1. Resultados de la selección de nanoanticuerpos miméticos de Gi para M2 de una biblioteca VHH de llama postinmune.

Figura 2. Resumen de secuencias de miméticos de Gi para M2 seleccionados y su efecto en un ensayo de unión a radioligando del receptor M2. Como ejemplo no limitante, Nb9_8, provoca una mejora sustancial de la afinidad de iperoxo en un ensayo de unión competitiva, similar a la proteína Gi.

Figura 3. Resultados de las selecciones para ligandos de nanoanticuerpos M2 funcionales de una biblioteca de VHH de llama postinmune usando el mimético de Gi Nb9-8.

Figura 4. Resumen de secuencias de ligandos de nanoanticuerpo M2 extracelulares funcionales seleccionados y su efecto sobre el receptor M2 en un ensayo de unión a radioligandos.

Figura 5. Se muestra la estructura general del receptor Mz en estado activo (naranja) en complejo con el agonista ortostérico iperoxo y el nanoanticuerpo estabilizador en estado activo Nb9-8.

Figura 6 Recopilación de datos y estadísticas de refinamiento.

DEFINICIONES

[0013] La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a ciertos dibujos, pero la invención no está limitada a los mismos sino solo por las reivindicaciones. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no se interpretará como una limitación del alcance. Los dibujos descritos son solo esquemáticos y no limitantes. En los dibujos, el tamaño de algunos de los elementos puede ser exagerado y no dibujado a escala con fines ilustrativos. Cuando el término "que comprende" se usa en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos o etapas. Cuando se usa un artículo indefinido o definido en referencia a un sustantivo singular, p. ej., "un" o "uno/a", "el/la", esto incluye el plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente otra cosa. Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones descritas en el presente documento pueden funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en el presente documento.

[0014] A menos que se defina lo contrario en este documento, los términos y frases científicos y técnicos utilizados en relación con la presente divulgación tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la materia. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con las técnicas de biología molecular y celular, biología estructural, biofísica, farmacología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, ⁿY (1991)) proporcionan al experto diccionarios generales de muchos de los términos utilizados en esta divulgación. Los métodos y técnicas descritos en este documento se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001)); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y suplementos hasta 2002); Rup, Biomolecular crystallography: principles, Practice and Applications to Structural Biology, primera edición, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, an informa Business, Nueva York (2009).); Limbird, Cell Surface Receptors, 3a ed., Springer (2004).

[0015] Tal como se usa en el presente documento, los términos "polipéptido", "proteína", "péptido" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen esqueletos de péptidos modificados. A lo largo de la solicitud, se utilizará la notación estándar de una letra de los aminoácidos. Típicamente, el término "aminoácido" se referirá a "aminoácido proteinogénico", es decir, aquellos aminoácidos que están presentes de manera natural en las proteínas. Más particularmente, los aminoácidos están en la forma isomérica L, pero también se prevén los aminoácidos D.

[0016] Tal como se usa en el presente documento, los términos "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido", "ácido polinucleico", "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, regiones de control, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. La molécula de ácido nucleico puede ser lineal o circular.

[0017] Cualquiera de los péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, compuestos, etc., descritos en el presente documento pueden estar "aislados" o "purificados". "Aislado" se utiliza en el presente documento para indicar que el material al que se hace referencia (i) se separa de una o más sustancias con las que existe en la naturaleza (por ejemplo, se separa de al menos algún material celular, se separa de otros polipéptidos, se separa de su contexto natural de secuencia) y / o (ii) se produce mediante un proceso que involucra la mano del hombre, como la tecnología de ADN recombinante, la síntesis química, etc .; y / o (iii) tiene una secuencia, estructura o composición química que no se encuentran en la naturaleza. "Aislado" pretende incluir compuestos que están dentro de muestras sustancialmente enriquecidas para el compuesto de interés y/o en las que el compuesto de interés está purificado parcial o sustancialmente. "Purificado", tal como se usa en el presente documento, denota que el material al que se hace referencia se retira de su entorno natural y está al menos en un 60 % libre, al menos en un 75 % libre o al menos en un 90 % libre de otros componentes con los que está naturalmente asociado, también se le conoce como "sustancialmente puro".

[0018] El término "identidad de secuencia", tal como se usa en el presente documento, se refiere al grado en que las secuencias son idénticas nucleótido por nucleótido o aminoácido por aminoácido en una ventana de comparación. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (p. ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) ocurren en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La determinación del porcentaje de identidad de secuencia se puede hacer manualmente o mediante el uso de programas informáticos disponibles en la técnica. Ejemplos de algoritmos útiles son PILEUP (Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151 (1989), BLAST y BLAST 2.0 (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0019] "Similitud" se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o constituyen sustituciones conservadoras. La similitud se puede determinar utilizando programas de comparación de secuencias como GAP (Deveraux et al. 1984). De esta manera, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en este documento podrían compararse mediante la inserción de espacios en la alineación, determinándose dichos espacios, por ejemplo, mediante el algoritmo de comparación utilizado por GAP. Tal como se usa en el presente documento, "sustitución conservadora" es la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen propiedades bioquímicas similares (por ejemplo, son alifáticas, aromáticas, están cargadas positivamente, etc.) y es bien conocida por los expertos. La sustitución no conservadora es, entonces, la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos cuyas cadenas laterales no tienen propiedades bioquímicas similares (por ejemplo, el reemplazo de un residuo hidrófobo con un residuo polar). Las sustituciones conservadoras típicamente producirán secuencias que ya no serán idénticas, pero seguirán siendo muy similares. Por sustituciones conservadoras se entienden combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; y phe, tyr, trp.

[0020] Una "deleción" se define aquí como un cambio en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos en la que uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, están ausentes en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un polipéptido o ácido nucleico progenitora. Dentro del contexto de una proteína, una deleción puede implicar la eliminación de aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o más aminoácidos. Una proteína o un fragmento de la misma puede contener más de una deleción. Dentro del contexto de un GPCR, una deleción también puede ser una deleción en bucle, o una deleción de los terminales N y/o C. Una deleción de los terminales N y/o C de un GPCR también se conoce como un truncamiento de la secuencia de aminoácidos del GPCR o un GPCR truncado, lo cual será evidente para los expertos.

[0021] Una "inserción" o "adición" es el cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que ha dado como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de una proteína progenitora. "Inserción" generalmente se refiere a la adición a uno o más residuos de aminoácidos dentro de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido, mientras que "adición" puede ser una inserción o se refiere a residuos de aminoácidos añadidos en un terminal N o C, o en ambos terminales. Dentro del contexto de una proteína o un fragmento de la misma, una inserción o adición es generalmente de aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o más aminoácidos. Una proteína o fragmento de la misma puede contener más de una inserción.

[0022] Una "sustitución", tal como se usa en el presente documento, resulta del reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por aminoácidos o nucleótidos diferentes, respectivamente en comparación con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de una proteína progenitora o un fragmento de la misma. Se entiende que una proteína o un fragmento de la misma puede tener sustituciones conservadoras de aminoácidos que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la actividad de la proteína. Por sustituciones conservadoras se entienden combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; y phe, tyr, trp.

[0023] El término "recombinante" cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o una proteína heterólogos o la alteración de un ácido nucleico o una proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan ácidos nucleicos o polipéptidos que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan de manera anormal, se expresan de manera insuficiente, se sobreexpresan o no se expresan en absoluto.

[0024] Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácidos nucleicos de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

[0025] El término "operativamente enlazado" tal como se usa en el presente documento se refiere a un enlace en el que la secuencia reguladora es contigua al gen de interés para controlarlo, así como las secuencias reguladoras que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés. Por ejemplo, una secuencia de ADN está operativamente enlazada a un promotor cuando está ligada al promotor aguas abajo con respecto al sitio de inicio de la transcripción del promotor y permite que el alargamiento de la transcripción continúe a través de la secuencia de ADN. Un ADN para una secuencia señal está operativamente enlazado al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en el transporte del polipéptido. El enlace de secuencias de ADN a secuencias reguladoras se realiza típicamente mediante ligadura en sitios de restricción adecuados o adaptadores o enlazadores insertados en lugar de los mismos usando endonucleasas de restricción conocidas por expertos en la técnica.

[0026] El término "secuencia reguladora" tal como se usa en el presente documento, y también denominado "secuencia de control", se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para afectar a la expresión de las secuencias codificantes a las que están operativamente enlazadas. Las secuencias reguladoras son secuencias que controlan la transcripción, los eventos postranscripcionales y la traducción de secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación, promotoras y potenciadoras de transcripción; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan ARNm citoplasmático; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas); secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que mejoren la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es beneficiosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas de fusión.

[0027] El término "vector" tal como se usa en el presente documento pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. El vector puede ser de cualquier tipo adecuado incluyendo, entre otros, fago, virus, plásmido, fagémido, cósmido, bácmido o incluso un cromosoma artificial. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresión de ciertos genes de interés. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). Los vectores adecuados tienen secuencias reguladoras, tales como promotores, potenciadores, secuencias de terminación y similares, según se desee y de acuerdo con un organismo huésped particular (por ejemplo, células bacterianas o células de levadura). Típicamente, un vector recombinante como el descrito en el presente documento comprende al menos un "gen quimérico" o "casete de expresión". Los casetes de expresión son generalmente constructos de ADN que incluyen preferiblemente (de 5' a 3' en la dirección de transcripción): una región promotora, una secuencia de polinucleótidos, un homólogo, una variante o un fragmento de las mismas de la presente divulgación operativamente enlazado con la región de inicio de la transcripción, y una secuencia de terminación que incluye una señal de parada para la ARN polimerasa y una señal de poliadenilación. Se entiende que todas estas regiones deberían ser capaces de operar en células biológicas, como las células procariotas o eucariotas, para ser transformadas. La región promotora que comprende la región de inicio de la transcripción, que incluye preferiblemente el sitio de unión a la ARN polimerasa, y la señal de poliadenilación pueden ser nativas de la célula biológica que se va a transformar o pueden derivarse de una fuente alternativa, donde la región es funcional en la célula biológica. .

[0028] El término "célula huésped", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no solo a la célula sujeto particular sino a los descendientes de dicha célula. Puesto que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones siguientes debido a mutaciones o influencias ambientales, dichos descendientes pueden, de hecho, no ser idénticos a la célula madre, pero siguen incluyéndose dentro del alcance del término "célula huésped" tal como se usa en el presente documento. Una célula huésped puede ser una célula o línea celular aislada que se cultiva o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivos. En particular, las células huésped son de origen bacteriano o fúngico, pero también pueden ser de origen vegetal o mamífero. Las palabras "célula huésped", "célula huésped recombinante", "célula huésped de expresión", "sistema huésped de expresión", "sistema de expresión", tienen el mismo significado y se usan indistintamente en el presente documento.

[0029] Los "receptores acoplados a la proteína G" o "GPCR" son polipéptidos que comparten un motivo estructural común, que tienen siete regiones de entre 22 y 24 aminoácidos hidrófobos que forman siete hélices alfa, cada una de las cuales abarca una membrana. Cada intervalo se identifica por número, es decir, transmembrana-1 (TM1), transmembrana-2 (TM2), etc. Las hélices transmembrana están unidas por regiones de aminoácidos entre transmembrana-2 y transmembrana-3, transmembrana-4 y transmembrana- 5, y transmembrana-6 y transmembrana-7 en el exterior, o lado "extracelular", de la membrana celular, denominadas regiones "extracelulares" 1,2 y 3 (EC1, EC2 y EC3), respectivamente. Las hélices transmembrana también están unidas por regiones de aminoácidos entre transmembrana-1 y transmembrana-2, transmembrana-3 y transmembrana-4, y transmembrana-5 y transmembrana-6 en el lado interior o "intracelular" de la membrana celular, denominadas regiones "intracelulares" 1, 2 y 3 (IC1, IC2 e IC3), respectivamente. El terminal "carboxi" ("C") del receptor se encuentra en el espacio intracelular dentro de la célula, y el terminal "amino" ("N") del receptor se encuentra en el espacio extracelular fuera de la célula. La estructura y clasificación de los GPCR generalmente es bien conocida en la técnica, y se puede encontrar más información sobre GPCR en Probst, DNA Cell Biol. 1992 11: 1-20; Marchese et al. Genomics 23: 609-618, 1994; y los siguientes libros: Jürgen Wess (Ed) Structure-Function Analysis of G Protein-Coupled Receptors publicado por Wiley Liss (1a edición; 15 de octubre de 1999); Kevin R. Lynch (Ed) Identification and Expression of G Protein-CoupledReceptors publicado por John Wiley & Sons (marzo de 1998) y Tatsuya Haga (Ed), G Protein-Coupled Receptors, publicado por CRC Press (24 de septiembre, 1999); y Steve Watson (Ed) G-Protein Linked Receptor Factsbook, publicado por Academic Press (1a edición; 1994).

[0030] El término "biológicamente activo", con respecto a un GPCR, se refiere a un GPCR que tiene una función bioquímica (p. ej., una función de unión, una función de transducción de señales o la capacidad de cambiar la conformación como resultado de la unión al ligando) de un GPCR de origen natural

[0031] En general, el término "de origen natural" en referencia a un GPCR se refiere a un GPCR que es producido de manera natural (por ejemplo, por un mamífero de tipo salvaje tal como un humano). Tales GPCR se encuentran en la naturaleza. El término "de origen no natural" en referencia a un GPCR se refiere a un GPCR que no es natural. Los GPCR de origen natural que se han vuelto constitutivamente activos a través de la mutación y las variantes de los receptores transmembrana de origen natural, por ejemplo, los GPCR etiquetados con epítopos y los GPCR que carecen de su terminal N nativo, son ejemplos de GPCR de origen no natural. Las versiones no naturales de un GPCR de origen natural a menudo son activadas por el mismo ligando que el GPCR de origen natural.

[0032] Ejemplos no limitantes de GPCR de origen natural o de origen no natural dentro del contexto de la presente descripción se proporcionan adicionalmente en el presente documento, en particular para receptores de acetilcolina muscarínicos.

[0033] Un "epítopo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo podría comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial, que es única para el epítopo. Generalmente, un epítopo consta de al menos 4, 5, 6, 7 de tales aminoácidos, y más habitualmente, consta de al menos 8, 9, 10 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear multidimensional. Un "epítopo conformacional", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un epítopo que comprende aminoácidos en una conformación espacial que es única para una conformación tridimensional plegada del polipéptido. Generalmente, un epítopo conformacional consiste en aminoácidos que son discontinuos en la secuencia lineal que se unen en la estructura plegada de la proteína. Sin embargo, un epítopo conformacional también puede consistir en una secuencia lineal de aminoácidos que adopta una conformación que es única para una conformación tridimensional plegada del polipéptido (y no está presente en un estado desnaturalizado).

[0034] El término "conformación" o "estado conformacional" de una proteína se refiere generalmente a la gama de estructuras que una proteína puede adoptar en cualquier instante en el tiempo. Un experto en la materia reconocerá que los determinantes de conformación o estado conformacional incluyen la estructura primaria de una proteína tal como se refleja en la secuencia de aminoácidos de una proteína (incluidos los aminoácidos modificados) y el entorno que rodea a la proteína. La conformación o estado conformacional de una proteína también se relaciona con características estructurales tales como las estructuras secundarias de proteínas (p. ej., la hélice a, la lámina p, entre otras), la estructura terciaria (p. ej., plegamiento tridimensional de una cadena de polipéptidos) y la estructura cuaternaria (por ejemplo, interacciones de una cadena de polipéptidos con otras subunidades de proteínas). Las modificaciones postraduccionales y de otro tipo en una cadena polipeptídica, tales como la unión de ligandos, la fosforilación, la sulfatación, la glucosilación o la unión de grupos hidrófobos, entre otras, pueden influir en la conformación de una proteína. Además, los factores ambientales, como el pH, la concentración salina, la fuerza iónica y la osmolalidad de la solución circundante, y la interacción con otras proteínas y cofactores, entre otros, pueden afectar a la conformación de las proteínas. El estado conformacional de una proteína puede determinarse mediante un ensayo funcional de la actividad o la unión a otra molécula o mediante métodos físicos tales como cristalografía de rayos X, RMN o spin labeling, entre otros métodos. Para un discusión general sobre conformación de proteínas y estados conformacionales, se remite a Cantor y Schimmel, Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological Macromolecules, .W.H. Freeman and Company, 1980y Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, 1993.

[0035] Una "conformación funcional" o un "estado conformacional funcional", tal como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que las proteínas poseen diferentes estados conformacionales que tienen un rango dinámico de actividad, en particular que varía desde la actividad nula hasta la actividad máxima. Debe quedar claro que se pretende que "un estado conformacional funcional" abarque cualquier estado conformacional de una proteína, que tenga alguna actividad, incluida la actividad nula, y no se pretende que abarque los estados desnaturalizados de las proteínas. Los ejemplos no limitantes de conformaciones funcionales incluyen conformaciones activas, conformaciones inactivas o conformaciones basales (tal como se define más adelante en este documento). Una clase particular de conformaciones funcionales se define como "conformación susceptible a fármacos" y generalmente se refiere a un estado conformacional único terapéuticamente relevante de una proteína diana. Como ilustración, la conformación activa unida al agonista del receptor de acetilcolina muscarínico M2 corresponde a la conformación susceptible a fármacos de este receptor relacionada con el dolor y el glioblastoma. Por lo tanto, se entenderá que la susceptibilidad a fármacos se limita a conformaciones particulares dependiendo de la indicación terapéutica. Más adelante se proporcionarán detalles adicionales en el presente documento.

[0036] Tal como se usa en el presente documento, los términos "conformación activa" y "forma activa" se refieren a un GPCR, particularmente al receptor de acetilcolina muscarínico M2, que se pliega de manera que sea activo. Se puede colocar un GPCR en una conformación activa usando un agonista del receptor. Por ejemplo, un GPCR en su conformación activa se une a la proteína G heterotrimérica y cataliza el intercambio de nucleótidos de la proteína G para activar las vías de señalización aguas abajo. Los GPCR activados se unen a la forma inactiva, unida a la GDP de las proteínas G heterotriméricas y hacen que las proteínas G liberen su GDP para que la GTP pueda unirse. Hay un estado transitorio "libre de nucleótidos" que resulta de este proceso que permite que el GTP se una. Una vez que se une el GTP, el receptor y la proteína G se disocian, permitiendo que la proteína G unida al GTP active vías de señalización aguas abajo, tales como adenilil ciclasa, canales iónicos, RAS/MAPK, etc. Los términos "conformación inactiva" y "forma inactiva" se refieren a un GPCR, en particular el receptor de acetilcolina muscarínico M2, que se pliega de manera que esté inactivo. Se puede colocar un GPCR en una conformación inactiva usando un agonista inverso del receptor. Por ejemplo, un GPCR en su conformación inactiva no se une a la proteína G heterotrimérica con alta afinidad. Los términos "conformación activa" y "conformación inactiva" se ilustrarán adicionalmente en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término "conformación basal" se refiere a un GPCR, particularmente al receptor de acetilcolina muscarínico M2, que se pliega de manera que exhibe actividad hacia una vía de señalización específica incluso en ausencia de un agonista (también denominado actividad basal o actividad constitutiva). Los agonistas inversos pueden inhibir esta actividad basal. Por lo tanto, una conformación basal de un GPCR corresponde a una conformación estable o a especies estructurales prominentes en ausencia de ligandos o proteínas accesorias.

[0037] El término "estabilizante" o "estabilizado", con respecto a un estado conformacional funcional de un GPCR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a retener o mantener una proteína GPCR en un subconjunto de las posibles conformaciones que de otro modo podría asumir, debido a los efectos de la interacción del GPCR con el agente aglutinante descrito en el presente documento. Dentro de este contexto, un agente aglutinante que se une selectivamente a una conformación o estado conformacional específico de una proteína se refiere a un agente aglutinante que se une con una mayor afinidad a una proteína en un subconjunto de conformaciones o estados conformacionales que en otras conformaciones o estados conformacionales que la proteína puede asumir. Un experto en la técnica reconocerá que los agentes de unión que se unen específica o selectivamente a una conformación o estado conformacional específico de una proteína estabilizarán esta conformación o estado conformacional específico, y su actividad relacionada. Más adelante se proporcionarán detalles adicionales en el presente documento.

[0038] El término "afinidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere al grado en que un ligando (según se define más adelante en el presente documento) se une a una proteína diana para desplazar el equilibrio de la proteína diana y el ligando hacia la presencia de un complejo formado por su unión. Por lo tanto, por ejemplo, cuando un GPCR y un ligando se combinan en una concentración relativamente igual, un ligando de alta afinidad se unirá al antígeno disponible en el GPCR para cambiar el equilibrio hacia una alta concentración del complejo resultante. La constante de disociación se usa comúnmente para describir la afinidad entre un ligando y una proteína diana. Típicamente, la constante de disociación es inferior a 10-5 M. Preferiblemente, la constante de disociación es inferior a 10-6 M, más preferiblemente, inferior a 10-7 M. Más preferiblemente, la constante de disociación es inferior a 10-8 M. Otras formas de describir la afinidad entre un ligando y su proteína diana son la constante de asociación (Ka), la constante de inhibición (Ki), o indirectamente evaluando la potencia de los ligandos midiendo la media concentración inhibitoria máxima (IC50) o la media concentración eficaz máxima (CE50). El ligando puede ser un agente aglutinante, preferiblemente una inmunoglobulina, p. ej., un anticuerpo, o un fragmento de inmunoglobulina, como un VHH o un nanoanticuerpo, que se une a un epítopo conformacional en un GPCR. Se apreciará que dentro del alcance de la presente divulgación, el término "afinidad" se usa en el contexto de un agente aglutinante, en particular una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un VHH o un nanoanticuerpo, que se une a un epítopo conformacional de un GPCR diana, así como en el contexto de un compuesto de prueba (como se define más adelante en este documento) que se une a un GPCR diana, más particularmente a un sitio ortostérico o alostérico de un GPCR diana.

[0039] El término "especificidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un agente aglutinante, en particular una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un VHH o un nanoanticuerpo, de unirse preferentemente a un antígeno, frente a un antígeno diferente, y no implica necesariamente una alta afinidad.

[0040] Los términos "unirse específicamente" y "unión específica", tal como se usan en el presente documento, generalmente se refieren a la capacidad de un agente aglutinante, en particular una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, o un fragmento de inmunoglobulina, tal como un VHH o un nanoanticuerpo, para unirse preferentemente a un antígeno particular que está presente en una mezcla homogénea de diferentes antígenos. En ciertas realizaciones, una interacción de unión específica discriminará entre antígenos deseables e indeseables en una muestra, en algunas realizaciones más de aproximadamente 10 a 100 veces o más (por ejemplo, más de aproximadamente 1000 o 10 000 veces). Dentro del contexto del espectro de estados conformacionales de GPCR, en particular del receptor de acetilcolina muscarínico M2, los términos se refieren particularmente a la capacidad de un agente aglutinante (como se define en el presente documento) de reconocer y/o unirse preferentemente a un estado conformacional particular de un GPCR en comparación con otro estado conformacional.

[0041] Tal como se usa en el presente documento, el término "agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación" en el contexto de la presente divulgación se refiere a un agente aglutinante que se une a una proteína diana de una manera selectiva en cuanto a conformación. Un agente aglutinante que se une selectivamente a una conformación o estado conformacional particular de una proteína se refiere a un agente aglutinante que se une con una mayor afinidad a una proteína en un subconjunto de conformaciones o estados conformacionales que en otras conformaciones o estados conformacionales que la proteína puede asumir. . Un experto en la técnica reconocerá que los agentes de unión que se unen selectivamente a una conformación o estado conformacional específico de una proteína estabilizarán o retendrán la proteína en esta conformación particular o estado conformacional. Por ejemplo, un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación activa se unirá preferentemente a un GPCR en un estado conformacional activo y no se unirá o lo hará en menor grado a un GPCR en un estado conformacional inactivo, y por lo tanto tendrá una mayor afinidad por dicho estado conformacional activo; o viceversa. Los términos "unir específicamente", "unir selectivamente", "unir preferentemente", y equivalentes gramaticales de los mismos, se usan indistintamente en el presente documento. Los términos "conformacionalmente específico" o "conformacionalmente selectivo" también se usan indistintamente en el presente documento.

[0042] El término "compuesto" o "compuesto de prueba" o "compuesto candidato" o "compuesto candidato a fármaco" tal como se usa en el presente documento describe cualquier molécula, ya sea natural o sintética, que se prueba en un ensayo, tal como un ensayo de cribado o ensayo de descubrimiento de fármacos. Como tales, estos compuestos comprenden compuestos orgánicos o inorgánicos. Los compuestos incluyen polinucleótidos, lípidos o análogos hormonales que se caracterizan por bajos pesos moleculares. Otros compuestos de prueba orgánicos biopoliméricos incluyen péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos (peptidomiméticos) que comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 aminoácidos y polipéptidos más grandes que comprenden de aproximadamente 40 a aproximadamente 500 aminoácidos, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o conjugados de anticuerpos. Los compuestos de prueba también pueden ser andamiajes de proteínas. Para fines de alto rendimiento, se pueden usar bibliotecas de compuestos de prueba, tales como bibliotecas combinatorias o aleatorias que proporcionan un rango suficiente de diversidad. Los ejemplos incluyen, entre otros, bibliotecas de compuestos naturales, bibliotecas de compuestos alostéricos, bibliotecas de péptidos, bibliotecas de fragmentos de anticuerpos, bibliotecas de compuestos sintéticos, bibliotecas basadas en fragmentos, bibliotecas de despliegue en fagos y similares. Se puede encontrar una descripción más detallada en la especificación.

[0043] Tal como se usa en el presente documento, el término "ligando" se refiere a una molécula que se une específicamente a un GPCR, en particular al receptor de acetilcolina muscarínico M2. Un ligando puede ser, sin la intención de ser limitante, un polipéptido, un lípido, una molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un ácido nucleico o un carbohidrato. Un ligando puede ser de origen sintético o natural. Un ligando también incluye un "ligando nativo" que es un ligando natural endógeno para un GPCR nativo. Dentro del contexto de la presente divulgación, un ligando puede unirse a un GPCR, ya sea intracelularmente o extracelularmente. Un ligando puede ser un agonista, un agonista parcial, un agonista inverso, un antagonista, un modulador alostérico y puede unirse en el sitio ortostérico o en el sitio alostérico. Un ligando puede ser un "ligando selectivo en cuanto a conformación" o un "ligando específico de conformación", lo que significa que dicho ligando se une al GPCR de manera selectiva en cuanto a conformación. Un ligando selectivo en cuanto a conformación se une con una mayor afinidad a una conformación particular del GPCR que a otras conformaciones que el GPCR puede adoptar. Con fines ilustrativos, un agonista es un ejemplo de un ligando selectivo en cuanto a conformación activa, mientras que un agonista inverso es un ejemplo de un ligando selectivo en cuanto a conformación inactiva. En aras de la claridad, un antagonista neutro no se considera un ligando selectivo en cuanto a conformación, ya que un antagonista neutro no distingue entre las diferentes conformaciones de un GPCR.

[0044] Un "ligando ortostérico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ligando (tanto natural como sintético), que se une al sitio activo de un GPCR, en particular el receptor de acetilcolina muscarínico M2, y que además se clasifica según su eficacia o en otras palabras según el efecto que tienen sobre la señalización a través de una vía específica. Tal como se usa en el presente documento, un "agonista" se refiere a un ligando que, al unirse a una proteína receptora, aumenta la actividad de señalización del receptor. Los agonistas completos son capaces de estimular la proteína al máximo; los agonistas parciales no pueden provocar actividad completa incluso a concentraciones de saturación. Los agonistas parciales también pueden funcionar como "bloqueadores" al evitar la unión de agonistas más robustos. Un "antagonista", también denominado "antagonista neutro", se refiere a un ligando que se une a un receptor sin estimular ninguna actividad. Un "antagonista" también se conoce como un "bloqueador" debido a su capacidad para evitar la unión de otros ligandos y, por lo tanto, bloquear la actividad inducida por el agonista. Además, un "agonista inverso" se refiere a un antagonista que, además de bloquear los efectos agonistas, reduce la actividad basal o constitutiva de un receptor por debajo de la proteína no ligada.

[0045] Los ligandos tal como se usan en el presente documento también pueden ser "ligandos sesgados" con la capacidad de estimular selectivamente un subconjunto de actividades de señalización de un receptor, por ejemplo, en el caso de GPCR, la activación selectiva de la función de la proteína G o la p-arrestina. Dichos ligandos se conocen como "ligandos sesgados", "agonistas sesgados" o "agonistas funcionalmente selectivos". Más particularmente, el sesgo del ligando puede ser un sesgo imperfecto caracterizado por una estimulación del ligando de múltiples actividades de receptor con diferentes eficacias relativas para diferentes señales (selectividad no absoluta) o puede ser un sesgo perfecto caracterizado por una estimulación del ligando de una actividad de proteína receptora sin ninguna estimulación de otra actividad de proteína receptora conocida.

[0046] Otro tipo de ligandos se conoce como reguladores alostéricos. "Reguladores alostéricos" o "moduladores alostéricos", "ligandos alostéricos" o "moléculas efectoras", tal como se usan en este documento, se refieren a ligandos que se unen en un sitio alostérico (es decir, un sitio regulador físicamente distinto del sitio activo de la proteína) de un GPCR, en particular el receptor de acetilcolina muscarínico M2. A diferencia de los ligandos ortostéricos, los moduladores alostéricos no son competitivos porque se unen a las proteínas receptoras en un sitio diferente y modifican su función incluso si el ligando endógeno también se une. Los reguladores alostéricos que mejoran la actividad de la proteína se denominan en el presente documento "activadores alostéricos" o "moduladores alostéricos positivos" (PAM), mientras que aquellos que disminuyen la actividad de la proteína se denominan en el presente documento "inhibidores alostéricos" o "moduladores alostéricos negativos" (NAM).

[0047] Tal como se usa en el presente documento, los términos "determinar", "medir", "evaluar", "analizar" se usan indistintamente e incluyen determinaciones cuantitativas y cualitativas.

[0048] El término "anticuerpo" pretende significar una inmunoglobulina o cualquier fragmento de la misma que sea capaz de unirse al antígeno. El término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos con un solo dominio de unión.

[0049] Tal como se usa en el presente documento, los términos "región determinante de complementariedad" o "CDR" dentro del contexto de los anticuerpos se refieren a regiones variables de cadenas H (pesadas) o L (ligeras) (también abreviadas como VH y VL, respectivamente) y contienen las secuencias de aminoácidos capaces de unirse específicamente a dianas antigénicas. Estas regiones CDR son responsables de la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular. Dichas regiones también se denominan "regiones hipervariables". Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, independientemente de la especie, se ha encontrado que las ubicaciones posicionales de estas secuencias críticas de aminoácidos dentro de las regiones variables de cadena pesada y ligera tienen ubicaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y ligeras variables de todos los anticuerpos canónicos tienen 3 regiones CDR, cada una no contigua a las otras (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las respectivas cadenas ligera (L) y pesada (H) . Los dominios variables individuales de inmunoglobulina, en particular los nanoanticuerpos, generalmente comprenden una cadena de aminoácidos única que puede considerarse que comprende 4 "secuencias o regiones marco" o FR y 3 "regiones determinantes complementarias" o CDR. Los nanoanticuerpos tienen 3 regiones CDR, cada una no contigua con las otras (denominadas CDR1, CDR2, CDR3). La delineación de las secuencias FR y CDR puede, por ejemplo, basarse en el sistema de numeración único de IMGT para dominios V y dominios similares a V (Lefranc et al. 2003).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Agentes de unión selectivos en cuanto a conformación contra el receptor de acetilcolina muscarínico y los complejos que lo comprenden

[0050] En el presente documento se describe un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que se dirige contra, y/o es capaz de unirse específicamente a, un GPCR de la familia de receptores de acetilcolina muscarínicos (mAChR).

[0051] Los receptores de acetilcolina muscarínicos (mAChR) pertenecen a la superfamilia de los GPCR (como se define en el presente documento), más particularmente a los GPCR de la familia A, e incluyen cinco subtipos, designados de M1 a M5. Clásicamente, estos receptores se subdividen en dos grandes grupos en función de su eficacia de acoplamiento primario a las proteínas G. Los receptores muscarínicos M2 y M4 pueden acoplarse a las proteínas Gi/o, mientras que los receptores muscarínicos M1, M3 y M5 se acoplan a las proteínas Gq/11 y activan la fosfolipasa C. El neurotransmisor acetilcolina (ACh) es un agonista natural para esta familia de receptores. Las secuencias de aminoácidos (y las secuencias de nucleótidos de los ADNc que las codifican) de los receptores de acetilcolina muscarínicos están fácilmente disponibles, por ejemplo, consultando GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). La nomenclatura estandarizada del HGNC para genes humanos, los números de acceso de diferentes isoformas de diferentes organismos están disponibles en Uniprot (www.uniprot.org). Además, se puede obtener una visión general completa de la nomenclatura del receptor e información farmacológica, funcional y fisiopatológica sobre los receptores de acetilcolina muscarínicos de la base de datos IUPHAR (http://www.iuphar-db.org/). Los términos "receptor de acetilcolina muscarínico" y "receptor muscarínico" se usan indistintamente en el presente documento.

[0052] Preferiblemente, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento se dirige contra, y/o se une específicamente a, un receptor de acetilcolina muscarínico M2 (M2R). La naturaleza del receptor muscarínico de acetilcolina, en particular el receptor muscarínico M2, no es crítica y puede provenir de cualquier organismo, incluido un hongo (incluida la levadura), nemátodo, virus, insecto, planta, ave (por ejemplo, pollo o pavo), reptil o mamífero (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster, jerbo, perro, gato, cabra, cerdo, vaca, caballo, ballena, mono, camélido o humano). Preferiblemente, el receptor de acetilcolina muscarínico es de origen mamífero, incluso más preferiblemente de origen humano.

[0053] El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento puede unirse específicamente al receptor de acetilcolina muscarínico humano M2 (SEQ ID N.°: 153), y/o al receptor de acetilcolina muscarínico de ratón M2 (SEQ ID N.°: 154), y/o al receptor de acetilcolina muscarínico de rata M2 (SEQ ID N.°: 155). Preferiblemente, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación se une al receptor de acetilcolina muscarínico humano M2 (SEQ ID N.°: 153).

[0054] El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento puede no dirigirse y/o no unirse específicamente al receptor de acetilcolina muscarínico M3 (por ejemplo, el receptor muscarínico humano M3; identificador Uniprot P20309). El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento puede no dirigirse y/o no unirse específicamente al receptor muscarínico de acetilcolina M4 (por ejemplo, el receptor muscarínico humano M4; identificador Uniprot P08173). El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento puede no dirigirse y/o no unirse específicamente al receptor de acetilcolina muscarínico m 5 (por ejemplo, el receptor muscarínico humano M5; identificador Uniprot P08912). El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento puede no dirigirse y/o no unirse específicamente al receptor muscarínico de acetilcolina M1 (por ejemplo, el receptor muscarínico humano M1; identificador Uniprot P11229).

[0055] Un requisito previo del agente aglutinante es su capacidad para unirse específicamente (tal como se define en el presente documento) al receptor de acetilcolina muscarínico, preferiblemente el receptor muscarínico M2. Por lo tanto, el agente aglutinante puede dirigirse contra cualquier epítopo conformacional (tal como se define en el presente documento) del receptor muscarínico. Un agente aglutinante que se une específicamente a un "epítopo conformacional" se une específicamente a una estructura terciaria (es decir, tridimensional) de una proteína plegada, y se une a una afinidad mucho más reducida (es decir, en un factor de al menos 2, 5, 10, 50 o 100) con la forma lineal (es decir, desplegada, desnaturalizada) de la proteína. En particular, dicho epítopo conformacional puede ser parte de una región intracelular o extracelular, o una región intramembrana, o un dominio o estructura de bucle del receptor muscarínico. Por lo tanto, el agente aglutinante puede dirigirse contra una región extracelular, dominio, bucle u otro epítopo conformacional extracelular del receptor muscarínico, pero preferiblemente se dirige contra partes extracelulares de los dominios transmembrana o contra bucles extracelulares que unen los dominios transmembrana. Alternativamente, el agente aglutinante puede dirigirse contra una región intracelular, dominio, bucle u otro epítopo conformacional intracelular del receptor muscarínico, pero preferiblemente se dirige contra partes intracelulares de los dominios transmembrana o contra bucles intracelulares que unen los dominios transmembrana. El agente aglutinante también puede dirigirse contra un epítopo conformacional que forma parte del sitio de unión de un ligando natural, que incluye, pero se limita a, un agonista ortostérico endógeno. El agente aglutinante también puede dirigirse contra un epítopo conformacional, en particular un epítopo conformacional intracelular, que está comprendido en un sitio de unión para una proteína de señalización aguas abajo, que incluye, entre otros, un sitio de unión a la proteína G o a la p-arrestina. Por ejemplo, el agente aglutinante puede unirse a un epítopo conformacional intracelular del receptor muscarínico M2, el epítopo conformacional comprende al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos: T56, N58, R121, C124, V125, P132, V133, R135, Y206, 1209, S213, S380, V385, T388, 1389, R381, C439, Y440, C443, A445, T446, donde la numeración de aminoácidos es tal como se define en el receptor muscarínico humano M2R (SEQ ID N.°: 153). Tenga en cuenta que estos residuos se conservan en otras especies, incluyendo M2R de ratón (SEQ ID N.°: 154) y M2R de rata (SEQ ID N.°: 155), según puede derivarse fácilmente de una alineación de estas secuencias, que es una práctica habitual por parte de personas expertas en la técnica.

[0056] Se entenderá que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación es capaz de estabilizar el receptor muscarínico en una conformación particular. Con el término "estabilizar", o términos gramaticalmente equivalentes, tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, se entiende una mayor estabilidad de un receptor muscarínico con respecto a la estructura (por ejemplo, estado conformacional) y/o la actividad biológica particular (por ejemplo, actividad de señalización intracelular, afinidad de unión a ligando, etc.) En relación con una mayor estabilidad con respecto a la estructura y/o la actividad biológica, esto puede determinarse fácilmente mediante un ensayo funcional de la actividad (por ejemplo, liberación de Ca2 , generación de cAMP o actividad transcripcional, reclutamiento de p-arrestina, etc.) o unión al ligando o por medio de métodos físicos tales como cristalografía de rayos X, RMN o spin labeling, entre otros métodos. El término "estabilizar" también incluye una mayor termoestabilidad del receptor en condiciones no fisiológicas inducidas por desnaturalizantes o condiciones desnaturalizadoras. El término "termoestabilizar", "termoestabilización", "aumentar la termoestabilidad de", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las propiedades funcionales más que a las propiedades termodinámicas de un receptor y a la resistencia de la proteína a la desnaturalización irreversible inducida por enfoques térmicos y/o químicos incluyendo, entre otros, calentamiento, enfriamiento, congelación, desnaturalizantes químicos, pH, detergentes, sales, aditivos, proteasas o temperatura. La desnaturalización irreversible conduce al desarrollo irreversible de las conformaciones funcionales de la proteína, la pérdida de actividad biológica y la agregación de la proteína desnaturalizada. En relación con una mayor estabilidad al calor, esto puede determinarse fácilmente midiendo la unión del ligando o utilizando métodos espectroscópicos tales como fluorescencia, CD o dispersión de luz que son sensibles al despliegue a temperaturas crecientes. Se prefiere que el agente aglutinante sea capaz de aumentar la estabilidad medida por un aumento en la estabilidad térmica de un receptor muscarínico en un estado conformacional funcional con al menos 2 °C, al menos 5 °C, al menos 8 °C, y más preferiblemente al menos 10 °C o 15 °C o 20 °C. En relación con una mayor estabilidad frente a un detergente o a un caotropo, típicamente el receptor muscarínico se incuba durante un tiempo definido en presencia de un detergente de prueba o un agente caotrópico de prueba y la estabilidad se determina usando, por ejemplo, la unión de ligando o un método espectroscópico, opcionalmente a temperaturas crecientes como se discutió anteriormente. De lo contrario, el agente aglutinante es capaz de aumentar la estabilidad al pH extremo de un estado conformacional funcional de un receptor muscarínico. En relación con un extremo de pH, se elegiría un pH de prueba típico, por ejemplo, en el rango de 6 a 8, el rango de 5.5 a 8.5, el rango de 5 a 9, el rango de 4.5 a 9.5, más específicamente en el rango de 4.5 a 5.5 (pH bajo) o en el rango de 8.5 a 9.5 (pH alto). El término "(termo)estabilizar", "(termo)estabilización", "aumentar la (termo)estabilidad de", tal como se usa aquí, se aplica a los receptores muscarínicos incrustados en partículas lipídicas o capas lipídicas (por ejemplo, monocapas lipídicas, bicapas lipídicas y similares) y a receptores muscarínicos que se han solubilizado en detergente.

[0057] Por lo tanto, se prevé particularmente que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento estabilice el receptor muscarínico en una conformación funcional tras la unión del agente aglutinante. Preferiblemente, el receptor muscarínico, más específicamente el receptor muscarínico M2, se estabiliza en una conformación activa tras la unión de un agente aglutinante que es selectivo en cuanto a conformación para una conformación activa. El término "conformación activa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un espectro de conformaciones de receptor que permite la transducción de señal hacia un sistema efector intracelular, tal como una señalización dependiente de proteína G y/o señalización independiente de proteína G (por ejemplo, señalización de p-arrestina). Por lo tanto, una "conformación activa" abarca un rango de conformaciones específicas de ligando, incluyendo una conformación de estado activo específica de agonista, una conformación de estado activo específica de agonista parcial o una conformación de estado activo específica de agonista sesgado, de modo que induce la unión cooperativa de una proteína efectora intracelular. Preferiblemente, el receptor muscarínico, más específicamente el receptor M2 muscarínico, se estabiliza en una conformación activa tras la unión de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación activa, por lo que el receptor se pliega de una manera que es activa induciendo la señalización dependiente de proteína G. Alternativamente, el receptor muscarínico, más específicamente el receptor muscarínico M2, se estabiliza en una conformación inactiva tras la unión de un agente aglutinante que es selectivo en cuanto a conformación para una conformación inactiva. El término "conformación inactiva", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un espectro de conformaciones de receptor que no permite o bloquea la transducción de señales hacia un sistema efector intracelular. Por lo tanto, una "conformación inactiva" abarca un rango de conformaciones específicas de ligando, que incluye una conformación inversa del estado inactivo específico del agonista, de modo que evita la unión cooperativa de una proteína efectora intracelular. Se entenderá que el sitio de unión del ligando no es crítico para obtener una conformación activa o inactiva. Por lo tanto, los ligandos ortostéricos así como los moduladores alostéricos pueden igualmente ser capaces de estabilizar un receptor muscarínico en una conformación activa o inactiva. Por ejemplo, el agente aglutinante que es capaz de estabilizar el receptor muscarínico puede unirse en el sitio ortostérico o en un sitio alostérico. El agente aglutinante que es capaz de estabilizar el receptor muscarínico puede ser un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación activa, o un agente aglutinante selectivo con respecto a la conformación inactiva, ya sea por unión en el sitio ortostérico o en un sitio alostérico.

[0058] En general, un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que estabilice una conformación activa de un receptor muscarínico, más específicamente el receptor muscarínico M2, aumentará o mejorará la afinidad del receptor por un ligando selectivo en cuanto a conformación activa, como un agonista, más específicamente un agonista, un agonista parcial o un agonista sesgado, en comparación con el receptor en ausencia del agente aglutinante (o en presencia de un agente aglutinante simulado, también denominado agente aglutinante de control o agente aglutinante irrelevante) que no está dirigido contra, y/o no se une específicamente a, el receptor muscarínico M2). Además, un agente aglutinante que estabilice una conformación activa de un receptor muscarínico disminuirá la afinidad del receptor por un ligando selectivo en cuanto a conformación inactiva, como un agonista inverso, en comparación con el receptor en ausencia del agente aglutinante (o en la presencia de un agente aglutinante simulado). Por el contrario, un agente aglutinante que estabilice una conformación inactiva de un receptor muscarínico aumentará la afinidad del receptor por un agonista inverso y disminuirá la afinidad del receptor por un agonista, particularmente por un agonista completo, un agonista parcial o un agonista sesgado, en comparación con el receptor en ausencia del agente aglutinante (o en presencia de un agente aglutinante simulado). Un aumento o disminución en la afinidad por un ligando puede medirse directamente y/o calcularse a partir de una disminución o aumento, respectivamente, en la CE⁵⁰, IC⁵⁰, K^d , Kⁱ o cualquier otra medida de afinidad o potencia conocida por un experto en la técnica. Se prefiere particularmente que el agente aglutinante que estabilice una conformación particular de un receptor muscarínico sea capaz de aumentar o disminuir la afinidad por un ligando selectivo en cuanto a conformación al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces y más preferiblemente al menos 100 veces, incluso más preferiblemente al menos 1000 veces o más, al unirse al receptor. Se apreciará que las mediciones de afinidad para ligandos selectivos en cuanto a conformación que desencadenan/inhiben vías de señalización particulares pueden llevarse a cabo con cualquier tipo de ligando, incluidos ligandos naturales, moléculas pequeñas, así como productos biológicos; con ligandos ortostéricos y moduladores alostéricos; con compuestos individuales, así como bibliotecas de compuestos; con compuestos principales o fragmentos; etc.

[0059] Un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación particularmente preferido que se dirige contra, y/o se une específicamente a, un receptor muscarínico, más específicamente M2R, tal como se describe en el presente documento, es un mimético de proteína G. El término "mimético de proteína G", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente aglutinante que, al unirse a un receptor muscarínico, aumenta la afinidad del receptor por agonistas ortostéricos o alostéricos, en una extensión similar a la unión de la proteína G natural al receptor muscarínico. Preferiblemente, un agente aglutinante que es un mimético de proteína G ocupará el sitio de unión de proteína G de un receptor muscarínico.

[0060] También se entenderá que el receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente el M2R, al que se unirán los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento, puede ser un receptor natural o no natural (es decir, alterado por el hombre) (tal como se define en el presente documento). En particular, las variantes polimórficas de tipo salvaje y las isoformas del receptor de acetilcolina muscarínico, así como los ortólogos en diferentes especies, son ejemplos de proteínas naturales y se encuentran, por ejemplo, y sin limitación, en un mamífero, más específicamente en un ser humano, o en un virus, o en una planta, o en un insecto, entre otros. Dichos receptores se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, un "receptor de acetilcolina muscarínico humano M2" tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a (por ejemplo, al menos un 95 % o al menos un 98 % idéntica a) el "receptor de acetilcolina muscarínico humano m2" de origen natural con número de acceso a Genbank AAA51570.1. Los receptores de acetilcolina muscarínicos de tipo salvaje que han sido mutados y otras variantes de los receptores de acetilcolina muscarínicos naturales son ejemplos de proteínas no naturales. Los ejemplos no limitantes de receptores de acetilcolina muscarínicos que no se producen de forma natural incluyen, entre otros, receptores de acetilcolina muscarínicos que se han hecho constitutivamente activos mediante mutación, receptores de acetilcolina muscarínicos con una deleción de bucle, receptores de acetilcolina muscarínicos con una deleción en los terminales N y/o C, receptores de acetilcolina muscarínicos con una sustitución, una inserción o adición, o cualquier combinación de los mismos, en relación con su secuencia de aminoácidos o nucleótidos, u otras variantes de receptores de acetilcolina muscarínicos de origen natural. También están comprendidos dentro del alcance de la presente divulgación los receptores de acetilcolina muscarínicos que comprenden una estructura quimérica o híbrida, por ejemplo, un receptor de acetilcolina muscarínico quimérico con un terminal N y/o C de un receptor de acetilcolina muscarínico y bucles de un segundo receptor de acetilcolina muscarínico, o que comprende un receptor de acetilcolina muscarínico fusionado a fracciones, tales como lisozima T4, flavodoxina, xilanasa, rubredoxina o citocromo b como una utilidad en la cristalización de GPCR (Chun et al. 2012 y también descrito en las solicitudes de patente WO2012/158555, WO2012/030735, WO2012/148586). De acuerdo con ejemplos específicos dentro del alcance de la presente divulgación, un receptor de acetilcolina muscarínico de origen no natural, en particular M2R, puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 80 % idéntica, al menos un 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica o al menos un 99 % idéntica a un receptor correspondiente de acetilcolina muscarínico de origen natural.

[0061] Por lo tanto, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación preferiblemente es capaz de reconocer tanto un receptor de acetilcolina muscarínico de origen natural como uno de origen no natural, en particular M2R. Esto puede ser particularmente beneficioso en ciertas circunstancias, y dependiendo del propósito o aplicación. Por ejemplo, y solo con fines ilustrativos, para aumentar la probabilidad de obtener cristales del receptor de acetilcolina muscarínico estabilizado en una conformación particular habilitada por los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento, puede desearse realizar una ingeniería de proteínas sin efecto o solo con efecto mínimo sobre la conformación (por ejemplo, conformación activa con mayor afinidad por los agonistas). O, de forma alternativa o adicional, para aumentar los niveles de expresión celular de un receptor de acetilcolina muscarínico, o para aumentar la estabilidad, también se podría considerar introducir ciertas mutaciones en el receptor de interés.

[0062] El término "agente aglutinante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la totalidad o a parte de una molécula proteica (proteína, similar a proteína o que contiene proteína) que es capaz de unirse usando interacciones intermoleculares específicas a un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R. En particular, el término "agente aglutinante" no pretende incluir un ligando de origen natural del receptor de acetilcolina muscarínico, tal como una proteína G, una arrestina, un ligando endógeno; o variantes o derivados (incluyendo fragmentos) de los mismos. Más específicamente, el término "agente aglutinante" se refiere a un polipéptido, más particularmente un dominio proteico. Un dominio proteico adecuado es un elemento de la estructura proteica global que se autoestabiliza y se pliega independientemente del resto de la cadena proteica y a menudo se denomina "dominio de unión". Dichos dominios de unión varían en longitud desde aproximadamente 25 aminoácidos hasta 500 aminoácidos y más. Muchos dominios de unión pueden clasificarse en pliegues y son estructuras tridimensionales reconocibles e identificables. Algunos pliegues son tan comunes en muchas proteínas diferentes que reciben nombres especiales. Ejemplos no limitantes son los dominios de unión seleccionados de un paquete de 3 o 4 hélices, un dominio de repeticiones de armadillo, un dominio de repetición rico en leucina, un dominio PDZ, un dominio SUMO o similar a SUMO, un dominio de cadherina, un dominio de tipo inmunoglobulina, un dominio de unión a fosfotirosina, un dominio de homología a la pleckstrina, un dominio 2 de homología a src, entre otros. Por lo tanto, un dominio de unión puede derivarse de una molécula de origen natural, p. ej., de componentes del sistema inmunitario innato o adaptativo, o puede ser completamente diseñado de manera artificial.

[0063] En general, un dominio de unión puede estar basado en inmunoglobulina o puede estar basado en dominios presentes en proteínas, que incluyen, pero se limitan a, proteínas microbianas, inhibidores de proteasas, toxinas, fibronectina, lipocalinas, proteínas superenrolladas antiparalelas de cadena simple o proteínas con motivos repetidos. Los ejemplos particulares de dominios de unión que se conocen en la técnica incluyen, entre otros: anticuerpos, anticuerpos de cadena pesada (hcAb), anticuerpos de dominio único (sdAb), minianticuerpos, el dominio variable derivado de anticuerpos de cadena pesada de camélidos (VHH o nanoanticuerpos), el dominio variable de los nuevos receptores de antígenos derivados de los anticuerpos de tiburón (VNAR), alfa anticuerpos, proteína A, proteína G, dominios de repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins), repeticiones de fibronectina tipo III, anticalinas, knotinas, dominios CH2 diseñados (nanoanticuerpos) , dominios SH3 diseñados, aficuerpos, péptidos y proteínas, lipopéptidos (p. ej., pepducinas) (véase, p. ej., Gebauer y Skerra, 2009; Skerra, 2000; Starovasnik et al., 1997; Binz et al., 2004; Koide et al., 1998; Dimitrov, 2009; Nygren et al. 2008; WO2010066740). Con frecuencia, cuando se genera un tipo particular de dominio de unión usando métodos de selección, se usan bibliotecas combinatorias que comprenden una secuencia consenso o marco que contiene residuos de interacción potencial aleatorios para seleccionar la unión a una molécula de interés, p. ej., una proteína.

[0064] Se prevé particularmente que el agente aglutinante descrito en el presente documento se derive de un sistema inmunitario innato o adaptativo. Preferiblemente, dicho agente aglutinante se deriva de una inmunoglobulina. Preferiblemente, el agente aglutinante descrito en el presente documento se deriva de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El término "anticuerpo" (Ab) se refiere generalmente a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina, o un fragmento funcional del mismo, que se une y reconoce específicamente un antígeno, y es conocido por el experto en la técnica. Se pretende que un anticuerpo incluya una inmunoglobulina convencional de cuatro cadenas, que comprende dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par con una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50 kDa). Típicamente, en las inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) interactúan para formar un sitio de unión a antígeno. El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos completos, incluidos anticuerpos completos de cadena sencilla y fragmentos de unión a antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno que incluyen, entre otros, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv (dsFv) enlazados por disulfuro y fragmentos que comprenden o consisten en un dominio VL o VH, y cualquier combinación de ellos o cualquier otra porción funcional de un péptido de inmunoglobulina capaz de unirse al antígeno diana. El término "anticuerpos" también pretende incluir anticuerpos de cadena pesada, o fragmentos de los mismos, que incluyen dominios variables individuales de inmunoglobulina, tal como se define adicionalmente en el presente documento.

[0065] El término "dominio variable individual de inmunoglobulina" define moléculas en las que el sitio de unión al antígeno está presente y formado por un dominio de inmunoglobulina individual (que es diferente de las inmunoglobulinas convencionales o sus fragmentos, en donde típicamente dos dominios variables de inmunoglobulina interactúan para formar un sitio de unión al antígeno). Sin embargo, debe quedar claro que el término "dominio variable individual de inmunoglobulina" comprende fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en las que el sitio de unión al antígeno está formado por un dominio variable individual. Preferiblemente, el agente aglutinante dentro del alcance de la presente descripción es un dominio variable individual de inmunoglobulina.

[0066] Generalmente, un dominio variable individual de inmunoglobulina será una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (de FR1 a FR4) y 3 regiones determinantes complementarias (de CDR1 a CDR3), preferiblemente de acuerdo con la siguiente fórmula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1), o cualquier fragmento adecuado del mismo (que luego contendrá al menos algunos de los residuos de aminoácidos que forman al menos una de las regiones determinantes de complementariedad). Los dominios variables individuales de inmunoglobulina que comprenden 4 FR y 3 CDR son conocidos por el experto en la técnica y se han descrito, como un ejemplo no limitante, en Wesolowski et al. 2009. Ejemplos típicos, pero no limitantes, de dominios variables individuales de inmunoglobulina incluyen secuencias de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia de dominio VL) o un fragmento adecuado de las mismas, o secuencias de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia de dominio VH o secuencia de dominio VHH ) o un fragmento adecuado de las mismas, siempre que sea capaz de formar una unidad individual de unión a antígeno. Por lo tanto, el agente aglutinante es preferiblemente un dominio variable individual de inmunoglobulina que es una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia de dominio VL) o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia de dominio VH); más específicamente, el dominio variable individual de inmunoglobulina es una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo convencional de cuatro cadenas o una secuencia de dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada. El dominio variable individual de inmunoglobulina puede ser un anticuerpo de dominio, o un anticuerpo de dominio individual, o un "dAB" o dAb, o un nanoanticuerpo (como se define en este documento), u otro dominio variable individual de inmunoglobulina, o cualquier fragmento adecuado de cualquiera de los mismos. Para una descripción general de los anticuerpos de dominio individual, se hace referencia al siguiente libro: "Single domainantibodies", Methods in Molecular Biology, Eds. Saerens y Muyldermans, 2012, Vol 911. Los dominios variables individuales de inmunoglobulina generalmente comprenden una cadena de aminoácidos única que puede considerarse que comprende 4 "secuencias marco" o FR y 3 "regiones determinantes complementarias" o CDR (como se ha definido en este documento anteriormente). Debe quedar claro que las regiones marco de los dominios variables individuales de inmunoglobulina también pueden contribuir a la unión de sus antígenos (Desmyter et al. 2002; Korotkov et al.

2009). La delineación de las secuencias CDR (y, por lo tanto, también las secuencias FR) puede basarse en el sistema de numeración único IMGT para dominios V y dominios similares a V (Lefranc et al. 2003).

Alternativamente, la delineación de las secuencias FR y CDR se puede hacer usando el sistema de numeración de Kabat tal como se aplica a los dominios VHH de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans (2000).

[0067] Debe observarse que los dominios variables individuales de inmunoglobulina como agente aglutinante en su sentido más amplio no se limitan a una fuente biológica específica o a un método específico de preparación. El término "dominio variable individual" de inmunoglobulina" abarca dominios variables de diferente origen, que comprenden dominios variables de ratón, rata, conejo, burro, humano, tiburón y camélido. Por ejemplo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden derivarse de anticuerpos de tiburón (los denominados nuevos receptores de antígeno de inmunoglobulina o IgNAR), más específicamente de anticuerpos de tiburón de cadena pesada de origen natural, desprovistos de cadenas ligeras, y se conocen como secuencias de dominio VNAR. Preferiblemente, los dominios variables individuales de inmunoglobulina se derivan de anticuerpos de camélidos. Más preferiblemente, los dominios variables individuales de inmunoglobulina se derivan de anticuerpos de camélidos de cadena pesada de origen natural, desprovistos de cadenas ligeras, y se conocen como secuencias de dominio VHH o nanoanticuerpos.

[0068] Preferiblemente, el agente aglutinante descrito en el presente documento es un dominio variable individual de inmunoglobulina que es un nanoanticuerpo (tal como se define adicionalmente en el presente documento, e incluye entre otros un VHH). El término "nanoanticuerpo" (Nb), tal como se usa en el presente documento, es un fragmento de unión a antígeno de dominio individual. En particular, se refiere a un dominio variable individual derivado de anticuerpos de cadena pesada de origen natural y es conocido por el experto en la técnica. Los nanoanticuerpos generalmente se derivan de anticuerpos solo de cadena pesada (desprovistos de cadenas ligeras) vistos en camélidos (Hamers-Casterman et al. 1993; Desmyter et al. 1996) y, en consecuencia, a menudo se les denomina anticuerpos VHH o secuencia VHH. Los camélidos comprenden los camélidos del viejo mundo (Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) y camélidos del nuevo mundo (por ejemplo Lama paceos, Lama glama, Lama guanicoe y Lama vicugna) nanoanticuerpo® y nanoanticuerpos® son marcas registradas de Ablynx NV (Bélgica). Para una descripción más detallada de los VHH o nanoanticuerpos, se hace referencia al libro "Single domain antibodies", Methods in MolecularBiology Eds. Saerens y Muyldermans, 2012, Vol 911, en particular al Capítulo de Vincke y Muyldermans (2012), así como a una lista no limitante de solicitudes de patentes, que se mencionan como antecedentes generales en la técnica e incluyen: WO 94/04678, WO 95/04079, WO 96/34103 de la Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1 134 231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 del Vlaams Institut voor Biotechnologie (VIB); WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825, por Ablynx N.V. y otras solicitudes de patentes publicadas por Ablynx N.V. Como sabrá el experto en la materia, los nanoanticuerpos se caracterizan particularmente por la presencia de uno o más "residuos distintivos" de Camelidae en una o más de las secuencias marco (según la numeración de Kabat), como se describe por ejemplo en WO 08/020079, en la página 75, Tabla A-3, incorporada aquí como referencia). Cabe señalar que los nanoanticuerpos, descritos aquí en su sentido más amplio, no se limitan a una fuente biológica específica o a un método específico de preparación. Por ejemplo, los nanoanticuerpos generalmente se pueden obtener: (1) aislando el dominio v Hh de un anticuerpo de cadena pesada de origen natural; (2) por expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VHH de origen natural; (3) por "humanización" de un dominio VHH de origen natural o por expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VHH humanizado; (4) mediante "camelización" de un dominio VH de origen natural de cualquier especie animal, y en particular de una especie de mamífero, p. ej., de un ser humano, o mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VH camelizado; (5) por "camelización" de un "anticuerpo de dominio" o "Dab" como se describe en la técnica, o por expresión de un ácido nucleico que codifica dicho dominio VH camelizado; (6) mediante el uso de técnicas sintéticas o semisintéticas para preparar proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos conocidas per se; (7) preparando un ácido nucleico que codifica un nanoanticuerpo utilizando técnicas para la síntesis de ácido nucleico conocidas per se, continuando con la expresión del ácido nucleico así obtenido; y/u (8) por cualquier combinación de uno o más de los anteriores. Se puede encontrar una descripción adicional de nanoanticuerpos, incluyendo la humanización y/o camelización de nanoanticuerpos, p. ej., en WO08/101985 y WO08/142164, así como en el presente documento más adelante. Una clase particular de nanoanticuerpos que se unen a epítopos conformacionales de dianas nativas se llama Xaperones y está particularmente contemplada aquí. Xaperone™ es una marca registrada de VIB y VUB (Bélgica). Un Xaperone™ es un anticuerpo de dominio individual de camélido que restringe las dianas del fármaco en una conformación susceptible a fármacos única y relevante para la enfermedad.

[0069] Dentro del alcance de la presente divulgación, el término "dominio variable individual de inmunoglobulina" también abarca dominios variables que están "humanizados" o "camelizados", en particular nanoanticuerpos que están "humanizados" o "camelizados". Por ejemplo, tanto la "humanización" como la "camelización" se pueden realizar proporcionando una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de origen natural VHH o VH respectivamente, y luego cambiando, de manera conocida per se, uno o más codones en dicha secuencia de nucleótidos de tal manera que la nueva secuencia de nucleótidos codifica un dominio variable individual de inmunoglobulina "humanizada" o "camelizada", respectivamente. Este ácido nucleico puede entonces expresarse de una manera conocida per se, para proporcionar los dominios variables individuales de inmunoglobulina deseados. Alternativamente, basándose en la secuencia de aminoácidos de un dominio de origen natural VHH o VH, respectivamente, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizada o camelizada deseados, respectivamente, puede diseñarse y luego sintetizarse de nuevo utilizando técnicas para la síntesis de péptidos conocidas per se. Además, en base a la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos de un dominio de origen natural VHH o VH, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios variables individuales de inmunoglobulina humanizada o camelizada, respectivamente, puede diseñarse y luego sintetizarse de nuevo utilizando técnicas para síntesis de ácido nucleico conocida per se, después de lo cual el ácido nucleico así obtenido puede expresarse de una manera conocida per se, para proporcionar los dominios variables individuales de inmunoglobulina deseados. Otros métodos y técnicas adecuados para obtener los dominios variables individuales de inmunoglobulina descritos en este documento y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, a partir de secuencias de origen natural VH o preferiblemente VHH, serán claros para los expertos, y pueden comprender, por ejemplo, combinar una o más partes de una o más secuencias VH de origen natural (p. ej., una o más secuencias FR y/o secuencias CDR), una o más partes de una o más secuencias VHH de origen natural (p. ej., una o más secuencias FR o secuencias CDR), y/o una o más secuencias sintéticas o semisintéticas, de manera adecuada, para proporcionar un nanoanticuerpo tal como se describe en el presente documento o una secuencia de nucleótidos o un ácido nucleico que codifica la misma.

[0070] La presente descripción abarca agentes aglutinantes conformacionalmente selectivos, en particular dominios variables individuales de inmunoglobulina conformacionalmente selectivos, dirigidos al receptor de acetilcolina muscarínico M2, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (de FR1 a FR4) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3), de acuerdo con la siguiente fórmula (1):

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1)

y donde CDR1 se elige del grupo que consiste en:

a) SEQ ID N.°: 31-41, 105-112,

(b) un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con las SEQ ID N.°: 31-41, 105­ 112,

c) un polipéptido que tiene una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácidos con las SEQ ID N.°: 31-41, 105-112, y donde CDR2 se elige del grupo que consiste en:

a) SEQ ID N.°: 53-63, 121-128,

(b) un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con las SEQ ID N.°: 53-63, 121­ 128,

c) un polipéptido que tiene una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácidos con las SEQ ID N.°: 53-63, 121-128, y donde CDR3 se elige del grupo que consiste en:

a) SEQ ID N.°: 75-85, 137-144,

(b) un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con las SEQ ID N.°: 75-85, 137­ 144,

c) un polipéptido que tiene una diferencia de 3, 2 o 1 aminoácidos con las SEQ ID N.°: 75-85, 137-144.

[0071] En particular, el dominio variable individual de inmunoglobulina selectiva en cuanto a conformación dirigido contra, y/o específicamente unido a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2 descrito en el presente documento puede ser un nanoanticuerpo o VHH, donde el nanoanticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 1-19 o variantes de las mismas. En particular, la presente descripción proporciona un dominio variable individual de inmunoglobulina que incluye una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR1 a FR4) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3), de acuerdo con la siguiente fórmula (1):

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1);

donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 31, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 53, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 75; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 32, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 54, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 76; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 33, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 55, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 77; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 34, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 56, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 78; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 35, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 57, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 79; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 36, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 58, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 80; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 37, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 59, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 81; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 38, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 60, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 82; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 39, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 61, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 83, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 40, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 62, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 84, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 41, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 63, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 85, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 105, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 121, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 137, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 106, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 122, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 138, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 107, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 123, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 139, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 108, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 124, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 140, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 109, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 125, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 141, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 110, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 126, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 142, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 111, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 127, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 143, o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 112, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 128, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 144.

[0072] Más preferiblemente, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación, en particular dominios variables individuales de inmunoglobulina, dirigidos contra, y/o que se unen específicamente a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2 tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 1-19. Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento pueden definirse por las SEQ ID N.°: 1-19.

[0073] En particular, ejemplos no limitantes de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación dirigidos contra, y/o que se unen específicamente a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2, que se caracterizan específicamente como miméticos de proteína G (tal como se ha definido aquí anteriormente) dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 1-11. Por lo tanto, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación dirigidos contra, y/o que se unen específicamente a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2, pueden tener una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 1-11. Preferiblemente, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en este documento pueden tener una secuencia de aminoácidos tal como se define en la SEQ ID N.°: 1. Ejemplos no limitantes de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación dirigidos contra, y/o que se unen específicamente a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2, que se caracterizan específicamente por unirse a un epítopo conformacional extracelular son dominios variables individuales de inmunoglobulina que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 12-19. Por lo tanto, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación dirigidos contra, y/o que se unen específicamente a, el receptor de acetilcolina muscarínico M2, pueden tener una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID N.°: 12-19.

[0074] También dentro del alcance de la divulgación se encuentran análogos, mutantes, variantes, alelos, partes o fragmentos naturales o sintéticos (denominados colectivamente en el presente documento como "variantes") de los dominios variables individuales de inmunoglobulina, en particular los nanoanticuerpos, tal como se definen en el presente documento, y en particular variantes de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de las s Eq ID N.°: 1-19 (ver Tablas 1-2). Generalmente, en tales variantes, uno o más residuos de aminoácidos pueden haber sido reemplazados, eliminados y/o añadidos, en comparación con los dominios variables individuales de inmunoglobulina tal como se define en el presente documento. Dichas sustituciones, inserciones o deleciones pueden realizarse en una o más de las FR y/o de las CDR, y en variantes particulares de las FR y CDR de los dominios variables individuales de inmunoglobulina de las SEQ ID N.°: 1-19 (ver Tablas 1-2). Las variantes, tal como se usan en el presente documento, son secuencias en las que cada una de las regiones marco y cada una de las regiones determinantes de complementariedad muestran al menos un 80 % de identidad, preferiblemente al menos un 85 % de identidad, más preferiblemente un 90 % de identidad, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad o, aún más preferiblemente un 99 % de identidad con la región correspondiente en la secuencia de referencia (es decir, FR1_variante frente a FR1_referencia, CDR1_variante frente a CDR1_referencia, FR2_variante frente a FR2_referencia, CDR2_variante frente a CDR2_referencia, FR3_variante frente a FR3_referencia, CDR3_variant frente a CDR3_referencia, FR4_variante frente a FR4_referencia), según puede medirse electrónicamente haciendo uso de algoritmos como PILEUP y BLAST (50, 51). El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http: //www/ncbi.nlm.nih.gov/). Se entenderá que para determinar el grado de identidad de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las CDR de una o más secuencias de los dominios variables individuales de inmunoglobulina, no se tienen en cuenta los residuos de aminoácidos que forman las regiones marco. De forma similar, para determinar el grado de identidad de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de las FR de una o más secuencias de los dominios variables individuales de inmunoglobulina descritos en el presente documento, no se tienen en cuenta los residuos de aminoácidos que forman las regiones de complementariedad. Dichas variantes de los dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden ser particularmente beneficiosas ya que pueden tener potencia/afinidad mejoradas.

[0075] Por medio de ejemplos no limitantes, una sustitución puede ser, por ejemplo, una sustitución conservadora (tal como se describe en el presente documento) y/o un residuo de aminoácido puede ser reemplazado por otro residuo de aminoácido que ocurre de manera natural en la misma posición en otro dominio VHH. Por lo tanto, cualesquiera sustituciones, deleciones o inserciones, o cualquier combinación de las mismas, que mejoran las propiedades de los dominios variables individuales de inmunoglobulina o que no restan valor a las propiedades deseadas o al equilibrio o la combinación de las propiedades deseadas del dominio variable individual de inmunoglobulina (es decir, en la medida en que los dominios variables individuales de inmunoglobulina ya no son adecuados para su uso previsto) se incluyen dentro del alcance de la divulgación. Una persona experta generalmente podrá determinar y seleccionar sustituciones, deleciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, basándose en la divulgación contenida en el presente documento y opcionalmente después de un grado limitado de experimentación de rutina, que puede implicar, por ejemplo, la introducción de un número limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia en las propiedades de los dominios variables individuales de inmunoglobulina así obtenidos.

[0076] También se incluye dentro del alcance de la presente divulgación los dominios variables individuales de inmunoglobulina que están en una forma "multivalente" y se forman enlazando, químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante, dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina monovalente. Los ejemplos no limitantes de construcciones multivalentes incluyen construcciones "bivalentes", construcciones "trivalentes", construcciones "tetravalentes", etc. Los dominios variables individuales de inmunoglobulina comprendidos dentro de una construcción multivalente pueden ser idénticos o diferentes. En otro ejemplo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina descritos aquí están en una forma "multiespecífica" y se forman uniendo dos o más dominios variables individuales de inmunoglobulina, de los cuales al menos uno tiene una especificidad diferente. Los ejemplos no limitantes de construcciones multiespecíficas incluyen construcciones "biespecíficas", construcciones "triespecíficas", construcciones "tetraespecíficas", etc. Para ilustrar esto en más profundidad, cualquier dominio variable individual de inmunoglobulina multivalente o multiespecífico (tal como se define en el presente documento) descrito en el presente documento puede dirigirse adecuadamente contra dos o más epítopos diferentes en el mismo antígeno, por ejemplo, contra dos o más epítopos diferentes del receptor de acetilcolina muscarínico M2; o puede dirigirse contra dos o más antígenos diferentes, por ejemplo, contra un epítopo del receptor de acetilcolina muscarínico M2 y un epítopo de un ligando de origen natural del receptor de acetilcolina muscarínico M2 (por ejemplo, proteína G, p-arrestina). En particular, un dominio variable individual de inmunoglobulina monovalente tal como se describe en el presente documento es aquel que se une al receptor diana con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, p. ej., menor de 500 pM. Los dominios variables individuales de inmunoglobulina multivalentes o multiespecíficos, tal como se describe en el presente documento, también pueden tener (o ser diseñados y/o seleccionados para) mayor avidez y/o selectividad mejorada para el receptor deseado, y/o para cualquier otra propiedad deseada o combinación de propiedades deseadas que puedan obtenerse mediante el uso de dichos dominios variables individuales de inmunoglobulina multivalentes o multiespecíficos. Dichos dominios de unión multivalentes o multiespecíficos también pueden tener (o ser diseñados y/o seleccionados para) una eficacia mejorada en la modulación de la actividad de señalización de un GPCR (véase también más adelante en este documento). Se apreciará que los dominios de unión multivalentes o multiespecíficos tal como se describe en el presente documento pueden además dirigirse adecuadamente a un antígeno diferente como, p. ej., entre otros, un ligando que interactúa con un receptor de acetilcolina muscarínico o una o varias proteínas de señalización aguas abajo.

[0077] Además, y dependiendo del organismo huésped usado para expresar el agente aglutinante tal como se describe en el presente documento, las deleciones y/o sustituciones dentro del agente aglutinante pueden diseñarse de tal manera que, p. ej., se eliminan uno o más sitios para la modificación postraduccional (por ejemplo, uno o más sitios de glucosilación), lo cual estará dentro de la capacidad del experto en la materia. Alternativamente, las sustituciones o inserciones pueden diseñarse con el fin de introducir uno o más sitios para la unión de grupos funcionales (tal como se describe más adelante en este documento).

[0078] También se espera que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación sea generalmente capaz de unirse a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes, fragmentos e isoformas de un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R que se producen de forma natural o sintética; o al menos a aquellos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes, fragmentos e isoformas de un receptor de acetilcolina muscarínico que contienen uno o varios determinantes antigénicos o epítopos que son esencialmente los mismos que los determinantes o epítopos antigénicos en los cuales los agentes aglutinantes, tal como se describe en el presente documento, se unen a un receptor de acetilcolina muscarínico.

[0079] También se proporciona aquí un complejo que comprende un receptor muscarínico, preferiblemente un receptor muscarínico M2, y un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que se dirige contra, y/o se une específicamente a, el receptor muscarínico. Como ejemplo no limitante, un complejo estable puede purificarse por cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo tal como se describió anteriormente puede comprender además al menos otro ligando del receptor selectivo en cuanto a conformación (tal como se define en el presente documento). Los ejemplos no limitantes de ligandos de receptores selectivos de conformación incluyen agonistas completos, agonistas parciales, agonistas inversos, ligandos de origen natural, moduladores alostéricos y similares. Para ilustrar esto más a fondo, sin el propósito de ser limitantes, los agonistas del receptor muscarínico M2 son conocidos en la técnica e incluyen xanomelina, oxotremorina, acetilcolina, carbacol, pilocarpina, furmetida y betanecol, entre otros. Los antagonistas del receptor muscarínico M2 son conocidos en la técnica e incluyen atropina, tripitramina, propantelina y escopolamina, entre otros. Los agonistas inversos del receptor muscarínico M2 son conocidos en la técnica e incluyen tolterodina, oxibutinina y darifenacina, entre otros. Los moduladores alostéricos del receptor muscarínico M2 son conocidos en la técnica e incluyen estaurosporina, vincamina, brucina y galamina, entre otros. Se pueden encontrar más ejemplos en la base de datos IUPHAR (http://www.iuphar-db.org/).

[0080] El agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y/o el complejo tal como se describe en el presente documento pueden estar en forma solubilizada, p. ej., en un detergente. Alternativamente, el agente de unión selectivo en cuanto a conformación y/o el complejo pueden inmovilizarse en un soporte sólido. Ejemplos no limitantes de soportes sólidos, así como métodos y técnicas para la inmovilización, se describen con más profundidad en la descripción detallada. En otro ejemplo adicional, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y/o complejo tal como se describe en el presente documento está en una composición celular, que incluye un organismo, un tejido, una célula, o una línea celular, o en una composición de membrana o una composición liposomal derivadas de dicho organismo, tejido, célula o línea celular. Los ejemplos de composiciones de membrana o liposomales incluyen, entre otros, orgánulos, preparados de membrana, virus, lipopartículas semejantes a virus y similares. Se apreciará que una composición celular o una composición de membrana o liposomal pueden comprender lípidos naturales o sintéticos. El complejo puede ser cristalino. Por lo tanto, también se proporciona un cristal del complejo, así como métodos para hacer dicho cristal, que se describen con mayor detalle a continuación. Preferiblemente, se prevé una forma cristalina de un complejo tal como se describe en este documento y un ligando del receptor.

Cribado y selección de agentes aglutinantes conformacionalmente selectivos contra receptores de acetilcolina muscarínicos

[0081] Los agentes de unión selectivos en cuanto a conformación, en particular los dominios variables individuales de inmunoglobulina se pueden identificar de varias formas, y se ilustrarán a continuación de manera no limitante para los VHH. Aunque las bibliotecas no inmunes o sintéticas de VHH (para obtener ejemplos de dichas bibliotecas, ver WO9937681, WO0043507, WO0190190, WO03025020 y WO03035694) pueden contener ligantes conformacionales contra un receptor muscarínico en una conformación funcional, un ejemplo preferido incluye la inmunización de un Camelidae con un receptor muscarínico en una conformación funcional, unida opcionalmente a un ligando del receptor, para exponer el sistema inmunitario del animal con los epítopos conformacionales que son únicos para el receptor en esa conformación particular (por ejemplo, receptor muscarínico unido a agonista para generar anticuerpos dirigidos contra el receptor en su estado conformacional activo). Opcionalmente, un ligando particular se puede acoplar al receptor de interés mediante reticulación química. Por lo tanto, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, tales secuencias de VHH pueden generarse u obtenerse preferiblemente inmunizando adecuadamente una especie de camélido con un receptor muscarínico, preferiblemente un receptor en un estado conformacional funcional (es decir, para generar una respuesta inmune y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra dicho receptor), obteniendo una muestra biológica adecuada de dicho camélido (p. ej., una muestra de sangre, o cualquier muestra de células B) y generando secuencias VHH dirigidas contra dicho receptor, comenzando desde dicha muestra. Dichas técnicas serán evidentes para los expertos. Otra técnica más para obtener las secuencias VHH deseadas implica inmunizar adecuadamente a un mamífero transgénico que es capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir, con el fin de generar una respuesta inmune y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra un receptor muscarínico en un estado conformacional funcional), obtener una muestra biológica adecuada de dicho mamífero transgénico (p. ej., una muestra de sangre, o cualquier muestra de células B), y luego generar secuencias VHH dirigidas contra dicho receptor a partir de dicha muestra, usando cualquier técnica adecuada conocida per se. Por ejemplo, para este fin se pueden usar los ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los métodos y técnicas adicionales descritos en WO02085945 y en WO04049794.

[0082] Para la inmunización de un animal con un receptor de acetilcolina muscarínico, el receptor puede producirse y purificarse utilizando métodos convencionales que pueden emplear la expresión de una forma recombinante de la proteína en una célula huésped y purificando la proteína mediante cromatografía de afinidad y/o métodos basados en anticuerpos. El sistema de baculovirus/Sf-9 puede emplearse para la expresión, aunque también pueden usarse otros sistemas de expresión (por ejemplo, sistemas de células bacterianas, de levadura o de mamífero). Los ejemplos de métodos para expresar y purificar GPCR como el receptor de acetilcolina muscarínico se describen, por ejemplo, en Kobilka (1995), Eroglu et al. (2002), Chelikani et al. (2006) y en el libro "Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors" (Kevin R. Lynch (Ed.), 1998), entre muchos otros. Un GPCR, como, por ejemplo, un receptor de acetilcolina muscarínico también puede reconstituirse en vesículas de fosfolípidos. Del mismo modo, se conocen métodos para reconstituir un GPCR activo en vesículas de fosfolípidos, y se describen en: Luca et al. (2003), Mansoor et al. (2006), Niu et al. (2005), Shimada et al. (2002) y Eroglu et al. (2003), entre otros. En ciertos casos, el GPCR y los fosfolípidos pueden reconstituirse a alta densidad (por ejemplo, 1 mg de receptor por mg de fosfolípido). Las vesículas de fosfolípidos pueden analizarse para confirmar que el GPCR está activo. En muchos casos, un GPCR puede estar presente en la vesícula de fosfolípidos en ambas orientaciones (en la orientación normal y en la orientación "invertida" en la que los bucles intracelulares están en el exterior de la vesícula). Otros métodos de inmunización incluyen, sin limitación, el uso de células completas que expresan un receptor de acetilcolina muscarínico o fracciones del mismo, la vacunación con una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de acetilcolina muscarínico (por ejemplo, vacunas de ADN), inmunización con virus o partículas similares a virus que expresan un receptor de acetilcolina muscarínica, entre otros (por ejemplo, tal como se describe en WO2010070145, WO2011083141).

[0083] Cualquier animal adecuado, en particular mamíferos tales como un conejo, un ratón, una rata, un camello, una oveja, una vaca, un cerdo, entre otros, o aves tales como un pollo o un pavo, o peces, como el tiburón, puede inmunizarse utilizando cualquiera de las técnicas bien conocidas en la técnica adecuadas para generar una respuesta inmune.

[0084] La selección de VHH o nanoanticuerpos, como ejemplo no limitante, que se une específicamente a un epítopo conformacional de un estado conformacional funcional de un receptor muscarínico puede realizarse, por ejemplo, mediante el cribado de un conjunto, colección o biblioteca de células que expresan los anticuerpos de cadena pesada en su superficie (p. ej., células B obtenidas de un camélido inmunizado adecuadamente), o bacteriófagos que muestran una fusión del genlll y nanoanticuerpos en su superficie, o células de levadura que muestran una fusión de la proteína del factor de apareamiento Aga2p, mediante el cribado de una biblioteca (no inmune o inmune) de secuencias de VHH o secuencias de nanoanticuerpo, o mediante el cribado de una biblioteca (no inmune o inmune) de secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de VHH o secuencias de nanoanticuerpos, que pueden realizarse de una manera conocida per se, y cuyo método opcionalmente puede comprender además uno o varios de los otros pasos adecuados, tales como, por ejemplo y sin limitación, un paso de maduración de afinidad, un paso para expresar la secuencia de aminoácidos deseada, un paso de cribado para la unión y/o la actividad contra el antígeno deseado (en este caso, el receptor muscarínico en una conformación particular), un paso para determinar la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos deseada, un paso para introducir una o más sustituciones humanizantes, un paso para dar un formato multivalente y/o multiespecífico adecuado, un paso de comprobación de las propiedades biológicas y/o fisiológicas deseadas (es decir usando un ensayo adecuado conocido en la técnica) y/o cualquier combinación de uno o varios de dichos pasos, en cualquier orden adecuado.

[0085] Se pueden usar varios métodos para determinar la unión específica (tal como se ha definido en el presente documento anteriormente) entre el agente aglutinante y un receptor muscarínico diana, que incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), citometría de flujo, ensayos de unión a radioligandos, ensayos de resonancia de plasmones de superficie, despliegue en fagos y similares, que son una práctica común en la técnica, por ejemplo, tal como se muestra en Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, y se ilustran en más detalle en la sección de ejemplos. Se apreciará que para este propósito a menudo se usará una etiqueta o marcador único, por ejemplo, un marcador de péptido, un marcador de ácido nucleico, un marcador químico, un marcador fluorescente o un marcador de radioisótopos, tal como se describe más adelante en este documento.

[0086] Una forma particularmente preferida de seleccionar agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación es la descrita, por ejemplo, en WO 2012/007593. En un ejemplo alternativo, la selección de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación también se puede realizar utilizando la clasificación celular para seleccionar, de una población de células que comprende una biblioteca de agentes aglutinantes extracelulares conectados a la superficie celular, células que se unen específicamente al receptor muscarínico, o bien en su conformación activa, o bien en su conformación inactiva, pero no en ambas. Sin el propósito de ser limitante, la selección de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación también se ilustra adicionalmente en la sección de ejemplos.

Modificaciones de los agentes aglutinantes conformacionalmente selectivos

[0087] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento pueden modificarse adicionalmente y/o pueden comprender (o pueden fusionarse a) otras fracciones, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Los ejemplos de modificaciones, así como los ejemplos de residuos de aminoácidos dentro del agente aglutinante descrito en el presente documento que pueden modificarse (es decir, ya sea en el esqueleto de la proteína o preferiblemente en una cadena lateral), los métodos y técnicas que pueden usarse para introducir dichas modificaciones y los posibles usos y ventajas de dichas modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, dicha modificación puede implicar la introducción (p. ej., mediante enlace covalente o de otra manera adecuada) de uno o varios grupos funcionales, residuos o fracciones dentro o sobre el agente aglutinante. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos serán claros para los expertos, y generalmente pueden incluir todos los grupos funcionales y técnicas mencionados en la técnica, así como los grupos funcionales y técnicas conocidos per se para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluidos ScFv y anticuerpos de dominio individual), para los que se hace referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Dichos grupos funcionales pueden, por ejemplo, estar enlazados directamente (p. ej., de manera covalente) al agente aglutinante, u opcionalmente a través de un enlazador o espaciador adecuados, como quedará claro nuevamente para los expertos.

[0088] Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para aumentar la vida media y/o reducir la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, como el poli(etilenglicol) (PEG) o sus derivados (como el metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, se puede usar cualquier forma adecuada de pegilación, como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (incluyendo, entre otros, anticuerpos de dominio (individual) y ScFv); se hace referencia, por ejemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); por Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en WO04060965. Varios reactivos para la pegilación de proteínas también están disponibles comercialmente, por ejemplo en Nektar Therapeutics, USA. Preferiblemente, se usa la pegilación dirigida, en particular a través de un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, para este propósito, el PEG puede estar unido a un residuo de cisteína de origen natural en un agente aglutinante, o el agente aglutinante puede modificarse para introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o varios residuos de cisteína para la unión de PEG puede fusionarse a los terminales N y/o C de un agente aglutinante, todo ello utilizando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas per se por los expertos. Preferiblemente, para los agentes aglutinantes descritos en el presente documento, se puede usar un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como de más de 10000 y menos de 200 000, tal como de menos de 100000; por ejemplo en el rango de 20000-80000. Otra modificación, generalmente menos preferida, comprende la glucosilación ligada a N o ligada a O, generalmente como parte de una modificación cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar el polipéptido o dominio variable individual de inmunoglobulina. Otra técnica para aumentar la vida media de un agente aglutinante puede comprender la ingeniería hacia constructos bifuncionales (por ejemplo, un nanoanticuerpo contra el M2R diana y otro contra una proteína sérica como la albúmina) o en fusiones de agentes aglutinantes con péptidos (por ejemplo, un péptido contra una proteína sérica como la albúmina).

[0089] Una modificación generalmente menos preferida comprende la glucosilación ligada a N o ligada a O, generalmente como parte de una modificación cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar el agente aglutinante descrito en el presente documento.

[0090] Otra modificación más puede comprender la introducción de uno o varios marcadores detectables u otros grupos o fracciones generadoras de señal, dependiendo del uso pretendido del agente aglutinante marcado. Los marcadores y técnicas adecuados para unirlos, usarlos y detectarlos serán claros para los expertos y, por ejemplo, incluyen, entre otros, marcadores fluorescentes (como IRDye800, VivoTag800, fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído, y fluorescamina y metales fluorescentes como Eu u otros metales de la serie de los lantánidos), marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminiscentes o marcadores bioluminiscentes (como luminol, isoluminol, éster de acridinio aromático, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, dioxetano o GFP y sus análogos), radioisótopos, metales, quelatos metálicos o cationes metálicos u otros metales o cationes metálicos que son particularmente adecuados para su uso en diagnóstico e imagen in vivo, in vitro o in situ, así como cromóforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfaglicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotina avidina peroxidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa). Otros marcadores adecuados serán claros para los expertos y, por ejemplo, incluyen fracciones que pueden detectarse usando espectroscopía de RMN o de ESR. Dichos agentes aglutinantes marcados de la divulgación pueden usarse, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos per se tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos sandwich", etc.) así como para fines de diagnóstico e imagen in vivo, según la elección del marcador específico. Como quedará claro para los expertos, otra modificación puede implicar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo, para quelar uno de los metales o cationes metálicos mencionados anteriormente. Los grupos quelantes adecuados, por ejemplo, incluyen, entre otros, ácido 2,2',2"-(10-(2 -((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil) triacético (DOTA), ácido 2,2'-(7-(2 -((2,5-dioxopirrolidin-1-il) oxi)-2-oxoetil)-1,4,7-triazonano-1,4-diil) diacético (NOTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Otra modificación puede incluir la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específico, tal como el par de unión de biotina-(estrept)avidina. Este grupo funcional puede usarse para unir el agente aglutinante a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que está unido a la otra mitad del par de unión, es decir, a través de formación del par de unión. Por ejemplo, un agente de unión tal como se describe en el presente documento puede conjugarse con biotina, y unirse a otra proteína, polipéptido, compuesto o vehículo conjugados con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, dicho agente aglutinante conjugado puede usarse como reportero, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico donde un agente productor de señal detectable se conjuga con avidina o estreptavidina. Dichos pares de unión también pueden usarse, por ejemplo, para unir el agente aglutinante descrito en el presente documento a un vehículo, incluidos los vehículos adecuados para fines farmacéuticos. Un ejemplo no limitante son las formulaciones liposomales descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Dichos pares de unión también pueden usarse para unir un agente terapéuticamente activo al agente aglutinante descrito en el presente documento.

[0091] En caso de que los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación se modifiquen enlazando grupos funcionales particulares, residuos o fracciones (como se ha descrito anteriormente) al agente aglutinante, entonces a menudo se usarán moléculas enlazantes. Las "moléculas enlazadoras" o "enlazadores" preferidos son péptidos de 1 a 200 aminoácidos de longitud, y típicamente, pero no necesariamente, se eligen o diseñan para no estar estructurados y ser flexibles. Por ejemplo, se pueden elegir aminoácidos que no forman una estructura secundaria particular. O, se pueden elegir aminoácidos para que no formen una estructura terciaria estable. O, los enlazadores de aminoácidos pueden formar una "random coil". Dichos enlazadores incluyen, entre otros, péptidos sintéticos ricos en Gly, Ser, Thr, Gin, Glu u otros aminoácidos que se asocian frecuentemente con regiones no estructuradas en proteínas naturales (Dosztányi, Z., Csizmok, V., Tompa, P. y Simon, I. (2005). IUPred: servidor web para la predicción de regiones intrínsecamente no estructuradas de proteínas basada en el contenido de energía estimado. Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 21 (16), 3433-4.). Los ejemplos no limitantes de secuencias enlazadoras adecuadas incluyen los enlazadores (GS)5 (GSGSGSGSGS; SEQ ID N.°: 156), (GS)10 (GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS; SEQ ID N.°: 157), (G4S)3 (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID N.°: 158) , bisagra de IgG2 de llama (AHHSEDPSSKAPKAPMA; SEQ ID N.°: 159) o bisagra de IgA humana (SPSTPPTPSPSTPPAS; SEQ ID N.°: 160).

[0092] Por lo tanto, la secuencia enlazadora de aminoácidos (AA) puede ser un péptido de entre 0 y 200 AA, entre 0 y 150 AA, entre 0 y 100 AA, entre 0 y 90 AA, entre 0 y 80 AA, entre 0 y 70 AA , entre 0 y 60 AA, entre 0 y 50 AA, entre 0 y 40 AA, entre 0 y 30 AA, entre 0 y 20 AA, entre 0 y 10 AA, entre 0 y 5 AA. Los ejemplos de secuencias enlazadoras cortas incluyen, entre otros, PPP, PP o GS.

[0093] Para ciertas aplicaciones, puede ser ventajoso que la molécula enlazadora comprenda o conste de uno o más motivos de secuencia particulares. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de escisión proteolítica en la molécula de enlace de manera que se puedan liberar el marcador o la fracción detectables. Los sitios de escisión útiles son conocidos en la técnica e incluyen sitios de escisión de proteasa tales como el sitio de escisión de Factor Xa que tiene la secuencia IEGR (SEq ID N.°: 161), el sitio de escisión de trombina que tiene la secuencia LVPR (S^eQ ID N.°: 162), el sitio de escisión de enteroquinasa que tiene la secuencia DD^d D^k (SEQ ID N.°: 163), o el sitio de escisión de PreScission LEVLFQGP (SEQ Id N.°: 164 ).

[0094] Alternativamente, en caso de que el agente aglutinante esté enlazado a un marcador o fracción detectable usando métodos quimioenzimáticos para la modificación de proteínas, la fracción enlazadora puede existir en diferentes entidades químicas, dependiendo de las enzimas o la química sintética que se usa para producir la molécula acoplada covalentemente en vivo o in vitro (revisado en: Rabuka 2010, Curr Opin Chem Biol 14: 790­ 796).

Sistemas de expresión

[0095] La divulgación también se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación tal como se describe anteriormente en el presente documento. Además, la presente divulgación también prevé vectores de expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento, así como células huésped que expresan dichos vectores de expresión. Los sistemas de expresión adecuados incluyen sistemas de expresión constitutivos e inducibles en bacterias o levaduras, sistemas de expresión de virus, tales como baculovirus, virus del bosque semliki y lentivirus, o transfección transitoria en células de insectos o mamíferos. La clonación y/o expresión de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en este documento se puede realizar de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

[0096] La "célula huésped" según la presente divulgación puede ser de cualquier organismo procariota o eucariota. Preferiblemente, la célula huésped es una célula eucariota y puede pertenecer a cualquier organismo eucariota, pero en ejemplos particulares se prevén células de levadura, plantas, mamíferos e insectos. La naturaleza de las células utilizadas dependerá típicamente de la facilidad y el coste de producir el agente aglutinante, las propiedades de glucosilación deseadas, el origen del agente aglutinante, la aplicación prevista o cualquier combinación de los mismos.

[0097] Las células de mamífero pueden usarse, por ejemplo, para lograr la glucosilación compleja, pero puede no ser rentable producir proteínas en sistemas celulares de mamífero. Las células de plantas e insectos, así como la levadura, generalmente alcanzan altos niveles de producción y son más rentables, pero pueden ser necesarias modificaciones adicionales para imitar los patrones complejos de glucosilación de las proteínas de los mamíferos. Las células de levadura a menudo se usan para la expresión de proteínas porque pueden cultivarse de manera económica, dar altos rendimientos de proteína y, cuando se modifican adecuadamente, son capaces de producir proteínas que tienen patrones de glucosilación adecuados. Además, la levadura ofrece una genética establecida que permite transformaciones rápidas, estrategias probadas de localización de proteínas y técnicas fáciles de desactivación génica. Las células de insecto también son un sistema atractivo para expresar los GPCR que incluyen receptores muscarínicos porque las células de insecto ofrecen un sistema de expresión sin interferencia de los GPCR y con un conjunto limitado de proteínas G. Las células o líneas celulares eucariotas para la producción de proteínas son bien conocidas en la técnica, incluyendo las líneas celulares con vías de glucosilación modificadas, y se proporcionarán ejemplos no limitantes a continuación.

[0098] Las células huésped de animales o mamíferos adecuadas para albergar, expresar y producir proteínas para su posterior aislamiento y/o purificación incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), tales como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986; Kolkekar et al., 1997), CHO-K1 línea celular Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), CHO clon 13 (GEIMG, Génova, IT), CHO clon B (GEIMG, Génova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), RR-CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), células CHO dihidrofolato reductasa negativas (CHO/-DHFR, Urlaub y Chasin, 1980) y células dp12.CHO (Pat. EE. UU. N.° 5.721.121); células CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651); células de riñón embrionario humano (por ejemplo, células 293, o células 293T, o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59, o células GnTI KO HEK293S, Reeves et al. 2002); células renales de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL-10); células renales de mono (CV1, ATCC CCL-70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC Cc L-81); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmón humano (W138, At Cc CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células tumorales mamarias de ratón (MMT 060562, ATCC CCL-51); células de hepáticas de rata búfalo (b Rl 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982); células MCR 5; células FS4. Por ejemplo, las células pueden ser células de mamífero seleccionadas de células Hek293 o células COS.

[0099] Los ejemplos de líneas celulares no mamíferas incluyen, entre otras, células de insectos, tales como células Sf9/sistemas de expresión de baculovirus (por ejemplo, revisión Jarvis, Virology Volume 310, número 1, 25 de mayo de 2003, páginas 1-7), células vegetales tales como células de tabaco, células de tomate, células de maíz, células de algas o levaduras como especies de Saccharomyces, especies de Schizosaccharomyces, especies de Hansenula, especies de Yarrowia o especies de Pichia. Por ejemplo, las células eucariotas pueden ser células de levadura de una especie de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), una especie de Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe), una especie de Hansenula (por ejemplo, Hansenula polymorpha), una especie de Yarrowia (por ejemplo, Yarrowia lipolytica), una especie de Kluyveromyces (por ejemplo, Kluyveromyces lactis), una especie de Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris) o una especie de Komagataella (por ejemplo, Komagataella pastoris). Por ejemplo, las células eucariotas pueden ser células de Pichia, y más particularmente células de Pichia pastoris.

[0100] La transfección de células diana (por ejemplo, células de mamífero) se puede llevar a cabo siguiendo los principios descritos por Sambrook y Russel (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición , volumen 3, capítulo 16, sección 16.1-16.54). Además, la transducción vírica también se puede realizar utilizando reactivos tales como vectores adenovirales. La selección del sistema de vector vírico, las regiones reguladoras y la célula huésped apropiados es de conocimiento común dentro del nivel de habilidad ordinaria en la técnica. Las células transfectadas resultantes se mantienen en cultivo o se congelan para su uso posterior de acuerdo con las prácticas estándar.

[0101] Por consiguiente, otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para producir un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento, que comprende al menos los pasos de:

a) Expresar en un sistema de expresión celular adecuado (como se ha definido anteriormente) un ácido nucleico que codifica un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento y, opcionalmente

b) Aislar y/o purificar dicho agente aglutinante.

[0102] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos anteriormente, así como los complejos que los comprenden, son particularmente útiles para el cribado y el descubrimiento de fármacos (en su sentido más amplio), lo cual se detalla en más profundidad en este documento.

Aplicaciones

[0103] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento pueden usarse en una variedad de contextos y aplicaciones, por ejemplo y sin limitación, (1) para capturar y/o purificar un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R, por lo que al unirse, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación mantiene el receptor en una conformación particular; (2) para estudios de cocristalización y análisis estructural de alta resolución de un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R, en complejo con el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, y opcionalmente unido adicionalmente a otro ligando del receptor selectivo en cuanto a conformación; (3) para el cribado de ligandos y el descubrimiento de fármacos (basados en la estructura); (4) como terapia y/o diagnóstico, todo lo cual se describirá con más detalle a continuación.

Métodos de captura, separación y purificación para el receptor de acetilcolina muscarínico en una conformación funcional

[0104] La divulgación proporciona además un método para capturar y/o purificar un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R, en una conformación funcional haciendo uso de cualquiera de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos anteriormente. La captura y/o purificación de un receptor en una conformación funcional permitirá la posterior cristalización, caracterización de ligandos y cribado de compuestos, e inmunizaciones, entre otras cosas.

[0105] Por lo tanto, la descripción se refiere al uso de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento para capturar un receptor de acetilcolina muscarínico en una conformación activa o inactiva. De manera opcional, pero no necesariamente, la captura de un receptor en una conformación particular tal como se ha descrito anteriormente puede incluir la captura de un receptor en complejo con otro ligando del receptor selectivo en cuanto a conformación (por ejemplo, un ligando ortostérico, un ligando alostérico, un ligando natural como, p. ej., una proteína G o una arrestina, y similares).

[0106] En consonancia, la divulgación también proporciona un método para capturar un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, en una conformación funcional, que comprende los pasos de:

(i) poner en contacto un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento con una solución que comprende un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R y

(ii) permitir que el agente aglutinante se una específicamente al receptor de acetilcolina muscarínico M2, a través de lo cual el receptor de acetilcolina muscarínico M2 se captura en una conformación funcional.

[0107] Más específicamente, la divulgación también prevé un método para capturar un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, en una conformación funcional, dicho método comprende los pasos de:

(i) aplicar una solución que contiene un receptor de acetilcolina muscarínico, más específicamente M2R, en una variedad de conformaciones a un soporte sólido que posee un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación inmovilizado tal como se describe en el presente documento y

(ii) permitir que el agente aglutinante se una específicamente al receptor de acetilcolina muscarínico M2, a través de lo cual el receptor de acetilcolina muscarínico M2 se captura en una conformación funcional y (iii) eliminar las moléculas débilmente unidas o no unidas.

[0108] Se apreciará que cualquiera de los métodos descritos anteriormente puede comprender además el paso de aislar el complejo formado en el paso (ii) de los métodos descritos anteriormente, donde dicho complejo comprende el agente aglutinante selectivo de conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico en una conformación particular.

[0109] Los métodos anteriores para aislar/purificar receptores muscarínicos incluyen, sin limitación, métodos basados en la afinidad tales como cromatografía de afinidad, purificación de afinidad, inmunoprecipitación, detección de proteínas, inmunoquímica, visualización de superficie, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, entre otros, y son bien conocidos en la técnica.

Cristalografía y aplicaciones en diseño de fármacos basado en la estructura.

[0110] Un aspecto de la presente divulgación se refiere a la utilidad de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento en la cristalografía de rayos X de los receptores de acetilcolina muscarínicos, en particular M2, y sus aplicaciones en el diseño de fármacos basado en estructuras. Con las estructuras en estado inactivo de los receptores de acetilcolina muscarínicos M2 y M3 que están disponibles en la técnica, los químicos farmacéuticos ahora tienen datos experimentales para guiar el desarrollo de ligandos para varios objetivos terapéuticos activos. Sin embargo, el valor de estas estructuras de alta resolución para el cribado in silico es limitado. Por otro lado, y a título ilustrativo, los cristales receptores unidos a los agonistas pueden proporcionar representaciones tridimensionales de los estados activos de los receptores de acetilcolina muscarínicos. Estas estructuras ayudarán a aclarar los cambios conformacionales que conectan los sitios de unión al ligando y de interacción con la proteína G, y conducirán a hipótesis mecanicistas más precisas y, finalmente, a nuevas terapias. Dada la flexibilidad conformacional inherente a los GPCR activados por ligando y la mayor heterogeneidad exhibida por los receptores unidos al agonista, estabilizar dicho estado no es fácil. Dichos esfuerzos pueden beneficiarse de la estabilización de la conformación del receptor unido al agonista mediante la adición de agentes aglutinantes que son específicos para un estado conformacional activo del receptor. A ese respecto, es una ventaja particular de los agentes de unión selectivos en cuanto a conformación que muestran un comportamiento similar a la proteína G y exhiben propiedades cooperativas con respecto a la unión del agonista (véase también la sección de ejemplos). Esto también será de gran ventaja para ayudar a guiar el descubrimiento de fármacos. Especialmente son muy valiosos y se proporcionan en el presente documento los métodos para adquirir estructuras de receptores unidos a compuestos principales que tienen actividad farmacológica o biológica y cuya estructura química se usa como punto de partida para modificaciones químicas con el fin de mejorar la potencia, la selectividad o los parámetros farmacocinéticos. Los expertos en la técnica reconocerán que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito aquí es particularmente adecuado para la cocristalización del receptor: agente aglutinante con compuestos principales que son selectivos en cuanto a conformación susceptible a fármacos inducida por el agente aglutinante porque este agente aglutinante es capaz de aumentar sustancialmente la afinidad por ligandos de receptores selectivos en cuanto a conformación.

[0111] Por lo tanto, es una ventaja particular de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento que el agente aglutinante se una a un epítopo conformacional en el receptor, estabilizando así el receptor en esa conformación particular, reduciendo su flexibilidad conformacional y aumentando su superficie polar, facilitando la cristalización de un complejo receptor:agente aglutinante. Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento son herramientas únicas para aumentar la probabilidad de obtener cristales bien ordenados minimizando la heterogeneidad conformacional en el receptor de acetilcolina muscarínico diana.

[0112] Por lo tanto, se prevé utilizar los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en este documento para fines de cristalización. De manera ventajosa, los cristales pueden estar formados por un complejo de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico, en el que el receptor está atrapado en una conformación particular de receptor, más particularmente una conformación de receptor terapéuticamente relevante (por ejemplo, una conformación activa), tal como garantiza la elección de un agente aglutinante conformacionalmente selectivo. El agente aglutinante también reducirá la flexibilidad de las regiones extracelulares al unirse al receptor para hacer crecer cristales bien ordenados. En particular, los dominios variables individuales de inmunoglobulina, incluidos los nanoanticuerpos, son agentes aglutinantes especialmente adecuados para este propósito porque se unen a epítopos conformacionales y están compuestos por un único dominio globular rígido, desprovisto de regiones de unión flexibles a diferencia de los anticuerpos convencionales o fragmentos derivados como Fab.

[0113] Por lo tanto, la presente divulgación proporciona agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación útiles como herramientas para cristalizar un complejo de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y un receptor de acetilcolina muscarínico al que el agente aglutinante se unirá específicamente, y finalmente para resolver la estructura del complejo. La presente descripción también prevé cristalizar un complejo de agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, un receptor de acetilcolina muscarínico al que se unirá específicamente el agente aglutinante y otro ligando del receptor selectivo en cuanto a conformación (tal como se ha definido aquí anteriormente). Por lo tanto, el complejo que comprende el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito aquí y el receptor de acetilcolina muscarínico mantenido en una conformación particular, puede cristalizarse usando cualquier método entre una variedad de métodos de cristalización especializados para proteínas de membrana, muchos de los cuales se revisan en Caffrey (2003 y 2009). En términos generales, los métodos son métodos basados en lípidos que incluyen la adición de lípidos al complejo antes de la cristalización. Dichos métodos se han usado previamente para cristalizar otras proteínas de membrana. Muchos de estos métodos, incluido el método de cristalización de fase cúbica lipídica y el método de cristalización de bicelas, explotan las propiedades de autoensamblaje espontáneo de lípidos y detergentes como vesículas (método de fusión de vesículas), micelas discoidales (método de bicelas) y cristales líquidos o mesofases (en el método mesofase o de fase cúbica). Los métodos de cristalización de fases cúbicas lipídicas se describen, por ejemplo, en Landau et al. 1996; Gouaux 1998; Rummel et al. 1998; Nollert et al. 2004, Rasmussen et al. 2011, cuyas publicaciones se incorporan como referencia para la divulgación de esos métodos. Los métodos de cristalización de bicelas se describen, por ejemplo, en Faham et al. 2005; Faham et al. 2002, cuyas publicaciones se incorporan por referencia para la divulgación de esos métodos.

[0114] La descripción también se refiere al uso de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento para resolver la estructura de un receptor de acetilcolina muscarínico en complejo con un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, y opcionalmente en complejo con otro ligando del receptor selectivo en cuanto a conformación. "Resolver la estructura" tal como se usa en el presente documento se refiere a determinar la disposición de los átomos o las coordenadas atómicas de una proteína, y a menudo se realiza mediante un método biofísico, tal como la cristalografía de rayos X.

[0115] En muchos casos, la obtención de un cristal de calidad de difracción es la barrera clave para resolver su estructura de resolución atómica. Por lo tanto, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento pueden usarse para mejorar la calidad de difracción de los cristales de modo que se pueda resolver la estructura cristalina del complejo receptor:agente aglutinante.

[0116] En consecuencia, la presente descripción abarca un método para determinar la estructura cristalina de un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, en una conformación funcional, el método comprende los pasos de:

a) Proporcionar un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento y el receptor de acetilcolina muscarínico M2, y opcionalmente un ligando del receptor, y b) Permitir la formación de un complejo del agente aglutinante, el receptor de acetilcolina muscarínico M2 y, opcionalmente, un ligando del receptor,

c) Cristalizar el complejo del paso b) para formar un cristal

Dicha determinación de la estructura cristalina puede hacerse mediante un método biofísico tal como la cristalografía de rayos X. El método puede comprender además un paso para obtener las coordenadas atómicas del cristal (tal como se ha definido aquí anteriormente).

Cribado de ligandos y descubrimiento de fármacos

[0117] Se prevén particularmente otras aplicaciones que pueden hacer uso de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en este documento, que incluyen cribado de compuestos e inmunizaciones, que se describirán más adelante en este documento.

[0118] En el proceso de cribado de compuestos, optimización del compuesto principal y descubrimiento de fármacos (incluido el descubrimiento de anticuerpos), se requiere un análisis de cribado más rápido, más efectivo, menos costoso y especialmente rico en información que proporcione información simultánea sobre diversas características de los compuestos y sus efectos en varias vías celulares (es decir, eficacia, especificidad, toxicidad y metabolismo de fármacos). Por lo tanto, existe la necesidad de cribar rápida y económicamente un gran número de compuestos para identificar nuevos ligandos específicos de una proteína de interés, preferiblemente ligandos selectivos en cuanto a conformación, que pueden ser candidatos potenciales para nuevos fármacos. La presente descripción resuelve este problema proporcionando agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación que estabilizan o bloquean un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, en una conformación funcional, preferiblemente en una conformación activa. Esto permitirá cribar y diferenciar de manera rápida y fiable entre agonistas de receptores, agonistas inversos, antagonistas y/o moduladores, así como inhibidores de los receptores de acetilcolina muscarínicos, aumentando así la probabilidad de identificar un ligando con las propiedades farmacológicas deseadas. En particular, se proporcionan los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación los complejos que los comprenden, las células huésped que comprenden a estos, así como los cultivos de células huésped o los preparados de membrana derivados de los mismos, para los cuales se han descrito preferencias específicas anteriormente, son particularmente adecuados para este propósito y pueden usarse entonces como inmunógenos o reactivos de selección para el cribado en una variedad de contextos.

[0119] Para ilustrar esto con mayor profundidad, los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento que reconocen la conformación activa del receptor de acetilcolina M2 muscarínico se usarán preferiblemente en ensayos de cribado para detectar agonistas porque aumentan la afinidad del receptor por los agonistas, en relación con agonistas inversos o antagonistas. Recíprocamente, los agentes aglutinantes que estabilizan la conformación en estado inactivo del receptor de acetilcolina muscarínico M2 aumentarán la afinidad por un agonista inverso, en relación con los agonistas o antagonistas. Dichos agentes aglutinantes se usarán preferiblemente para detectar agonistas inversos.

[0120] Por lo tanto, la presente divulgación abarca el uso de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación, complejos que los comprenden, células huésped que comprenden a estos, cultivos de células huésped o preparados de membrana derivados de los mismos, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en programas de cribado y/o identificación para ligandos selectivos en cuanto a conformación de un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, que en última instancia podría conducir a candidatos potenciales para nuevos fármacos.

[0121] Por ejemplo, se describe un método para identificar compuestos selectivos en cuanto a conformación, el método comprende los pasos de

(i) proporcionar un complejo que comprende un receptor de acetilcolina muscarínico, en particular M2R, y un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que se une específicamente al receptor,

(ii) proporcionar un compuesto de prueba y

(iii) evaluar la unión selectiva del compuesto de prueba al M2R comprendido en el complejo.

[0122] Las preferencias específicas con respecto a agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación, complejos, células huésped, cultivos de células huésped y preparados de membrana de los mismos son como se han definido anteriormente.

[0123] Preferiblemente, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, el receptor de acetilcolina muscarínico o el complejo que comprende el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico, tal como se usa en cualquiera de los métodos de cribado descritos en el presente documento, se proporcionan como células enteras, o extractos de células (orgánulos) tales como extractos de membrana o fracciones de los mismos, o pueden incorporarse en capas de lípidos o vesículas (que comprenden lípidos naturales y/o sintéticos), lipopartículas de alta densidad o cualquier nanopartícula, como nanodiscos, o se proporcionan como virus o partículas semejantes a virus (VLP), de modo que se conserva la funcionalidad suficiente de las proteínas correspondientes. Los métodos para los preparados de GPCR a partir de fragmentos de membrana o extractos de detergente de membrana se revisan en detalle en Cooper (2004). Alternativamente, el receptor y/o el complejo también pueden solubilizarse en detergentes. En la sección de ejemplos también se proporcionan ejemplos no limitantes de preparados de receptor solubilizado.

[0124] Los ensayos de cribado para el descubrimiento de fármacos pueden ser en fase sólida (por ejemplo, perlas, columnas, portaobjetos, chips o placas) o ensayos en fase de solución, por ejemplo un ensayo de unión, como los ensayos de unión a radioligandos. En los ensayos de alto rendimiento, es posible cribar hasta varios miles de compuestos diferentes en un solo día en formatos de 96, 384 o 1536 pocillos. Por ejemplo, cada pocillo de una placa de microtitulación se puede usar para realizar un ensayo por separado contra un modulador potencial seleccionado o, si hay que observar efectos de concentración o tiempo de incubación, cada grupo de 5­ 10 pocillos puede comprobar un solo modulador. Por lo tanto, una única placa de microtitulación estándar puede ensayar aproximadamente 96 moduladores. Es posible ensayar muchas placas por día; actualmente son posibles ensayos de cribado para aproximadamente hasta 6000, 20000, 50000 o más compuestos diferentes. Preferiblemente, se realizará una criba de compuestos selectivos en cuanto a conformación del receptor muscarínico a partir de células huésped, o cultivos de células huésped, o preparados de membrana derivados de los mismos.

[0125] Se pueden usar varios métodos para determinar la unión entre el receptor muscarínico estabilizado y un compuesto de prueba, que incluyen, por ejemplo, citometría de flujo, ensayos de unión a radioligandos, ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), ensayos de resonancia de plasmones de superficie, ensayos basados en chips, inmunocitofluorescencia, técnica de doble híbrido de levadura y despliegue en fagos, que son una práctica común en la técnica, por ejemplo, en Sambrook y col. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Tercera edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Otros métodos para detectar la unión entre un compuesto de prueba y una proteína de membrana incluyen la ultrafiltración con métodos de espectroscopía de masas por pulverización iónica/HPLC u otros métodos (bio)físicos y analíticos. También pueden usarse métodos de transferencia de resonancia de energía fluorescente (FRET), por ejemplo, bien conocidos por los expertos en la técnica. Se apreciará que un compuesto de prueba unido puede detectarse usando una etiqueta o marcador único asociado al compuesto, tal como un marcador de péptido, un marcador de ácido nucleico, un marcador químico, un marcador fluorescente o un marcador de radioisótopo, como se describe más adelante en este documento.

[0126] El método descrito anteriormente para identificar compuestos selectivos en cuanto a conformación puede realizarse mediante un ensayo de unión a ligando o un ensayo de competición, incluso más preferiblemente un ensayo de unión a radioligando o de competición. Más preferiblemente, el método descrito anteriormente para identificar compuestos selectivos en cuanto a conformación puede realizarse en un ensayo comparativo, más específicamente, un ensayo de competición de ligando comparativo, incluso más específicamente un ensayo de competición de radioligando comparativo.

[0127] En caso de que el método descrito anteriormente se realice en un ensayo comparativo, se entenderá que el método comprenderá el paso de comparar la unión de un compuesto de prueba para M2R se estabiliza mediante un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación en una conformación funcional de interés, preferiblemente una conformación activa, con la unión del compuesto de prueba a un control. Dentro del alcance de la divulgación, el control puede ser el M2R correspondiente en ausencia de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o en presencia de un agente aglutinante simulado (también denominado agente de unión de control o fracción de unión irrelevante), que es un agente aglutinante que no está dirigido y/o no se une específicamente al M2R correspondiente.

[0128] El paso de evaluación de la unión selectiva del compuesto de prueba al receptor en cualquiera de los métodos descritos anteriormente se puede realizar midiendo y/o calculando la afinidad (tal como se define en el presente documento) del compuesto de prueba por el receptor.

[0129] A menudo se preferirá el cribado de alto rendimiento para ligandos selectivos en cuanto a conformación de receptores. Esto puede facilitarse mediante la inmovilización, o bien de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación descrito en el presente documento, o bien del receptor de acetilcolina muscarínico, o bien del complejo que comprende el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico, sobre una superficie sólida adecuada o soporte que se puede disponer o multiplexar. Ejemplos no limitantes de soportes sólidos adecuados incluyen perlas, columnas, portaobjetos, chips o placas.

[0130] Más particularmente, los soportes sólidos pueden ser partículas (por ejemplo, perlas o gránulos, generalmente utilizados en columnas de extracción) o estar en forma de lámina (por ejemplo, membranas o filtros, portaobjetos de vidrio o plástico, placas de ensayo de microtitulación, varillas de medición, dispositivos de llenado capilar o similares) que pueden ser fibras o tubos planos, plisados o huecos. Las siguientes matrices se dan como ejemplos y no son exhaustivas, tales ejemplos podrían incluir sílice (sílice amorfa porosa), es decir, la serie FLASH de cartuchos que contienen sílice irregular 60A (32-63 |_im o 35-70 |_im) suministrada por Biotage (una división de Dyax Corp.), soportes de agarosa o poliacrilamida, por ejemplo, la gama de productos Sepharose suministrados por Amersham Pharmacia Biotech, o los soportes Affi-Gel suministrados por Bio-Rad. Además, hay polímeros macroporosos, como los soportes Affi-Prep estables frente a la presión suministrados por Bio-Rad. Otros soportes que podrían utilizarse incluyen; dextrano, colágeno, poliestireno, metacrilato, alginato de calcio, vidrio de poro controlado, aluminio, titanio y cerámica porosa. Alternativamente, la superficie sólida puede comprender parte de un sensor dependiente de la masa, por ejemplo, un detector de resonancia de plasmón superficial. Otros ejemplos de soportes disponibles comercialmente se comentan en, por ejemplo, Protein Immobilisation, R.F. Taylor ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1991).

[0131] La inmovilización puede ser covalente o no covalente. En particular, la inmovilización no covalente o adsorción en una superficie sólida del agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, el receptor de acetilcolina muscarínico o el complejo que comprende el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico, puede ocurrir a través de un recubrimiento superficial con cualquier anticuerpo, o estreptavidina o avidina, o un ion metálico, que reconoce una etiqueta molecular adosada al agente de unión, de acuerdo con técnicas estándar conocidas por los expertos (por ejemplo, etiqueta de biotina, etiqueta de histidina, etc.).

[0132] En particular, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, el receptor de acetilcolina muscarínico o el complejo que comprende el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor de acetilcolina muscarínico, pueden unirse a una superficie sólida mediante reticulación covalente usando productos químicos de acoplamiento convencionales. Una superficie sólida puede comprender de manera natural residuos reticulables adecuados para la unión covalente o puede recubrirse o derivatizarse para introducir grupos reticulables adecuados de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Se puede retener la suficiente funcionalidad de la proteína inmovilizada después del acoplamiento covalente directo a la matriz deseada a través de una fracción reactiva que no contiene un brazo separador químico. Otros ejemplos e información más detallada sobre los métodos de inmovilización de anticuerpos (fragmentos) en soportes sólidos se analizan en Jung et al. (2008); de manera similar, los métodos de inmovilización del receptor de membrana se revisan en Cooper (2004); ambos incorporados en el presente documento como referencia.

[0133] Los avances en biología molecular, particularmente a través de mutagénesis dirigida, permiten la mutación de residuos de aminoácidos específicos en una secuencia de proteínas. La mutación de un aminoácido particular (en una proteína con estructura conocida o inferida) a una lisina o una cisteína (u otro aminoácido deseado) puede proporcionar un sitio específico para el acoplamiento covalente, por ejemplo. También es posible volver a diseñar una proteína específica para alterar la distribución de los aminoácidos disponibles en la superficie involucrados en el acoplamiento químico (Kallwass et al, 1993), controlando, en efecto, la orientación de la proteína acoplada. Se puede aplicar un enfoque similar a los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento, así como a los receptores muscarínicos estabilizados conformacionalmente, tanto si están incluidos en el complejo como si no, proporcionando así un medio de inmovilización orientada sin la adición de otras colas de péptidos o dominios que contienen aminoácidos naturales o no naturales. En el caso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, p. ej., un nanoanticuerpo, se prefiere la introducción de mutaciones en la región marco, minimizando la interrupción de la actividad de unión al antígeno del anticuerpo (fragmento).

[0134] Convenientemente, las proteínas inmovilizadas pueden usarse en procesos de inmunoadsorción tales como inmunoensayos, por ejemplo ELISA, o procesos de purificación de inmunoafinidad poniendo en contacto las proteínas inmovilizadas con una muestra de prueba de acuerdo con métodos estándar convencionales en la técnica. Alternativamente, y en particular para fines de alto rendimiento, las proteínas inmovilizadas pueden disponerse o, de otro modo, multiplexarse. Preferiblemente, las proteínas inmovilizadas descritas en el presente documento se usan para el cribado y la selección de compuestos que se unen selectivamente a una conformación particular de un receptor muscarínico, particularmente M2R.

[0135] Se apreciará que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o el receptor muscarínico diana pueden estar inmovilizados, dependiendo del tipo de aplicación o del tipo de cribado que deba realizarse. Además, la elección del agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación (dirigido a un epítopo conformacional particular del receptor) determinará la orientación del receptor y, en consecuencia, el resultado deseado de la identificación del compuesto, p. ej., compuestos que se unen específicamente a partes extracelulares, partes intramembranales o partes intracelulares de dicho receptor conformacionalmente estabilizado.

[0136] Alternativamente, el compuesto de prueba (o una biblioteca de compuestos de prueba) puede inmovilizarse en una superficie sólida, tal como una superficie de chip, mientras que el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación y el receptor muscarínico se proporcionan, por ejemplo, en una solución de detergente o en un preparado de tipo membrana.

[0137] Por consiguiente, se proporciona un soporte sólido en el que se inmoviliza un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento para su uso en cualquiera de los métodos de cribado anteriores.

[0138] Más preferiblemente, ni el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación, ni el receptor muscarínico, ni el compuesto de prueba están inmovilizados, por ejemplo, en protocolos de selección de despliegue en fagos en solución, o ensayos de unión de radioligandos.

[0139] Los compuestos que se van a probar pueden ser cualquier compuesto químico pequeño o una macromolécula, como una proteína, un azúcar, un ácido nucleico o un lípido. Típicamente, los compuestos de prueba serán pequeños compuestos químicos, péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos. Se apreciará que en algunos casos el compuesto de prueba puede ser una biblioteca de compuestos de prueba. En particular, los ensayos de cribado de alto rendimiento para compuestos terapéuticos tales como agonistas, antagonistas o agonistas inversos y/o moduladores forman parte de la divulgación. Para fines de alto rendimiento, pueden usarse bibliotecas de compuestos o bibliotecas combinatorias tales como bibliotecas de compuestos alostéricos, bibliotecas de péptidos, bibliotecas de anticuerpos, bibliotecas basadas en fragmentos, bibliotecas de compuestos sintéticos, bibliotecas de compuestos naturales, bibliotecas de despliegue en fagos y similares. Los expertos en la técnica conocen las metodologías para preparar y cribar dichas bibliotecas.

[0140] El compuesto de prueba puede estar opcionalmente enlazado de manera covalente o no covalente a un marcador detectable. Los marcadores y técnicas detectables adecuados para unirse, usarse y detectarse serán claros para los expertos e incluirán, entre otras, cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, dynabeads), tintes fluorescentes (por ejemplo, todos los tintes Alexa Fluor, isotiocianato de fluoresceína, rojo de Texas, rodamina, proteína fluorescente verde y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) y marcadores colorimétricos como oro coloidal o vidrio o plástico coloreados (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Los medios para detectar dichos marcadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Así, por ejemplo, los radiomarcadores pueden detectarse utilizando película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse utilizando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador coloreado. Otros marcadores detectables adecuados se describieron anteriormente.

[0141] Por lo tanto, el compuesto de prueba tal como se usa en cualquiera de los métodos de cribado anteriores puede seleccionarse del grupo que comprende un polipéptido, un péptido, una molécula pequeña, un producto natural, un peptidomimético, un ácido nucleico, un lípido, un lipopéptido, un carbohidrato, un anticuerpo o cualquier fragmento derivado de los mismos, como Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, un anticuerpo de cadena pesada (hcAb), un anticuerpo de dominio único (sdAb), un minianticuerpo, el dominio variable derivado de anticuerpos de cadena pesada de camélidos (VHH o nanoanticuerpo), el dominio variable de los nuevos receptores de antígeno derivados de anticuerpos de tiburón (VNAR), un andamiaje de proteínas que incluye un alfa anticuerpo, proteína A, proteína G, dominios de repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins), repeticiones de fibronectina tipo III, anticalinas, knotinas, dominios CH2 diseñados (nanoanticuerpos), tal como se ha definido anteriormente.

[0142] Por ejemplo, los métodos de cribado de alto rendimiento pueden implicar proporcionar una biblioteca combinatoria química o peptídica que contenga una gran cantidad de ligandos terapéuticos potenciales. Dichas "bibliotecas combinatorias" o "bibliotecas de compuestos" se criban entonces en uno o más ensayos, tal como se describe en el presente documento, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que muestran una actividad característica deseada. Una "biblioteca de compuestos" es una colección de productos químicos almacenados que generalmente se utilizan en última instancia en el cribado de alto rendimiento. Una "biblioteca combinatoria" es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, combinando una serie de "bloques de construcción" químicos como los reactivos. La preparación y el cribado de bibliotecas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la materia. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos principales" convencionales o pueden usarse ellos mismos como terapia potencial o real. Por lo tanto, los métodos de cribado tal como se describen en el presente documento pueden comprender además la modificación de un compuesto de prueba que se ha demostrado que se une selectivamente a un receptor muscarínico en una conformación particular, y determinar si el compuesto de prueba modificado se une al receptor cuando reside en la conformación particular.

[0143] Se puede determinar si el compuesto altera la unión del receptor muscarínico a un ligando del receptor (tal como se define en el presente documento). La unión de un receptor a su ligando puede ensayarse usando métodos estándar de unión de ligandos conocidos en la técnica tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un ligando puede estar radiomarcado o marcado con fluorescencia. El ensayo puede llevarse a cabo en células enteras o en membranas obtenidas de las células o en un receptor acuoso solubilizado con un detergente. El compuesto se caracterizará por su capacidad para alterar la unión del ligando marcado (véase también la sección de ejemplos). El compuesto puede disminuir la unión entre el receptor y su ligando, o puede aumentar la unión entre el receptor y su ligando, por ejemplo, en un factor de al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100.

[0144] Por lo tanto, un complejo que comprende un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento, un receptor muscarínico y un ligando del receptor, puede usarse en cualquiera de los métodos de detección anteriores. Preferiblemente, el ligando del receptor se elige del grupo que comprende una molécula pequeña, un polipéptido, un anticuerpo o cualquier fragmento derivado de los mismos, un producto natural y similares. Más preferiblemente, el ligando del receptor es un agonista completo, o un agonista parcial, un agonista sesgado, un antagonista o un agonista inverso, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

[0145] El compuesto de prueba tal como se usa en cualquiera de los métodos de cribado anteriores se puede proporcionar como una muestra biológica. En particular, la muestra puede ser cualquier muestra adecuada tomada de un individuo. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de fluido corporal como sangre, suero, plasma o líquido cefalorraquídeo.

[0146] Además de establecer la unión a un receptor muscarínico, en particular M2R, en una conformación particular de interés, también será deseable determinar el efecto funcional de un compuesto sobre el receptor. Por ejemplo, los compuestos pueden unirse al receptor muscarínico dando como resultado la modulación (activación o inhibición) de la función biológica del receptor, en particular la señalización del receptor aguas abajo. Esta modulación de la señalización intracelular puede ocurrir ortostérica o alostéricamente. Los compuestos pueden unirse al receptor muscarínico para activar o aumentar la señalización del receptor; o alternativamente para disminuir o inhibir la señalización del receptor. Los compuestos también pueden unirse al receptor muscarínico de tal manera que bloquean la actividad constitutiva del receptor. Los compuestos también pueden unirse al receptor muscarínico de tal manera que median en la modulación alostérica (por ejemplo, se unen al receptor en un sitio alostérico). De esta manera, los compuestos pueden modular la función del receptor uniéndose a diferentes regiones en el receptor (por ejemplo, en sitios alostéricos). Se hace referencia, por ejemplo, a George et al. 2002; Kenakin 2002; Rios y et al. 2001. Los compuestos también pueden unirse al receptor muscarínico de tal manera que prolonguen la duración de la señalización mediada por el receptor o que mejoren la señalización del receptor al aumentar la afinidad receptor-ligando. Además, los compuestos también pueden unirse al receptor muscarínico de tal manera que inhiban o mejoren el ensamblaje de los homómeros o heterómeros funcionales del receptor. La eficacia de los compuestos y/o composiciones que comprenden los mismos, se puede probar usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido per se adecuados, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad específica o trastorno involucrado.

[0147] Se apreciará que los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación, los complejos, las células huésped y los derivados de los mismos, tal como se describen en el presente documento, pueden continuar diseñándose y, por lo tanto, son herramientas particularmente útiles para el desarrollo o la mejora de ensayos basados en células. Los ensayos basados en células son críticos para evaluar el mecanismo de acción de nuevos objetivos biológicos y la actividad biológica de los compuestos químicos. Por ejemplo, sin el propósito de ser limitante, los ensayos actuales basados en células para GPCR incluyen medidas de activación de la vía (liberación de Ca2+, generación de cAMP o actividad transcripcional); mediciones del tráfico de proteínas mediante el etiquetado de GPCR y elementos aguas abajo con GFP; y mediciones directas de las interacciones entre proteínas utilizando la transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) o los enfoques de doble híbrido de levadura.

[0148] Además, puede ser particularmente beneficioso inmunizar un animal con un complejo que comprende un receptor muscarínico, particularmente M2R, y un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que se dirige contra, y/o se une específicamente a, dicho receptor o con una célula huésped que comprende dicho complejo, o derivados de los mismos, para generar anticuerpos, preferiblemente anticuerpos selectivos en cuanto a conformación contra el receptor muscarínico. Por lo tanto, dichos métodos de inmunización también se contemplan en el presente documento. Los métodos para generar anticuerpos en vivo son conocidos en la técnica y también se han descrito en el presente documento anteriormente. Cualquier animal adecuado, por ejemplo, un animal de sangre caliente, en particular un mamífero tal como un conejo, un ratón, una rata, un camello, una oveja, una vaca, un tiburón o un cerdo, o un ave tal como un pollo o un pavo, puede inmunizarse con cualquiera de las técnicas bien conocidas en la técnica adecuadas para generar una respuesta inmune. Después de la inmunización, las bibliotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulina o porciones de las mismas, expresadas en bacterias, levaduras, fagos filamentosos, ribosomas o subunidades ribosómicas u otros sistemas de despliegue, se pueden hacer de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica. Además de eso, las bibliotecas de anticuerpos que se generan comprenden una colección de compuestos de prueba adecuados para su uso en cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente. Los anticuerpos que se han generado tal como se describe anteriormente en el presente documento también pueden ser herramientas de diagnóstico útiles para detectar específicamente receptores muscarínicos en una conformación particular y, por lo tanto, también forman parte de la presente divulgación.

[0149] El complejo que comprende el receptor muscarínico, en particular M2R, y el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que se dirige contra, y/o se une específicamente a, el receptor muscarínico pueden usarse para la selección de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación que incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen el receptor por cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente. Los expertos en la técnica reconocerán que dichos agentes aglutinantes, como ejemplo no limitante, pueden seleccionarse cribando un conjunto, colección o biblioteca de células que expresan agentes de unión en su superficie, o bacteriófagos que muestran una fusión del genlll y el agente aglutinante en su superficie, o células de levadura que muestran una fusión de la proteína del factor de apareamiento Aga2p, o por despliegue de ribosomas, entre otros.

Aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico

[0150] Un aspecto adicional se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento y al menos uno de entre un vehículo, un adyuvante o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

[0151] Un "vehículo" o un "adyuvante", en particular un "vehículo farmacéuticamente aceptable" o un "adyuvante farmacéuticamente aceptable" es cualquier excipiente, diluyente, vehículo y/o adyuvante adecuado que, por sí mismo, no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición ni genera protección. Por lo tanto, los vehículos farmacéuticamente aceptables son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos, y son conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos o adyuvantes adecuados comprenden típicamente uno o más de los compuestos incluidos en la siguiente lista no exhaustiva: macromoléculas grandes de metabolización lenta tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos. Los vehículos o adyuvantes pueden ser, como ejemplo no limitante, la solución de Ringer, la solución de dextrosa o la solución de Hank. También se pueden usar soluciones no acuosas tales como aceites fijos y oleato de etilo. Un excipiente preferido es el de dextrosa al 5 % en solución salina. El excipiente puede contener cantidades pequeñas de aditivos, tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, incluidos los tampones y los conservantes.

[0152] La administración de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación tal como se describe en el presente documento, o de una composición farmacéutica del mismo puede realizarse mediante administración oral, inhalada o parenteral. El agente aglutinante puede administrarse mediante administración intratecal o intracerebroventricular. El compuesto activo puede administrarse solo o preferiblemente formulado como una composición farmacéutica. Una cantidad eficaz para tratar una determinada enfermedad o trastorno que expresa el antígeno reconocido por el dominio de unión a proteínas depende de los factores habituales, como la naturaleza y la gravedad del trastorno que se está tratando y el peso del mamífero. Sin embargo, una dosis unitaria normalmente estará en el intervalo de 0,1 mg a 1 g, por ejemplo, de 0,1 a 500 mg, por ejemplo de 0,1 a 50 mg, o de 0,1 a 2 mg del dominio de unión a proteínas o una composición farmacéutica del mismo. Las dosis unitarias normalmente se administrarán una vez al mes, una vez a la semana, dos veces por semana, una vez o más de una vez al día, por ejemplo 2, 3 o 4 veces al día, más generalmente de 1 a 3 veces al día. Se prefiere enormemente que el agente aglutinante o una composición farmacéutica del mismo se administre en forma de una composición de dosis unitaria, tal como una composición de dosis unitaria oral, parenteral o inhalada. Dichas composiciones se preparan mediante mezcla y se adaptan adecuadamente para administración oral, inhalada o parenteral, y como tales pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, preparados líquidos orales, polvos, gránulos, pastillas, polvos reconstituibles, soluciones o suspensiones inyectables y como infusión, o supositorios o aerosoles. Los comprimidos y cápsulas para administración oral generalmente se presentan en una dosis unitaria y contienen excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, rellenos, diluyentes, agentes de formación de comprimidos, lubricantes, desintegrantes, colorantes, saborizantes y agentes humectantes. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los rellenos adecuados para su uso incluyen celulosa, manitol, lactosa y otros agentes similares. Los desintegrantes adecuados incluyen almidón, polivinilpirrolidona y derivados de almidón tales como glicolato sódico de almidón. Los lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio. Los agentes humectantes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen laurilsulfato de sodio. Estas composiciones orales sólidas pueden prepararse por métodos convencionales de mezcla, relleno, formación de comprimidos o similares. Se pueden usar operaciones de mezcla repetidas para distribuir el agente activo a través de aquellas composiciones que emplean grandes cantidades de rellenos. Dichas operaciones son, por supuesto, convencionales en la técnica. Los preparados líquidos orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichos preparados líquidos pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitán, o acacia; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos tales como ésteres de glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo, metil o propil p-hidroxibenzoato o ácido sórbico, y si se desea, agentes saborizantes o colorantes convencionales. Las formulaciones orales también incluyen formulaciones convencionales de liberación sostenida, tales como comprimidos o gránulos que tienen un recubrimiento entérico. Preferiblemente, las composiciones para inhalación se presentan para su administración al tracto respiratorio como un tabaco o un aerosol o una solución para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas del compuesto activo tienen adecuadamente diámetros de menos de 50 micrómetros, preferiblemente menos de 10 micrómetros, por ejemplo entre 1 y 5 micrómetros, tal como entre 2 y 5 micrómetros. Una dosis inhalada preferida estará en el rango de 0,05 a 2 mg, por ejemplo 0,05 a 0,5 mg, 0,1 a 1 mg o 0,5 a 2 mg. Para la administración parenteral, se preparan formas dosificación unitarias fluidas que contienen un compuesto de la presente divulgación y un vehículo estéril. El compuesto activo, dependiendo del vehículo y la concentración, se puede suspender o disolver. Las soluciones parenterales se preparan normalmente disolviendo el compuesto en un vehículo y esterilizando por filtración antes de llenar con ellas un vial o ampolla adecuados y sellarlos. Como ventaja, los adyuvantes tales como un anestésico local, conservantes y agentes tamponantes también se disuelven en el vehículo. Para mejorar la estabilidad, la composición se puede congelar después de llenar el vial y el agua se puede eliminar mediante vacío. Las suspensiones parenterales se preparan esencialmente de la misma manera, excepto que el compuesto se suspende en el vehículo en lugar de disolverse y esterilizarse por exposición al óxido de etileno antes de suspenderse en el vehículo estéril. Como ventaja, se incluye un agente surfactante o humectante en la composición para facilitar la distribución uniforme del compuesto activo. Cuando sea apropiado, se pueden incluir pequeñas cantidades de broncodilatadores, por ejemplo, aminas simpaticomiméticas tales como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de la xantina como la teofilina y la aminofilina y corticosteroides como la prednisolona y estimulantes suprarrenales como la ACTH. Puesto que es una práctica común, las composiciones generalmente irán acompañadas de instrucciones escritas o impresas para su uso en el tratamiento médico en cuestión.

[0153] En el caso de un producto biológico, el suministro de agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación a las células puede realizarse como se describe para péptidos, polipéptidos y proteínas. Si el antígeno es extracelular o un dominio extracelular, el agente aglutinante puede ejercer su función al unirse a este dominio, sin necesidad de administración intracelular. Los agentes aglutinantes tal como se describen en el presente documento pueden tomar como diana epítopos conformacionales intracelulares del receptor muscarínico. Para usar estos agentes aglutinantes como terapias eficaces y seguras dentro de una célula, la administración intracelular puede mejorarse mediante la transducción de proteínas o los sistemas de administración conocidos en la técnica. Los dominios de transducción de proteínas (PTD) han atraído un interés considerable en el campo de la administración de fármacos por su capacidad de translocarse a través de membranas biológicas. Los PTD son secuencias relativamente cortas (1-35 aminoácidos) que confieren esta actividad de translocación aparente a las proteínas y otras cargas macromoleculares a las que se conjugan, complejan o fusionan (Sawant y Torchilin 2010). El péptido TAT derivado del VIH (YGRKKRRQRRR), por ejemplo, se ha utilizado ampliamente para la administración intracelular de diversos agentes que van desde moléculas pequeñas hasta proteínas, péptidos, una gama de nanovehículos farmacéuticos y agentes de imagen de diagnóstico. Alternativamente, los mecanismos endocíticos mediados por el receptor también se pueden usar para la administración intracelular de fármacos. Por ejemplo, la vía de internalización mediada por receptor de transferrina es una vía de absorción celular eficiente que ha sido explotada para la administración específica de sitio de fármacos y proteínas (Qian et al. 2002). Esto se logra químicamente mediante la conjugación de transferrina con fármacos o proteínas terapéuticas o genéticamente mediante infusión de péptidos o proteínas terapéuticos en la estructura de la transferrina. Las proteínas existentes de forma natural (como la proteína de unión al hierro transferrina) son muy útiles en esta área de la administración de fármacos orientada a dianas, ya que estas proteínas son biodegradables, no tóxicas y no inmunogénicas. Además, pueden lograr la orientación específica de sitio debido a las altas cantidades de sus receptores presentes en la superficie celular. Otros sistemas de administración incluyen, sin el propósito de ser limitantes, sistemas de administración basados en polímeros y liposomas.

[0154] La eficacia de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos en el presente documento y de las composiciones que los comprenden, se puede probar usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido per se adecuados, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico involucrado.

[0155] Otro aspecto de la divulgación se refiere al uso del agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o de la composición farmacéutica tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento para modular la actividad de señalización de M2R.

[0156] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación tal como se describen en el presente documento pueden unirse al receptor muscarínico para activar o aumentar la señalización del receptor; o alternativamente para disminuir o inhibir la señalización del receptor. Los agentes aglutinantes descritos en el presente documento también pueden unirse al receptor de tal manera que bloqueen la actividad constitutiva del receptor. Los agentes aglutinantes descritos en el presente documento también pueden unirse al receptor de tal manera que median en la modulación alostérica (por ejemplo, se unen al receptor en un sitio alostérico). De esta manera, los agentes aglutinantes descritos en este documento pueden modular la función del receptor uniéndose a diferentes regiones en el receptor (por ejemplo, en sitios alostéricos). Se hace referencia, por ejemplo, a George et al. (2002), Kenakin (2002) y Rios et al. (2001) Los agentes aglutinantes descritos en el presente documento también pueden unirse al receptor de tal manera que prolonguen la duración de la señalización mediada por el receptor o que mejoren la señalización del receptor al aumentar la afinidad receptor-ligando. Además, los agentes aglutinantes descritos en el presente documento también pueden unirse al receptor de tal manera que inhiban o mejoren el ensamblaje de los homómeros o los heterómeros funcionales del receptor.

[0157] Por ejemplo, el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o la composición farmacéutica tal como se han descrito anteriormente en el presente documento pueden bloquear la señalización mediada por la proteína G.

[0158] La divulgación también contempla el agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o la composición farmacéutica tal como se han descrito anteriormente en el presente documento para usar en el tratamiento de una enfermedad relacionada con el receptor muscarínico, en particular una enfermedad relacionada con el M2R.

[0159] Por lo tanto, se entenderá que algunos de los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación descritos anteriormente pueden tener utilidad terapéutica y pueden administrarse a un sujeto que tiene una afección para tratar al sujeto en esa afección. La utilidad terapéutica para un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación puede determinarse mediante el receptor muscarínico al que se une el agente aglutinante en esa señalización a través de ese receptor que está vinculado a la afección. Se puede emplear un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación para el tratamiento de una afección mediada por receptor muscarínico, en particular una afección mediada por M2R, tal como la enfermedad de Alzheimer y los trastornos cognitivos, el dolor, la EII y el glioblastoma, entre otros. Más ejemplos de afecciones adicionales relacionadas con el receptor muscarínico se encuentran en la base de datos en línea de herencia mendeliana en el hombre que están en el sitio web mundial del NCBI. Por lo tanto, también se proporciona el uso de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación o de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el receptor muscarínico, en particular una enfermedad o trastorno relacionado con el M2R.

[0160] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación pueden emplearse como agentes coterapéuticos para su uso en combinación con otras sustancias farmacológicas, por ejemplo, como potenciadores de la actividad terapéutica de dichos fármacos o como un medio para reducir la dosificación requerida o los posibles efectos secundarios de dichos fármacos. Un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación puede mezclarse con la otra sustancia farmacológica en una composición farmacéutica fija o puede administrarse por separado, antes, simultáneamente o después de la otra sustancia farmacológica. En términos generales, estos protocolos implican administrar a un individuo que padece una enfermedad o trastorno relacionado con el receptor muscarínico, en particular una enfermedad o trastorno relacionado con el M2R, una cantidad eficaz de un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que modula un receptor muscarínico, en particular M2R, para modular el receptor en el huésped y tratar el trastorno en el individuo.

[0161] Cuando se desea una reducción en la actividad de un receptor muscarínico, particularmente M2R, se pueden administrar uno o más compuestos que disminuyen la actividad del receptor, mientras que cuando se desea un aumento en la actividad de un receptor muscarínico, particularmente M2R, se pueden administrar uno o más más compuestos que aumentan la actividad del receptor.

[0162] Se puede tratar a una variedad de individuos de acuerdo con los métodos de la materia. En general, dichos individuos son mamíferos, y estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase mammalia, incluidos los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas), y primates (p. ej., humanos, chimpancés y monos). En muchos ejemplos, los individuos serán humanos. Los métodos de tratamiento de la materia se realizan típicamente en individuos con dichos trastornos o en individuos con el deseo de evitar dichos trastornos.

[0163] Los agentes aglutinantes selectivos en cuanto a conformación también pueden ser útiles para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad relacionada con el receptor muscarínico, en particular una enfermedad o trastorno relacionado con M2R, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Kit de piezas

[0164] Otro aspecto más se refiere a un kit que comprende un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que toma como diana un receptor muscarínico, en particular M2R, o un kit que comprende una célula huésped o un cultivo de células huésped o un preparado de membrana que comprende un agente aglutinante selectivo en cuanto a conformación que toma como diana un receptor muscarínico tal como se describe en este documento. El kit puede comprender además una combinación de reactivos tales como tampones, etiquetas moleculares, constructos de vectores, material de muestra de referencia, así como soportes sólidos adecuados y otros elementos similares. Dicho kit puede ser útil para cualquiera de las aplicaciones según se describen en este documento. Por ejemplo, el kit puede comprender (una biblioteca de) compuestos de prueba útiles para aplicaciones de cribado de compuestos.

EJEMPLOS

Métodos para los ejemplos

[0165] Expresión y purificación del receptor muscarínico M2. El gen del receptor muscarínico M2 humano se modificó para eliminar los sitios de glicosilación y para agregar una etiqueta FLAg amino-terminal y una etiqueta 8xHis carboxi-terminal. Además, se eliminaron los residuos 233 - 374 del bucle intracelular 3. Anteriormente se ha demostrado que esta región no está estructurada (Ichiyama et al. 2006) y no es esencial para el acoplamiento de la proteína G (Shapiro et al. 1989). El receptor muscarínico M2 humano que lleva una etiqueta de epítopo FLAG amino-terminal y una etiqueta 8xH carboxi-terminal se expresó en células Sf9 que usan el sistema de baculovirus BestBac (Expression Systems; Davis, CA). Las células fueron infectadas a una densidad de 4 x 106 células/ml, luego se incubaron durante dos días a 27 °C. El receptor se extrajo y se purificó de la manera descrita anteriormente para el receptor muscarínico M3 (Kruse et al. 2012). Brevemente, el receptor se purificó primero mediante cromatografía de Ni-NTA, cromatografía de afinidad FLAG y cromatografía de exclusión por tamaño. Se incluyó atropina 1 pM en todos los tampones. El receptor se marcó luego con un exceso molar de 5 veces de éster de biotina-NHS (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) en un tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,2. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y una incubación de 30 minutos en hielo, el marcador no reaccionado se inactivó con Tris 50 mM, pH 8. Las muestras marcadas directamente con ésteres de fluoróforo-NHS se prepararon de manera similar. El receptor se desaló luego en un tampón que contenía tiotropio 10 pM, iperoxo 10 pM o tampón que no contenía ligando. El receptor eluido en tampón que no contiene ligando se trató con mostaza de iperoxo 50 pM (derivado de iperoxo, que permite la unión covalente al receptor M2) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se concentraron, se dividieron en alícuotas y se congelaron rápidamente con glicerol al 20 % (v/v).

[0166] Muestras de inmunización de llama. El receptor M2 se preparó tal como se ha descrito anteriormente, y se unió al iperoxo incluyéndolo a 10 pM comenzando en los pasos de lavado de FLAG y en todos los tampones posteriores. El receptor se reconstituyó en vesículas de fosfolípidos compuestas de DOPC (1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfocolina, Avanti Polar Lipids) y lípido A en una proporción de 10:1 (p:p), luego se dividió en alícuotas a 1 mg/ml de concentración del receptor y se congeló en alícuotas de 100 pl antes de la inyección.

[0167] Inmunización de llama. Una llama (Lama glama) se inmunizó durante seis semanas con un receptor de 1 mg en total. Los linfocitos de sangre periférica se aislaron del animal inmunizado para extraer ARN total. El ADNc se preparó usando 50 pg de ARN total y 2,5 pg de cebador oligo-dN6. Los marcos de lectura abiertos de nanoanticuerpos se amplificaron como se tal como describe (Conrath et al. 2001).

[0168] Construcción de la biblioteca de levadura de nanoanticuerpo M2 de llama postinmune. A partir de una biblioteca de nanoanticuerpos PCR, fragmentos de los nanoanticuerpos VHH se amplificaron por PCR usando los cebadores pYalNB80AMPF (CATTTTCAATTAAGATGCAG TTACTTCGCT GTTTTTCAAT ATTTTCTGTT ATTGCTAGCG TTTTAGCAAT GGCCCAGGTG CAGCTGCAGG AG; SEQ ID N.°: 165) y pYalNB80AMPR 5CCACCAGATC CACCACCACC CAAGGTCTTCT TCGGAGATAA GCTTTTGTTC GGATCCTGAG GAGACGGTGA CCTGGGTCCC; SEQ ID N.°: 166). Los productos de PCR se cotransformaron luego con pYal linealizado en la cepa de levadura EBY100, produciendo un tamaño de biblioteca de 0,6x108 transformantes

[0169] Selecciones de nanoanticuerpos miméticos de Gi para M2 de la biblioteca postinmune de nanoanticuerpos de M2 de llama. Para la primera ronda de selección, se realizó una selección negativa contra el receptor adrenérgico p2 para eliminar los clones de levadura que se unen de forma no específica a proteínas de membrana o a reactivos de tinción secundarios. 1.0x109 de la levadura inducida se lavaron con tampón PBEM y luego se tiñeron en 5 ml de tampón PBEM que contenía un receptor p2 biotinilado 1 pM se unieron con carazolol durante una hora a 4 °C. Las levaduras se lavaron con tampón PBEM y luego se tiñeron con estreptavidina-647 como reactivo secundario en tampón PBEM durante 15 minutos a 4 ° C. La levadura se lavó nuevamente con tampón PBEM y se marcó magnéticamente con microperlas anti-647 (Miltenyi) en 4,75 ml de tampón PBEM durante 15 minutos a 4 °C. Las células de levadura marcada positivamente, que se unen al receptor p2, se eliminaron entonces mediante la aplicación a una columna LD (Miltenyi); el flujo se utilizó luego para la selección posterior. La selección positiva de los clones que reconocen el estado activo del receptor M2 se realizó mediante tinción de la levadura con un receptor M2 biotinilado 2 pM ligado con el agonista iperoxo en 5 ml de tampón PBEM suplementado con 2 pM de iperoxo durante una hora a 4 °C. Luego se lavaron las levaduras, se tiñeron con estreptavidina-647 y se marcaron magnéticamente con microperlas anti-647, incluyendo iperoxo 1 pM en el tampón PBEM en todos los pasos. La separación magnética de los clones de levadura de unión al receptor M2 se realizó usando una columna LS (Miltenyi) siguiendo las instrucciones del fabricante. La levadura clasificada magnéticamente se volvió a suspender en medio SDCAA y se cultivó a 30 °C. Las rondas 2-4 se seleccionaron de manera similar, seleccionando negativamente contra el receptor p2 biotinilado carazolol 1 pM y seleccionando positivamente usando el receptor M2 biotinilado 1 pM iperoxo. Para estas rondas, la escala se redujo diez veces hasta a 1 x 108 de levadura inducida y volúmenes de tinción de 0,5 ml.

[0170] La selección conformacional se realizó para las rondas 5-9. Para las rondas 5-8, la levadura se tiñó con un receptor M2 biotinilado 1 pM preincubado con el antagonista de alta afinidad tiotropio durante una hora a 4 °C. La levadura se marcó de manera fluorescente con estreptavidina-647 o estreptavidina-PE, y se marcó magnéticamente con las microperlas anti-647 o anti-PE correspondientes (Miltenyi). Solo se marcan las células de levadura que se unen al receptor M2 cargado con tiotropio y agotar los ligantes en estado inactivo se llevó a cabo usando una columna LS. La levadura aclarada se seleccionó luego positivamente mediante tinción con 0,5 pM (rondas 5-7) o 0,1 pM (ronda 8) del receptor M2 biotinilado previamente unido al iperoxo durante una hora a 4 °C. La levadura se marcó de manera fluorescente con estreptavidina-PE o estreptavidina-647, utilizando el fluoróforo distinto de la selección negativa del paso anterior. Las células de levadura que se unen al receptor M2 cargado con iperoxo se marcaron y la separación magnética del receptor M2 ocupado por agonistas se realizó usando una columna LS, como en los pasos 1-4. Para la ronda 9, se realizó FACS de dos colores. La levadura inducida se tiñó simultáneamente con un receptor M2 marcado con Alexa647 1 pM que reaccionó con mostaza de iperoxo y un receptor M2 marcado con Alexa488 1 pM previamente unido con tiotropio durante una hora a 4 °C. La levadura Alexa647 positiva/Alexa488 negativa se purificó usando un clasificador de células FACS Jazz (BD Biosciences). La levadura postclasificada se colocó en placas de agar SDCAA y se secuenciaron las secuencias que codifican nanoanticuerpos de varias colonias. Las secuencias completas de clones que se ha confirmado que potencian la afinidad de agonistas son Nb9-1 (SEQ ID N.°: 8), Nb9-8 (SEQ ID N.°: 10) y Nb9-20 (SEQ ID N.°: 11).

Selecciones de nanoanticuerpos funcionales con el nanoanticuerpo mimético de Gi para M2 Nb9-8.

[0171] Las selecciones se iniciaron con la levadura restante después de las primeras cuatro rondas de selección para el nanoanticuerpo mimético de Gi para M2 antes de la selección conformacional. Para las rondas 5 y 6 , la levadura se preaclaró usando MACS contra tetrámeros de estreptavidina marcados con PE 500 nM conjugados con Nb9-8 biotinilado, eliminando clones que se unen directamente a Nb9-8. Los tetrámeros se formaron preincubando Nb9-8 biotinilado 2 pM con estreptavidina-PE 0,5 pM en tampón PBEM en hielo durante 10 minutos. La levadura se seleccionó luego positivamente con tetrámeros de estreptavidina-PE/Nb9-8 500 nM después de teñir primero la levadura con un receptor M2 marcado con Alexa488 1 pM y reaccionado con mostaza de iperoxo. La separación magnética con MACS se logró utilizando microperlas anti-PE y una columna LS. Para seleccionar adicionalmente los clones que se unen en el sitio extracelular, alostérico/ortostérico del receptor M2, para las rondas 7 y 8 se realizó una selección negativa contra el receptor M2 biotinilado 1 pM ocupado con iperoxo en presencia de galamina 2 mM, que es un ligando alostérico/ortostérico. La selección positiva para el receptor M2 en ausencia de galamina se realizó entonces utilizando un receptor M2 biotinilado 1 pM ocupado con iperoxo y MACS para la ronda 7 y un receptor M2 marcado con Alexa488 1 pM reaccionado con mostaza de iperoxo y FACS para la ronda 8.

[0172] Expresión de fusiones de nanoanticuerpo de MBP en E. coli. Las secuencias de nanoanticuerpos se subclonaron en un vector pMalp2x modificado (New England Biolabs), que contenía una etiqueta amino-terminal, proteína de unión a maltosa (MBP) escindible de proteasa 3C y una etiqueta carboxi-terminal de 8xHistidina. Los plásmidos se transformaron en células BL21 (DE3) y se indujo la expresión de proteínas en Caldo Terrific añadiendo IPTG hasta 1 mM a una OD600 de 0,8. Después de 24 horas de incubación a 22 °C, se recogieron las células y se obtuvo la proteína periplásmica mediante choque osmótico. Las fusiones de nanoanticuerpos de MBP se purificaron mediante cromatografía de Ni-NTA y la MBP se eliminó usando proteasa 3C. La MBP escindida se separó de los nanoanticuerpos marcados con 8xHis mediante un paso adicional de purificación mediante Ni-NTA. La etiqueta 8xHis se eliminó posteriormente usando carboxipeptidasa A. Para obtener nanoanticuerpos biotinilados, las proteínas se expresaron con una etiqueta de péptido aceptor de biotina carboxiterminal (GLNDIFEAQKIEWHE) y se purificaron como se ha descrito anteriormente. Las proteínas purificadas se biotinilaron in vitro con ligasa BirA y luego repurificado de la mezcla de reacción mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

[0173] Expresión y purificación de proteína G. Se preparó Gi heterotrimérica mediante expresión usando un solo baculovirus para la subunidad de Ga¡1 humana y un segundo virus bicistrónico para las subunidades de Gp1 y Gy2 humanas. La proteína G se expresó en células de insecto HighFive, y luego se purificó como se ha descrito previamente para Gs (Rasmussen et al. 2011). En resumen, la proteína G se extrajo con colato, se purificó mediante cromatografía de Ni-NTA, se cambió el detergente a tampón de dodecil maltósido, y luego se purificó mediante intercambio iónico y se dializó antes de su uso.

[0174] Ensayos de unión al radioligando del receptor M2. El receptor M2 se expresó y purificó como se ha descrito anteriormente. El receptor se reconstituyó luego en partículas de HDL que consisten en apolipoproteína A1 y una mezcla 3:2 (mol:mol) de los lípidos POPC:POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y 1-hexadecanoil-2-(9Z-octadecenoil) -sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) respectivamente, Avanti Polar Lipids). Las reacciones de unión contenían 50 fmol de receptor funcional, 3H N-metil escopolamina (NMS) 0.6 nM, NaCl 100 mM, HEPES 20 mM pH 7.5, BSA al 0.1 %, y ligandos y nanoanticuerpos tal como se indica. Los efectos alostéricos de punto único de nanoanticuerpos se midieron en presencia de iperoxo 10 nM. Los efectos dependientes de la concentración de nanoanticuerpos se midieron en presencia de iperoxo 10 nM. Todas las reacciones tuvieron un volumen de 500 pl. Las reacciones se mezclaron y luego se incubaron durante dos horas. Las muestras se filtraron entonces en una recolectora de 48 pocillos (Brandel) con un filtro que se había tratado previamente con polietilenimina al 0,1 %. Todas las mediciones se tomaron mediante recuento de centelleo líquido, y los experimentos se realizaron al menos por triplicado.

[0175] Muestras de cristalización. El receptor M2 para cristalización se preparó como se ha descrito anteriormente. Cuando se unió a la resina FLAG, la muestra se lavó con una mezcla de tampón de dodecil maltósido (DDM) y tampón que contenía 0,2 % de detergente de lauril maltosa neopentilglicol (MNG; Anatrace). Estos tampones se mezclaron primero en una relación 1:1 (tampón DDM:MNG), luego en relaciones 1:4 y 1:10. En cada paso, la columna de 5 ml se lavó con 10 ml de tampón a una velocidad de flujo de 1 ml/min, y todos los tampones contenían atropina 1 pM. Finalmente, la columna se lavó con 10 ml de tampón MNG, y luego 10 ml de tampón bajo en detergente con agonista (MNG al 0,01 %, hemisuccinato de colesterol al 0,001 %, HEPES 20 mM, pH 7.5, NaCl 100 mM, iperoxo 10 IlM). La muestra se eluyó, se mezcló con un exceso estequiométrico de factor 1,5 de Nb9-8 y un segundo nanoanticuerpo, NbB4. Este nanoanticuerpo se unió a un epítopo diferente de Nb9-8, pero no se resolvió en la estructura cristalina. Después de mezclar, la muestra se incubó durante 30 minutos en hielo, luego se concentró y se purificó mediante exclusión de tamaño en tampón bajo en detergente. La proteína eluida se concentró a A280 = 96, y se congeló en nitrógeno líquido en alícuotas de 7 |_il.

[0176] Cristalización. El receptor M2 purificado se reconstituyó en fase lipídica cúbica mezclándolo con un exceso de 1,5 veces la masa de una mezcla lipídica de monooleína colesterol de 10:1 (p:p). La proteína y los lípidos se cargaron en jeringas de vidrio (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, CA), y luego se mezclaron 100 veces mediante el método de jeringa acoplada (Caffrey y Cherezov 2009). Se colocaron muestras de un volumen de 30 - 100 nl en placas de vidrio de 96 pocillos y se superpusieron en bloque con 600 nl de solución precipitante para cada pocillo. La solución precipitante consistió en PEG300 al 10-20 %, HEPES 100 mM pH 7,2 - 7,9, 1,2,3-heptanotrilo al 1,2% y EDTA 2080 mM pH 8,0.

[0177] Recopilación de datos. Las rejillas de cristales se rasterizaron en las líneas de haz de Advanced Photon Source 23ID-B y 23ID-D. La rasterización inicial se realizó con un haz de 80 |_im por 30 |_im con atenuación de factor 5 y exposición de 1 segundo, y las regiones con difracción fuerte se subrasterizaron con un haz colimado de 10 |_im con una dosis de rayos X equivalente. La recolección de datos se realizó de manera similar con un haz de 10 |_im, pero sin atenuación y con exposiciones típicamente de 1 a 5 s. Se usó un ancho de oscilación de 1 a 2 grados en cada caso, y se compilaron cuñas de 5 a 10 grados para crear los conjuntos de datos finales.

[0178] Reducción y refinamiento de datos. Los datos de difracción se procesaron en HKL2000 (Otwinowski y Minor, 1997), y las estadísticas se resumen en la fig. 6. La estructura se resolvió mediante el reemplazo molecular con la estructura del receptor M2 inactivo (PDB ID: 3UON) y Nb80 (PDB ID: 3POG) como modelos de búsqueda en Phaser (McCoy et al. 2007). La estructura resultante fue refinada iterativamente en PheniX (Afonine et al. 2012) y reconstruida manualmente en Coot (Emsley et al. 2004). Las estadísticas finales de refinamiento se resumen en la fig. 6. Las figuras se prepararon en PyMol (Schrodinger)

Ejemplo 1. Selecciones conformacionales de nanoanticuerpos miméticos de Gi para M2 por despliegue de levaduras

[0179] Se identificaron las proteínas miméticas de Gi conformacionalmente específicas para el receptor muscarínico M2 (para obtener detalles experimentales, ver también la sección "Métodos para los ejemplos" tal como se describió anteriormente). Primero, las llamas se inmunizaron con el receptor M2 unido al agonista iperoxo, y se construyó una biblioteca de dominio variable individual postinmune (VHH) desplegado en fagos. A diferencia del caso del P2AR, las técnicas de biopanning estándar no tuvieron éxito en la identificación de nanoanticuerpos de unión al receptor M2 conformacionalmente selectivos. Con el fin de aislar específicamente dichos nanoanticuerpos, empleamos una estrategia de selección conformacional usando el despliegue de la superficie de levaduras. Se desplegó una biblioteca postinmune de variantes de nanoanticuerpo de llama en la superficie de la levadura y se seleccionó por la capacidad de unirse al receptor M2 ocupado con un agonista, iperoxo. Se realizaron primero cuatro rondas de selecciones mediante MACS, seleccionando cada ronda con el receptor unido al agonista después de la primera selección negativa contra una proteína de membrana no relacionada (receptor adrenérgico p2). A continuación vinieron varias rondas de selección conformacional usando MACS donde primero se hacía selección negativa de la levadura contra el receptor M2 ocupado por un antagonista (tiotropio) seguido de selección positiva con el receptor M2 ocupado por un agonista (iperoxo). Para la novena y última ronda de selección, se empleó una selección basada en FACS. La levadura se tiñó simultáneamente con el receptor M2 marcado con Alexa647 unido al agonista covalente de mostaza de iperoxo y con el receptor M2 marcado con Alexa488 unido a tiotropio. Las células de levadura positivas solo para el marcador Alexa647 se purificaron, seleccionando así esas variantes que se unen preferentemente al receptor ocupado por el agonista. La tinción de la biblioteca durante el proceso de selección en su conjunto muestra el enriquecimiento de las variantes de nanoanticuerpos que se unen al receptor M2 ocupado por el agonista iperoxo, pero no al receptor M2 unido al antagonista tiotropio, particularmente después de aplicar la selección conformacional en las rondas 5-9 ( Figura 1).

Ejemplo 2. Los ensayos de unión a radioligandos confirman que los nanoanticuerpos seleccionados estabilizan el estado activo del receptor M2

[0180] Para determinar si las variantes de nanoanticuerpo que tiñen específicamente al receptor M2 unido al agonista son capaces de estabilizar el estado activo del receptor M2, se realizó un ensayo de unión. Debido a las propiedades alostéricas de los GPCR, las moléculas que estabilizan la conformación activa de un receptor también aumentan la afinidad de agonistas. Se aislaron varios aglutinantes conformacionalmente específicos y se probó su capacidad para inducir un aumento en la afinidad del agonista no covalente iperoxo. Los resultados para uno de estos, el clon de nanoanticuerpos Nb9-8, se muestran en la fig. 2. Además, el Nb9-8 y otros aglutinantes conformacionalmente específicos exhibieron un efecto dependiente de la dosis sobre la capacidad del agonista para desplazar una sonda radiactiva (Fig. 2). El Nb9-8 fue el más potente, con una CE50 de aproximadamente 100 nM. A altas concentraciones, Nb9-8 aumentó la afinidad del receptor M2 por el iperoxo casi en la misma medida que la observada en presencia de la proteína G heterotrimérica Gi (Fig. 2).

emp o . os nanoan cuerpos mm cos e ac an a crsa zac n e recepor un o a agonsa.

[0181] Los intentos iniciales de cristalización con el receptor M2 unido a los agonistas no tuvieron éxito. Se hicieron varios intentos, ya sea fusionando el receptor M2 con una lisozima T4 (T4L) amino-terminal o insertando T4L en el tercer bucle intracelular, tal como se describió originalmente para el receptor adrenérgico p2 (Rosenbaum et al. 2007). Esto se debe probablemente a la flexibilidad de la superficie del receptor intracelular en ausencia de una proteína estabilizadora. Por lo tanto, se usó un nanoanticuerpo mimético de proteína Gi para el receptor M2 para permitir la cristalización del receptor M2 en su conformación activa.

[0182] El receptor M2 se purificó en presencia de iperoxo 10 pM, y pudimos obtener cristales de receptor M2 unido a iperoxo en complejo con Nb9-8 mediante cristalografía de mesofase lipídica (para obtener detalles experimentales, ver también la sección "Métodos para los ejemplos" tal como se describió anteriormente). La estructura se resolvió por microdifracción en las líneas de haz de Advanced Photon Source 23ID-B y 23ID-D. Si bien se han cristalizado varios GPCR en complejo con agonistas, solo el P2AR y la rodopsina muestran un estado completamente activo con espacio adecuado para permitir la unión a la proteína G (Rasmussen et al.

2011; Park et al. 2008). Tal como se anticipó sobre la base de estudios funcionales, el receptor M2 en complejo con Nb9-8 muestra cambios estructurales similares, con la unión de Nb9-8 a la superficie intracelular del receptor (Fig. 5). Las coordenadas y los factores de estructura del receptor M2 activo en complejo con Nb9-8 e iperoxo se depositan en el Protein Data Bank.

Ejemplo 4. Epítopo de unión del nanoanticuerpo mimético de Gi para M2 Nb9-8

[0183] Nb9-8 se une a una cavidad intracelular de M2R (SEQ ID N.°: 153). El epítopo de unión está compuesto por los siguientes elementos: las cadenas laterales de los residuos T56 y N58 en el bucle intracelular que enlaza TM1 y TM2, las cadenas laterales de R121, C124 y V125 de TM3, las cadenas laterales de P132, V133 y R135 del bucle intracelular que enlaza TM3 y TM4, las cadenas laterales de Y206, 1209 y S213 de TM5, las cadenas laterales de S380, V385, T388 y 1389 y los átomos de la cadena principal de R381 que forman parte de TM6 , los átomos de la cadena principal de C439 y Y440 y las cadenas laterales de C443, A445 y T446 de TM7.

Ejemplo 5. Selección de nanoanticuerpos funcionales usando el nanoanticuerpo mimético de Gi para M2 Nb9-8.

[0184] Para seleccionar ligandos funcionales para el receptor M2, la biblioteca resultante de las primeras cuatro rondas de selección de MACS descritas anteriormente se sometió a selecciones adicionales para identificar variantes de nanoanticuerpos que se unen al lado extracelular del receptor. Primero, se realizaron dos rondas de selecciones de MACS seleccionando la capacidad de las variantes para captar Nb9-8 en presencia del receptor M2, mientras se hacía selección negativa de las variantes que se unen a Nb9-8 en ausencia del receptor M2. Esta estrategia de selección enriquece los clones que inducen una conformación activa del receptor M2 o son compatibles con ella, pero que también se unen a un sitio distinto del de Nb9-8. Para seguir seleccionando las variantes que se unen específicamente al lado extracelular del receptor M2, se realizó una selección negativa contra el receptor M2 en presencia de galamina (que es un ligando muscarínico alostérico), mientras se seleccionaron positivamente aquellos clones que se unen al receptor M2 en ausencia de galamina. La tinción del proceso de selección en su conjunto muestra el enriquecimiento de las variantes de nanoanticuerpos que se unen al receptor M2 y a Nb9-8 simultáneamente (Fig. 3). Además, estos clones son sensibles a la presencia de galamina, lo que sugiere que se unen en el sitio alostérico/ortostérico del receptor. Las propiedades de unión alostérica de varios de estos clones se midieron mediante un ensayo de unión (Fig. 4). Entre las variantes caracterizadas, el clon B4 (SEQ ID N.°: 16) y otros causaron una disminución en la unión del radioligando N-metilescopolamina solo en presencia de un agonista, consistente con la capacidad del clon para unirse en el sitio alostérico del receptor M2.

Tabla 1. Lista de nanoanticuer os

Tabla 2. FR y CDR de nanoanticuerpos selectivos en cuanto a conformación M2R

T l . E ml r r il lin m ríni M2

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformación activa que está dirigido contra (y es capaz de unirse específicamente a) una conformación activa de un receptor muscarínico M2 (M2R), donde el anticuerpo VHH comprende una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones marco (FR1 a FR4) y tres regiones determinantes complementarias (CDR1 a CDR3) de acuerdo con la fórmula: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 31, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 53, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 75; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 32, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 54, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 76; o en donde CDR1 es la SEQ ID N.°: 41, y CDR2 es la SEQ ID N.°: 63, y CDR3 es la SEQ ID N.°: 85.

2. Anticuerpo VHH según la reivindicación 1, donde el anticuerpo VHH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N.°: 1, ^s E^q ID N.°: 2 y SEQ ID N.°: 11.

3. Anticuerpo VHH según la reivindicación 1, donde el anticuerpo VHH es un mimético de proteína G.

4. Anticuerpo VHH según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo VHH está comprendido en un polipéptido.

5. Anticuerpo VHH según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo VHH está inmovilizado sobre un soporte sólido.

6. Complejo, preferiblemente un complejo cristalino, que comprende el receptor muscarínico M2 (M2R) y un anticuerpo VHH de M2R selectivo en cuanto a conformación activa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y opcionalmente al menos otro ligando receptor selectivo en cuanto a conformación.

7. Composición no celular, preferiblemente una composición de membrana, que comprende el complejo según la reivindicación 6.

8. Composición celular aislada que comprende el complejo según la reivindicación 6.

9. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo VHH según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Método para identificar compuestos selectivos en cuanto a conformación que tienen como diana el receptor muscarínico M2, el método comprende los pasos de

(i) proporcionar un complejo que comprende un receptor muscarínico M2 (M2R) y un anticuerpo VHH de M2R selectivo en cuanto a conformación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde M2R está en una conformación activa, y

(ii) proporcionar un compuesto de prueba y

(iii) evaluar la unión selectiva del compuesto de prueba al M2R comprendido en el complejo.

12. Uso del anticuerpo VHH según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como medio para la cristalización.

13. Uso del anticuerpo VHH según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el complejo de la reivindicación 6 como medio para la detección de compuestos y el descubrimiento de fármacos o como medio para capturar y/o purificar moléculas.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformación activa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos uno de entre un vehículo, un adyuvante o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

15. Uso in vitro del anticuerpo VHH selectivo en cuanto a conformación activa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para modular la actividad de señalización de M2R.