BR112013032451B1 - Domínio variável simples de imunoglobulina, usos e métodos de produção do mesmo, complexo, sequência de ácidos nucleicos, vetor recombinante, bem como método de captura e/ou purificação de um complexo compreendendo um gpcr e uma proteína g - Google Patents

Abstract

DOMÍNIO VARIÁVEL SIMPLES DE IMUNOGLOBULINA, COMPLEXOS, SEQUENCIA DE AMINOÁCIDOS, VETOR, E USOS DO REFERIDO DOMÍNIO, MÉTODO DE CAPTURA E/OU PURIFICAÇÃO DE UM COMPLEXO COMPREENDENDO UM GPCR E UMA PROTEÍNA G E MÉTODO DE PRODUÇÃO E RASTREAMENTO DO REFERIDO DOMÍNIO. A presente invenção refere-se ao campo da biologia estrutural e da sinalização do receptor acoplado à proteína G (GPCR). Em particular, a presente invenção refere-se a domínios de ligação direcionados contra e/ou ligando-se especificamente a complexos GPCR:G. Também são oferecidos sequências de ácidos nucleicos codificando tais domínios de ligação e células expressando ou capazes de expressar tais domínios de ligação. Os domínios de ligação da presente invenção podem ser usados como ferramentas universais para a caracterização estrutural e funcional de receptores acoplados à proteína G em um complexo com proteínas G heterotriméricas a jusante e ligados a vários ligandos naturais ou sintéticos, para investigar os aspectos dinâmicos da ativação das proteínas G, assim como para o rastreamento e a descoberta de novas drogas que fazem uso de complexos proteicos GPCR:G.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biologia estrutural e sinalização de receptores acoplados à proteína G (GPCR). Em particular, a presente invenção refere-se a domínios de ligação direcionados contra e/ou ligando-se especificamente a complexos GPCR:proteína G. Também são oferecidas sequências de ácidos nucleicos codificando tais domínios de ligação e células expressando ou capazes de expressar tais domínios de ligação. Os domínios de ligação da presente invenção podem ser usados como ferramentas universais para a caracterização estrutural e funcional de receptores acoplados à proteína G em um complexo com proteínas G a jusante e ligadas a vários ligantes naturais ou sintéticos, para investigar os aspectos dinâmicos da ativação da proteína G, assim como para esforços de rastreamento e descoberta de fármacos que utilizem complexos GPCR:proteína G.

Antecedentes

[002] Receptores de sete transmembranas (7TMRs), também chamados de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), constituem a maior classe de receptores no genoma humano e são a classe de proteínas mais comumente visadas para terápicos medicinais. Durante as últimas três décadas houve um avanço significativo na compreensão de diversos GPCRs, desde sua farmacologia até sua caracterização funcional in vivo. Os recentes estudos estruturais de alta resolução forneceram conhecimento dos mecanismos moleculares da ativação e atividade constitutiva dos GPCR (por exemplo Rasmussen et al. 2011). Entretanto, ainda faltam os detalhes moleculares de como os GPCRs interagem com e regulam a atividade de seus alvos a jusante. As estruturas de GPCRs em complexo com suas proteínas a jusante são de grande interesse não só porque essas interações são farmacologicamente relevantes, mas também porque o conhecimento atômico das interações intermoleculares é essencial para desvendar os segredos da seletividade funcional, a capacidade de diferentes agonistas para forçar efeitos a jusante distintos a partir de um único tipo de receptor. Os recentes dados estruturais suportam a ideia de que os GPCRs, apesar de seu tamanho pequeno, são máquinas alostéricas sofisticadas com múltiplas saídas sinalizadoras.

[003] Os GPCRs, uma vez ativados, transportam seus sinais de uma maneira GTP-dependente via um complexo de três proteínas conhecidas como proteínas G heterotriméricas, ou Gαβy. A ligação de ligantes extracelulares a GPCRs modula sua capacidade de catalisar a troca GDP-GTP em Gαβy, regulando assim o nível intracelular de mensageiros secundários. O heterotrímero Gαβy inativo é composto de dois elementos principais, Gα^GDP e o heterodímero Gβy. O Gβy sequestra elemento interruptor II em Gα de modo que ele fica incapaz de interagir com sistemas mensageiros secundários, tais como aqueles que envolvem cAMP, diacilglicerol e cálcio. GPCRs ativados catalisam a liberação de GDP de Gα, permitindo que o GTP se ligue e libere a subunidade Gα-GTP ativada. Neste estado, o interruptor II forma uma hélice estabilizada pelo y-fosfato do GTP permitindo que ele interaja com efetores tais como adenilil ciclase. Embora muito avanço tenha ocorrido na compreensão de como as subunidades Gα interagem com e regulam a atividade de seus alvos a jusante, ainda não está claro como GPCRs ativados iniciam este processo catalisando a troca de nucleotídeos em Gαβy.

[004] Os esforços para descobertas de fármacos geralmente concentram-se em ligantes de molécula pequena que se ligam competitivamente a um sítio catalítico ou ativo particular, usando modelos estáticos do alvo como ponto de partida. Este método identificou e validou múltiplos terápicos de sítio ativo viáveis em uso atualmente. No entanto, segundo refletido pelo alto índice de fracasso de novos compostos medicamentosos (uma estimativa de apenas 8% de terápicos clínicos de fase I eventualmente conseguem a aprovação da Food and Drug Administration, a um custo conservativo de $800 milhões por fármaco), muitos esforços são infrutíferos e frequentemente os alvos são abandonados depois de serem considerados não drogáveis (Lee & Craik, 2009). Uma parte considerável desses fracassos deve-se ao fato de que a conformação mais proeminente do alvo em questão não corresponde à conformação "drogável" à qual um fármaco deve se ligar para ser eficaz para a indicação terapêutica. Por exemplo, os esforços para obter uma estrutura de GPCR no estado ativo ligado a um agonista mostraram-se difíceis devido à instabilidade inerente desse estado na ausência de uma proteína G. Recentemente foi possível obter estruturas de um estado ativo de um GPCR, fazendo-se uso de nanocorpos estabilizantes conformacionalmente seletivos ou Xaperones® que mimetizam proteínas G e aumentam a afinidade para agonistas no sítio ortostérico (Rasmussen et al. 2011). Isto demonstra o poder do Xaperones® de trancar a estrutura dos alvos medicamentosos mais desafiadores em uma conformação terapeuticamente relevante (Steyaert & Kobilka, 2011) e sua utilidade para a descoberta de fármacos vetorizados permitindo o rastreamento específico de fármacos em potencial com maior sensibilidade e seletividade para um alvo particular (WO2012007593). Uma limitação desta abordagem tecnológica é que para cada alvo de GPCR é necessário identificar uma nanocorpo estabilizante específico, o que não só é demorado e dispendioso, como também implica a disponibilidade de diferentes ferramentas, como material biológico com fins de imunização e seleção, entre outros.

[005] O desenvolvimento de novas ferramentas simples para análise estrutural e farmacológica de alvos medicamentosos de GPCR é, portanto, necessário.

Sumário da Invenção

[006] Desvendar os aspectos estruturais e funcionais dos GPCRs em complexo com suas proteínas G heterotriméricas a jusante e ligados a vários ligantes naturais e sintéticos é valioso tanto para compreender os mecanismos de transdução de sinal dos GPCR como para os esforços de descoberta de fármacos. Por exemplo, a obtenção da estrutura do complexo ternário no estado ativo do agonista, do GPCR e da proteína G até agora não foi bem-sucedida mas é altamente desejada na biologia estrutural da transdução de sinal porque esta biologia é pobremente compreendida. A cristalogênese desse complexo mostrou-se extremamente difícil porque um integrante (o receptor) precisa de detergentes para ser solubilizado ao passo que a proteína G é instável em detergentes. Também, os nucleotídeos que são requeridos para a formação do complexo também dissociam o complexo em um processo transitório.

[007] Portanto, e de forma muita inesperada, os inventores identificaram ferramentas que estabilizam complexos de GPCRs e proteínas G, que permitiram que eles capturassem e purificassem tais complexos, e finalmente cristalizassem tais complexos. Isto vai facilitar a identificação de ligantes ou compostos medicamentosos por, por exemplo, rastreamento ou desenho virtual baseado na estrutura, rastreamento de alto rendimento ou descoberta de fármacos baseada em fragmentos (vide por exemplo o Exemplo 10). Mais especificamente, os inventores identificaram domínios de ligação, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, adequados para a análise estrutural e funcional de um composto no estado ativo composto de um agonista, GPCR e proteína G (vide por exemplo o Exemplo 4-7). Curiosamente, foi demonstrado que alguns desses domínios de ligação seletivos para o complexo GPCR:proteína G são especificamente direcionados contra a proteína G, e não contra o GPCR. Por exemplo, foram identificados domínios de ligação que se ligam à Gs na interface de Gas e Gβy, sem fazer contato com o receptor beta-adrenérgico (vide por exemplo o Exemplo 3), e, portanto, serão úteis para capturar e estabilizar outros receptores acoplados à Gs, como foi demonstrado para o receptor da arginina vasopressina 2 (V2R) (vide por exemplo o Exemplo 9). Por conseguinte, constitui uma vantagem particular que domínios de ligação sejam direcionados contra a proteína G de um complexo GPCR:proteína G, já que tal domínio de ligação pode ser usado como uma ferramenta genérica para estabilizar e capturar complexos no estado ativo da gama de GPCRs que interagem com aquela proteína G particular.

[008] Por conseguinte, de acordo com um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um domínio de ligação que é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G. Mais especificamente, o domínio de ligação descrito nesta invenção se liga com maior afinidade ao complexo GPCR:proteína G em comparação com a ligação à proteína G isolada e/ou ao GPCR isolado, respectivamente. Também o domínio de ligação descrito nesta invenção melhora a finidade de uma proteína G para um GPCR. Por conseguinte, a presente invenção oferece domínios de ligação direcionados contra e/ou ligando-se especificamente a um epítopo conformacional de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e estabiliza ou tranca o complexo em um estado conformacional particular, mais especificamente um estado conformacional ativo.

[009] Em geral, o domínio de ligação descrito nesta invenção pode se ligar a qualquer epítopo conformacional que seja disponibilizado ou accessível por um complexo de um GPCR e uma proteína G. Esses epítopos conformacionais podem ser representados pelas proteínas individuais compreendidas no complexo, e/ou só podem ser representadas mediante a formação do complexo. Além disso, esses epítopos conformacionais podem ser representados ou não pelas proteínas individuais isoladas. De acordo com uma modalidade particular, o domínio de ligação descrito nesta invenção liga-se especificamente à proteína G compreendida no complexo, e não ao GPCR.

[010] Tipicamente, por natureza, as proteínas G são uma forma ligada a nucleotídeo. Mais especificamente, as proteínas G (ou pelo menos a subunidade α) são ligadas seja ao GTP ou ao GDP dependendo do estado de ativação de um GPCR particular, como descrito mais adiante neste relatório. A ligação de um agonista a um GPCR promove interações com o heterotrímero Gαβy ligado ao GDP levando à troca de GDP por GTP em Gα, e a dissociação funcional da proteína G em subunidades Gα-GTP e Gβy, o que é necessário para maior sinalização intracelular. Em uma modalidade específica, o domínio de ligação descrito nesta invenção liga-se especificamente a e estabiliza um complexo GPCR:proteína G na ausência de nucleotídeos, mais especificamente os domínios de ligação ligam-se a e estabilizam um complexo GPCR:proteína G em que a proteína G encontra-se em uma forma livre de nucleotídeos. Em uma modalidade particular, o domínio de ligação descrito nesta invenção vai ligar-se especificamente a um epítopo conformacional na interface entre a subunidade alta e a subunidade gama da referida proteína G, e dessa forma bloqueia o sítio de ligação de GDP/GTP e interfere na ligação de GDP/GTP. Assim sendo, e surpreendentemente, o domínio de ligação descrito nesta invenção previne ou inibe a dissociação do complexo GPCR:proteína G na presença de nucleotídeos, em particular nucleotídeos de guanina ou análogos dos mesmos, tais como GTPyS. também, o domínio de ligação descrito nesta invenção previne ou inibe a ligação de nucleotídeos à proteína G.

[011] De preferência, o domínio de ligação descrito nesta invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR, uma proteína G, e um ou mais ligantes de receptores. Tipicamente, o ligante de receptor será um agonista ou um modulador alostérico positivo, ou uma combinação dos mesmos.

[012] De acordo com uma outra modalidade preferida, o domínio de ligação descrito nesta invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Gs e uma proteína Gs; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Gi e uma proteína Gi; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Gt e uma proteína Gt; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Ggust e uma proteína Ggust; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Gz e uma proteína Gz; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Golf e uma proteína Golf; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína Gq e uma proteína Gq; ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína G12 e uma proteína G12: ou a um complexo compreendendo um receptor acoplado à proteína G13 e uma proteína G13. O GPCR e/ou a proteína G compreendidos no complexo podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes, em particular de uma espécie de mamífero. De preferência, o GPCR é uma proteína humana.

[013] Em geral, um domínio de ligação da invenção pode ser qualquer molécula de ocorrência não natural, ou parte da mesma, que seja capaz de se ligar especificamente a um complexo GPCR:proteína G. Particularmente, o domínio de ligação descrito nesta invenção é um domínio variável simples de imunoglobulina compreendendo uma sequência aminoacídica que compreende 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1).

[014] De preferência, o domínio de ligação descrito nesta invenção é um domínio variável simples de imunoglobulina derivado de uma espécie Camelidae, e particularmente é um nanocorpo ou VHH.

[015] De acordo com modalidades específicas, o domínio de ligação descrito nesta invenção é um domínio variável simples de imunoglobulina compreendendo uma sequência aminoacídica que compreende 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1); e em que CDR1 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 13-18, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 13-18, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 13-18, d) em que CDR2 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 25-30, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 25-30, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 25-30, e em que CDR3 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 37-42, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 37-42, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 37-42.

[016] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção oferece um domínio variável simples de imunoglobulina compreendendo uma sequência aminoacídica que compreende 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1); em que CDR1 é SEQ ID No: 13; em que CDR2 é SEQ ID N°: 25; e em que CDR3 é SEQ ID N°: 37.

[017] De acordo com uma modalidade muito específica, o domínio de ligação, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina, tem uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1 a 6.

[018] Além disso, os domínios de ligação descritos nesta invenção também podem estar compreendidos em um polipeptídio. Também, os domínios de ligação podem ser imobilizados sobre um suporte sólido.

[019] Em um aspecto particular, a presente invenção refere-se a um domínio de ligação que é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a uma proteína G.

[020] Um outro aspecto da invenção visa um complex compreendendo um domínio de ligação descrito nesta invenção. Em particular, o complexo compreende um GPCR, uma proteína G, e opcionalmente um ligante de receptor. Em certas aplicações, o complexo descrito nesta invenção é cristalino.

[021] Além disso, a invenção também oferece sequências de ácidos nucleicos, em particular uma sequência de ácidos nucleicos codificando qualquer sequência aminoacídica de qualquer um dos domínios de ligação descritos nesta invenção, assim como vetores recombinantes compreendendo qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos descritas nesta invenção. Aspectos particularmente preferidos são células compreendendo qualquer um dos vetores ou ácidos nucleicos descritos nesta invenção, e por conseguinte, que podem expressar ou são capazes de expressar um GPCR e/ou uma proteína G. Culturas de células de células de acordo com a invenção assim como preparações de membranas derivadas das mesmas também se enquadram no escopo da presente invenção.

[022] Os domínios de ligação, complexos e células descritos neste relatório podem ser úteis em vários contextos e aplicações. Assim, por conseguinte, um aspecto da invenção refere-se ao uso de um domínio de ligação descrito nesta invenção para estabilizar um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e opcionalmente um ligante de receptor, em um estado conformacional funcional, mais especificamente em um estado conformacional ativo. Em uma modalidade específica, os domínios de ligação descritos nesta invenção podem ser usados para prevenir a dissociação do complexo na presença de nucleotídeos, em particular nucleotídeos de guanina ou análogos dos mesmos, tais como GTPyS. Domínios de ligação como ferramentas para estabilizar complexos GPCR:proteína G e bloquear o GPCR em um estado conformacional funcional, de preferência um estado conformacional ativo, são portanto muito úteis para uma gama de aplicações, conforme descrito mais adiante.

[023] Constitui um objetivo da invenção o uso de um domínio de ligação descrito nesta invenção para cristalizar e/ou resolver a estrutura de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e opcionalmente um ligante de receptor.

[024] Também abrangido pelo escopo da presente invenção está o uso de um domínio de ligação descrito nesta invenção ou de uma célula ou uma preparação de membrana derivada do mesmo, descrito nesta invenção, para rastrear compostos que modulam a atividade de sinalização do GPCR.

[025] Além disso, os domínios de ligação descritos nesta invenção podem ser usados para capturar uma ou mais proteínas interatuantes, em particular proteínas que interagem com a proteína G e/ou com o GPCR.

[026] De acordo com modalidades específicas, a presente invenção oferece um método de captura e/ou purificação de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer um domínio de ligação descrito nesta invenção, e b) deixar que o domínio de ligação se ligue a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor, e c) opcionalmente, isolar o complexo formado na etapa b).

[027] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção refere-se a um método de determinação da estrutura cristalina de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer um domínio de ligação descrito nesta invenção, e b) deixar que o domínio de ligação se ligue a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor, e c) cristalizar o complexo formado na etapa b).

[028] Alguns dos domínios de ligação descritos nesta invenção podem ter utilidade terapêutica. Portanto, também constitui um objetivo da invenção usar os domínios de ligação descritos nesta invenção para modular a sinalização do receptor GPCR, em particular a sinalização do receptor GPCR mediada pela proteína G.

[029] A presente invenção abrange ainda um método de produção de um domínio de ligação direcionado contra e/ou ligando-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) Expressar em um sistema de expressão celular adequado um ácido nucleico descrito nesta invenção, e opcionalmente, b) isolar e/ou purificar o domíndio de ligação.

[030] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de rastreamento de domínios de ligação direcionados contra e/ou ligando-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer uma pluralidade de domínios de ligação, e b) rastrear a referida pluralidade de pluralidade de domínios de ligação quanto a um domínio de ligação que se liga a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e c) isolar o domínio de ligação que se liga ao complexo.

[031] Outros objetivos da invenção ficarão claros a partir da descrição a seguir.

Breve Descrição dos Desenhos

[032] Figura 1: Ciclo da proteína G para o complexo β 2AR:Gs. a, A ligação de um agonista extracelular ao β2AR leva a rearranjos conformacionais das extremidades citoplasmáticas de segmentos transmembrana que permitem que o heterotrímero Gs (α, β, e y) se ligue ao receptor (R, R*). O GDP é liberado da subunidade α mediante a formação de um complexo R:G. O GTP se liga à subunidade α sem nucleotídios resultando na dissociação das subunidades das α e βy do receptor. As subunidades regularm suas respectivas proteínas efetoras adenilil ciclase (AC) e canais de Ca2+. O heterotrímero Gs se refaz das subunidades α e βy depois da hidrólise de GTP para GDP na subunidade α. b, O complexo β 2AR:proteína Gs livre de nucleotídeos purificado mantido em micelas detersivas. A subunidade Gsα consiste em dois domínios, o domínio Ras (αRas) e o domínio α-helicoidal (αAH). Ambos estão envolvidos na ligação de nucleotídeos. No estado livre de nucleotídeos, o domínio αAH tem uma posição variável em relação αRas.

[033] Figura 2: Formação de um complexo β2AR:Gs estável. Um complexo β2AR:Gs estável foi obtido pelos efeitos combinados de: 1) ligação de um agonista de alta afinidade do receptor com uma taxa de dissociação extremamente lenta (conforme descrito em Rasmussen et al., 2011); 2) formação de um complexo livre de nucleotídeos na presença de apirase que hidrolisa o GDP liberado impedindo que ele volte a se ligar e cause uma interação R:G menos estável; e 3) troca troca de detergente de DDM para MNG-3 que estabiliza o complexo.

[034] Figura 3: Efeito de análogos nucleotídicos, pH, e nanocorpos na estabilidade do complexo β2AR:Gs. a) Gel filtração analítica mostrando que os nucleotídeos GDP e GTPyS (0,1 mM) causam dissociação do complexo β2AR-365:Gs. b) Os fosfatos pirofosfato e forcarnet (usados a 5 mM) que se parecem com os grupos fosfato nucleotídico não causaram romprimento do complexo. Eles serviram de aditivos uma vez que melhoraram o crescimento de cristais tanto co complexo T4L-β2AR:Gs (em nanocorpos), quanto do T4L-β2AR:Gs:Nb37, e T4L-β2AR:Gs:Nb35. c) O limite de pH foi determinado para orientar a preparação de telas de cristalização. Pelo mesmo motivo o efeito da resistência iônica (dados não mostrados) foi determinado usando NaCl em várias concentrações. O complexo é estável em 20, 100, e 500 mM mas dissocia em NaCl 2,5 M. d) O nanocorpo 35 (Nb35, linha tracejada vermelha) se liga ao complexo ternário T4L-β2AR:Gs:BI167107 (linha cheia azul) para formar o complexo R:G:Nb35 (linha cheia vermelha) que é insensível ao tratamento com GTPyS (linha cheia verde) em contraste com o complexo R:G tratado (linha pontilhada verde). O Nb35 e o Nb37 se ligam a epítopos separados no heterotrímero Gs para formar um complexo R:G:Nb35:Nb37 (linha cheia roxa). e) O nanocorpo 36 (Nb36, linha pontilhada vermelha) se liga ao complexo R:G (linha cheia preta) para formar o complexo R:G:Nb36 (linha cheia vermelha) que é menos sensível ao tratamento com GTPyS (linha cheia verde). O Nb36 e o Nb37 se ligam a epítopos separados no heterotrímero Gs para formar um complexo R:G:Nb36:Nb37 (linha cheia roxa). f) O nanocorpo 37 (Nb37, linha verde) se liga ao complexo R:G (linha cheia preta) para formar o complexo R:G:Nb37 (linha cheia vermelha). g) O complexo R:G:Nb37 é insensível ao tratamento com GTPyS (linha cheia azul) em contraste com o complexo R:G tratado (linha tracejada azul).

[035] Figura 4: Efeito estabilizante do MNG-3 no complex R:G. a) Gel filtração analítica de complexos β2AR-365:Gs purificados em DDM (em preto), MNG-3 (em azul), ou dois análogos de MNG-3 (em vermelho e verde) subsequente à incubação por 48 horas a 4°C. Em contraste com o DDM os complexos R:G são estáveis em detergentes MNG. b) Efeito da diluição de β2AR purificado não ligado em DDM ou MNG-3 abaixo da concentração micelar crítica (CMC) do detergente segundo analisado por ligação de saturação de 3H-di-hidro alprenolol (3H-DHA). A diluição do β2AR mantido em DDM 1000 vezes abaixo da CMC causa perda na ligação de 3H-DHA (pontos de dados pretos) depois de 20 segundos. Em contrasnte, o β2AR em MNG-3 diluído vezes abaixo da CMC manteve plena capacidade de se ligar ao radioligando depois de 24 horas.

[036] Figura 5: Pureza e homogeneidade do complexo R:G. a) SDS-PAGE/mancha azul de Coomassie analítica de amostras obtidas em vários estágios de purificação de T4L-β2AR:Gs. O receptor ligado ao agonista BI167107, desfosforilado, e desglicosilado em quantidade excessiva do heterotrímero Gs é usado para eficiência de acoplamento ideal com a fração funcional da proteína G. A purificação funcional de Gs fica arquivada através de sua interação com o receptor imobilizado na resina M1 ao passo que a Gs não funcional/não ligante é removida. b) Um perfil de eluição representativo de uma de quatro gel filtrações preparatórias consecutivas com fracionamento está indicado em vermelho. As frações contendo o complexo R:G foram agrupadas nas linhas tracejadas indicadas, concentradas por centrifugação e analisadas quanto à pureza e homogeneidade por SDS-PAGE/azul de Coomassie (a, segunda última raia à direita), gel filtração em c), e por cromatografia de troca iônica em d). O painel superior mostra o perfil de eluição da IEC analítica do complexo β2AR-365:Gs que foi tratado com ÀPPase antes da formação do complexo em comparação com um complexo que não foi desfosforilado resultando em uma preparação heterogênea (painel inferior). O material menos homogêneo nas frações fora das linhas tracejadas indicadas em b) foi usado para experiências de gel filtração analítica do complexo R:G na presença de vários químicos (exemplos na figura 1).

[037] Figura 6: Fluxograma dos procedimento de purificação para preparar o complexo R:G com Nb35.

[038] Figura 7: Purificação de Nb35 e determinação da proporção de misturação de R:G:Nb. a) Cromatografia de troca iônica preparatória subsequente à purificação por cromatografia por afinidade de níquel do Nanocorpo 35 (Nb35). O nanocorpo eluiu em duas populações (mostradas em vermelho) como um pico menor e um pico homogêneo maior que foi coletado, concentrado por centrifugação, e usado para cristalografia subsequente à determinação da proporção de misturação de apropriada com o complexo R:G como mostrado em (b). b) O complexo T4L-β 2AR:Gs ligado a agonista foi misturado com um ligeiro excesso de Nb35 (relação molar 1 para 1,2 de complexo R:G para Nb35) com base nas suas concentrações de proteína e verificado por gel filtração analítica.

[039] Figura 8: Cristais do complexo T4L-β2AR:Gs:Nb35 em mesofase semelhante à esponja.

[040] Figura 9: Estrutura geral do complexo β2AR:Gs. a, O acondicionamento de treliça ("lattice packing") do complexo mostra camadas alternadas de receptor e proteína G no cristal. Contatos abundantes são formados entre as proteínas nas camadas aquosas. b, A estrutura geral do conteúdo de unidades assimétricas mostra o β2AR (verde) ligado a um agonista (esferas amarelas) e engajado em extensas interações com Gsa (laranja). Gas junto com Gβ (ciano) e Gy (roxo) constituem a proteína G heterotrimérica Gs. Um nanocorpo de ligação à Gs (Nb35, vermelho) se liga à proteína G entre as subunidades a e β . O nanocorpo (Nb35) facilita a cristalização, assim como a lisozina T4 (magenta) fundida ao aminoterminal do β2AR. c, O complexo biológico omitindo auxiliares de cristalização, mostrando sua localização e orientação em uma membrana celular.

[041] Figura 10: Interações de Nb35 com Gs no complexo T4L-β 2AR:Gs:Nb35 ligado ao BI-167107. a, Duas vistas representativas das interações de CDR1 (representação de preenchimento do espaço) de Nb35 (vermelho) com Gβ (preenchimento do espaço, ciano). b, Duas vistas representativas das interações de CDR3 (representação de preenchimento do espaço) of Nb35 (vermelho) com GαS (preenchimento do espaço, laranja) e Gβ (preenchimento do espaço, ciano). Interagindo com GαS e Gβ, o Nb35 pode reduzir a flexibilidade conformacional do complexo. c. Duas vistas representativas das interações das regiões de estrutura de Nb35 (representação de preenchimento do espaço, vermelho) com GαS (laranja).

[042] Figura 11: Contatos de cristal entre Nb35 e subunidades GαS de complexos adjacentes. Contatos de cristal envolvendo Nb35 (vermelho, representação de preenchimento do espaço) e GαS (laranja) do complexo (a) associado à simetria -x,y-1/2,-z+1 e do complexo (b) associado à simetria x,y-1,z.

[043] Figura 12: Comparação de estruturas β2AR ativas e inativas. a, Vistas lateral e citoplasmática da estrutura β2AR:Gs (verde) comparada com a estrutura β2AR inativa ligada ao carazolol (azul; Rosenbaum et al., 2007). Alterações estruturais significativas são vistas para o domínio intracelular de TM5 e TM6. TM5 é expandido por duas voltas helicoidais ao passo que TM6 é deslocado para fora por 14Â segundo medido nos carbonos α de Glu268 (seta amarela) nas duas estruturas. b, β2AR:Gs comparado com a estrutura β2AR:Nb80 no estado ativo estabilizado com nanocorpo (laranja, Rasmussen et al., 2011). c, As posições dos resíduos nos motivos E/DRY e NPxxY e outros resíduos essenciais das estruturas β2AR:Gs e β2AR:Nb80 vistas do lado citoplasmático. Todos os resíduos ocupam posições muito parecidas exceto o Arg131 que na estrutura β2AR:Nb80 interage com o nanocorpo.

[044] Figura 13: Vistas da densidade eletrônica para resíduos na interface R:G. a) O motivo D/ERY na extremidade citoplasmática de TM3. b) Interação de acondicionamento entre Arg131 do motivo E/DRY e Tyr391 da GαS C-terminal. c) O NPxxY na extremidade citoplasmática de TM7. d) Interações de Thr68 e Tyr141 com Asp130 do motivo E/DRY. O Phe139 de IL2 é enterrado em uma bolsa hidrofógica em GαS. e) A alça β1-α1 (alça P) da GαS envolvida em ligação nucleotídica. Mapas de densidade eletrônica são mapas 2Fo- Fc contornados em 1 sigma.

[045] Figura 14: Receptor:G protein interactions. a, b A hélice α5 da GαS atraca em uma cavidade formada no lado intracelular do receptor pela abertura de hélices transmembrana 5 e 6. a. No núcleo transmembrana, as interações são principalmente não polares. Uma exceção envolve o acondicionamento de Tyr391 da hélice α5 contra Arg131 da sequência DRY conservada em TM3 (vide também a Figura 13). Arg131 também se acondiciona contra Tyr da sequência NPxxY conservada em TM7. b. Quando a hélice α5 deixa o receptor ela forma uma rede de interações polares com TM5 e TM3. c, Os resíduos Thr68 e Asp130 do receptor interagem com a hélice IL2 di β2AR via Tyr141, posicionando a hélice de modo que o Phe139 do receptor atraca em uma bolsa hidrofóbica na superfície da proteína G, dessa forma ligante estruturalmente interações receptor-proteína G com o motivo DRY altamente conservado do β2AR.

[046] Figura 15: Alterações conformacionais na Gαs. a, Uma comparação da Gαs no complexo β2AR:Gs (laranja) com a Gαs ligada ao GTPyS (cinza) (PDB ID: 1AZT; Sunahara et al., 1997). O GTPyS está mostrado como esferas. O domínio helicoidal da Gαs (GαsAH) exibe um deslocamento dramática em relação a sua posição no estado ligado ao GTPyS. b, A hélice α5 da Gas é girada e deslocada em direção ao β2AR, perturbando a alça β 6-a5 que do contrário faz parte da bolsa de ligação do GTPyS. c, A alça β 1-a1 (alça P) e a alça β 6-a5 da Gas interage com os fosfatos e o anel purina, respectivamente, do GTPyS na estrutura GTPyS-Gas. d, As alças β 1-a1 e β6-a5 são rearranjadas na estrutura β2AR:Gs livre de nucleotídeo.

[047] Figura 16: Nb37 inibe a ligação de GTPyS à Gas. Bodipy- GTPyS (100 nM) foi incubado com 1 μM de Gas purificada e o aumento de fluorescência foi medido em tempo real na presença de concentrações crescentes de Nb37.

[048] Figura 17: Nb35 não afeta a ligação de GTPyS à Gas. Bodipy-GTPyS (100 nM) foi incubado com 1 μM de Gas purificada e o aumento de fluorescência foi medido em tempo real na presença de concentrações crescentes de Nb35.

[049] Figura 18: Nb35 inibe a ligação de GTPyS ao heterotrímero Gsaβy. Bodipy-GTPãS (100 nM) foi incubado com 1 μM do heterotrímero Gsáβy purificado e o aumento de fluorescência foi medido em tempo real na presença de concentrações crescentes de Nb35.

[050] Figura 19: Purificação de um complexo AVP:NT4LV 2R:Gs estável. a, representação esquemática da purificação do complexo AVP:NT4LV2R:Gs usando Ni-NTA seguido por purificação por afinidade com FLAG-tag. b, cromatograma de SEC do AVP:NT4LV2R:Gs purificado por afinidade. c, SDS-page para monitorar o esquema de purificação. raia 1: fluxo através da coluna de afinidade de FLAG-tag; raia 2: mistura de AVP, NT4LV2R e Gs, antes da purificação; raia 3: marcador molecular; raia 4: complex AVP:NT4LV2R:Gs eluído a partir de SEC; raia 5: complex AVP:NT4LV2R:Gs depois de Ni-NTA seguido por purificação por afinidade com FLAG-tag.

[051] Figura 20: Estabilido do complexo AVP:NT4LV2R:Gs monitorado por SEC. Linha tracejada: cromatograma de SEC do complexo AVP:NT4LV2R:Gs depois de 24 horas de incubação sobre gelo. Linha azul: cromatograma de SEC do complex AVP:NT4LV2R:Gs depois de 48 horas de incubação sobre gelo. Linha vermelha, cromatograma de SEC do AVP:NT4LV2R:Gs depois de incubação do complexo com 10 μM do antagonista SR121463.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

[052] A presente invenção será descrita em relação a modalidades particulares e com referência a certos desenhos, mas a invenção não é limitada pelos mesmos, mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitativos do seu escopo. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitativos. Nos desenhos, a dimensão de alguns dos elementos pode estar exagerada e não traçados em escala com fins ilustrativos. Em que o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e nas reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Em que um artigo indefinido ou definido é quando se referindo a um substantivo singular, por exemplo "um" ou "uma", "o", este inclui o plural daquele substantivo a menos que especificamente indicado em contrário. Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares na descrição e nas reivindicações, são usados para fazer a distinção entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ficar entendido que os termos assim usados são intercambiáveis em circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção descritas neste relatório podem ser colocadas em prática em outras sequências diferentes daquelas descritas ou ilustradas neste relatório.

[053] A menos que de outra forma definido neste relatório, os termos e expressões centíficas e técnicas usadas no contexto da presente invenção terão os significados que são comumente conhecidos pelos especialistas na técnica. Em geral, as nomenclaturas usadas, e as técnicas de biologia molecular e celular, genética e química e hibridização de proteínas e ácidos nucleicos descritas neste relatório são aquelas bastante conhecidas e comumente usadas na literatura. Os métodos e as técnicas da presente invenção geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais bastante conhecidos na literatura e da maneira descrita em várias referências genéricas e mais específicas que são citadas e discutidas em todo o presente relatório descritivo a menos que de outra forma indicado. Vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, e Supplements to 2002).

[054] O termo "domínio de ligação" ou "domínio de ligação à proteína" refere-se de um modo geral a qualquer molécula de ocorrência não natural, ou parte da mesma, que seja capaz de se ligar a uma proteína ou peptídio usando interações intermoleculares específicas. Uma variedade de moléculas pode funcional como domínios de ligação à proteína, incluindo, porém sem limitação, moléculas proteináceas (proteína, peptídio, semelhante à proteína ou contendo proteína), moléculas de ácido nucleico (ácido nucleico, semelhante a ácido nucleico, contendo ácido nucleico), e moléculas de carboidrato (carboidrato, semelhante a carboidrato, contendo carboidrato). Uma descrição mais detalhada pode ser encontrada mais adiante no relatório descritivo.

[055] Os termos "polipeptídio", "proteína", "peptídio" são usados intercambiavelmente neste relatório, e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos quimicamente ou bioquimicamente modificados ou derivatizados, e polipeptídios tendo esqueletos peptídicos modificados.

[056] Conforme usado neste relatório, o termo "complex proteico", ou simplesmente "complexo", refere-se a um grupo de duas ou mais cadeias polipeptídicas associadas. As proteínas em um complexo proteico são ligadas por interações proteína-proteína não covalentes. A "estrutura quaternária" é o arranjo estrutural das proteínas enroladas associadas no complexo proteico. Ficará entendido que o complexo pode ser um complexo multimérico compreendendo dois, três, quatro, cinco, seis ou mais polipeptídios. Também, o complexo pode adicionalmente compreender uma molécula não proteinácea.

[057] Conforme usado neste relatório, os termos "molécula de ácido nucleico", "polinucleotídeo", "ácido polinucleito", "ácido nucleico" são usados intercambiavelmente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem efetuar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Exemplos não limitativos de polinucleotídeos incluem um gene, um fragmento de gene, exons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídios, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, regiões de controle, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular.

[058] Conforme usado neste relatório, o termo "ligante" ou "ligante de receptor" significa uma molécula que se liga especificamente a um GPCR, seja intracelularmente ou extracelularmente. Um ligante pode ser, porém sem limitação, uma proteína, um (poli)peptídio, um lipídio, uma molécula pequena, uma esqueleto proteico, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico, um carboidrato. Um ligante pode ser de ocorrência sintética ou natural. O termo "ligante" inclui um "ligante nativo" que é um ligante que é um ligante natural endógeno para um GPCR nativo. Na maioria dos casos, um ligante é um "modulador" que aumenta ou diminui uma resposta intracelular quando está em contato com, por exemplo se liga a, um GPCR que é expresso em uma célula. Exemplos de ligantes que são moduladores incluem agonistas, agonistas parciais, agonistas inversos, e antagonistas, uma descrição mais detalhada dos quais podem ser encontrada mais adiante neste relatório descritivo.

[059] O termo "conformação" ou "estado conformacional" de uma proteína refere-se de modo geral à gama de estruturas que uma proteína pode adotar em qualquer momento no tempo. O especialista na técnica vai reconhecer que determinantes da conformação ou estado conformacional incluem uma estrutura primária da proteína como refletido em uma sequência aminoacídica da proteína (incluindo aminoácidos modificados) e o ambiente em volta da proteína. A conformação ou estado conformacional de uma proteína também se se refere a aspectos estruturais tais como estruturas secundárias da proteína (por exemplo, hélice a, lâmina β, entre outras), estruturas terciárias (por exemplo, o enrolamento tridimensional de uma cadeia polipeptídica), e estruturas quaternárias (por exemplo, interações de uma cadeia polipeptídica com outras subunidades proteicas). Modificações pós-translacionais e outras modificações feitas em uma cadeia polipeptídica tais como ligação a ligante, fosforilação, glicosilação, ou ligações de grupos hidrofóbicos, entre outras, podem influenciar a conformação de uma proteína. Além disso, fatores ambientais, tais como pH, concentração de sal, resistência iônica, e osmolalidade da solução circundante, e interação com outras proteínas e cofatores, entre outros, podem afetar a conformação da proteína. O estado conformacional de uma proteína pode ser determinado seja por ensaio funcional para verificar a atividade ou ligação a uma outra molécula ou por meio de métodos físicos tais como cristalografia de raios-X, NMR, ou marcação de spin, entre outros métodos. Para uma discussão geral da conformação e estados conformacionais das proteínas, favor consular Cantor & Schimmel, Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological. Macromolecules,.W.H. Freeman and Company, 1980, e Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, 1993. Uma "conformação específica" ou "estado conformacional específico" é qualquer subconjunto na gama de conformações ou estados conformacionais que uma proteína pode adotar.

[060] Conforme usado neste relatório, uma "conformação funcional" ou "estado conformacional funcional" refere-se ao fato de que as proteínas possuem diferentes estados conformacionais tendo uma gama dinâmica de atividade, em particular variando de nenhuma atividade à atividade máxima. Exemplos de estados conformacionais funcionais incluem conformações ativas e conformações inativas. Deve ficar claro que "um estado conformacional funcional" destina-se a cobrir qualquer estado conformacional de um GPCR, tendo qualquer atividade, inclusive nenhuma atividade; e não se destina a cobrir os estados desnaturados das proteínas. Uma classe particular de conformações funcionais que é considerada nesta invenção é uma "conformação drogável" e geralmente refere-se a um estado conformacional terapeuticamente relevante único de uma proteína alvo.Como uma ilustração, a conformação ativa do receptor adrenérgico β2 corresponde à conformação drogável deste receptor para o tratamento de asma. Ficará portanto entendido que a farmacobilidade fica restrita a conformações particulares dependendo da indicação terapêutica.

[061] As palavras "trancar" ou "aprisionar" ou "fixar" ou "congelar" no contexto de um estado conformacional funcional de um GPCR (já definido neste relatório), conforme usado neste relatório, refere-se a reter ou manter um GPCR em um subconjunto das conformações possíveis que que ele poderia assumir, devido aos efeitos da interação do complexo GPCR:proteína G com o domínio de ligação de acordo com a invenção. Por conseguinte, uma proteína que é "conformacionalmente aprisionada" ou "conformacionalmente fixada" ou "conformacionalmente trancada" ou "conformacionalmente congelada", conforme usado neste relatório, é uma proteína que está contida em um subconjunto das conformações possíveis que que ela poderia assumir, devido aos efeitos da interação do complexo GPCR:proteína G com o domínio de ligação de acordo com a invenção. Neste contexto, um domínio de ligação que se liga especificamente ou seletivamente a uma conformação ou estado conformacional específico de uma proteína refere-se a um domínio de ligação que se ligar com maior afinidade a uma proteína em um subconjunto de conformações ou estados conformacionais do que outras conformações ou estados conformacionais que a proteína pode vir a assumir. O especialista na técnica vai reconhecer que domínios de ligação que se ligam especificamente ou seletivamente a uma conformação ou estado conformacional específico de uma proteína vai estabilizar esta conformação ou estado conformacional específico.

[062] Conforme usado neste relatório, os termos "região determinante de complementaridade" ou "CDR" no contexto de anticorpos referem-se a regiões variáveis seja da cadeia H (pesada) ou L (leve) (também abreviadas por VH e VL, respectivamente) e contém as sequências aminoacídicas capazes de se ligar especificamente a alvos antigênicos. Estas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do anticorpo de uma estrutura determinante antigênica particular. Tais regiões também são chamadas de "regiões hipervariáveis". As CDRs representam extensões não contíguas de aminoácidos nas regiões variáveis mas, independente da espécie, foi verificado que as localizações posicionais dessas sequências aminoacídicas críticas nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve têm localizações similares nas sequências aminoacídicas das cadeias variáveis. As cadeias variáveis pesadas e leves de todos os anticorpos canônicos possuem cada uma 3 regiões CDR, cada uma delas sendo não contígua com as outras (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para as respectivas cadeias leves (L) e pesadas (H). Em particular, domínios variáveis simples de imunoglobulina, tais como nanocorpos (definidos mais adiante neste relatório), geralmente compreendem uma única cadeia aminoacídica que compreende 4 "sequências ou regiões de estrutura" ou FRs (denominadas FR1, FR2, FR3, FR4) e 3 "regiões determinantes de complementaridade" ou CDRs (denominadas CDR1, CDR2, CDR3), cada uma delas sendo não contígua com as outras. A delineação das sequências de CDR (e portanto também das sequências de FR) baseia-se no sistema de numeração único IMGT para domínios V e domínios V-semelhantes (Lefranc et al. 2003).

[063] Um "epítopo", conforme usado neste relatório, refere-se a um determinante antigênico de um polipeptídio. Um epítopo pode compreender 3 aminoácidos em uma conformação espacial, que é única para o epítopo. Geralmente um epítopo consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7 desses aminoácidos, e mais usualmente, consiste em pelo menos 8, 9, 10 desses aminoácidos. Métodos para determinar a conformação espacial de aminoácidos são conhecidos na literatura, e incluem, porém sem limitação, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear multidimensional.

[064] Um "epítopo conformacional", conforme usado neste relatório, refere-se a um epítopo compreendendo aminoácidos em uma conformação espacial que é única para uma conformação tridimensional enrolada do polipeptídio. Geralmente, um epitope conformacional consiste em aminoácidos que são descontínuos na sequência linear que se reúnem na estrutura enrolada da proteína. No entanto, um epítopo conformacional também pode consistir em uma sequência linear de aminoácidos que adota uma conformação que é única para uma conformação tridimensional enrolada do polipeptídio (e não presente no estado desnaturado). Em complexos proteicos, os epítios conformacionais consistem em aminoácidos que são descontínuos nas sequências lineares de um ou mais polipeptídios que se reúnem mediante o enrolamento dos diferentes polipeptídios enrolados e sua associação em uma estrutura quaternária única. Similarmente, os epítopos conformacionais também podem neste contexto consistir em uma sequência linear de aminoácidos de um ou mais polipeptídios que se reúnem e adotam uma conformação que é única para a estrutura quaternária.

[065] O termo "especificidade", conforme usado neste relatório, refere-se à capacidade de um domínio de ligação, em particular uma imunoglobulina, tal como um anticorpo, ou um fragmento de imunoglobulina, tal como um nanocorpo, de se ligar preferencialmente a um antígeno, versus um antígeno diferente, e não necessariamente implicar alta afinidade (definido mais adiante neste relatório). Um domínio de ligação, em particular uma imunoglobulina, tal como um anticorpo, ou um fragmento de imunoglobulina, tal como um nanocorpo, que pode se ligar especificamente a e/ou que tem afinidade para um antígeno ou determinante antigênico (por exemplo epítopo) específico é chamado de "contra" ou "direcionado contra" o referido antígeno ou determinante antigênico. Um domínio de ligação de acordo com a invenção é chamado de "reativo cruzado" para dois antígenos ou determinantes antigênicos diferentes se ele for específico para esses dois antígenos ou determinantes antigênicos diferentes.

[066] O termo "afinidade", conforme usado neste relatório, refere-se ao grau com que um domínio de ligação, em particular uma imunoglobulina, tal como um anticorpo, ou um fragmento de imunoglobulina, tal como um nanocorpo, se liga a um antígeno de modo a desviar o equilíbrio do antígeno e do domínio de ligação para a presença de um complexo formado pela ligação dos mesmos. Portanto, por exemplo, em que um antígeno e um anticorpo (fragmento) são combinados em concentrações relativamente iguais, o anticorpo (fragmento) de alta afinidade vai se ligar ao antígeno disponível de modo a desviar o equilíbrio para a alta concentração do complexo resultante. A constante de dissociação (Kd) é comumente usada para descrever a afinidade entre o domínio de ligação da proteína e o alvo antigênico. Tipicamente, a constante de dissociação é menor que 10-5 M. De preferência, a constante de dissociação é menor que 10-6 M, mais preferivelmente menor que 10-7 M. Ainda mais preferivelmente, a constante de dissociação é menor que 10-8 M.

[067] Os termos "se liga especificamente" e "ligação específica", conforme usado neste relatório, geralmente se refere à capacidade de um domínio de ligação, em particular uma imunoglobulina, tal como um anticorpo, ou um fragmento de imunoglobulina, tal como um nanocorpo, de se ligar preferencialmente a um antígeno particular que está presente em uma mistura homogênea de diferentes antígenos. Em certas modalidades, uma interação de ligação específica vai discriminar entre antígenos desejáveis e indesejáveis em uma amostra, em certas modalidades mais de cerca de 10 a 100 vezes ou mais (por exemplo mais de cerca de 1000 ou 10.000 vezes).

[068] Os termos "se liga especificamente", "se liga seletivamente", "se liga preferncialmente", e equivalentes gramaticais dos mesmos, são usados intercambiavelmente neste relatório. Os termos "conformacional específico" ou "conformacional seletivo" também são usados intercambiavelmente neste relatório.

[069] Uma "deleção" é definida nesta invenção como uma alteração em uma sequênica aminoacídica ou nucleotídica na qual um ou mais resíduos aminoacídicos ou nucleotídicos, respectivamente, estão ausentes em comparação com uma sequência aminoacídica ou com uma sequência nucleotídica de um um polipeptídio ou ácido nucleico parental. No contexto de uma proteína ou um fragmento da mesma, uma deleção pode envolver a deleção de cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, até cerca de 20, até cerca de 30 ou até cerca de 50 ou mais aminoácidos. Uma proteína ou um fragmento da mesma pode conter mais de uma deleção. No contexto de um GPCR, uma deleção pode ser em particular uma deleção de laço, uma deleção N- e/ou C- terminal.

[070] Uma "inserção" ou "adição" é aquela alteração em uma sequência aminoacídica ou nucleotídica que resultou na adição de um ou mais resíduos aminoacídicos ou nucleotídicos, respectivamente, em comparação com uma sequência aminoacídica ou uma sequência nucleotídica de uma proteína parental. "Inserção" geralmente refere-se à adição a um ou mais resíduos aminoacídicos em uma sequência aminoacídica de um polipeptídio, ao passo que "adição" pode ser uma inserção ou referir-se a resíduos aminoacídicos acrescentados a um terminal N- ou C-, ou a ambos os terminais. No contexto de uma proteína ou um fragmento da mesma, uma inserção ou adição usualmente é cerca de 1 cerca de 3, cerca de 5, cerca de 10, até cerca de 20, até cerca de 30 ou até cerca de 50 ou mais aminoácidos. Uma proteína ou um fragmento da mesma pode conter mais de uma inserção.

[071] Uma "substituição", conforme usado neste relatório, resulta da substituição de um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos por diferentes aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente, em comparação com uma sequência aminoacídica ou com uma sequência nucleotídica de uma proteína parental ou um fragmento da mesma. Fica entendido que uma proteína ou um fragmento da mesma pode ter substituições aminoacídicas conservativas que substancialmente não possuem qualquer efeito na atividade da proteína. Por substituições conservativas entende-se combinações tais como gly, ala; val, ile, leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; e phe, tyr, trp.

[072] O termo "identidade de sequência" conforme usado neste relatório refere-se à extensão em que as sequências são idênticas em termos de nucleotídeo por nucleotídeo ou em termos de aminoácido por aminoácido em uma ampla janela de comparação. Portanto, uma "percentagem de identidade de sequência é calculada comparando-se duas sequências alinhadas de forma ideal na janela de comparação, determinando-se o número de posições nas quais a base ácido nucleico idêntico (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo aminoacídifico idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre nas duas sequências para dar o número de posições coincidentes, dividindo-se o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando-se o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequência. A determinação da percentagem de identidade de sequência pode ser feita manualmente, ou pode ser feita usando-se programas de computador que estão disponíveis na técnica.

[073] "Cristal" ou "estrutura cristalina", conforme usado neste relatório, refere-se a um material sólido, cujos átomos, moléculas, ou íons constituintes estão dispostos em um padrão ordenadamente repetitivo se estendendo em todas ass três dimensões espaciais. O processo de formar uma estrutura cristalina a partir de um fluido ou a partir de materiais dissolvidos no fluido geralmente é denominado "cristalização" ou "cristalogênese". Cristais de proteína são quase sempre cultivados em solução. A abordagem mais comum é reduzir a solubilidade de suas moléculas componentes gradualmente. O crescimento de cristais em solução caracteriza-se por duas etapas: nucleação de um cristalito microscópico (possivelmente apenas apenas 100 moléculas), seguido pelo crescimento daquele cristalito, idealmente até formar um cristal com qualidade para difração.

[074] "Cristalografia de raios-X", conforme usado neste relatório, é um método de determinação do arranjo dos átomos em um cristal, no qual um feixe de raios-X colide com um cristal e difrata em muitas direções específicas. A partir dos ângulos e intensidades desses feixes difratados, um cristalógrafo pode produzir uma imagem tridimensional da densidade de elétrons no cristal. A partir desta densidade de elétrons, as posições médias dos átomos no cristal podem ser determinadas, assim como suas ligações químicas, sua desordem e várias outras informações, como sabem os especialistas na técnica.

[075] O termo "coordenadas atômicas", conforme usado neste relatório, refere-se a um conjunto de coordenadas tridimensionais para átomos em uma estrutura molecular. Em uma modalidade, as coordenadas atômicas são obtidas usando-se cristalografia de raios-X de acordo com métodos bastante conhecidos petos especialistas no campo da biofísica. Em resumo, padrões de difração de raios-X podem ser obtidos pela difração de raios-X em um cristal. Os dados de difração são usados para calcular um mapa de densidade de elétrons da unidade celular compreendendo o cristal; os referidos mapas são usados para estabelecer as posições dos átomos (isto é, as coordenadas atômicas) na unidade celular. Os especialistas na técnica sabem que um conjunto de coordenadas estruturais determinadas por cristalogafia de raios-X contém erros padrão. Em outras modalidades, as coordenadas atômicas podem ser obtidas usando-se outros métodos experimentais de determinação de estruturas biofísicas que podem incluir métodos de difração de elétrons (também conhecida como cristalografia de elétrons) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Em ainda outras modalidades, as coordenadas atômicas podem ser obtidas usando-se ferramentas de modelagem molecular que podem basear-se em um ou mais algoritmos de enrolamento de proteína ab initio, minimização de energia, e modelagem baseada na homologia. Estas técnicas são bastante conhecidas pelos especialistas nos campos de biofísica e bioinformática.

[076] "Resolver a estrutura" conforme usado neste relatório refere-se a determinar o arranjo dos átomos ou as coordenadas atômicas de uma proteína, e isto geralmente é feito por um método biofísico, tal como cristalografia de raios-X.

[077] O termo "composto" ou "composto de teste" ou "compost candidato" ou "composto candidato à fármaco" conforme usado neste relatório descreve qualquer molécula, seja de ocorência natural ou sintética, que é testada em um ensaio, tal como um ensaio de rastreamento ou um ensaio de descoberta de fármacos. Assim sendo, estes compostos compreendem compostos orgânicos e inorgânicos. Os compostos incluem polinucleotídeos, lípidios ou análogos hormonais que são caracterizados por pesos moleculares baixos. Outros compostos de teste orgânicos biopoliméricos incluem peptídios pequenos ou moléculas similares a peptídio (peptidomiméticos) compreendendo de cerca de 2 a cerca de 40 aminoácidos e polipeptídios maiores compreendendo de cerca de 40 a cerca de 500 aminoácidos, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo ou conjugados de anticorpo. Os compostos de teste também podem ser esqueletos proteicos. Com o propósito de alto rendimento, é possível usar bibliotecas de compostos de teste, tais como bibliotecas combinatoriais ou randomizadas que oferecem uma gama suficiente de diversidade. Exemplos incluem, porém sem limitação, bibliotecas de compostos naturais, bibliotecas de compostos alostéricos, bibliotecas de peptídios, bibliotecas de fragmentos de anticorpo, bibliotecas de compostos sintéticos, bibliotecas baseadas em fragmentos, bibliotecas de exibição de fagos, entre outras. Uma descrição mais detalhada por ser encontrada mais adiante neste relatório descritivo.

[078] Conforme usado neste relatório, os termos "determinar", "medir", "avaliar", "monitorar" e "analisar" são usasdos intercambiavelmente e incluem determinações tanto quantitativas quanto qualitativas.

[079] O termo "biologicamente ativo", em relação a um GPCR,refere-se a um GPCR tendo uma função bioquímica (por exemplo, uma função de ligação, uma função de transdução de sinal, ou uma capacidade para alterar a conformação como resultado de ligação a um ligante) de um GPCR de ocorrência natural.

[080] Os termos "quantidade terapeuticamente eficaz", "dosee terapeuticamente eficaz" e "quantidade eficaz", conforme usado neste relatório, significam a quantidade necessária para obter o resultado ou resultados desejados.

[081] O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme usado neste relatório, significa um material que não biologicamente nem de outra forma indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo junto com o composto sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou sem interagir de forma prejudicial com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica na qual ele está contido.

Descrição Detalhada

[082] Apesar da grande diversidade de ligantes que podem ativar GPCRs, eles interagem com um número relativamente pequeno de proteínas intracelulares para induzir uma profunda alteração fisiológica. As proteínas G heterotriméricas, β-arrestinas e quinases de GPCR são bastante conhecidas quanto a sua capacidade de reconhecer especificamente GPCRs em seu estado ativo, embora sejam muito pouco compreendidas do ponto de vista de vista estrutural assim como funcional. Portanto, surpreendente e vantajosamente, foram identificados domínios de ligação que se ligam especificamente a complexos GPCR:proteína G e que são capazes de estabilizar ou trancar o complexo em um estado conformacional funcional, em particular um estado conformacional ativo. Além disso, os domínios de ligação são ferramentas genéricas para estabilização e captura de um GPCR de escolha em seu estado ligado à proteína G, que geralmente se presume representar um estado ativo de um GPCR (já definido neste relatório).

[083] Por conseguinte, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um domínio de ligação que é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G.

[084] O domínio de ligação da presente invenção pode ser qualquer molécula de ocorrência não natural ou parte da mesma (já definido acima) que é capaz de se ligar especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G. De acordo com uma modalidade preferida, os domínios de ligação descritos neste relatório são esqueletos proteicos. O termo "esqueleto proteico" refere-se em geral a unidades de enrolamento que formam estruturas, particularmente estruturas proteicas ou peptídicas, que compreendem esqueletos para a ligação de uma outra molécula, por exemplo uma proteína (Vide, por exemplo, Skerra (2000), para recapitulação). Um domínio de ligação pode ser derivado de uma molécula de ocorrência natural, por exemplo de componentes do sistema imunológico inato ou adaptivo, ou pode ser totalmente desenhado artificialmente. Um domínio de ligação pode basear-se em imunoglobulina ou pode basear-se em domínios presentes nas proteínas, incluindo, porém sem limitação, proteínas microbianas, inibiddores da protease, toxinas, fibronectina, lipocalinas, proteínas helicoidais enroladas antiparalelas de cadeia simples ou proteínas de motivos repetitivos. Exemplos de domínios de ligação que são conhecidos na literatura incluem, porém sem limitação: anticorpos, anticorpos de cadeia pesada (hcAb), anticorpos de domínio simples (sdAb), minicorpos, o domínio variável derivado de anticorpos camelídeos de cadeia pesada (VHH ou nanocorpos), o domínio variável dos novos receptores de antígeno derivados de anticorpos de tubarão (VNAR), alfacorpos, proteína A, proteína G, motivos repetitivos de ancrina desenhados (DARPins), repetições fibronectina tipo III, anticalinas, quinotinas, domínios CH2 construídos geneticamente (nanoanticorpos), peptídios e proteínas, lipopeptídios (por exemplo pepducinas), DNA, e RNA (vide, por exemplo, Gebauer & Skerra, 2009; Skerra, 2000; Starovasnik et al., 1997; Binz et al., 2004; Koide et al., 1998; Dimitrov, 2009; Nygren et al. 2008; WO2010066740). Frequentemente, ao se gerar um tipo particular de domínio de ligação usando métodos de seleção, bibliotecas combinatoriais compreendendo uma sequência de consenso ou esqueleto contendo potenciais resíduos de interação randomizados são usadas para analisar a ligação a uma molécula de interesse, tal como uma proteína.

[085] O domínio de ligação da presente invenção pode ser direcionado contra e/ou ligar-se especificamente a qualquer complexo GPCR:proteína G de escolha. Complexos alvo preferidos são complexos de um GPCR e uma proteína G que ocorrem na natureza ou, alternativamente, por exemplo no caso de variantes de ocorrência não natural (descritas mais adiante neste relatóri) de GPCRs e proteína G, complexos em que o GPCR e a proteína G vão se associar nas condições fisiológicas apropriadas. Ficará entendido pelo especialista na técnica que a relação estrutural entre GPCR e proteína G determina se um complexo GPCR:proteína G particular pode ser formado, o que será descrito em detalhes mais adiante para membros da família de proteínas G e membros da família de GPCRs.

[086] Por "proteínas G" entende-se a família de proteínas de ligação ao nucleotídeo da guanina envolvidas na transmissão de sinais químicos para fora da célula, e que causam alterações no interior da célula. As proteínas G são componentes moleculares essenciais na transdução de sinal intracelular subsequente à ligação do ligante ao domínio extracelular de um domínio de GPCR. Elas também denominadas "proteínas G heterotriméricas:, ou "proteínas G grandes". As proteínas G consistem em três subunidades: alfa (α), beta (β), e gama (y) e sua classificação baseia-se bastante na identidade de suas subunidades α distintas, e na natureza do evento de transdução subsequente. Outra classificação das proteínas G é decorrente da análise de homologia da sequência de cDNA. As proteínas G se ligam seja ao guanosina difosfato (GDP) ou ao guanosina trifosfato (GTP), e possui domínios de ligação ao nucleotídeo da guanina altamente homólogos e domínios distintos para interações com receptores e efetores. As diferentes subclasses das proteínas Gα, tais como Gαs, Gαi, Gαq e Gα12, entre outras, sinalizam através de vias distintas envolvendo moléculas segundo mensageiro tais como cAMP, inositol trifosfato (IP3), diacilglicerol, Ca2+ intracelular e RhoA GTPases. Para uma melhor ilustração, a subunidade a (39 — 46 kDa) contém o sítio de ligação ao nucleotídeo da guanina e possuir atividade de GTPase activity; as subunidades β (37 kDa) e y (8 kDa) são fortemente associadas e funcionam como um heterodímero βyD Existem 23 tipos (incluindo algumas isoformas de emenda) de subunidades a, 6 de β, e 11 de y atualmente descritas. As classes de proteína G e subunidades estão subscritas: assim, por exemplo, a subunidade a da proteína Gs (que ativa a classe a adenilato ciclase) é Gsa; outras proteínas G incluem Gi, que diferem estruturalmente da Gs (tipo diferente de subunidade a) e inibe a adenilato ciclase. Outros exemplos estão dados na Tabela 1.

[087] Tipicamente, por natureza, as proteínas G estão em uma forma ligada a nucleotídeo. Mais especificamente, as proteínas G (ou pelo menos a subunidade a) estão ligadas ao GTP ou ao GDP dependendo do estado de ativação de um GPCR particular. A ligação de um agonista a um GPCR promove interações com o heterotrímero Gaβy ligado ao GDP levando à troca do GDP por GTP em Ga, e à dissociação funcional da proteínas G nas subunidades Ga-GTP e Gβy. As subunidades Ga-GTP e Gβy separadas podem modular, seja independentemente ou paralelamente, efetores celulares a jusante (canais, quinases ou outras enzimas, vide Tabela 1). A atividade de GTPase intrínseca da Gy leva à hidróliseo do GTP para GDP e à reassociação das subunidades Ga-GDP e Gβy, e ao término da sinalização. Portanto, as proteínas G funcionam como interruptores moleculares regulados capazes de produzir sinais bifurcantes através de efeitos das subunidades a e βy. O interruptor é ligado pelo receptor e por sua vez é desligado em alguns segundos, um tempo suficiente para amplicação considerável da transdução de sinal.

[088] "Receptores acoplados à proteína G", ou "GPCRs", conforme usado neste relatório, são polipeptídios que compartilham um motivo estrutura comum, tendo sete regiões de entre 22 e 24 aminoácidos hidrofóbicos que formam sete hélices alfa, cada uma delas transpondo a membrana. Cada transposição é identificada por um número, isto é, transmembrana-1 (TM1), transmembrana-2 (TM2), etc. As hélices transmembrana são unidas por regiões de aminoácidos entre a transmembrana-2 e transmembrana-3, a transmembrana-4 e a transmembrana-5, e a transmembrana-6 e a transmembrana-7 no lado externo, ou "extracelular", da membrana celular, denominadas regiões "extracelulares" 1 , 2 e 3 (EC1 , EC2 e a EC3), respectivamente. As hélices transmembrana também são unidas por regiões de aminoácidos entre a transmembrana-1 e a transmembrana-2, a transmembrana-3 e a transmembrana-4, e a transmembrana-5 e a transmembrana-6 no lado interno, ou "intracelular", da membrana celular, denominadas regiões "intracelulares" 1 , 2 e a 3 (IC1 , IC2 e a IC3), respectivamente. O terminal "carbóxi " ("C") do receptor fica no espaço intracelular no inteiror da célula, e o terminal "amino" ("N") do receptor fica no espaço extracelular fora da célula. Qualquer uma dessas regiões é facilmente identificável por análise da sequência aminoacídica primária de um GPCR.

[089] A estrutura e a classificação dos GPCRs geralmente são bastante conhecidas na literatura e discussões adicionais sobre GPCRs podem ser encontradas em Probst et al. 1992; Marchese et al. 1994; Lagerstrom & Schioth, 2008; Rosenbaum et al. 2009; e nos seguintes livros: Jurgen Wess (Ed) Structure-Function Analysis of G Protein- Coupled Receptors publicado por Wiley-Liss (1a edição; 15 de outubro de 1999); Kevin R. Lynch (Ed) Identification and Expression of G Protein-Coupled Receptors publicado por John Wiley & Sons (Março 1998) e Tatsuya Haga (Ed), G Protein- Coupled Receptors, publicado por CRC Press (24 de setembro de 1999); e Steve Watson (Ed) G-Protein Linked Receptor Factsbook, publicado por Academic Press (1a edição; 1994). Os GPCRs podem ser agrupados com base na homologia de sequência em várias famílias distintas. Embora todos os GPCRs tenham uma arquitetura similar de sete hélices α transpondo a membrana, as diferentes famílias nesta classe de receptores não apresentam homologia de sequência uma com outro, sugerindo assim que a semelhança da estrutura de seu domínio transmembrana pode definir exigências funcionais comuns. Um panorama completo do repertório de GPCR foi possível quando o primeiro esboço do genoma humano foi disponibilizado. Fredriksson e colaboradoras dividiram 802 GPCRs humanas em famílias com base em critérios filogenéticos. Iso mostrou que a maioria dos GPCRs humanos podem ser encontrados em cinco famílias principais, denominadas Rodopsina, Adesão, Secretina, Glutamato, Frizzled/Taste2 (Fredriksson et al., 2003).

[090] Os membros da família Rodoposina (corresponde à classe A (Kolakowski, 1994) ou Classe 1 (Foord et al. (2005) em sistemas de classificação mais antigos) só têm alças extracelulares pequenas e a interação dos ligantes ocorre com resíduos na fenda transmembrana. Este é de longe o maior grupo (>90% dos GPCRs) e contém receptores para odores, moléculas pequenas tais como catecolaminas e aminas, (neuro)peptídios e hormônios glicoproteicos. A Rodopsina, um representante desta família, é o primeiro GPCR para o qual a estrutura fora resolvida (Palczewski et al., 2000). β2-AR, o primeiro receptor interagindo com um ligante difusível para o qual a estrutura fora resolvida (Rosenbaum et al., 2007) também pertence a esta família. Com base na análise filogenética, os GPCRs classe B ou receptores Classe 2 (Foord et al., 2005) foram recentemente subdivididos em duas famílias: adesão e secretina (Fredriksson et al., 2003). Os receptores de adesão e secretina caracterizam-se por um domínio extracelular amino terminal relativamente longo envolvido na ligação a ligante. Pouco se sabe sobre a orientação dos domínios transmembrana, mas ela é provavelmente bastante diferente daquela da rodopsina. Ligantes para esses GPCRs são hormônio, tais como glucagon, secretina, hormônio de liberação da gonadotropina e hormônio paratireoidiano. Os receptores da família do glutamato (receptores Classe C ou Classe 3) também têm um domínio extracelular grande, que funciona como um "Venus fly trap" uma vez que ele pode abrir e fechar com o agonista ligado no interior. Os membros da família são os receptores de glutamato metabotrópico, os receptores sensores de Ca2+ e os os receptores ácido y-aminobutírico (GABA)- B.

[091] GPCRs incluem, porém sem limitação, receptors olfativos de serotonina, receptores hormonais de glicoproteína, receptores de quimiocinas, receptores de adenosina, receptores de aminas biogênicas, receptores de melanocortina, receptores de neuropeptídios, receptores quimiotáticos, receptores de somatostatina, receptores de opioides, receptores de melatonina, receptores de calcitonina, receptores de PTH/PTHrP, receptores de glucagon, receptores da secretina, receptores de latrotoxina, receptores de glutamato metabotrópico, receptores de cálcio, receptores de GABA-B, receptores de feromônios, os receptores ativados por protease, as rodopsinas e outros receptores do segmento de sete transmembranas acoplado à proteína G. GPCRs também incluem os receptores GPCR associados um ao outro como dímeros homoméricos ou heteromáricos ou como oligômeros de ordem mais alta. As sequências aminoacídicas (e as sequências nucleotídicas dos cDNAs que codificam os mesmos) dos GPCRs estão disponívies, por exemplo, no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).

[092] Por conseguinte, de acordo com modalidades específicas, a presente invenção oferece domínios de ligação que são direcionados contra e/ou se ligam especificamente a complexos GPCR:proteína G em que a proteína G é selecionada do grupo que consiste em Gs, Gi, Go, Gt, Ggust, Gz, Golf, Gq, G12 e G13. Em uma modalidade preferida, a proteína G é Gs. Em uma outra modalidade preferida, a proteína G é Gi. Em ainda uma outra modalidade preferida, a proteína G é Gt, mais especificamente transducina. Correspondentemente, o GPCR compreendido no complexo é selecionado do grupo que consiste em um receptor acoplado à Gs, um receptor acoplado à Gi, um receptor acoplado à Go, um receptor acoplado à Grupo terminal, um receptor acoplado à Ggust, um receptor acoplado à Golf, um receptor acoplado à Gq, um receptor acoplado à G12 e um receptor acoplado à G13. Em uma modalidade preferida, o GPCR é um receptor acoplado à Gs. Em uma outra modalidade preferida, o GPCR é um receptor acoplado à Gi. Em ainda uma outra modalidade preferida, o GPCR é um receptor acoplado à Grupo terminal, mais especificamente rodopsina. Exemplos não limitativos particulares estão dados na Tabela 1.Tabela 1. Exemplos não limitativos da relação de receptores acoplados à proteína G e vias de sinalização.

[093] Geralmente, os domínios de ligação da invenção vão se ligar àquelas formas de complexos GPCR:proteína G que são mais relevantes do ponto de vista biológico e/ou terapêutico, como ficará claro para o especialista na técnica. Ficará portanto entendido que, dependendo da finalidade e da aplicação, o GPCR e a proteína G compreendidos no complexo alvo podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural (isto é, alterado pelo homem). O termo "ocorrência natural", conforme usado neste relatório, significa um GPCR ou uma proteína G que são produzidos naturalmente. Em particular, variantes polimórficas do tipo selvagem e isoformas de GPCRs e proteínas G, assim como ortólogos através de espécies diferentes, são exemplos de proteínas de ocorrência natural, e são encontrados por exemplo, porém sem limitação, em um mamífero, mais especificamente em um ser humano, ou em um vírus, ou em uma planta, ou em um inseto, entre outros). Portanto, tais GPCRs e proteínas G são encontrados na natureza. O termo "ocorrência não natural ", conforme usado neste relatório, significa um GPCR ou uma proteína G que não ocorre naturalmente. Em certas circunstâncias, é vantajoso que o GPCR e/ou a proteína G compreendidos no complexos sejam proteínas de ocorrência não natural. Por exemplo, e apenas a título ilustrativo, para aumentar a probabilidade de obter cristais de um complexo GPCR:proteína G estabilizado pelos domínios de ligação da presente invenção, pode ser desejável fazer algumas alterações genéticas na proteína sem afetar ou afetando apenas o mínimo a afinidade de ligação ao ligante. Ou, alternativamente ou adicionalmente, para aumentar os níveis de expressão celular um GPCR e/ou de uma proteína G, ou para aumentar a estabilidade, pode- se considerar introduzir certas mutações no GPCR e/ou a proteína G de interesse. Exemplos não limitativos de GPCRs de ocorrência não natural incluem, sem limitação, GPCRs que foram deixados constitutivamente ativos através de mutação, GPCRs com uma deleção na alça, GPCRs com uma deleção no terminal N- e/ou C-, GPCRs com uma substituição, uma inserção ou adição, ou qualquer combinação destes, em relação a sua sequência aminoacídica ou nucleotídica, ou outras variantes de GPCRs de ocorrência natural. Similarmente, exemplos não limitativos de proteínas G de ocorrência não natural incluem, sem limitação, proteínas G com uma deleção no terminal N- e/ou C-, proteínas G com uma substituição, uma inserção ou adição, ou qualquer combinação destes, em relação a sua sequência aminoacídica ou nucleotídica, ou outras variantes de proteínas G de ocorrência natural. Também estão compreendidos no escopo da presente invenção complexos GPCR:proteína G alvo compreendendo um GPCR quimérico ou híbrido, por exemplo um GPCR quimérico com um terminal N- e/ou C- de um GPCR e alças de um segundo GPCR, ou compreendendo um GPCR fundido a uma porção, tal como lisozima T4 (vide também a seção de Exemplos).

[094] De acordo com modalidades específicas no escopo da presente invenção, um GPCR ou proteína G de ocorrência não natural, compreendidos no complexo GPCR:proteína G, pode ter uma sequência aminoacídica que é pelo menos 80% idêntica a, pelo menos 90% idêntica a, pelo menos 95% idêntica a, pelo menos 97% idêntica a, ou pelo menos 99% idêntica a, um GPCR ou proteína G de ocorrência natural. Para ilustrar melhor, e tomando receptor adrenérgico β2 como um exemplo não limitativo particular de um GPCR dentro do escopo da presente invenção, deve ficar claro pelo acima exposto que além do receptor adrenérgico β2 humano (por exemplo, a sequência descrita pelo número de acesso GenBank NP_000015), o receptor adrenérgico β2 de camundongo (por exemplo, descrito pelo n° de acesso GenBank NM 007420) o o receptor adrenérgico β2 de outros mamíferos estão abrangidos. Também são consideradas variantes polimórficas do tipo selvagem e certas outras variantes ativas do receptor adrenérgico β2 de uma espécie particular. Por exemplo, o "receptor adrenérgico β2 humano" tem uma sequência aminoacídica que é pelo menos 80% idêntica a, pelo menos 90% idêntica a, pelo menos 95% idêntica a, pelo menos 97% idêntica a, ou pelo menos 99% idêntica ao "adrenoreceptor β 2 humano" de ocorrência natural de número de acesso GenBank NP_000015. De maneira análoga, e tomando Gas, Gai e Gat como exemplos não limitativos particulares das subunidades das proteínas G dentro do escopo da presente invenção, deve ficar claro pelo acima exposto que além das Gas ou Gai ou Gat humanas, as proteínas Gas ou Gai ou Gat de camundongo ou as proteínas Gas ou Gai ou Gat de outros mamíferos estão abrangidas. Também são consideradas variantes polimórficas do tipo selvagem e certas outras variantes ativas das Gas ou Gai ou Gat de uma espécie particular. Por exemplo, uma "Gas humana" ou uma "Gai humana" ou um "Gat humana" tem uma sequência aminoacídica que é pelo menos 80% idêntica a, pelo menos 90% idêntica a, pelo menos 95% idêntica a, pelo menos 97% idêntica a, ou pelo menos 99% idêntica à "Gas humana" ou "Gai humana" ou "Gat humana" de ocorrência natural de número de acesso Genbank P63092, P63096 e P11488, respectivamente. Além disso, existem muitas isoformas das subunidades da proteína G, incluindo por exemplo isoformas das proteínas Gs e Gi (Gas: GNAS; Ga0: GNAO1; Gai: GNAI1 ou GNAI2 ou GNAI3; Gβ: GNB1 ou GNB2 ou GNB3 ou GNB4 ou GNB5 ou GNB1L ou GNB2L ; Gy: GNGT1 ou GNGT2 ou GNG2 ou GNG3 ou GNG4 ou GNG5 ou GNG7 ou GNG8 ou GNG10 ou GNG11 ou GNG12 ou GNG13; de acordo com a nomenclatura HGNC padronizada para genes humanos; os números de acesso de diferentes isoformas de diferentes organismos estão disponíveis no site www.uniprot.org). Alguns exemplos particulares de isoformas das subunidades da proteína G estão dados na Tabela 5. O especialista na técnica vai perceber que as sequências aminoacídicas das diferentes subunidades da proteína G são quase 100%, se não 100%, conservadas através das espécies e organismos. Notavalmente, o alinhamento de sequências de uma sequência aminoacídica da subunidade β do homem, boi, rato e camundongo da proteína G revela que as sequências aminoacídicas entre estes organimos são 100% conservadas. Analogamente, as sequências aminoacídicas da subunidade y do homem, camundongo, e boi da proteína G são 100% idênticas. As sequências aminoacídicas da Gas de rato e camundongo também são 100% idênticas, ao passo que a Gas de homem e boi só diferem em 1 ou 2 aminoácidos, respectivamente. Portanto, espera-se que os domínios de ligação direcionados contra e/ou que se ligam especificamente a um complexo GPCR:proteína G, e particularmente se ligam a uma proteína G compreendida no complexo, tenham reatividade cruzada. Também ficará claro que o GPCR e a proteína G compreendidos no complexo alvo podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes. De preferência, o GPCR e/ou a proteína G é uma proteína de mamífero, ou uma proteína vegetal, ou uma proteína microbiana, ou uma proteína viral, ou uma proteína de inseto. Mais preferivelmente o GPCR é uma proteína humana.

[095] Também se espera que os domínios de ligação da invenção geralmente sejam capazes de se ligar a complexos GPCR:proteína G compreendendo todos os análogos, variantes, mutantes, alelos, partes, fragmentos, e isoformas de ocorrência natural ou sintéticos de um GPCR e/ou proteína G particulares compreendidos no complexo; ou pelo menos àqueles análogos, variantes, mutantes, alelos, partes, fragmentos, e isoformas de um GPCR e/ou proteína G particulares compreendidos no complexo que contêm um ou mais determinantes ou epítopos antigênicos que são essencialmente os mesmos que os determinantes ou epítopos antigênicos aos quais os domínios de ligação da invenção se ligam a um GPCR e/ou proteína G particulares compreendidos no complexo.

[096] Vários métodos podem ser usados para determinar a ligação específica (definida mais adiante) entre o domínio de ligação e o complexo GPCR:proteína G alvo, incluind, por exemplo, ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), ensaios de ressonância de plasmônio de superfície, exibição de fagos, entre outros, que são práticas comuns na técnica, por exemplo, discutidas em Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, e estão ainda ilustradas na seção Exemplos. Será observado que para isso frequentemente será usado um marcador ou tag único, tal como um marcador peptídico, um marcador ácido nucleico, um marcador químico, um marcador fluorescente, ou um tag de radiofrequência, como descrito mais adiante neste relatório.

[097] De acordo com uma modalidade específica, o domínio de ligação contra um complexo GPCR:proteína G liga-se com maior afinidade ao complexo em comparação com a ligação à proteína G isolada e/ou ao GPCR isolado, respectivamente. Em uma modalidade, o domínio de ligação contra um complexo GPCR:proteína G liga-se especificamente ao GPCR compreendido no complexo, e não à proteína G. De preferência, em uma outra modalidade, o domínio de ligação contra um complexo GPCR:proteína G liga-se especificamente à proteína G compreendida no complexo, e não ao GPCR. Mais especificamente, o domínio de ligação contra um complexo GPCR:proteína G liga-se especificamente à proteína G que é uma proteína Gs compreendida em um complexo de um receptor acoplado à Gs e uma proteína Gs.

[098] Bem se sabe que os GPCRs são proteínas membranares conformacionalmente complexas que apresentam um espectro de comportamento funcional em resposta a ligantes naturais e sintéticos. Por natureza um GPCR ligado a ligante pode se associar com uma proteína G em um complexo que vai representar um estado conformacional funcional particular, mais especificamente um estado conformacional ativo, resultando em uma atividade biológica particular. A presente invenção oferece a vantagem particular de que os domínios de ligação descritos nesta invenção podem estabilizar várias dessas conformações ativas de GPCRs em complexo com uma proteína G e ligados a vários ligantes naturais ou sintéticos. O especialista na técnica vai perceber que os domínios de ligação que se ligam especificamente a um complexo ligante:GPCR:proteína G vão estabilizar a conformação específica do GPCR no complexo. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação é capaz de estabilizar, ou senão, aumentar a estabilidade de um estado conformacional funcional particular de um complexo GPCR:proteína G, de preferência em que o GPCR está em um estado conformacional ativo. Geralmente, um estado conformacional funcional do referido GPCR pode ser um estado conformacional basal, ou um estado conformacional ativo ou um estado conformacional inativo. De preferência, o domínio de ligação da invenção é capaz de estabilizar um GPCR em seu estado conformacional ativo e/ou é capaz de trancar o GPCR em um estado conformacional ativo quando se liga ao complexo GPCR:proteína G, seja na presença de um ligante de receptor ou não.

[099] Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, considera-se que o domínio de ligação é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR, uma proteína G e um ligante de receptor (já definido neste relatório). Mais preferivelmente, o domínio de ligação é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo consisting de um GPCR, uma proteína G e um ligante de receptor. Um ligante de receptor pode ser um composto pequeno, um peptídio, um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, entre outros, que desencadeia uma resposta ao se ligar. Ligantes de receptor, ou simplesmente ligantes, conforme usado neste relatório podem ser ligantes ortostéricos (tanto naturais quanto sintéticos) que se ligam ao sítio ativo do receptor e são classificados de acordo com sua eficácia ou em outras palavras quanto ao efeito que eles têm na sinalização do receptor através de uma via específica. Conforme usado neste relatório, um "agonista" refere-se a um ligante que, ao se ligar a um receptor, aumenta a atividade de sinalização do receptor. Agonistas completos são capazes de estimulação máxima do receptor; agonistas parciais são incapazes de produzir atividade total mesmo a concentrações saturantes. Os agonistas parciais também podem funcionar como "bloqueadores" impedindo a ligação de agonistas mais robutos. Um "anagonista" refere-se a um ligante que se liga a um receptor sem estimular qualquer atividade. Um "antagonista" também é conhecido como "bloqueador" por causa de sua capacidade de impedir a ligação de outros ligantes e, por conseguinte, bloquear a atividade induzida por um agonista. Além disso, um "agonista inverso" refere-se a um antagonista que, além de bloquear os efeitos agoníticos, reduz a atividade basal ou constitutiva dos receptores abaixo daquela do receptor não ligado. De preferência, o domínio de ligação da invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR, uma proteína G e um ligante de receptor, em que o ligante de receptor é um agonista. Mais especificamente, o agonista se liga ao receptor no sítio ortostérico.

[0100] As atividades de sinalização dos GPCRs (e portanto seu comportamento conformacional) também podem ser afetadas pela ligação de outro tipo de ligantes conhecidos como reguladores alostéricos. "Reguladores alostéricos" ou ainda "moduladores alostéricos"ou "moléculas efetoras" ligam-se a um sítio alostérico de um GPCR (isto é, um sítio regulador fisicamente distinto do sítio ativo da proteína). Em contraste com ligantes ortostéricos, moduladores alostéricos são não competitivos porque eles se ligam aos receptores em um sítio diferente e modificam a função do receptor mesmo que o ligante endógeno também esteja ligando-se. Por causa disso, os moduladores alostéricos não se limitam a simplesmente ligar ou desligar um receptor, como a maioria dos fármacos fazem. Ao contrário, eles agem mais como um interruptor de luz, oferecendo controle sobre a intensidade de ativação ou desativação, permitindo ao mesmo tempo que o corpo conserve seu controle natural sobre iniciar a ativação do receptor, alterando a afinidade do receptor para seu ligante (endógeno). Reguladores alostéricos que intensificam a atividade da proteína são denominados neste relatório "ativadores alostéricos" ou "moduladores alostéricos positivos", enquanto que aqueles que diminuem a atividade da proteína são denominados neste relatório "inibidores alostéricos" ou ainda "moduladores alostéricos negativos". Assim sendo, em uma modalidade particular, o domínio de ligação da invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR, uma proteína G e um ligante de receptor, em que o ligante de receptor é um modulador alostérico, de preferência um modulador alostérico positivo. Mais especificamente, o modulador alostérico positivo se liga ao receptor em seu sítio alostérico.

[0101] Como explicado, o panorama canônico de como os GPCRs regulam a fisiologia celular é que a ligação de ligantes (tais como hormônios, neurotransmissores ou estímulos sensoriais) estabiliza um estado conformacional ativo do receptor, permitindo assim interações com proteínas G heterotriméricas. Além de interagir com proteínas G, GPCRs ligados a agonistas se associam com quinases de GPCR (GRKs), levando à fosforilação do receptor. Um resultado comum da fosforilação de GPCR por GRKs é uma diminuição nas interações do GPCR com proteínas G e um aumento nas interações do GPCR com arrestinas, que interditam estericamente posterior sinalização da proteína G, resultando na dessensibilização do receptor. Como as β-arrestinas desligam os sinais da proteína G, elas podem simultaneamente iniciar um segundo conjunto paralelo de cascatas de sinal, tais como a via MAPK. GPCRs também se associam a várias proteínas fora das famílias de proteínas GPCR-interatuantes gerais (proteínas G, GRKs, arrestinas e outros receptores). Esses parceiros GPCR-seletivos podem mediar a sinalização do GPCR, organizar a sinalização do GPCR através de proteínas G, direcionar o tráfego de GPCR, ancorar GPCRs em áreas subcelulares particulares e/ou influenciar a farmacologia do GPCR (Ritter & Hall 2009). Neste contexto, ligantes conforme usado neste relatório "ligantes tendenciosos" com a capacidade de estimular seletivamente um subconjunto de atividades de sinalização de um receptor, por exemplo a ativação seletiva da função da proteína G ou β-arrestina. Tais ligantes são conhecidos como "ligantes tendenciosos", "agonistas tendenciosos" ou "agonistas funcionalmente seletivos". Mais particularmente, a tendência do ligante pode ser uma tendência imperfeita caracterizada por uma estimulação do ligante de múltiplas atividades do receptor com eficácias relativas diferentes para sinais diferentes (seletividade não absoluta) ou podem ser uma tendência tendência caracterizada por uma estimulação de ligante de uma atividade do receptor sem qualquer estimulação de outra atividade conhecida do receptor. Assim sendo, em uma modalidade particular, o domínio de ligação da invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR, uma proteína G e um ligante de receptor, em que o ligante de receptor é um ligante tendencioso.

[0102] Além disso, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, considera-se particularmente que o domínio de ligação da invenção direicionado contra e/ou ligando-se especificamente a um complexo GPCR:proteína G, já descrito nesta invenção, é derivado de um sistema imunológico inato ou adaptivo. De preferência, o referido domínio de ligação é derivado de uma imunoglobulina. De preferência, o domínio de ligação de acordo com a invenção é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. O termo "anticorpo" (Ab) refere-se em geral a um polipeptídio codificado por um gene de imunoglobulina, ou um fragmento funcional do mesmo, que se liga especificamente e reconhece um antígeno, e é conhecido pelo especialista na técnica. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) convencional compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis principalmente pelo reconhecimento do antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a essas cadeias leve e pesada, respectivamente. O termo "anticorpo" destina- se a incluir anticorpos inteiros, incluindo anticorpos inteiros de cadeia simples, e fragmentos de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, os fragmentos de ligação a antígeno podem ser fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno que incluem, porém sem limitação, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado a dissulfeto (dsFv) e fragmentos compreendendo ou consistindo em seja um domínio VL ou um domínio VH, e qualquer combinações destes ou qualquer outra porção funcional de um peptídio de imunoglobulina capaz de se ligar ao antígeno alvo. O termo "anticorpos" também se destina a incluir anticorpos de cadeia pesada, ou fragmentos funcionais dos mesmos, tais como anticorpos de domínio simples, mais especificamente, domínios variáveis simples de imunoglobulina tais como VHHs ou nanocorpos, definidos mais adiante neste relatório.

[0103] De preferência, o domínio de ligação da invenção é um domínio variável simples de imunoglobulina. Mais preferivelmente, o referido domínio de ligação é um domínio variável simples de imunoglobulina que compreende uma sequência aminoacídica compreendendo 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de preferência de acordo com a seguinte fórmula (1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1),

[0104] ou qualquer fragmento adequado da mesma (que geralmente vai então conter pelo menos alguns dos resíduos aminoacídicos que formam pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade).

[0105] Domínios de ligação compreendendo 4 FRs e 3 CDRs são conhecidos pelo especialista na técnica e já foram descritos, como um exemplo não limitativo, por Wesolowski et al. (2009, Med. Microbiol. Immunol. 198:157). Exemplos típicos, porém não limitativos, de domínios variáveis simples de imunoglobulina incluem sequências de domínios variáveis de cadeia leve (por exemplo uma sequência de domínios VL), ou sequências de domínios variáveis de cadeia pesada (por exemplo uma sequência de domínios VH) que usualmente são derivados de anticorpos de quatro cadeias convencionais. De preferência, os domínios variáveis simples de imunoglobulina são derivados de anticorpos camelídeos, de preferência de anticorpos camelídeos de cadeia pesada, destituídos de cadeias leves, e são conhecidos como sequências de domínios VHH ou nanocorpos (descritos mais adiante neste relatório).

[0106] O termo "nanocorpo" (Nb), conforme usado neste relatório, refere-se ao menor fragmento de ligação a antígeno ou domínio variável simples (VHH) derivado de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural e é conhecido pelo especialista na técnica. Eles são derivados de anticorpos com apenas cadeias pesadas, e são vistos em camelídeos (Hamers-Casterman et al. 1993; Desmyter et al. 1996). Nas famílias dos "camelídeos" são encontradas imunoglobulinas destituídas de cadeias polipeptídicas leves. "Camelídeos" compreendem camelídeos do velho mundo (Camelus bactrianus e Camelus dromedarius) e camelídeos do novo mundo (por exemplo Lama paccos, Lama glama, Lama guanicoe e Lama vicugna). O referido anticorpo de cadeia pesada de domínio simples é neste relatório denominado nanocorpo ou anticorpo VHH. NanocorpoTM e NanocorposTM são marcas registradas da Ablynx NV (Bélgica). O tamanho pequeno e as propriedades biofísicas únicas dos NBs superam fragmentos de anticorpo convencionais para o reconhecimento de epítopos incomuns ou ocultos e para ligação em cavidades ou sítios ativos de proteínas alvo. Além disso, os Nbs podem ser desenhados como anticorpos multiespecícos e/ou multivalentes ou presos a moléculas repórteres (Conrath et al. 2001). Os Nbs são proteínas de domínio simples estáveis e rígidas que podem ser facilmente produzidas e sobrevivem no sistema gastrointestinal. Assim sendo, os Nbs podem ser usados em muitas aplicações inclusive a descoberta de fármacos e terapia medicamentosa (Saerens et al. 2008) mas também como uma ferramenta versátil e valiosa para purificação, estudo funcional e cristalização de proteínas (Conrath et al. 2009). Uma classe particular de nanocorpos que agem como chaperonas de cristalização ligante epítopos conformacionais de alvos nativos são chamados de Xaperones e são particularmente considerados nesta invenção. Xaperones são ferramentas únicas em biologia estrutural. XaperoneTM é uma marca registrada de VIB e VUB (Bélgica). As principais vantagens para o uso de fragmentos de anticorpo camelídeo como auxiliar de cristalização sao que as Xaperones (1) se ligam a epítopos crípticos e trancam proteínas em conformações nativas únicas, (2) aumentam a estabilidade de proteínas solúveis e proteínas membranares solubilizadas, (3) reduzem a complexidade conformacional de proteínas membranares solubilizadas, (4) aumetam a superfície polar possibilitando o crescimento de cristais difratantes, (5) sequestram superfícies agregadoras ou polimerizantes, (6) permitem aprisionar por afinidade a proteína ativa.

[0107] Portanto, os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção, em particular os nanocorpos da invenção, geralmente compreendem uma única cadeia aminoacídica que tipicamente compreende 4 "sequências de esqueleto" ou FRs e 3 "regiões determinantes de complementaridade" ou CDRs de acordo com a fórmula (1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1).

[0108] O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR" refere-se a regiões variáveis em domínios variáveis simples de imunoglobulina e coném as sequências aminoacídicas capazes de se ligar especificamente a alvos antigênicos. Essas regiões CDR são responsáveis pela especificidade básica do nanocorpo para uma estrutura determinante antigênica particular. Tais regiões também são denominadas "regiões hipervariáveis". Os domínios variáveis simples de imunoglobulina têm 3 regiões CDR, cada uma delas não contígua com as outras (denominadas CDR1, CDR2, CDR3). Deve ficar claro que regiões de estrutura of domínios variáveis simples de imunoglobulina também podem contribuir para a ligação de seus antígenos (Desmyter et al. 2002; Korotkov et al. 2009). Exemplos não limitativos de tais domínios variáveis simples de imunoglobulina de acordo com a presente invenção assim como combinações particulares de FRs e CDRs estão descritos nesta invenção (vide Tabelas 2-3). A delineação das sequências de CDR (e portanto também das sequências de FR) baseia-se no sistema de numeração único IMGT para domínios V e domínios V-semelhantes (Lefranc et al. 2003). Alternativamente, a delineação das sequências de FR e CDR pode ser feita usando o sistema de numeração de Kabat aplicado a domínios VHH de Camelídeos no artigo de Riechmann e Muyldermans (2000). Como sabe o especialista na técnica, os domínios variáveis simples de imunoglobulina, em particular os nanocorpos, podem em particular ser caracterizados pela presença de um ou mais resíduos característicos dos Camelidae em uma ou mais das sequências de esqueleto (de acordo com a numeração de Kabat), segundo descrito por exemplo no documento WO 08/020079, página 75, Tabela A-3, aqui incorporado a título de referência).

[0109] Em uma modalidade preferida, a invenção oferece domínios variáveis simples de imunoglobulina com uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em sequências aminoacídicas que consistem essencialmente em 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente), nas quais as sequências de CDR das referidas sequências aminoacídicas têm pelo menos 70% de identidade aminoacídica, de preferência pelo menos 80% de identidade aminoacídica, mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade aminoacídica, tal como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou ainda 100% de identidade aminoacídica com as sequências de CDR (vide Tabela 3) de pelo menos um dos domínios variáveis simples de imunoglobulina de SEQ ID Nos: 1-6, de preferência SEQ ID N°: 1 e/ou 4. Ficará entendido que determinar o grau de identidade aminoacídica das sequências aminoacídicas das CDRs de uma ou mais sequência dos domínios variáveis simples de imunoglobulina, os resíduos aminoacídicos que formam as regiões de estrutura são desconsiderados. Alguns exemplos preferidos porém não limitativos de domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção estão dados nas SEQ ID Nos: 1 a 6, de preferência na SEQ ID N°: 1 e/ou na SEQ ID N°: 4 (vide Tabela 2).

[0110] Deve-se observar que os domínios variáveis simples de imunoglobulina, em particular os nanocorpos, da invenção em seu sentido mais amplo não se limitam a uma fonte biológica específica ou a um método de preparação específico. Por exemplo, os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção, em particular os nanocorpos, geralmente podem ser obtidos: (1) por isolamento do domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural; (2) por expressão de uma sequência nucleotídica codificando um domínio VHH de ocorrência natural; (3) por "humanização" de um domínio VHH de ocorrência natural ou por expressão de um ácido nucleico codificando tal domínio VHH humanizado; (4) por "camelização" de um domínio VH de ocorrência natural de qualquer espécie animal, e em particular de uma espécie de mamífero, tal como de um ser humano, ou por expressão de um ácido nucleico codificando tal domínio VH camelizado; (5) por "camelização" de "anticorpo de domínio" ou "Dab" já descrito na literatura, ou por expressão de um ácido nucleico codificando tal domínio VH camelizado; (6) pelo uso de técnicas sintéticas ou semissintéticas para a preparação de proteínas, polipeptídios ou outras sequências aminoacídicas conhecidas per se; (7) por preparação de um ácido nucleico codificando um nanocorpo usando técnicas para a síntese de ácidos nucleicos conhecida per se, seguida por expressão do ácido nucleico assim obtido; e/ou (8) por qualquer combinação de um ou mais dos itens acima.

[0111] Uma classe preferida de domínios variáveis simples de imunoglobulina corresponde aos domínios VHH de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural direcionados contra um complexo alvo de um GPCR e uma proteína G. Embora bibliotecas naives ou sintéticas de domínios variáveis simples de imunoglobulina possam conter ligantes conformacionais contra o complexo alvo, uma modalidade preferida desta invenção inclui a imunização de um Camelidae com um complexo alvo para expor o sistema imunológico do animal aos epítopos conformacionais que únicos para o complexo. Os animais podem ser imunizados com misturas dos monômeros interatuantes. Opcionalmente, o complexo pode ser estabiliado por reticulação química ou por adição de ligantes/metabólitos cooperativos/alostéricos que estabilizam o complexo (agonistas ortostéricos, ativadores alostéricos, Ca++, ATP, ...). O complexo também pode ser estabilizado por modificação covalente (fosforilação, ...) dos (de um dos) memros do complexo. Em uma modalidade alternativa, também é possível imunizar Camelidae com o GPCR e/ou a proteína G isolados, portanto não em complexo um com o outro. Opcionalmente, o GPCR e/ou a proteína G também podem ser estabilizados, por exemplo, por adição de ligantes/metabólitos cooperativos/alostéricos que estabilizam o GPCR e/ou a proteína G (agonistas ortostéricos, ativadores alostéricos, Ca++, ATP, entre outros).

[0112] Portanto, tais sequências de VHH geralmente podem ser geradas ou obtidas imunizando-se adequadamente um espécie de camelídeo com um complexo alvo compreendendo um GPCR e uma proteína G, ou com uma ou ambas de suas proteínas membro constituintes (isto é, para provocar uma resposta imunológico e/ou anticorpos de cadeia pesada direcionados contra um complexo alvo), obtendo-se uma amostra biológica adequada do referido camelídeo (tal como uma amostra de sangue, ou qualquer amostras de células B), e gerando-se sequências de VHH direcionadas contra um complexo alvo, partindo da referida amostra, usando qualquer técnica adequada conhecida per se. Tais técnicas serão evidentes para o especialista na técnica. Alternativamente, tais domínios VHH de ocorrência natural podem ser obtidos de bibliotecas naives das sequências de VHH de camelídeos, por exemplo por rastreamento de tal biblioteca usando um complexo alvo ou pelo menos uma parte, fragmento, determinante antigênico ou epítopo do mesmo usando uma ou mais técnicas de rastreamento conhecidas per se. Tais bibliotecas e técnicas estão descritas por exemplo nos documentos WO9937681, WO0190190, WO03025020 e WO03035694. Alternativamente, bibliotecas sintéticas ou semissintéticas melhoradas derivadas de bibliotecas de VHH naive podem ser usadas, tais como bibliotecas de VHH obtidas de bibliotecas de VHH naive por técnicass tais como mutagênese aleatória e/ou embaralhamento de CDR, como descrito por exemplo no documento WO0043507. Ainda uma outra técnica para obter sequências de VHH direcionadas contra um alvo envolve imunizar adequadamente um mamífero transgênico que é capaz de expressar anticorpos de cadeia pesada (isto é, para produzir uma resposta imunológica e/ou anticorpos de cadeia pesada direcionados contra um alvo), obter uma amostra biológica adequada do referido mamífero transgênico (tal como uma amostra de sangue, ou qualquer amostra de células B), e então gerar sequências de VHH direcionadas contra um alvo partindo da referida amostra, usando qualquer técnica adequada conhecida per se. Por exemplo, para esta finalidade, os camundongos expressando anticorpos de cadeia pesada e os métodos e técnicas adicionais descritos nos documentos WO02085945 e WO04049794 podem ser usados.

[0113] Uma classe particularmente preferida de domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção, em particular nanocorpos da invenção, compreende domínios variáveis simples de imunoglobulina com uma sequência aminoacídica que corresponde à sequência aminoacídica de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que fora "humanizado", isto é, por substituição de um ou mais resíduos aminoacídicos na sequência aminoacídica da referida sequência do VHH de ocorrência natural (e em particular nas sequências de esqueleto) por um ou mais dos resíduos aminoacídicos que ocorrem nas posições correspondentes em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano. Isto pode ser feito de maneira conhecida per se, que será evidente para o especialista na técnica, por exemplo com base na descrição mais adiante e na técnica anterior sobre humanização aqui mencionada. Mais uma vez, deve-se observar que tais domínios variáveis simples humanizados de imunoglobulina da invenção podem ser obtidos de qualquer maneira adequada conhecida per se (isto é, indicadas nos itens (1) - (8) acima) e portanto não estão estritamente limitados aos polipeptídios que foram obtidos usando usando um polipeptídio que compreende um domínio VHH de ocorrência natural como material de partida. Domínios variáveis simples humanizados de imunoglobulina, em particular nanocorpos, podem apresentar diversas vantagens, tais como imunogenicidade reduzida, em comparação com os domínios VHH de ocorrência natural correspondentes. Tal humanização geralmente envolve a substituição de um ou mais resíduos aminoacídicos na sequência de um VHH de ocorrência natural pelos resíduos aminoacídicos que ocorrem na posição em um domínio VH humano, tal como um domínio VH3 humano. As substituições humanizantes devem ser escolhidas de maneira que os domínios variáveis simples humanizados resultantes de imunoglobulina ainda conservem as propriedades favoráveis dos domínios variáveis simples de imunoglobulina definidos neste relatório. O especialista na técnica está apto a selecionar substituições humanizantes ou combinações adequadas de substituições humanizantes que otimizam ou atingem um equilíbrio desejado ou adequado entre as propriedades favoráveis proporcionadas pelas substituições humanizantes de um lado e as propriedades favoráveis dos domínios VHH de ocorrência natural, de outro lado.

[0114] Uma outra classe particularmente preferida de domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção, em particular nanocorpos da invenção, compreende domínios variáveis simples de imunoglobulina com uma sequência aminoacídica que corresponde à sequência aminoacídica de um domínio VH de ocorrência natural, mas que fora "camelizado", isto é, por substituição de um ou mais resíduos aminoacídicos na sequência aminoacídica de um domínio VH de ocorrência natural de um anticorpo de 4 cadeias convencional por um ou mais dos resíduos aminoacídicos que ocorre nas posições correspondente em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Tais substituições "camelizantes" são de preferência inseridas em posições aminoacídicas que formam e/ou estão presentes na interface VH-VL, e/ou nos chamados ressíduos característicos de Camelidae, já definidos neste relatório (vide por exemplo o documento WO9404678). De preferência, a sequência de VH que é usada como um material de partida ou ponto de partida para gerar ou desenhar o nanocorpo camelizado é de preferência uma sequência de VH de um mamífero, mais preferivelmente a sequência de VH de um ser humano, tal como uma sequência de VH3. No entanto, deve-se observar que tais domínios variáveis simples camelizados de imunoglobulina da invenção podem ser obtidos de qualquer maneira adequada conhecida per se (isto é, indicadas nos itens (1) - (8) acima) e portanto não estão estritamente limitados aos polipeptídios que foram obtidos usando usando um polipeptídio que compreende um domínio VH de ocorrência natural como material de partida.

[0115] Por exemplo, tanto a "humanização" como a "camelização" pode ser feitas provendo-se uma sequência nucleotídica que codifica um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, e então alterando-se, de maneira conhecida per se, um ou mais códons na referida sequência nucleotídica de tal maneira que a nova sequência nucleotídica codifique um domínio variável simples "humanizado" ou "camelizado" de imunoglobulina da invenção, respectivamente. Este ácido nucleico pode ser então expresso de maneira conhecida per se, de modo a proporcionar os domínios variáveis simples de imunoglobulina desejados da invenção. Alternativamente, com base na sequência aminoacídica de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, a sequência aminoacídica dos domínios variáveis simples humanizados ou camelizados de imunoglobulina da invenção, respectivamente, pode ser desenhada e então sintetizada de novo usando técnicas para a síntese de peptídios conhecidas per se. Também, com base na sequência aminoacídica ou na sequência nucleotídica de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, uma nucleotídica codificando os domínios variáveis simples humanizados ou camelizados de imunoglobulina desejados da invenção, respectivamente, pode ser desenhada e então sintetizada de novo usando técnicas para a síntese de ácidos nucleicos conhecidas per se, e depois disso o ácido nucleico assim obtido pode ser expresso de maneira conhecida per se, de modo a fornecer os domínios variáveis simples de imunoglobulina desejados da invenção. Outros métodos e técnicas adequados para obter os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção e/ou ácidos nucleicos codificando os mesmos, partindo de sequências de VH de ocorrência natural ou de preferência de sequências de VHH, serão evidentes para o especialista na técnica, e podem por exemplo compreender a combinação de uma ou mais partes de uma ou mais sequências de VH de ocorrência natural (tal como uma ou mais sequências de FR e/ou sequências de CDR), uma ou mais partes de uma ou mais sequências de VHH de ocorrência natural (tal como uma ou mais sequências de Fr ou sequências de CFR), e/ou uma ou mais sequências de sintéticas ou semissintéticas, de maneira adequada, de modo a fornecer um nanocorpo da invenção ou uma sequência nucleotídica ou ácido nucleico codificando o mesmo.

[0116] Também estão dentro do escopo da invenção análogos, mutantes, variantes, alelos, partes ou fragmentos (doravante coletivamente denominados "variantes") naturais ou sintéticos dos domínios variáveis simples de imunoglobulina, em particular os nanocorpos, da invenção já definidos neste relatório, r em particular variantes dos domínios variáveis simples de imunoglobulina de SEQ ID Nos: 1-6 (vide Tabelas 2-3). Portanto, de acordo com uma modalidade da invenção, o termo "domínio variável simples de imunoglobulina da invenção" ou "nanocorpo da invenção" em seu sentido mais amplo também cobre tais variantes. Geralmente, em tais variantes, um ou mais resíduos aminoacídicos podem ter sido substituídos, deletados e/ou adicionados, em comparação com os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção já definidos neste relatório. Tais substituições, inserções ou deleções podem ser feitas em uma ou mais das FRs e/ou em uma ou mais das CDRs, e em particular variantes das FRs e CDRs dos domínios variáveis simples de imunoglobulina de SEQ ID Nos: 1-6 (videTabelas 2-3). Variantes, conforme usado neste relatório, são sequências em que toda ou qualquer região de esqueleto e toda ou qualquer região determinante de complementaridade mostra pelo menos 80% de identidade, de preferência pelo menos 85% de identidade, mais preferivelmente 90% de identidade, ainda mais preferivelmente 95% de identidade, ou mais preferivelmente ainda 99% de identidade com a região correspondente na sequência de referência (isto é, FR1_variant versus FR1_reference, CDR1_variant versus CDR1_reference, FR2_variant versus FR2_reference, CDR2_variant versus CDR2_reference, FR3_variant versus FR3_reference, CDR3_variant versus CDR3_reference, FR4_variant versus FR4_reference), que pode ser medida eletronicamente usando-se algoritmos tais como PILEUP e BLAST (50, 51). Software para a realização de análises BLAST encontra- se disponível para o público no National Center for Biotechnology Information (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/). Ficará entendido que para determinar o grau de identidade aminoacídica das sequências aminoacídicas das CDRs de uma ou mais sequências dos domínios variáveis simples de imunoglobulina, os resíduos aminoacídicos que formam as regiões de estrutura são desconsiderados. Similarmente, para determinar o grau de identidade aminoacídica das sequências aminoacídicas das FRs de uma ou mais sequências dos domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção, os resíduos aminoacídicos que formam as regiões de complementaridade são desconsiderados. Tais variantes de domínios variáveis simples de imunoglobulina podem ser particularmente vantajosos uma vez que eles possuem potência/afinidade melhorada.

[0117] Por meio de exemplos não limitativos, uma substituição pode por exemplo ser uma substituição conservativa (descrita nesta invenção) e/ou um resíduo aminoacídico pode ser substituído por outro resíduo aminoacídico que ocorre naturalmente na mesma posição em um outro domínio VHH. Portanto, qualquer uma ou mais substituições, deleções ou inserções, ou qualquer combinação das mesmas, que ou melhora as propriedades dos domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção ou que pelo menos não prejudicam demais as propriedades desejadas ou o equilíbrio ou combinação de propriedades desejadas do nanocorpo da invenção (isto é, até o ponto em que o domínio variável simples de imunoglobulina não é mais adequado para seu uso pretendido) estão incluídas no escopo da invenção. O especialista na técnica geralmente estará apto a determinar e selecionar substituições, deleções ou inserções, ou combinações adequadas das mesmas, com base da presente descrição e opcionalmente depois de um grau limitado de experimentação de rotina, que pode por exemplo envolver a introdução de um número limitado de substituições possíveis e a determinação de sua influência nas propriedades dos domínios variáveis simples de imunoglobulina assim obtidos.

[0118] De acordo com modalidades particularmente preferidas,variantes dos domínios variáveis simples de imunoglobulina, em particular os nanocorpos, da presente invenção podem ter uma substituição, deleção ou inserção, de 1, 2 ou 3 aminoácidos seja em uma, duas ou três das CDRs, mais especificamente uma substituição, deleção ou inserção, de 1, 2 ou 3 aminoácidos (i) na CDR1 ou CDR2 ou CDR3; (ii) na CDR1 e CDR2, ou, na CDR1 e CDR3, ou, na CDR2 e CDR3; (iii) na CDR1 e CDR2 e CDR3, cujas sequências aminoacídicas das CDRs são aquelas listadas na Tabela 3. Mais preferivelmente, variantes dos domínios variáveis simples de imunoglobulina, em particular os nanocorpos, da presente invenção pode ter uma substituição conservativa (já definida neste relatório) de 1, 2 ou 3 aminoácidos em uma, duas ou três das CDRs, mais especificamente (i) na CDR1 ou CDR2 ou CDR3; (ii) na CDR1 e CDR2, ou, na CDR1 e CDR3, ou, na CDR2 e CDR3; (iii) na CDR1 e CDR2 e CDR3, listadas na Tabela 3.

[0119] De acordo com uma modalidade específica, a presente invenção oferece um domínio variável simples de imunoglobulina compreendendo uma sequência aminoacídica que compreende 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1); e em que CDR1 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 13-18, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 13-18, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 13-18, d) em que CDR2 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 25-30, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 25-30, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 25-30, d) em que CDR3 é selecionada do grupo que consiste em: a) SEQ ID Nos: 37-42, b) Polipeptídios que têm pelo menos 80% de identidade aminoacídica com as SEQ ID Nos: 37-42, c) Polipeptídios que têm 3, 2 ou 1 diferença aminoacídica com as SEQ ID Nos: 37-42.

[0120] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção oferece um domínio variável simples de imunoglobulina compreendendo uma sequência aminoacídica que compreende 4 regiões de estrutura (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1);

[0121] em que CDR1 é SEQ ID N°: 13; em que CDR2 é SEQ ID N°: 25; e em que CDR3 é SEQ ID N°: 37.

[0122] Além disso, e dependendo do organismo hospedeiro para expressar o domínio de ligação, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, as deleções e/ou substituições podem ser desenhadas de tal maneira que um ou mais sítios para modificações pós-translacional (tais como um ou mais sítios de glicosilação) são removidos, como é de conhecimento do especialista na técnica. Alternativamente, as substituições ou inserções podem ser desenhadas de maneira a introduzir um ou mais sítios para ligação de grupos funcionais (descritos nesta invenção), por exemplo para permitir peguilação sítio-específca.

[0123] Exemplos de modificações, assim como exemplos de resíduos aminoacídicos no domínio de ligação, em particular no domínio variável simples de imunoglobulina da invenção que podem ser modificados (isto é, seja na estrutura proteica mas de preferência em uma cadeia lateral), métodos e técnicas que podem ser usados para introduzir tais modificações e os potenciais usos e vantagens de tais modificações ficarão claros para o especialista na técnica. Exemplo, tal modificação pode envolver a introdução (por exemplo por ligação covalente ou de outra maneira adequada) de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou porções no ou sobre o domínio de ligação, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, e em particular de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou porções que conferem uma ou mais propriedades ou funcionalidades desejados ao domínio de ligação da invenção. Exemplos de tais grupos funcionais e de técnicas para introduzir os mesmos ficarão claros para o especialista na técnica, e geralmente podem compreender todos os grupos funcionais e técnicas mencionados na literatura assim como os grupos funcionais e técnicas conhecidos per se para a modificação de proteínas farmacêuticas, e em particular para a modificação anticorpos ou fragmentos de anticorpo (incluindo ScFvs e anticorpos de domínio simples), para os quais pode-se consultar por exemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tais grupos funcionais podem ser por exemplo ligados diretamente (por exemplo covalentemente) ao domínio de ligação, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, ou opcionalmente via um ligante ou espaçador adequado, como mais uma vez ficará claro para o especialista na técnica. Uma das técnicas mais amplamente usadas para aumentar a meia-vida e/ou reduzir a imunogenicidade de proteínas farmacêuticas compreende a ligação de polímero farmacologicamente aceitável adequado, tal como poli(etilenoglicol) (PEG) ou derivados do mesmo (tais como metoxipoli(etilenoglicol) ou mPEG). Generalmente, qualquer forma adequada de peguilação pode ser usada, tal como a peguilação usada na técnica para anticorpos e fragmentos de anticorpo (incluindo, porém sem limitação, anticorpos de domínio (simples) e ScFvs); faz-se referência por exemplo a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); de Veronese & Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), de Harris & Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) e ao documento WO04060965. Vários reagentes para peguilação de proteínas também se encontram comercialmente disponíveis, por exemplo na Nektar Therapeutics, EUA. De preferência, é usada a peguilação sítio-direcionada, em particular via um resíduo cisteína (vide por exemplo Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por exemplo, para esta finalidade, PEG pode ser preso a uma resíduo cisteína que ocorre naturalmente em um domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, um domínio variável simples de imunoglobulina da invenção pode ser modificado de maneira a introduzir adequadamente um ou mais resíduos cisteína para ligação do PEG, ou uma sequência aminoacídica compreendendo um ou mais resíduos cisteína para ligação do PEG pode ser fundida ao terminal N- e/ou C- de um nanocorpo da invenção, todos usando técnicas de modificação genética de proteínas conhecidas per se pelo especialista na técnica. De preferência, para o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, é usado um PEG com um peso molecular maior que 5000, tal como maior que 10.000 e menos que 200.000, tal como menor que 100.000; por exemplo na faixa de 20.000-80.000. Uma outra modificação usualmente menos preferida compreende glicosilação N-ligada ou O-ligada, usualmente como parte de uma modificação cotranslacional e/ou pós-translacional, dependendo da célula hospedeira usada para expressar do domínio de ligação, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção. Uma outra técnica para aumentar a meia-vida de um domínio de ligação pode compreender a modificação genética em domínios de ligação bifuncionais (por exemplo, um domínio variável simples de imunoglobulina contra o complexo GPCR:proteína G alvo e um contra uma proteína sérica tal como albumina) ou em fusões de domínios de ligação, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, com peptídios (por exemplo, um peptídio contra uma proteína sérica tal como albumina).

[0124] Ainda uma outra modificação pode compreender a introdução de um ou mais marcadores detectáveis ou outros grupos ou porções geradores de sinal, dependendo do uso pretendido do domínio de ligação marcado. Marcadores adequados e técnicas para prender, usar e detectar os mesmos ficarão claros para especialista na técnica, e por exemplo incluem, porém sem limitação, marcadores fluorescentes (tais como fluoresceína, isotiocianato, rodamina,ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, e fluorescamina e metais fluorescentes tais como Eu ou outros metais da série dos lantanídeos), marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminescentes ou marcadores bioluminescentes (tais como luminal, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sais de acridínio, éster de oxalato, dioxetano ou GFP e seus análogos ), radioisótopos, metais, quelatos metálicos ou cátions metálicos ou outros metais ou cátions metálicos que são particularmente adequados para uso em diagnóstico e imagem in vivo, in vitro ou in situ, assim como cromóforos e enzimas (tais como malato desidrogenase, nuclease estafilocóccica, delta- V- isomerase esteroide, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de biotinavidina, peroxidase de raiz- forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, betagalactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-VI-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolina esterase). Outros marcadores adequados ficarão claros para o especialista na técnica, e por exemplo incluem porções que podem ser detectadas pelo uso de RMN ou espectroscopia ESR. Tais domínios de ligação marcados da invenção podem ser por exemplo usadsos para ensaios in vitro, in vivo ou in situ (incluindo imunoensaios conhecidos per se tais como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios tipo sanduíche", etc.) assim como para diagnóstico e imagem in vivo, dependendo da escolha do marcador específico. Como será evidente para o especialista na técnica, uma outra modificação pode envolver a introdução de um grupo quelante, por exemplo para quelatar um dos metais ou cátions metálicos mencionados acima. Grupos quelantes adequados incluem por exemplo, porém sem limitação, ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA) ou ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA). Ainda uma outra modificação pode envolver a introdução de um grupo funcional que é uma parte de um par de ligação específico, tal como o par de ligação biotina-(estrept)avidina. Tal grupo funcional pode ser usado para ligar o domínio de ligação da invenção a uma outra proteína, polipeptídio ou composto químico que é ligado à outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, um domínio variável simples de imunoglobulina da invenção podem ser conjugado com biotina, e ligado a uma outra proteína, polipeptídio, composto ou carreador conjungado com avidina ou estreptavidina. Por exemplo, tal domínio variável simples de imunoglobulina conjugado pode ser usado como um repórter, por exemplo em um sistema de diagnóstico em que um agente produtor de sinais detectáveis é conjugado com avidina ou estreptavidina. Tais pares de ligação também podem ser usados por exemplo para ligar o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção a um carreador, incluindo carreadores para fins farmacêuticos. Um exemplo não limitativo são as formulações lipossômicas descritas por Cao & Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Tais pares de ligação também podem ser usados para ligar um agente terapeuticamente ativo ao domínio de ligação da invenção.

[0125] Também abrangidos pelo escopo da presente invenção estão os domínios de ligação, em particular os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção que estão em uma forma "multivalente" e são formados pela ligação, quimicamente ou por técnicas de DNA recombinante, de dois ou mais domínios variáveis simples monovalentes de imunoglobulina. Exemplos não limitativos de construções multivalentes incluem construções "bivalentes", construções "trivalentes", construções "tetravalentes", e assim por diante. Os domínios variáveis simples de imunoglobulina compreendidos em uma construção multivalente podem ser idênticos ou diferentes. Em uma outra modalidade particular, os domínios variáveis simples de imunoglobulina da invenção estão em uma forma "multiespecífica" e são formados pela ligação de dois ou mais domínios variáveis simples de imunoglobulina, dos quais pelo menos um tem uma especificidade diferente. Exemplos não limitativos de construções multiespecíficas incluem construções "biespecíficas", construções "triespecíficas", construções "tetraespecíficas", e assim adiante. Para ilustrar melhor, qualquer domínio variável simples de imunoglobulina multivalente ou multiespecífico (já definido neste relatório) da invenção pode ser adequadamente direcionado contra dois ou mais epítopos diferentes no mesmo antígeno, por exemplo contra duas ou mais partes diferentes da proteína G compreendida no complexo GPCR:proteína G; ou pode ser direcionado contra dois ou mais epítopos diferentes, por exemplo contra um epítopo do GPCR e um epítopo da proteína G. Em particular, um domínio variável simples de imunoglobulina monovalente é tal que ele vai se ligar ao complexo GPCR:proteína G alvo (descrito nesta invenção) com uma afinidade inferior a 500 nM, de preferência inferior a 200 nM, mais preferivelmente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM. Domínios variáveis simples de imunoglobulina multivalentes ou multeispecíficos da invenção também podem ter (ou ser modificados geneticamente e/ou selecionados para) avidez aumentada e/ou seletividade melhorada para o complexto GPCR:proteína G desejado, e/ou para qualquer outra propriedade desejada ou combinação de propriedades desejadas que possam ser obtidas pelo uso de tais domínios variáveis simples de imunoglobulina multivalentes ou multiespecíficos.

[0126] Além disso, o domínio de ligação da invenção, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina da invenção, geralmente pode ser direcionado contra ou se ligar especificamente a qualquer epítopo conformacional que é representado por ou accessível em ou parte de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G.Um domínio de ligação que se liga especificamente a um epítopo "tridimensional" ou "conformacional" é um domínio de ligação que se liga especificamente a uma estrutura terciária ou quaternária de uma proteína enrolada ou de um complexo proteico. Tal domínio de ligação se liga com afinidade muito reduzido (isto é, por um fator de pelo menos 2, 5, 10, 50 ou 100) à cadeia polipeptídica linear (isto é,desenrolada, desnaturada). A estrutura à qual tal domínio de ligação se liga geralmente contém aminoácidos que são descontínuos na sequência linear da proteína (complexo). Em outras palavras, a ligação de tal domínio de ligação a um polipeptídio é dependente do polipeptídio sendo enrolado em uma conformação tridimensional particular. Deve ficar claro que os epítopos conformacionais seletivamente reconhecidos pelos domínios de ligação da invenção podem ser epítopos GPCR-específicos, ou epítopos proteína G- específicos, ou ainda epítopos complexo GPCR:proteína G- específicos, que só são formados mediante associação das proteínas constituintes, e portanto por combinação de resíduos aminoacídicos do referido GPCR e da referida proteína G. Em uma modalidade, o domínio de ligação da invenção, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina, se liga especificamente a qualquer epítopo conformacional de qualquer proteína G desejada ou de partes da mesma. Em uma outra modalidade, o referido epítopo conformactional pode ser parte de uma região intracelular ou extracelular, ou uma região intramembranosa, ou um domínio ou estrutura de alça de qualquer GPCR desejado. Está claro que alguns desses epítopos conformacionais estarão accessíveis no GPCR e/ou na proteína G na forma não associada, ao passo que outros só estarão accessíveis depois de o complexo ser formado. De acordo com uma modalidade específica, o domínio de ligação da invenção, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina, liga-se especificamente a um epítopo conformacional na interface entre a subunidade α e β de uma proteína G, como especificado como um exemplo não limitativo mais adiante neste relatório (vide a seção Exemplos).

[0127] De acordo com outras modalidades específicas, o domínio de ligação liga-se a um complexo GPCR:proteína G em que a proteína G está em sua forma livre de nucleotídeo. De acordo com outras modalidades específicas, o domínio de ligação da invenção, em particular o domínio variável simples de imunoglobulina, inibe ou previne a dissociação do complexo GPCR:proteína G na presença de nucleotídeos, em particular nucleotídeos de guanina, tais como GDP ou GTP, ou análogos dos mesmos, tais como análogos não hidrolisáveis de GTP, tais como GTPyS, ou GDP em combinação com espécies de fluoreto de alumínio ou berílio, ou análogos nucleotídicos mínimos tais como pirofosfato ou forcarnet. Na ausência dos domínios de ligação da invenção, a dissociação do complexo GPCR:proteína G normalmente ocorre na presença desses nucleotídeos.

[0128] De acordo com um aspecto particular, a invenção também oferece um domínio de ligação que é direcionado contra ou se liga especificamente a uma proteína G (isto é, uma proteína G isolada, portanto não com complexo com um GPCR). Em modalidades específicas, o domínio de ligação descrito nesta invenção é direcionado contra e/ou liga-se especificamente a uma proteína Gs. De acordo com modalidades específicas deste aspecto, o domínio de ligação da invenção previne ou inibe a ligação de nucleotídeos, em particular nucleotídeos de guanina ou análogos (já descritos nesta invenção), à proteína G. Ou também, o domínio de ligação da invenção é capaz de deslocar um nucleotídeo de guanina ou análogo do mesmo da proteína G. Exemplos não limitativos de ensaios para determinar o grau de inibição da ligação ou deslocamento de nucleotídeos de guanina para uma proteína estão dados na seção Exemplos, por exemplo nos Exemplos 3 e 8. Além disso, será observado que todas as modalidades particulares referentes aos domínios de ligação da invenção, já descritos nesta invenção, também se aplicam a este aspecto particular da invenção.

[0129] A versatilidade funcional dos GPCRs está inerentemente acoplada à flexibilidade dessas proteínas resultando em um espectro de conformações. O panorama energético conformacional está intrinsecamente a fatores tais como a presença de ligantes ligados (moléculas efetoras, agonists, antagonistas, agonistas inversos, ...), ao ambiente lipídico ou à ligação de proteínas interatuantes. Portanto, em uma modalidade, os domínios de ligação da invenção, em particular os domínios variáveis simples de imunoglobulina aumenta a estabilidade do complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G mediante ligação ao referido domínio de ligação. Em ainda outra modalidade, a ligação do domínio de ligação da invenção a qualquer epítopo conformacional é representado por ou accessível em ou parte de um complexo compreendendo um complexo GPCR:proteína G, induz a formação de um estado conformacional funcional de um GPCR, em particular um estado conformacional ativo do referido GPCR. Mais especificamente, o domínio de ligação da invenção é capaz de estabilizar o estado ativo do GPCR compreendido no complexo GPCR:proteína G, aumentando a afinidade da proteína G para o receptor. Da mesma forma, o domínio de ligação da presente invenção é capaz de estabilizar um complexo GPCR:proteína G ligado a um agonista e/ou melhorar a afinidade de um agonista para um complexo GPCR:proteína G. De preferência, o domínio de ligação é capaz de aumentar a afinidade da proteína G para o GPCR e/ou a afinidade do agonista para o complexo GPCR:proteína G pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes, e mais preferivelmente pelo menos dez vezes medida por uma redução na Kd. Alternativamente, o domínio de ligação é capaz de induzir um desvio na EC50 ou na IC50 de pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes, e mais preferivelmente pelo menos dez vezes em qualquer configuração do ensaio que compara a resistência de interação do receptor e da proteína G na presença do complexo estabilizando o domínio de ligação versus uma condição na qual este domínio de ligação está ausente ou qualquer outra medida de afinidade ou potência conhecida pelo especialista na técnica.

[0130] O termo "um estado conformacional funcional", conforme usado neste relatório, refere-se ao fato de que proteína, em particular proteínas membranares tais como GPCRs, possuem muito estados conformacionais diferentes tendo uma faixa dinâmica de atividade, em particular variando de nenhuma atividade à atividade máxima (revsito em Kobilka & Deupi, 2007). Deve ficar claro que "um estado conformacional funcional" não cobre os estados desnaturados das proteínas. Por exemplo, um estado conformacional basal pode ser definido como um estado de baixa energia do receptor na ausência de um ligante. A probabilidade de que uma proteína vai sofrer uma transição para um outro estado conformacional é uma função da diferença de energia entre os dois estados e a altura da barreira de energia entre os dois estados. No caso de uma proteína receptora, tal como um GPCR, a energia de ligação do ligante pode ser usada seja para alterar a barreira de energia entre os dois estados, ou para alterar os níveis de energia relativa entre os dois estados, ou ambos. A alteração da barreira de energia teria um efeito na taxa de transição entre os dois estados, ao passo que a alteração dos níveis de energia teria um efeito na distribuição de equilíbrio dos receptores em dois estados. A ligação de um agonista ou agonista parciala diminuiria a barreira de energia e/ou reduziria a energia do estado conformacional mais ativo em relação ao estado conformacional inativo. Um agonista inverso aumentaria a barreira de energia e/ou reduziria a energia do estado conformacional inativo em relação à conformação ativa. O acoplamento do receptor a sua proteína G poderia ainda alterar o panorama energético. Interações cooperativas de β2AR e Gs observadas em ensaios de ligação a ligante formaram a base do modelo do complexo ternário de ativação do GPCR (Delean et al., 1980). No complexo ternário consistindo em agonista, receptor, e proteína G, a afinidade do receptor para o agonista é melhorada e a especificidade da proteína G para nucleotídeos de guanina muda a favor do GTP sobre o GDP.

[0131] Deve ser observado que as atividades das proteínas membranares integrais, incluindo GPCRs, também são afetadas pelas estruturas das moléculas lipídicas que as envolve na membrana. As proteínas membranares não são entidades rígidas, e deformam para garantir uma boa correspondência hidrofóbica com a bicamada lipídica envolvente. Um parâmetro importante é a espessura hidrofóbica da bicamada lipídica, definida pelos comprimentos das cadeias acílicas graxas do lipídio. Também, a estrutura da região do grupo cabeça é possivelmente importante para definir as estruturas daquelas partes de uma proteína membranar que ficam localizadas na região do grupo cabeça do lipídio. Entre outros lipídios, palmitoilação e ligação de colesterol a GPCRs também podem desempenhar um papel estrutural no interior de receptores monoméricos e contribuir para a formação/estabilização de oligômeros do receptor (Lee 2004; Chini & Parenti 2009).

[0132] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um complexo compreendendo um domínio de ligação da invenção. Mais especificamente, a invenção oferece um complexo compreendendo um domínio de ligação da invenção, um GPCR, uma proteína G, e opcionalmente um ligante de receptor. Como um exemplo não limitativo, um complexo estável pode ser purificado por filtração em gel, como foi feito por exemplo com o complexo quaternário contendo um nanocorpo, um GPCR, uma proteína G, e um ligante de receptor (vide a seção Exemplos). Em uma modalidade particular, o complexo pode ser cristalino. Por conseguinte, a invenção também oferece um cristal do complexo, assim como métodos para fazer o referido cristal, que estão descritos em maiores detalhes mais adiante.

[0133] Em um outro aspecto, uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma sequência aminoacídica de qualquer um dos domínios de ligação da invenção, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, também faz parte da presente invenção e exemplos não limitativos estão dados na Tabela 4. De acordo com modalidades preferidas, a invenção refere-se a sequências de ácidos nucleicos dos domínios de ligação da invenção, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, nas quais as sequências têm mais de 80%, de preferência mais de 90%, mais preferivelmente mais de 95%, tal como 99% ou mais de identidade de sequência (já definido neste relatório) com as sequências de pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos dos domínios de ligação de SEQ ID Nos: 49-54 (vide Tabela 4). Para o cálculo da percentagem de identidade de sequência, as sequências de ácidos nucleicos de tags (por exemplo tag His ou tag EPEA) devem ser desconsideradas. Também, as sequências de ácidos nucleicos descritas nesta invenção podem estar compreendidas em uma sequência de ácidos nucleicos.

[0134] Além disso, a presente invenção também prevê vetores de expressão compreendendo sequências de ácidos nucleicos codificando qualquer um dos domínios de ligação da invenção, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, assim como células hospedeiras expressando tais vetores de expressão. Sistemas de expressão adequados incluem sistemas de expressão constitutivos e induzíveis em bactérias ou leveduras, sistemas de expressão virais, tais como baculovírus, vírus da floresta de Semliki e lentivírus, ou transfecção transitória em células de insetos ou mamíferos. A clonagem, expressão e/ou purificação dos domínios de ligação da invenção, em particular os domínios variáveis simples de imunoglobulina, podem ser feitas de acordo com técnicas conhecidas pelo especialista na técnica.

[0135] Portanto, a presente invenção abrange uma célula ou uma cultura de células expressando um domínio de ligação da invenção, em particular um domínio variável simples de imunoglobulina que é direcionado contra e/ou capaz de se ligar especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G. As células de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer organismo procariota ou eucariota. De preferência, as células são células eucariotas, por exemplo células de levedura, ou células de inseto, ou linhagens celulares cultivadas, por exemplo linhagens celulares de mamífero, de preferência linhagens celulares humanas, que expressa endógena ou recombinantemente um GPCR e/ou uma proteína G de interesse. A natureza das células usadas vai tipicamente depender da facilidade e do custo de produção das proteínas nativas, das propriedades de glicosilação desejadas, da origem da proteína alvo, da aplicação pretendida, ou qualquer combinação destes. Células ou linhagens celulares eucatiotas para a produção de proteínas são bastante conhecidas na literatura, inclusive linhagens celulares com vias de glicosilação modificadas, e exemplos não limitativos serão fornecidos mais adiante.

[0136] Células hospedeiras de animais ou mamíferos adequadas para ancorar, expressar, e produzir proteínas para subsequente isolamento e/ou purificação incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), tais como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; e Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909), linhagem celular CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO clone 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clone B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), RR-CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), células CHO negativas para di-hidrofolato redutase (CHO/-DHFR, Urlaub & Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), e células dp12.CHO (Patente US N° 5.721.121); células CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651); células de rim embrionário humano (por exemplo, células 293, ou células 293T, ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59, ou células GnTI KO HEK293S, Reeves et al. 2002, PNAS, 99: 13419); células de rim hamster bebê (BHK, ATCC CCL-10); células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de rim de cachorro (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL-51); células de fígado de búfalo e rato ("buffalo rat liver cells") (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NYAcad. Sci., 383:4468); células MCR 5; células FS4. De acordo com uma modalidade particular, as células são células de mamífero selecionadas dentre as células Hek293 ou as células COS.

[0137] Linhagens celulares de não mamíferos exemplificativas incluem, porém sem limitação, células Sf9, sistemas celulares de baculovírus-insetos (por exemplo vide Jarvis, Virology Volume 310, Issue 1, 25 May 2003, páginas 1-7), células vegetais tais como células de tabaco, células de tomate, células de milho, células de algas, ou leveduras tais como a espécie Saccharomyces, a espécie Schizosaccharomyces, a espécie Hansenula, a espécie Yarrowia ou a espécie Pichia. De acordo com modalidades particulares, as células eucariotas são células de levedura de uma espécie Saccharomyces (por exemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces sp. (por exemplo Schizosaccharomyces pombe), uma espécie Hansenula (por exemplo Hansenula polymorpha), uma espécie Yarrowia (por exemplo Yarrowia lipolytica), uma espécie Kluyveromyces (por exemplo Kluyveromyces lactis), uma espécie Pichia (por exemplo Pichia pastoris), ou uma espécie Komagataella (por exemplo Komagataella pastoris). De acordo com uma modalidade específica, as células eucariotas são células de Pichia, e em uma modalidade masi particular células de Pichia pastoris.

[0138] A transfecção de células-alvo (por exemplo células de mamífero) pode ser efetuada seguindo-se os princípios traçados por Sambrook & Russel (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Volume 3, Chapter 16, Section 16.1-16.54). Além disso, transducção viral também pode ser efetuada usando-se reagentes tais como vetores adenovirais. Como selecionar o sistema vetor viral apropriado, regiões reguladoras e células hospedeiras é de conhecimento comum do especialista na técnica. As células transfectadas resultantes são mantidas em cultura ou congeladas para uso posterior de acordo com práticas tradicionais.

[0139] Por conseguinte, um outro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir um domínio de ligação de acordo com a invenção, o método compreendendo pelo menos as etapas de: a) expressar em um sistema de expressão celular adequado (já definido acima) um ácido nucleico de acordo com a invenção, e opcionalmente b) isolar e/ou purificar o referido domínio de ligação.

[0140] Os domínios de ligação, complexos, células ou linhagens celulares descritos nesta invenção podem ser usados em uma variedade de contextos e aplicações, por exemplo, porém sem limitação, para a captura e/ou purificação de complexos GPCR:proteína G, e em estudos de cristalização e análise estrutural de alta resolução de complexos GPCR:proteína G. Constitui portanto um dos objetivos da invenção usar o domínio de ligação de acordo com a invenção, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, tais como nanocorpos, como ferramentas para estabilizar complexos GPCR:proteína G e ainda usar esses domínios de ligação como auxiliares de cocristalização para GPCRs em complexo com uma proteína G, ou em outras palavras para facilitar a cristalogênese de complexos GPCR:proteína G. Adicionalmente, e/ou alternativamente, os domínios de ligação e de preferência sistemas celulares expressando os domínios de ligação, descritos nesta invenção, podem ser úteis para outras aplicações tais como rastreamento de ligantes, descoberta de fármacos, imunização, todos estes estando descritos em maiores detalhes mais adiante.

Estabilização de um complexo GPCR:proteína G e trancamento do GPCR no estado ligado à proteína G

[0141] Por conseguinte, de acordo com um aspecto, a invenção refere-se ao uso de um domínio de ligação descrito nesta mais acima neste relatório para estabilizar um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G. De acordo com uma modalidade preferida, o complexo que é estabilizado compreende ainda um ligante de receptor, mais expe um agonista. O termo "estabilizar", "estabilizando" ou "aumentando a estabilidade", conforme usado neste relatório, refere-se a aumentar a estabilidade de um complexo GPCR:proteína G em relação à estrutura (estado conformacional) e/ou atividade biológica particular (atividade de sinalização intracelular) de uma das proteínas constituintes do complexo ou de ambas, em particular o GPCR e/ou a proteína G. Em uma modalidade particularmente preferida, o domínio de ligação da invenção pode ser usado para estabilizar o complexo GPCR:proteína G de modo que o GPCR fique trancado ou fixado em um estado ativo ou ligado à proteína G. Um GPCR que adota tal estado ativo ou ligado à proteína G vai exercer sua atividade biológica por natureza. Maneiras de determinar a estabilidade (aumentada) de um complexo GPCR:proteína G já foram descritas e estão ainda ilustradas na seção Exemplos.

[0142] Será apreciado que ter a estabilidade aumentada em termos de estrutura e/ou uma atividade biológica particular de um GPCR inclui a estabilidade a outros desnaturantes ou condições desnaturantes que incluem calor, um detergente, um agente caotrópico e um pH extremo. Por conseguinte, em uma outra modalidade, o domínio de ligação de acordo com a invenção é capaz de aumentar a estabilidade de um complexo GPCR:proteína G em condições não fisiológicas induzidas por diluição, concentração, composição tampão, aquecimento, resfriamento, congelamento, detergente, agente caotrópico, pH, entre outros. Por conseguinte, o termo "termoestabilizar", "termoestabilizando", "aumentar a termoestabilidade de", refere-se às propriedades funcionais e não às propriedades termodinâmicas de um complexo GPCR:proteína G e à resistência da proteína constituinte à desnaturação irreversível induzida por abordagens térmicas e/ou químicas que incluem, porém sem limitação, aquecimento, resfriamento, congelamento, desnaturantes químicos, pH, detergentes, sais, aditivos, proteases ou temperatura. A desnaturação irreversível leva ao desenrolamento irreversível das conformações funcionais da proteína, perda de atividade biológica e agregação da proteína desnaturada. O termo "(termo)estabilizar", "(termo)estabilizando", "aumentando a (termo)estabilidade de", conforme usado neste relatório, aplica-se a complexos GPCR:proteína G incrustados em partículas lipídicas ou em camadas lipídicas (por exemplo, monocamadas lipídicas, bicamadas lipídicas, e similares) e a complexos GPCR:proteína G que foram solublizados em detergente.

[0143] Quanto a uma estabilidade aumentada ao calor, esta pode ser facilmente determinada medindo-se a ligação ao ligante ou usando-se métodos espectroscópicos tais como fluorescência, CD ou espalhamento de luz que são sensíveis ao desenrolamento a temperaturas crescentes. É preferível que o domínio de ligação seja capaz de aumentar a estabilidade segundo medida por um aumento na estabilidade térmica de um complexo GPCR:proteína G com pelo menos 2°C, pelo menos 5°C, pelo menos 8°C, e mais preferivelmente pelo menos 10°C ou 15°C ou 20°C. De acordo com uma modalidade preferida, o domínio de ligação é capaz de aumentar a estabilidade térmica de um complexo GPCR:proteína G com um ligante de receptor, mais especificamente um agonista ou um modulador alostérico positivo da via de sinalização dependente de GPCR. De acordo com uma outra modalidade preferida, o domínio de ligação de acordo com a invenção é capaz de aumentar a estabilidade de um complexo GPCR:proteína G na presença de um detergente ou caótropo. De preferência, o domínio de ligação é capaz de aumentar a estabilidade de um complexo GPCR:proteína G à desnaturação induzida por abordagens térmicas ou químicas. Quanto a uma estabilidade aumentada ao calor, a um detergente ou a um caótropo, o complexo GPCR:proteína G é incubado por um tempo definido na presença de um detergente de teste ou de um agente caotrópico de teste e a estabilidade é determindada usando-se, por exemplo, ligação ao ligante ou um método espectroscópico, opcionalmente a temperaturas crescentes como discutido acima. De acordo ainda com uma outra modalidade preferida, o domínio de ligação de acordo com a invenção é capaz de aumentar a estabilidade a um pH extremo de um estado conformacional funcional de um GPCR. De preferência, o domínio de ligação é capaz de aumentar a estabilidade de um complexo GPCR:proteína G a um pH extremo. No que diz respeito a um pH extremo, um pH de teste típico seria escolhido por exemplo na faixa de 6 a 8, na faixa de 5,5 a 8,5, na faixa de 5 a 9, na faixa de 4,5 a 9,5, mais especificamente na faixa de 4,5 a 5,5 (pH baixo) ou na faixa de 8,5 a 9,5 (pH alto).

[0144] Em uma modalidade particularmente preferida, o domínio de ligação de acordo com a invenção pode ser usado para prevenir a dissociação do complexo na presença de nucleotídeos, em particular nucleotídeos de guanina ou análogos dos mesmos. Mais especificamente, nucleotídeos de guanina incluem GDP e GTP, e análogos de nucleotídeos de guanina incluem, porém sem limitação, GTPyS ou GDP em combinação com espécies de fluoreto de alumínio ou berílio ou fragmentos de nucleotídeo tais como pirofosfato ou foscarnet.

Captura e/ou purificação de um complexo GPCR:proteína G

[0145] Ficará portanto compreendido que a capacidade de formar um complexo GPCR:proteína G estável é particularmente útil para capturar e/ou purificar um complexo GPCR:proteína G, o que vai permitir subsequente cristalização, caracterização do ligante e análise do composto, imunizações, entre outros. Além disso, é particularmente vantajoso que os domínios de ligação da invenção podem ser ferramentas genéricas úteis que podem ser de aplicação para uma gama de complexos GPCR:proteína G.

[0146] Por conseguinte, a presente invenção também fornece um método de captura e/ou purificação de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer um domínio de ligação de acordo com a invenção, e b) deixar que o domínio de ligação se ligue a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e c) opcionalmente, isolar o complexo formado na etapa b).

[0147] Em uma modalidade específica, a invenção oferece um método de captura de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G compreendendo as etapas de: a) aplicar uma solução contendo uma pluralidade de GPCRs e proteínas G a um suporte sólido possuindo um domínio de ligação imobilizado de acordo com a invenção, e b) formar um complexo da domínio de ligação, o GPCR e a proteína G, e c) remover moléculas fracamente ligadas ou não ligadas.

[0148] A presente invenção também fornece um método de purificação de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) contactar uma soluçãao contendo um GPCR e uma proteína G com um domínio de ligação de acordo com a invenção, e b) formar um complexo compreendendo o domínio de ligação, o GPCR e a proteína G, e c) isolar o complexo da etapa b) em que um complexo de um GPCR e uma proteína G é essencialmente purificado.

[0149] De acordo com uma modalidade particular, o domínio de ligação descrito nesta invenção também pode ser usado para capturar um complexo GPCR:proteína G alvo compreendendo ainda um ligante de receptor e/ou uma ou mais outras proteínas interatuantes.

[0150] Os métodos acima para a captura/purificação de complexos GPCR:proteína G alvo incluem, porém sem limitação, métodos baseados na afinidade tais como cromatografia por afinidade, purificação por afinidade, imunoprecipitação, detecção de proteínas, imunoquímica, exibição superficial, entre outros, e todos são bastante conhecidos na literatura.

Cristalização e resolução da estrutura de um complexo GPCR:proteína G

[0151] A Cristalização de proteínas membranares incluindo GPCRs continua sendo um desafio formidável. Embora estejam surgindo métodos de expressão e purificação que permitem gerar quantidades da ordem de miligramas, atingir a estabilidade com essas moléculas é talvez o obstáculo mais difícil de superar. Antes de mais nada, os domínios de ligação de acordo com a invenção podem aumentar a estabilidade de complexos GPCR:proteína G solubilizados com detergente, protegê-los contra degradação proteolítica e/ou agregação e facilitar a purificação e a concentração de amostras homogêneas de proteínas corretamente enroladas. Os especialistas na técnica vão perceber que tais amostras constituem o ponto de partida preferido para a geração de cristais difratantes.

[0152] Cristalização representa uma outra barreira importante no processo de determinação da estrutura macromolecular por cristalografia de raios-X. Uma cristalização bem-sucedida requer a formação de núcleos e seu subsequente crescimento como cristais de tamanho adequado. O crescimento de cristais geralmente ocorre espontaneamente em uma solução supersaturada como resultado de nucleação homogênea. As proteínas podem ser cristalizadas em uma experiência de rastreamento de matriz esparsa típica, na qual precipitantes, aditivos e concentrações de proteína são extensivamente amostrados, e condições de supersaturação adequadas para nucleação e crescimento de cristais podem ser identificadas para uma proteína particular. Relacionado com a abordagem de rastreamento de matriz esparsa é gerar variação estrutural na própria proteína, por exemplo por adição de ligantes que se ligam à proteína, ou fazendo diferentes mutações, de preferência em resíduos superficiais da proteína alvo ou tentanto cristalizar diferentes espécies ortólogas da proteína alvo (Chang 1998). Uma descoberta inesperada da presente invenção é a utilidade de domínios de ligação que se ligam especificamente a um complexo GPCR:proteína G para introduzir um grau de variação estrutural com a ligação preservando ao mesmo tempo o enrolamento total do complexo.

[0153] Como a cristalização envolve uma perda desfavorável de entropia conformacional na molécula a ser reunida na rede de cristal, métodos que reduzem a entropia conformacional do alvo enquanto ainda em solução devem aumentar a probabilidade de cristalização reduzindo a penalidade entrópica líquida de formação da rede. A aboordagem de ‘redução da entropia superficial’ mostrou-se altamente eficaz (Derewenda 2004). Da mesma forma, parceiros de ligação tais como íons, ligantess de molécula pequena, e peptídios podem reduzir a heterogeneidade conformacional ligando-se a e estabilizando um subconjunto de estados conformacionais de uma proteína. Embora tais parceiros de ligação sejam eficazes, nem todas as proteínas possuem um parceiro de ligação, e mesmo quando um parceiro de ligação é conhecido, sua afinidade, solubilidade, e estabilidade química podem não ser compatíveis com experiências de cristalização. Portanto, foi surpreendentemente descoberto que os domínios de ligação da presente invenção podem ser usados como ferramentas para aumentar a probabilidade de obter cristais bem ordenados minimizando a heterogeneidade conformacional no complexo GPCR:proteína G alvo ligando-se a uma conformação específica da proteína G.

[0154] A cristalização de GPCRs estudos estruturais de alta resolução é particularmente difícil por causa da superfície anfipática dessas proteínas membranares. Incrustados na bicamada membranar, os sítios de contato da proteína com cadeias acil dos fosfolipídios são hidrofóbicos, ao passo que as superfícies polares ficam expostas aos grupos cabeça polares dos lipídios e às fases aquosas. Para obter cristais tridimensionais bem ordenados - um pré-requisito para análise estrutural por raios X em alta resolução - os GPCRs são solubilizados com a ajuda de detergentes e purificados como complexos proteína- detergente. A micela de detergente cobre a superfície hidrofóbica da proteína membranar de maenria semelhante a um cinto (Hunte & Michel 2002; Ostermeier et al. 1995). Complexos GPCR-detergente formam cristais tridimensionais nos quais contatos entre moléculas proteicas adjacentes são feitos pelas superfícies polares da proteína que se projeta da micela de detergente (Day et al. 2007). Obviamente, a micela de detergente requer espaço na rede cristalina. Embora interações de atração entre as micelas possam estabilizar o acondicionamento do cristal ("crystal packing") (Rasmussen et al. 2007; Dunn et al. 1997), essas interações não levam a contatos rígidos no cristal. Como muitas proteínas membranares, inclusive GPCRs, contêm domínios hidrofílicos relativamente pequenos ou altamente flexíveis, uma estratégia para aumentar a probabilidade de obter cristais bem ordenados para amplicar a superfície polar da proteína e/ou reduzir sua flexibilidade. A abordagem mais fisiológica é usar um parceiro de sinalização nativo tal como uma proteína G ou arrestina. Infelizmente, as interações de GPCRs com proteínas G ou arrestinas são altamente dependentes de lipídios, e tem sido difícil formar complexos de estabilidade suficiente para cristalografia. Portanto, os domínios de ligação da presente invenção podem ser usados para ampliar as superfícies polares dos GPCRs embora a ligação de uma proteína G, suplementando a quantidade de superfície proteína que pode facilitar contatos primários entre moléculas na rede cristalina com as superfícies polares da proteína G e do nanocorpo. Os domínios de ligação da presente invenção também podem reduzir a flexibilidade de suas regiões extracelulares para o crescimento de cristais bem ordenados. Domínios variáveis simples de imunoglobulina, incluindo nanocorpos, são especialmente adequados para este fim porque eles se ligam a epítopos conformacionais e são compostos de um único domínio globular rígido, destituído de regiões ligantes flexíveis ao contrário de anticorpos convencionais ou fragmentos derivados tais como Fab’s.

[0155] Portanto, de acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção oferece domínios de ligação úteis como ferramentas para cristalizar um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e eventualmente resolver a estrutural. Mais preferivelmente, o complexo que é cristalizado pelo uso de um domínio de ligação da presente invenção compreende ainda um ligante de receptor, mais especificamente um agonista. Em uma modalidade particularmente preferida, o GPCR compreendido no complexo está em um estado ou conformação ativa.

[0156] Portanto, o domínio de ligação em complexo com o complexo GPCR:proteína G e opcionalmente o ligante de receptor pode ser cristalizado usando-se qualquer um de uma variedade de métodos de cristalização particulares para proteínas membranares, muitos dos quais estão revistos em Caffrey (2003 & 2009). Em termos gerais, os métodos são métodos baseados em lipídios que incluem adicionar lipídio ao complexo antes da cristalização. Tais métodos foram previamente usados para cristalizar outras proteínas membranares. Muitos desses métodos, inclusive o método de cristalização de fase cúbica lipídica e o método de cristalização de bicelas, exploram as propriedades de auto-agrupamento espontâneo de lipídios e detergente como vesículas (método de fusão de vesícula), micelas discoides (método de bicelas), e cristais líquidos ou mesofases (no método de mesofase ou fase cúbica). Os métodos de cristalização de fases cúbicas lipídicas estão descritos em, por exemplo: Landau et al. 1996; Gouaux 1998; Rummel et al. 1998; Nollert et al. 2004, Rasmussen et al. 2011, cujas publicações estão aqui incorporadas a título de referência para divulgação desses métodos. Métodos de cristalização de bicelas estão descritos em, por exemplo: Faham et al. 2005; Faham et al. 2002, cujas publicações estão aqui incorporadas a título de referência para divulgação desses métodos.

[0157] De acordo com uma outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de um domínio de ligação descrito nesta invenção para resolver a estrutura de um complexo alvo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e opcionalmente compreendendo ainda um ligante de receptor. "Resolver a estrutura" conforme usado neste relatório refere- se a determinar o arranjo de átomos ou as coordenadas atômicas de uma proteína, e geralmente é feito por um método biofísico, tal como cristalografia de raios-X.

[0158] Na cristalografia de raios-X, os dados de difração quando apropriadamente agrupados dão a amplitude da transformada deFourier 3D da densidade de elétrons da molécula na unidade celular. Se as fases forem conhecidas, a densidade de elétrons pode ser simplesmente obtida pela síntese de Fourier. Para um complexo proteico, o sucesso de derivar informações de fase da substituição molecular (MR) apenas é questionável quando a fração de proteínas com uma estrutura conhecida (os modelos de busca) é baixa (menor que 50% do teor de aminoácidos) e/ou quando os cristais exibem qualidade de difração limitada. Embora a combinação de substituição isomorfa múltipla (MIR) e faseamento MR tenha se mostrado um sucesso para complexos proteicos (por exemplo Ostermeier et al. 1995; Li et al. 1997; Hunte et al. 2000), a exigência de produzir um derivado de átomo pesado satisfatório é quase sempre problemática. Durante a última década, abordagens de MIR clássicas em geral foram relegadas pelo uso de dados de dispersão anômalos usando principalmente incorporação (MAD ou SAD) de selenometionina (SeMet) (Hendrickson 1991). Na verdade, os dados experimentais anômalos usando energia marginal de Se geralmente fornecem informações de fase superiores e menos tendenciosas em comparação com os dados de MIR ou de MR baseado no modelo. Por conseguinte, uma modalidade específica refere-se ao uso de um domínio de ligação de acordo com a invenção para o faseamento de complexos GPCR:G por MR ou MAD. Em particular, domínios variáveis simples de imunoglobulina, incluindo nanocorpos, geralmente se expressam de forma robusta e são adequados para incorporação de SeMet. Para ilustrar melhor, e sem ser limitativo, o faseamento de um complexo compreendendo um GPCR, proteína G e um nanocorpo pela introdução de todos os sítios de SeMet no nanocorpo apenas evita a necessidade de incorporar sítios de SeMet no GPCR ou na proteína G.

[0159] Em muitos casos, a obtenção de um cristal com qualidade de difração é a principal barreira para a resolução de sua estrutura de resolução atômica. Por conseguinte, de acordo com modalidades específicas, os domínios de ligação descritos nesta invenção podem ser usados para melhorar a qualidade de difração dos cristais para que a estrutura cristalina do complexo alvo possa ser resolvida.

[0160] Além disso, a obtenção de informações estruturais de GPCRs alvo, por exemplo para ajudar a orientar a descoberta de fármacos à base de GPCR, é altamente desejável. Além da cristalização de mais GPCRs, são necessários especialmente métodos para adquirir estruturas de receptores ligados a diferentes classes de ligantes que incluem agonistas, antagonistas, reguladores alostéricos e/ou proteínas G. A presente invenção particularmente oferece ferramentas para obter cristais de complexos GPCR:proteína G. Em particular, cristais de um complexo GPCR:proteína G ligado à agonista podem fornecer representações tridimensionais dos estados ativos de GPCRs. Estas estruturas vão ajudar a esclarecer as alterações conformacionais conectando a ligação ao ligante e os sítios de interação da proteína G, e levam a hipóteses mecanísticas mais precisas e eventualmente a novos terápicos. Dada a flexibilidade conformacional inerente aos GPCRs ativos por ligante e a maior heterogeneidade apresentada por receptores ligados a um agonista, a estabilização de tal estado não é fácil. Portanto, tais esforços podem se beneficiar da estabilização de um complexo de uma conformação receptor ligado a agonista ligada a sua proteína G heterotrimérico pela adição de domínios de ligação que são específicos para tal complexo. Especialmente adequados são domínios de ligação que se ligam à proteína G que faz parte de tal um complexo, visto que esses domínios de ligação podem ser usados como ferramentais gerais para estabilizar todos os GPCRs que sinalizam através da mesma proteína G (por exemplo receptores acoplados à Gs, receptores acoplados à Gi, etc.).

[0161] De acordo com uma modalidade alternativa, a presente invenção abrange um método para determinar a estrutura cristalina de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, o método compreendendo as etapas de: a) fornecer um domínio de ligação de acordo com a invenção, e b) deixar que o domínio de ligação se ligue a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e c) cristalizar o complexo formado na etapa b).

[0162] Em modalidades particulares do método acima para determinação da estrutura cristalina, o complexo alvo compreendendo um GPCR e uma proteína G compreende ainda um ligante de receptor, mais especificamente um agonista, ligado ao GPCR.

[0163] A referida determinação da estrutura cristalina pode ser feita por um método biofísico tal como cristalografia de raios-X. O método pode compreender ainda uma etapa para obter as coordenadas atômicas do cristal (já definidas neste relatório).

Identificação de compostos vetorizando um complexo GPCR:proteína G

[0164] No processo de rastreamento de compostos, descoberta de fármacos e otimização de sondagem ("lead optimisation"), vem sendo exigidos ensaios de rastreamento mais rápidos, mais eficazes, mais baratos e especialmente ricos em informações que forneçam informações simultâneas sobre várias características dos compostos e seus efeitos nas diversas vias celulares (isto é, eficácia, especificidade, toxicidade e metabolismo do fármaco). Portanto, é necessário rastrear de forma rápida e barata inúmeros compostos a fim de identificar novos ligantes específicos de um GPCR de interesse, ligantes conformação-específicos, que podem ser potenciais candidatos a novos fármacos. A presente invenção resolve este problema oferece domínios de ligação que estabilizam um complexo GPCR:proteína G em um estado conformacional funcional, que podem ser usados como imunógeno ou reagente de seleção para rastreamento em uma variedade de contextos. Uma importante vantagem dos domínios de ligação de acordo com a invenção é que o GPCR compreendido no complexo GPCR:proteína G pode ser mantido em uma conformação funcional estabilizada, particularmente em uma conformação de estado ativo. Por exemplo, compostos de biblioteca que se ligam seletivamente a esta conformação ativa do receptor têm uma maior tendência de se comportar como agonistas porque a estabilização ortostérica ou alostérica da conformação ativa do GPCR produz respostas biológicas. Uma outra vantagem é que o domínio de ligação aumenta a termoestabilidade da conformação ativa do GPCR compreendido no complexo, protegendo assim o GPCR contra desnaturação irreversível ou térmica induzida pelas condições não nativas usadas no rastreamento de compostos e descoberta de fármacos, sem a necessidade de contar depender de GPCRs mutantes com estabilidade aumentada. Uma outra importante vantagem dos domínios de ligação conformação-seletivos de acordo com a invenção é que eles tornam possível rastrear de forma rápida e confiável e diferenciar entre agonistas de receptor, agonistas inversos, antagonistas e/ou moduladores assim como inibidores de GPCRs e vias dependentes do GPCR, aumentando assim a probabilidade de identificar um ligante com as propriedades farmacológicas desejadas.

[0165] Para ilustrar melhor, é um conceito bem consolidado que a maioria dos GPCRs apresentam maior afinidade de ligaçãao ao agonista quando complexado com a proteína G. Isto é atribuído à interação cooperativa entre o receptor acupado com o agonista e a proteína G. Os domínios de ligação da presente invenção que inibem a dissociação de um complexo de um GPCR e uma proteína G vai portanto estabilizar um estado conformacional ativo do complexo R:proteína G, aumentando assim a afinidade do GPCR para agonistas e diminuindo a afinidade para agonistas inversos. Daí segue-se que domínios de ligação que reconhecem a conformação funcional ativa do complexo R:G podem por exemplo ser usados em ensaios de rastreamento de alto rendimento para rastrear agonistas porque eles aumentam a afinidade do receptor para agonistas, em relação a agonistas inversos. Domínios de ligação que reconhecem a conformação funcional ativa do complexo G:R também podem ser ser usados em ensaios de rastreamento de alto rendimento para rastrear agonistas tendenciosos com capacidade para estimular seletivamente um subconjunto de atividades de sinalização de um receptor, por exemplo a ativação seletiva da proteína G, em relação à função da β-arrestina. De acordo com uma modalidade específica, um domínio de ligação que se liga especificamente à proteína G em complexo com um GPCR (por exemplo Tabelas 2-3) pode ser usado como uma ferramenta universal para programas de rastreamento visando uma pluralidade de GPCRs, uma vez que uma proteína G particular (por exemplo Gs) vai formar um complexo com uma pluralidade GPCRs (por exemplo receptores acoplados à Gs, incluindo receptores de 5-HT tipos 5-HT4 e 5-HT7, receptor de ACTH, receptor de adenosina tipos A2a e A2b, receptor 2 da arginina vasopressina, receptores β-adrenérgicos tipos βi, β2 e β3, receptor da calcitonina, receptor do peptídio relacionado com o gene da calcitonina, receptor do hormônio liberador de corticotropina, família Di-like de receptores da dopamina (Di e D5), receptor de FSH, receptor do polipeptídio inibitório gástrico, receptor de glucagon, receptor da histamina H2, receptor do hormônio luteinizante/coriogonadotropina, receptor da melanocortina, receptor i do hormônio paratireoidiano, receptor da prostaglandina tipos D2 e I2, receptor da secretina, receptor da tirotropina, ...; vide também a Tabela i).

[0166] Portanto, um outro aspecto de acordo com a presente invenção abrande o uso de um domínio de ligação, ou o uso de um complexo, uma célula, uma preparação de membrana compreendendo um domínio de ligação, todos já descritos mais acima, no rastreamento e/ou identificação de programas para parceiros de ligação conformação-específicos de um complexo GPCR:proteína G, que finalmente podem levar a potenciais candidatos para novas fármacos.

[0167] De acordo com uma modalidade, a invenção oferece um método de identificação de compostos capazes de se ligar seletivamente a um complexo GPCR:proteína G, o método compreendendo as etapas de: (i) fornecer um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G (ii) contactar o complexo com um domínio de ligação que é direcionado contra e/ou se liga especificamente ao complexo e deixar que o domínio de ligação se ligue ao complexo, e (iii) fornecer um composto de teste, e (iv) avaliar se o composto de teste se liga ao complexo, e (v) selecionar um composto que se ligue seletivamente ao complexo.

[0168] Ficará claro que o domínio de ligação usado em qualquer um dos métodos acima é capaz de estabilizar o estado conformacional funcional do complexo GPCR:proteína G e previne a dissociação do complexo. De preferência, o complexo GPCR:proteína G está em um estado conformacional ativo (já definido mais acima). De acordo com modalidades particularmente preferidas dos métodos de rastreamento acima, o complexo GPCR:proteína G compreende ainda um ligante de receptor.

[0169] Deve-se observar que modalidades particularmente preferidas dos domínios de ligação estão descritas mais acima em relação aos primeiros aspectos da invenção.

[0170] Portanto, os domínios de ligação da presente invenção podem ser úteis em ensaios de rastreamento. Os ensaios de rastreamento para a descoberta de fármacos podem ser ensaios em fase sólida ou em fase de solução, por exemplo um ensaio de ligação, tal como ensaios de ligação a radioligando. Será apreciado que em muitos casos o rastreamento de alto rendimento de compostos de teste é preferido e que os métodos descritos acima podem ser usados como método "de rastreamento de bibliotecas", um termo bastante conhecido pelos especialistas na técnica. Portanto, o composto de teste pode ser uma biblioteca de compostos de teste. Em particular, ensaios de rastreamento de alto rendimento para compostos terapêuticos tais como agonistas, antagonistas ou agonistas inversos e/ou moduladores fazem parte da invenção. Para fins de alto rendimento, podem ser usadas bibliotecas de compostos tais como bibliotecas de compostos alostéricos, bibliotecas de peptídios, bibliotecas de anticorpos, bibliotecas baseadas em fragmentos, bibliotecas de compostos sintéticos, bibliotecas de compostos naturais, bibliotecas de exibição de fagos, entre outras. As metodologias para preparar e rastrear tais bibliotecas são conhecidas na literatura. Em uma modalidade preferida, os métodos de rastreamento de alto rendimento envolvem uma biblioteca combinatorial de substâncias químicas ou peptídios contendo um grande número de potenciais ligantes terapêuticos. Tais "bibliotecas combinatoriais" ou "bibliotecas de compostos" são então rastreadas em um ou mais ensaios, descritos nesta invenção, para identificar aqueles membros da biblioteca (espécies ou subclasses de substâncias químicas particulares) que exibem uma atividade característica desejada. Uma "biblioteca de compostos" é uma coleção de substâncias químicas armazenadas usualmente usados basicamente em rastreamento de alto rendimento. Uma "biblioteca combinatorial" é uma coleção de diversos compostos químicos gerados seja por síntese química ou por síntese biológica, combinando inúmeros "blocos de construção" químicos tais como reagentes. A preparação e o rastreamento de bibliotecas combinatoriais são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. Os compostos assim identificados podem servir de "compostos de sondagem ("lead compounds") convencionais ou podem eles próprios ser usados como potenciais terápicos ou como terápicos verdadeiros. Portanto, em uma outra modalidade, os métodos de rastreamento descritos mais acima nesta invenção compreendem modificar um composto de teste que mostrou ligar-se a um complexo GPCR:proteína G conformacionalmente ativo, e determinar se o composto de teste modificado se liga ao GPCR quando residindo na conformação particular.

[0171] Nos casos em que o rastreamento de alto rendimento de complexos GPCR:proteína G alvo por parceiros de ligação conformação-específicos são preferidos, este será facilitado por imobilização do domínio de ligação de acordo com a invenção, ou do complexo GPCR:proteína G estabilizado pelo domínio de ligação, em uma superfície ou suporte sólido adequado pode ser arranjado ("arrayed") ou de alguma forma multiplexado. Exemplos não limitativos de suportes sólidos adequados incluem contas, colunas, lâminas, chips ou placas. Mais especificamente, os suportes sólidos podem ser particulados (por exemplo contas ou grânulos, geralmente usados em colunas de extração) ou na forma de folha (por exemplo membranas ou filtros, lâminas de vidro ou plástico, placas de ensaio de microtitulação, varetas graduadas, dispositivos de enchimento capilares ou similares) que podem ser fibras ou tubos lisos, pregueados, ou ocos. As seguintes matrizes são dados como exemplos mas não são exaustivas, tais exemplos poderiam incluir sílica (sílica amorfa porosa) isto é, a série FLASH de cartuchos contendo sílica irregular 60A (32-63 um ou 35-70 um) fornecida pela Biotage (uma divisão da Dyax Corp.), suportes de agarose ou poliacrilamida, por exemplo a gama Sepharose de produtos fornecidos pela Amersham Pharmacia Biotech, ou os suportes Affi-Gel fornecidos pela Bio-Rad. Além disso, existem polímeros macroporosos, tais como os suportes Affi-Prep estáveis à pressão fornecidos pela Bio-Rad. Outros suportes que poderiam ser utilizados incluem dextrana, colágeno, poliestireno, metacrilato, alginato de cálcio, vidro de poro controlado, alumínio, titânio e cerâmica porosa. Alternativamente, a superfície sólida pode compreende parte de sensor massa-dependente, por exemplo, um detector de ressonância de plasmon superficial. Outros exemplos de suportes comercialmente disponíveis estão discutidos em, por exemplo, Protein Immobilisation, R.F. Taylor ed., Marcel Dekker, Inc., New York, (1991).

[0172] A imobilização pode ser não covalente ou covalente. Em particular, a imobilização ou adsorção não covalente em uma superfície sólida do domínio de ligação, ou do complexo GPCR:proteína G estabilizado pelo domínio de ligação, de acordo com a invenção pode ocorrer via uma revestimento da superfície com qualquer dentre um anticorpo, ou estreptavidina ou avidina, ou um íon metálico, que reconhece um tag molecular preso ao domínio de ligação ou ao GPCR, de acordo com técnicas tradicionais conhecidas pelo especialista na técnica (por exemplo tag de biotina, tag de histidina, etc.). Alternativamente, o domínio de ligação, ou o complexo GPCR:proteína G estabilizado pelo domínio de ligação, de acordo com a invenção, pode ser preso a uma superfície sólida por reticulação covalente usando químicas de acoplamento convencionais. Uma superfície sólida naturalmente pode compreender resíduos reticuláveis adequados para ligação covalente ou pode ser revestida ou derivatizada para introduzir grupos reticuláveis adequados de acordo com métodos bastante conhecidos na literatura. Em uma modalidade particular, funcionalidade suficiente da proteína imobilizada fica conservada subsequente ao acoplamento covalente direto à matriz desejada via uma porção reativa que não contém um braço espaçador químico. Exemplos adicionais e informações mais detalhadas sobre métodos de imobilização de anticorpo (fragmentos) em suportes sólidos estão discutidos em Jung et al. (2008); igualmente, métodos de imobilização de receptor de membrana estão revistos em Cooper (2004); ambos aqui incorporados a título de referência. Extraordinariamente, a mutação de um aminoácido particular (em uma proteína com estrutura conhecida ou deduzida) para uma lisina ou cisteína (ou outro aminoácido desejado) pode fornecer um sítio específico para acoplamento covalente, por exemplo. Também é possível reconstruir geneticamente uma proteína específica para alterar a distribuição de aminoácidos disponíveis na superfície envolvidos no acoplamento químico (Kallwass et al., 1993), na realidade controlar a orientação da proteína acoplada. Uma abordagem similar pode ser aplicado aos domínios de ligação de acordo com a invenção, assim como aos complexos GPCR:proteína G conformacionalmente estabilizados, oferecendo assim um meio de imobilização orientada sem a adição de outras caudas de peptídios ou domínios contendo aminoácidos seja naturais ou não naturais. No caso de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo, tal como um nanocorpo, a introdução de mutações na região de estrutura é preferida, minimizando a ruptura para a atividade de ligação a antígeno do anticorpo (fragmento).

[0173] Convenientemente, as proteínas imobilizadas podem ser usadas em processos de imunoadsorção tais como imunoensaios, por exemplo ELISA, ou processos de purificação por imunoafinidade por contato das proteínas imobilizadas de acordo com a invenção com uma amostra de teste (isto é, compreendendo o composto de teste, entre outros) de acordo com métodos tradicionais convencionais na literatura. Alternativamente, e particularmente para fins de alto rendimento, as proteínas imobilizadas podem ser arranjadas ou de alguma forma multiplexadas. De preferência, as proteínas imobilizados de acordo com a invenção são usados para o rastreamento e a seleção de compostos que se ligam especificamente a um complexo GPCR:proteína G conformacionalmente estabilizado, em que em particular o GPCR está em um estado conformacional ativo.

[0174] Será apreciado que ou o domínio de ligação ou o complex GPCR:proteína (conformacionalmente estabilizado) ou suas proteínas constituintes podem ser imobilizadas, dependendo do tipo de aplicação ou do tipo de rastreamento que precisa ser feito. Também, a escolha do domínio de ligação que estabiliza o complexo GPCR:proteína G (visando um epítopo conformacional particular do complexo GPCR:proteína G), vai determinar a orientação das proteínas e, por conseguinte, o resultado desejado da identificação do composto, por exemplo compostos ligando-se especificamente a partes extracelulares, a partes intramembranares ou a partes intracelulares do referido GPCR conformacionalmente estabilizado ou compostos ligando-se especificamente à referida proteína G conformacionalmente estabilizada.

[0175] Alternativamente, o composto de teste (ou uma biblioteca de compostos de teste) pode ser imobilizado sobre uma superfície sólida, tal como a superfície de um chip, enquanto que o domínio de ligação e o complexo GPCR:proteína G são apresentados, por exemplo, em uma solução detergente ou em uma preparação semelhante à membrana (vide abaixo).

[0176] Mais preferivelmente, nem o domínio de ligação, nem o complexo GPCR:proteína G ou suas partes constituintes, nem o composto de teste são imobilizados, como é o caso por exemplo em protocolos de seleção por exibição de fagos em solução, ou em ensaios de ligação a radioligando. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação, o complexo GPCR:proteína G (ou separadamente, as proteínas constituintes) usados em qualquer um dos métodos de rastreamento acima, são apresentados como células inteiras, ou extratos celulares (organela) tais como como extratos de membranas ou frações dos mesmos, ou podem ser incorporados em camadas de lipídios ou vesículas (compreendendo lipídios naturais e/ou sintéticos), lipopartículas de alta densidade, ou qualquer nanopartícula, tais como nanodiscos, ou são apresentados como VLPs, de modo que funcionalidade suficiente das respectivas proteínas seja considerada. Preparações de GPCRs formadas de fragmentos de membrana ou extratos detergentes de membrana estão revistas em detalhes em Cooper (2004), aqui incorporada a título de referência. Alternativamente, os domínios de ligação, os complexos GPCR:proteína G, ou as proteínas constituintes também podem ser solubilizados em deterdentes. Exemplos não limitativos de preparações de receptor solubilizado são ainda mostrados na seção Exemplos.

[0177] Vários métodos podem ser usados para determinar a ligação entre o complexo GPCR:proteína G estabilizado e um composto de teste, que incluem por exemplo ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), ensaios de ressonância de plasmon superficial, ensaios baseados em chip, imunocitofluorescência, tecnologia de dois híbridos de levedura e exibição de fagos que são prática comum na literatura, por exemplo, em Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Outros métodos de detecção de ligação entre um composto de teste e um GPCR incluem métodos de ultrafiltração com espectroscopia de massa de pulverização de íons/HPLC ou outros métodos (bio)físicos e analíticos. Métodos de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), por exemplo, bastante conhecidos pelos especialistas na técnica, também podem ser usados. Será observado que um composto de teste ligado pode ser detectado usando-se um marcador ou tag único associado ao composto, tal como um marcador tipo peptídio, um marcador tipo ácido nucleico, um marcador químico, um marcador fluorescente, ou tag de radiofrequência, descritos mais adiante.

[0178] A eficádia dos compostos e/ou composições compreendendo os mesmos pode ser testada usando-se qualquer ensaio in vitro, ensaio baseado em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal adequado conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença ou distúrbio específico envolvido.

[0179] Em uma modalidade particular, determina-se se o compost altera a ligação do GPCR a um ligante de receptor (já definido neste relatório). A ligação de um GPCR ao seu ligante pode ser avaliada usando-se métodos de ligação de ligantes conhecidos na literatura e descritos neste relatório. Por exemplo, um ligante pode ser radiomarcado ou marcado fluorescentemente. O ensaio pode ser realizado em células inteiras ou em membranas obtidas das células ou receptor solubilizado aquoso com um detergente. O composto será caracterizado por sua capacidade para alterar a ligação do ligante marcado (vide também a seção Exemplos). O composto pode diminuir a ligação entre o GPCR e seu ligante, ou pode aumentar a ligação entre o GPCR e seu ligante, por exemplo por um fator de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes. Portanto, de acordo com modalidades mais específicas, o complexo usado em qualquer um dos métodos de rastreamento acima compreende ainda um ligante de receptor. De preferência, o ligante de receptor é escolhido do grupo compreendendo uma molécula pequena, um polipeptídio, um anticorpo ou qualquer fragmento derivado do mesmo, um produto natural, entre outros. Mais preferivelmente, o ligante de receptor é um agonista completo, ou um agonista parcial, ou um agonista inverso, ou um antagonista, já descritos mais acima.

[0180] Além de estabelecer a ligação a um complex GPCR:proteína G alvo em um estado conformacional funcional, também será desejável determinar o efeito funcional de um composto no complexo GPCR:proteína G, em particular na atividade biológica do GPCR e parceiros de interação a jusante. Em particular, os domínios de ligação de acordo com a invenção podem ser usados para rastrear compostos que modulam (aumentam ou diminuem) a atividade biológico do complexo GPCR:proteína G, ou seus constituintes, sendo o GPCR ou a proteína G. A modulação desejada na atividade biológica vai depender do GPCR escolhido. Os compostos podem se ligar ao complexo GPCR:proteína G alvo, em particular a um ou ambos de seus constituintes, resultando na modulação (ativação ou inibição) da sinalização do receptor a jusante. Esta modulação da sinalização do GPCR pode ocorrer de forma orto- ou alostérica. Os compostos podem se ligar ao complexo alvo compreendendo um GPCR ligado a uma proteína G ou seus constituintes de modo a ativar ou aumentar a sinalização do receptor; ou alternativamente de modo a diminuir ou inibir a sinalização do receptor. Os compostos também podem se ligar ao complexo alvo de tal maneira que eles bloqueiam a atividade constitutiva do GPCR. Os compostos também podem se ligar ao complexo alvo de tal maneira que eles medeiam a modulação alostérica (por exemplo ligam-se ao GPCR ou à proteína G em um sítio alostérico). Desta maneira, os compostos podem modular a função do receptor ligando-se a regiões diferentes no complexo GPCR:proteína G (por exemplo em sítios alostéricos). Referimo-nos por exemplo a George et al. (2002), Kenakin (2002) e Rios et al. (2001). Os compostos da invenção também podem se ligar ao complexo alvo de tal maneira que eles prolongam a duração da sinalização mediada pelo GPCR ou de tal maneira que eles melhoram a sinalização do receptor aumentando a afinidade receptor-ligante. Além disso, os compostos também podem se ligar ao complexo alvo de tal maneira que eles inibem ou melhoram o agrupamento de homômeros ou heterômeros funcionais do GPCR.

[0181] Também, os ensaios baseados em células são críticos para avaliar o mecanismo de ação de novos alvos biológicos e a atividade biológica de compostos químicos. Os atuais ensaios baseados em células para GPCRs incluem medidas da ativação da via (liberação de Ca2+, produção de cAMP ou atividade transcricional); medições do tráfego de proteínas por tagging de GPCRs e elementos a jusante com GFP; e medidas diretas das interações entre proteínas usando a transferência de energia de ressonância de Fürster (FRET), a transferência de energia de ressonância por bioluminescência (BRET) ou a abordagem de dois híbridos de levedura. A introdução dos domínios de ligação da presente invenção, no interior da célula ao compartimento relevante da célula (intra- ou extracelularmente) por qualquer meio bastante conhecido e comumente usado na técnica, pode levar a novos ou melhores ensaios baseados em células.

[0182] Em particular, é necessário "desorfanizar" os GPCRs para os quais um ligante ativante natural ainda não fora identificdo. A estabilização de GPCRs em um estado conformacional funcional usando os domínios de ligação de acordo com a invenção permite rastrear abordagens que podem ser usadas para identificar ligantes de GPCRs "órfãos" em que o ligante natural é desconhecido. Por exemplo, já foram adotadas várias abordagens para "desorfanizar" que incluem matriz de triagem ("array-screening") contra famílias de ligantes conhecidos. Ligantes de GPCRs órfãos podem ser identificados a partir de amostras biológicas. Portanto, em uma modalidade particular, o composto de teste é apresentado como uma amostra biológica. Em particular, a amostra pode ser qualquer amostra adequada tirada de um indivíduo. Por exemplo, a amostra pode ser uma amostra de líquido corporal, tal como sangue, soro, plasma, líquido espinhal. Alternativamente, a amostra é extrato tecidual ou celular.

[0183] O composto de teste usado em qualquer um dos métodos de rastreamento acima pode ser selecionado do que grupo que compreende um polipeptídio, um peptídio, uma molécula pequena, um produto natural, um peptidomimético, um ácido nucleico, um lipídio, um lipopeptídio, um carboidrato, um anticorpo ou qualquer fragmento derivado do mesmo, tal como Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados a dissulfeto (dsFv) e fragmentos compreendendo seja um domínio VL ou VH, um anticorpo de cadeia pesada (hcAb), um anticorpo de domínio simples (sdAb), um minicorpo, o domínio variável derivado de anticorpos de cadeia pesada de camelídeo (VHH ou nanocorpo), o domínio variável dos novos receptores de antígeno derivados de anticorpos de tubarão (VNAR), uma esqueleto proteico incluindo um alfacorpo, proteína A, proteína G, domínios com repetições de anquirina desenhados (DARPins), repetições de fibronectina tipo III, anticalinas, quinotinas, domínios CH2 construídos geneticamente (nanoanticorpos), já definidos mais acima.

[0184] O composto de teste pode ser opcionalmente covalentemente ou não covalentemente ligado a um marcador detectável. Marcadores detectáveis adequados e técnicas para prender, usar e detectar os mesmos ficarão evidentes para o especialista na técnica, e incluem, porém sem limitação, qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos. Marcadores úteis incluem contas magnéticas (por exemplo dinacontas), corantes fluorescentes (por exemplo todos os corantes Alexa Fluor, isotiocianato de fluoresceína, vermelho do Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, entre outros), radiomarcadores (por exemplo 3H, 125I, 35S, 14C, ou 32P), enzimas (por exemplo peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina), e marcadores colorimétricos tais como contas de ouro coloidal ou de vidro ou plástico colorido (por exemplo poliestireno, polipropileno, látex etc.). Meios para a detecção de tais marcadores são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. Portanto, por exemplo, radiomarcadores podem ser detectados usando-se filme fotográfico ou contadores de cintilação, marcadores fluorescentes podem ser detectados usando-se um fotodetector para detectar a iluminação emitida. Marcadores enzimáticos são tipicamente detectados provendo-se a enzima com um substrato e detectando-se o produto reacional produzido pela ação da enzima no substrato, e marcadores colorimétricos são detectados simplesmente visualizando- se o marcador colorido. Outros marcadores detectáveis adequados foram descritos mais acima no contexto do primeiro aspecto invenção referente a um domínio de ligação.

[0185] De acordo com uma modalidade especificamente preferida, o composto de teste é um anticorpo ou qualquer fragmento derivado do mesmo, já descrito acima, incluindo um nanocorpo. Por exemplo, e sem a intenção de ser limitativo, os compostos de teste podem ser anticorpos (já definidos neste relatório em seu sentido mais amplo) que foram produzidos contra um complexo GPCR:proteína G estabilizado por um domínio de ligação de acordo com a invenção. Métodos para produzir anticorpos in vivo são conhecidos na literatura. De preferência, a imunização de um animal será feita de maneira semelhante àquela descrita mais acima. A invenção também se refere a métodos para selecionar anticorpos que se ligam especificamente a um complexo GPCR:proteína G conformacionalmente estabilizado, envolvendo o rastreamento de bibliotecas de expressão codificando genes de imunoglobulina, ou porções dos mesmos, expressos em bactérias, levedura, fagos filamentosos, ribossomas ou subunidades ribossômicas ou outros sistemas de exibição no referido complexo GPCR:proteína G.

[0186] Um aspecto particular da presente invenção refere-se a um suporte sólido no qual é imobilizado um domínio de ligação de acordo com a invenção. Tal suporte sólido (descrito mais acima) pode portanto ser usado em qualquer um dos métodos de rastreamento acima.

Modulação da sinalização do receptor GPCR

[0187] Os domínios de ligação da presente invenção também podem ser usados para modular a sinalização do GPCR, em particular a sinalização do GPCR mediada pela proteína G, inclusive suprimir a sinalização do GPCR mediada pela proteína G. Os termos "modular", "modulação", "modulado" significam um aumento ou redução na atividade de uma proteína ou de um complexo proteico, em particular um complexo GPCR:proteína G. Em particular, os domínios de ligação da presente invenção podem ser moduladores alostéricos ou inibidores alostéricos. Os termos "modulador alostérico" ou "inibidor alostérico" no contexto da presente invenção referem-se a moduladores ou inibidores não competitivos, que exercem seu efeito ligando-se a um sítio que não o sítio ativo do receptor, e modulam a atividade do receptor ou deixam o receptor ineficaz em termos de transdução de sinal. Um "modulador alostérico positivo (PAM)" aumenta a transdução de sinal, ao passo que um um "modulador alostérico negativo (NAM)" reduz a transdução de sinal. Em particular, um inibidor alostérico também suprime a transdução de sinal. Ensaios para avaliar a modulação na sinalização de GPCR pelos domínios de ligação da invenção estão descritos mais acima neste relatório.

[0188] Nesse contexto, de acordo com uma modalidade específica, os domínios de ligação da presente invenção, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, também podem ser úteis para identificação de sondagem ("lead identification") e para o desenho de peptidomiméticos. O uso de uma estrutura peptídica ou proteica biologicamente relevante como ponto de partida para identificação de sondagem ("lead identification") representa uma das abordagens mais potentes na moderna descoberta de fármacos. Peptidomiméticos são compostos cujos elementos essenciais (farmacóforo) mimetizam um peptídio ou proteína natural no espaço 3D e que conservam a capacidade de interagir com o alvo biológico e produzir o mesmo efeito biológico. Os peptidomiméticos são desenhados para superar alguns dos problemas associados com um peptídio natural: por exemplo a estabilidade contra proteólise (duração da atividade) e a pobre biodisponibilidade. Certas outras propriedades, tais como seletividade ou potência do receptor, geralmente podem ser substancialmente melhoradas.

Aplicações terapêuticas e diagnósticas

[0189] Alguns dos domínios de ligação descritos acima podem ter utilidade terapêutica e podem ser administrados a um indivíduo tendo uma condição a fim de tratar o indivíduo quanto àquela condição. A utilidade terapêutica para um domínio de ligação é determinada pelo complexo GPCR:proteína G alvo ao qual o domínio de ligação se liga pelo fato de que a sinalização via aquele GPCR está associada à condição. Em certos casos, o GPCR pode ser ativado na condição pela ligação a um ligante. Em outras modalidades, o GPCR pode ser mutado para deixá-lo constitutivamente ativo, por exemplo. Um domínio de ligação em questão pode ser empregado para o tratamento de uma condição mediada pelo GPCR tal como esquizofrenia, cefaleia hemicrânia, refluxo, asma, broncoespasmo, hipertrofia da próstata, úlceras, epilepsia, angina, alergia, rinite, câncer por exemplo câncer de próstada, glaucoma e derrame. Outras condições relacionadas com GPCR exemplificativas no banco de dados da On-line Mendelian Inheritance in Man podem ser encontradas no website da NCBI. Assim sendo, uma modalidade particular da presente invenção também visa o domínio de ligação da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo o domínio de ligação, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com GPCR. Será observado que a utilidade terapêutico também vai depender do epítopo conformacional particular do complexo GPCR:proteína G contra o qual o domínio de ligação está direcionado.

[0190] Um domínio de ligação em questão pode ser misturado com uma outra substância medicamentosa em uma composição farmacêutica fixa ou ele pode ser administrado separadamente, antes, simultaneamente com ou depois da outra substância medicamentosa. Em termos gerais, esses protocolos envolver administrar a um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbios relacionado com GPCR uma quantidade eficaz de um domínio de ligação que modula a atividade de sinalização de um GPCR no hospedeiro e tratar o indivíduo quanto ao distúrbios.

[0191] Em algumas modalidades, em que se deseja uma redução na atividade de um certo GPCR, devem ser administrados um ou mais compostos que diminuem a atividade do GPCR, ao passo que quando se deseja um aumento na atividade de um certo GPCR, devem ser administrados um ou mais compostos que aumentam a atividade do GPCR.

[0192] Uma variedade de indivíduos são tratáveis de acordo com o método em questão. Geralmente tais indivíduos são mamíferos ou uma espécie de mamífero, em que esses termos são usados amplamente para descrever organismos que estão na classe dos mamíferos, incluindo a ordem dos carnívoros (por exemplo, cachorros e gatos), roedores (por exemplo, camundongos, porquinhos-da-índia, e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés, e macacos). Em muitas modalidades, os indivíduos serão seres humanos. Os métodos de tratamento em questão são tipicamente efetuados em indivíduos com tais distúrbios ou em indivíduos com vontade de evitar tais distúrbios.

[0193] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz dos domínios de ligação da invenção e pelo menos um carreador, adjuvante ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0194] Um ‘carreador’, ou ‘adjuvante’, em particular um ‘carreador farmaceuticamente aceitável’ ou ‘adjuvante farmaceuticamente aceitável’ é qualquer excipiente, diluente, carreador e/ou adjuvante adequado que, por si sós, não induzem a produção de anticorpos nocivos ao indivíduo que está recebendo a composição nem provocam proteção. Assim sendo, carreadores farmaceuticamente aceitáveis são inerentemente atóxicos e não terapêuticos, e são conhecidos pelo especialistas na técnica. Carreadores ou adjuvantes adequados tipicamente compreendem um ou mais dos compostos incluídos na seguinte lista não exaustiva: macromoléculas grandes lentamente metabolisadas tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inativas. Os carreadores ou adjuvantes podem ser, como um exemplo não limitativo, solução de Ringer, solução de dextrose ou solução de Hank. Soluções não aquosas tais como óleos fixos e etil oleato também podem ser usadas. Um excipiente preferido é dextrose 5% em solução salina. O excipiente pode conter pequenas quantidades de aditivos tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e a estabilidade química, incluindo tampões e preservativos.

[0195] A administração de um domínio de ligação descrito nesta invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser por via de administração oral, inalada ou parenteral. Em modalidades particulares o nanocorpo é distribuído por administração intratecal ou intracerebroventricular. O composto ativo pode ser administrado isolado ou de preferência formulado como uma composição farmacêutica. Uma quantidade eficaz para tratar uma determinada doença ou distúrbio que expressa o antígeno reconhecido pelo domínio de ligação depende dos fatores usuais tais como a natureza e a severidade do distúrbio sendo tratado e o peso do mamífero. No entanto, uma dose unitária normalmente vai variar na faixa de 0,01 a 50 mg, por exemplo 0,01 a 10 mg, ou 0,05 a 2 mg de domínio de ligação ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Doses unitárias normalmente serão administradas uma ou mais vezes ao dia, por exemplo 2, 3, ou 4 vezes ao dia, mais usualmente 1 a 3 vezes ao dia, de modo que a dose diária total normalmente vai variar na faixa de 0,0001 a 1 mg/kg; portanto uma dose diária total adequado para um adulto de 70 kg varia de 0,01 a 50 mg, por exemplo 0,01 a 10 mg ou mais usualmente de 0,05 a 10 mg. É bastante preferido que o composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo seja administrado na forma de uma composição de dose unitária, tal como uma composição de dose unitária oral, parenteral, ou inalada. Tais composições são preparadas por mistura e são adequadamente adaptadas para administração oral, inalada ou parenteral, e como tal podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, preparações líquidas orais, pós, grânulos, pastilhas, pós reconstituíveis, soluções ou suspensões injetáveis e infusíveis ou supositórios ou aerossóis. Comprimidos e cápsulas para administração oral usualmente são apresentados em uma dose unitária, e contêm excipientes convencionais tais como agentes aglutinantes, cargas, diluentes, agentes de tabletagem, lubrificantes, desintegrantes, corantes, flavorizantes, e agentes umectantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bastante conhecidos na literatura. Cargas adequadas para uso incluem celulose, manitol, lactose e outros agentes similares. Agentes desintegrantes adequados incluem amido, polivinilpirrolidona e derivados de amido tais como glicolato de amido sódico. Lubrificantes adequados incluem, por exemplo, estearato de magnésio. Agentes umectantes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem lauril sulfato de sódio. Estas composições orais sólidas podem ser preparadas por métodos convencionais de misturação, enchimento, tabletagem ou similar. Várias operações de misturação podem ser usadas para distribuir o agente ativo pelas composições empregando grandes quantidades de cargas. Tais operações são, naturalmente, convencionais na literatura. As preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes suspensores, por exemplo sorbitol, xarope, metil celulose, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetil celulose, estearato de alumínio gel ou gorduras comestíveis hidrogenadas, agentes emulsificantes, por exemplo lecitina, sorbitan mono-oleato, ou acácia; veículos não aquosos (que incluem óleos comestíveis), por exemplo, óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos tais como ésteres de glicerina, propileno glicol, ou álcool etílico; preservativos, por exemplo metil ou propil p-hidroxibenzoato ou ácido sórbico, e se desejado agentes flavorizantes ou corantes convencionais. Formulações orais também incluem formulações de liberação sistemática convencionais, tais como comprimidos ou grânulos tendo um revestimento entérico. De preferência, as composições para inalação são apresentadas para administração ao trato respiratório como um rapé ou um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflação, isolado ou em combinação com um carreador inerte tal como lactose. Neste caso as partículas de composto ativo têm adequadamente diâmetros inferiores a 50 microns, de preferência inferiores a 10 microns, por exemplo entre 1 e 5 microns, tal como entre 2 e 5 microns. Uma dose inalada preferida vai variar na faixa de 0,05 a 2 mg, por exemplo 0,05 a 0,5 mg, 0,1 a 1 mg ou 0,5 a 2 mg. Para administração parenteral, são preparadas formas de dose unitária fluidas contendo um composto da presente invenção e um veículo estéril. O composto ativo, dependendo do veículo e da concentração, pode ser suspendido ou dissolvido. Soluções parenterais são normalmente preparadas por dissolução do composto em um veículo e esterilização em filtro antes de sua introdução em um frasco ou ampola adequada e vedação. Vantajosamente, adjuvantes tais como um anestésico local, preservativos e agentes tamponantes também são dissolvidos no veículo. Para melhorar a estabilidade, a composição pode ser congelado depois de introduzida no frasco e a água removida a vácuo. Suspensões parenterais são preparadas substancialmente da mesma maneira exceto que o composto é suspendido no veículo em vez de ser dissolvido e esterilizado por exposição a óxido de etileno antes de ser suspendido no veículo estéril. Vantajosamente, um tensoativo ou agente umectante é incluído na composição para facilitar a distribuição uniforme do composto ativo. Em que apropriado, pequenas quantidades de broncodilatadores por exemplo aminas simpatomiméticas tais como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina e eferdina; derivados de xantina tais como teofilina e aminofilina e corticosteroides tais como prednisolona e estimulantes adrenais tais como ACTH podem ser incluídos. Como é prática comum, as composições geralmente vêm acompanhadas por orientações escritas ou impressas para uso no tratamento médico em questão.

[0196] A distribuição de domínios de ligação, em particular domínios variáveis simples de imunoglobulina, nas células pode ser efetuada da maneira descrita para peptídios, polipeptídios e proteínas. Se o antígeno for extracelular ou um domínio extracelular, o domínio de ligação pode exercer sua função ligando-se a este domínio, sem necessidade de distribuição intracelular. Os domínios de ligação da presente invenção descritos neste relatório podem visar epítopos conformacionais intracelulares dos GPCR:proteínas G de interesse. Para usar esses domínios de ligação como terápicos eficazes e seguros no interior de uma célula, a distribuição intracelular pode ser melhorada pela transdução da proteína ou sistemas de distribuição conhecidos na literatura. Domínios de transdução de proteína (PTDs) têm atraído considerável interesse no campo de distribuição de fármacos por sua capacidade de se translocar através das membranas biológicas. Os PTDs são sequências relativamente curtas (1 1-35 aminoácidos) que conferem essa atividade de translocação aparente às proteínas e outras cargas macromoleculares com as quais eles são conjugados, complexados ou fundidos (Sawant & Torchilin 2010). O peptídio TAT derivado do HIV (YGRKKRRQRRR), por exemplo, tem sido amplamente usado para distribuição intracelular de vários agentes variando de moléculas pequenas a proteínas, peptídios, uma gama de nanocarreadores farmacêuticos e agentes de imagem. Alternativamente, mecanismos endocíticos mediados por receptor também podem ser usados para distribuição intracelular de fármacos. Por exemplo, a via de internalização mediada pelo receptor da transferrina é uma via de absorção celular eficiente que vem sendo explorada para distribuição sítio-específica de fármacos e proteínas (Qian et al. 2002). Isto é obtido seja quimicamente por conjugação da transferrina com fármacos ou proteínas terapêuticas ou geneticamente por infusão de peptídios ou proteínas terapêuticas na estrutura da transferrina. Proteínas naturalmente existentes (tais como a transferrina proteica de ligação ao ferro) são muito úteis nesta área de vetorização de fármacos já que essas proteínas são biodegradáveis, atóxicas, e não imunogênicas. Além disso, elas podem conseguir a vetorização sítio-específica devido às altas quantidades de seus receptores presentes na superfície celular. Ainda outros sistemas de distribuição incluem, porém sem limitação, sistemas de distribuição à base de polímeros e de lipossomas.

[0197] A eficácia dos domínios de ligação da invenção, e de composições compreendendo os mesmos, pode ser testada usando-se qualquer esaio in vitro, ensaio baseado em células, ensaio in vivo e/ou modelo animal adequado conhecido per se, ou qualquer combinação dos mesmos, dependendo da doença ou distúrbio específico envolvido.

Rastreamento, seleção, produção de domínios de ligação

[0198] Em ainda um outro aspecto, a invenção também abrange um método de rastreamento para domínios de ligação direcionados contra e/ou ligando-se especificamente a um complex compreendendo um GPCR e uma proteína G, compreendendo as etapas de: a) oferecer uma pluralidade de domínios de ligação, e b) rastrear a referida pluralidade de domínios de ligação quanto a um domínio de ligação que se liga ao um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, e c) isolar o domínio de ligação que se liga ao complexo.

[0199] Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, os domínios de ligação são gerados e rastreados quanto a sua ligação específica a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor. Os domínios de ligação também podem ser gerados e rastreados quanto a sua ligação específica a uma proteína G. Conforme descrito nesta invenção, os domínios de ligação podem ser gerados de muitas maneiras. No caso de domínios variáveis simples de imunoglobulina, tais como nanocorpos, tipicamente, a imunizacão de um animal será feita com um complexo alvo compreendendo um GPCR ligado a uma proteína G e um ligante de receptor, descrito mais acima (por exemplo para sequências de VHH, como um exemplo não limitativo) e também exemplificados mais adiante.

[0200] Para a imunização de um animal com um complexo alvo, as proteínas do complexo alvo (isto é, GPCR e proteína G) podem ser produzidas e purificadas usando-se métodos convencionais que podem empregar a expressão de uma forma recombinante das referidas proteínas em uma célula hospedeira, e purificação das proteínas usando cromatografia por afinidade e/ou métodos baseados em anticorpos. Em modalidades particulares, o sistema bactulovírus/Sf-9 pode ser empregado para expressão, embora outros sistemas de expressão (por exemplo, sistemas celulares de bactérias, levedura ou mamíferos) também possam ser usados. Métodos exemplificativos para expressar e purificar gcprs estão descritos em, por exemplo, Kobilka (1995), Eroglu et al. (2002), Chelikani et al. (2006) e no livro "Identification e Expression of G Protein-Coupled Receptors" (Kevin R. Lynch (Ed.), 1998), entre muitos outros. Um complexo GPCR:proteína G funcional também pode ser reconstituído usando receptor purificado (por exemplo β2-AR ou MOR) reconstituído em partículas de HDL recombinante com um excesso estequiométrica da proteína G (Gs ou Gi) como descrito em Whorton et al. (2009) para β2-AR:Gs ou em Kuszaket al. (2009) para MOR:Gi. Um GPCR também pode ser reconstituído em vesículas de fosfolipídios e carregado com um excesso estequiométrico da proteína G. Da mesma forma, métodos para reconstituir um GPCR ativo em vesículas de fosfolipídios são conhecidos, e estão descritos em: Luca et al. (2003), Mansoor et al. (2006), Niu et al. (2005), Shimada et al. (2002), e Eroglu et al. (2003), entre outros. Em certos casos, o GPCR e os fosfolipídios podem ser reconstituídos à alta densidade (por exemplo, 1 mg de receptor por mg de fosfolipídio). Em muitos casos, um GPCR pode estar presente na vesícula de fosfolipídios nas duas orientações (na orientação normal, e na orientação "de cabeça para baixo" na qual as alças intracelulares ficam do lado de fora da vesícula). Outros métodos de imunização com um GPCR incluem, porém sem limitação, o uso de células completas expressando um GPCR e/ou uma proteína G ou membranas derivadas da mesma.

[0201] Em uma modalidade particular, o animal é imunizado com um complexo alvo que é reticulado com um reticulador bifuncional (vide também a seção Exemplos). A reticulação química pode ser feita usando-se técnicas tradicionais que são bastante conhecidas pelo especialista na técnica (vide por exemplo Hermanson, G.T. (2008) Bioconjugate Techniques, 2nd ed., Elsevier Inc., 1202 páginas).

[0202] Qualquer animal adequado, por exemplo, um animal de sangue quente, em particular um mamífero tal como um coelho, camundongo, rato, camelo, carneiro, vaca ou porco ou uma ave tal como galinha ou peru, pode ser imunizado usando-se qualquer uma das técnicas bastante conhecidas na literatura e adequadas para gerar uma resposta imune.

[0203] O rastreamento de domínios de ligação que se ligam especificamente a um epítopo conformacional de um complexo alvo pode ser feito por exemplo por rastreamento de um conjunto, coleção ou biblioteca de células que expressam os domínios de ligação em sua superfície (células B obtidas de um camelídeo adequadamente imunizado), por rastreamento de uma biblioteca (naive ou imune) de domínios de ligação, ou por rastreamento de uma biblioteca (naive ou imune) de sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências aminoacídicas dos domínios de ligação, todos eles podendo ser efetuados de maneira conhecida per se, e cujo método pode opcionalmente compreender ainda uma ou mais outras etapas adequadas, tais como, por exemplo e sem limitação, uma etapa de maturação por afinidade, uma etapa de expressão da sequência aminoacídica desejada, e uma etapa de rastreamento quanto à ligação e/ou quanto à atividade contra o antígeno alvo, uma etapa de determinação da sequência aminoacídica ou sequência nucleotídica, uma etapa de introdução de uma ou mais substituições humanizantes, uma etapa de formatação em um formato multivalente e/ou multiespecífico adequado, uma etapa de rastreamento quanto às propriedades biológicas e/ou fisiológicas desejadas (isto é, usando um ensaio adequado conhecido na literatura), e/ou qualquer combinação de uma ou mais destas etapas, em qualquer ordem adequada.

[0204] Ainda um outro aspecto da invenção refere-se a um kit compreendendo um domínio de ligação de acordo com a invenção. O kit pode compreender ainda uma combinação de reagentes tais como tampões, tags moleculares, construções vetoriais, material de amostra de referência, assim como suportes sólidos adequados, células, ácidos nucleicos, entre outros. Tal kit pode ser útil para qualquer uma das aplicações da presente invenção descritas neste relatório. Por exemplo, o kit pode compreender (uma biblioteca de) compostos de teste úteis para aplicações de rastreamento de compostos.

[0205] Finalmente, um último aspecto da invenção é o uso de qualquer domínio de ligação de acordo com a invenção para isolar sequências aminoacídicas que são responsáveis pela ligação específica a um epítopo conformacional de um complexo GPCR:proteína G e para construir domínios de ligação artificiais com base nas referidas sequências aminoacídicas. Será apreciado que nos domínios de ligação de acordo com a invenção, as regiões de estrutura e as regiões determinantes de complementaridade são conhecidas, e o estudo de derivados do domínio de ligação, a ligação ao mesmo epítopo conformacional de um complexo GPCR:proteína G, permitirá deduzir os aminoácidos essenciais envolvidos na ligação ao referido epítopo conformacional. Esta informação pode ser usada para construir um domínio de ligação mínimo e criar derivados dos mesmos, o que pode ser feito rotineiramente por técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica.

[0206] Os exemplos a seguir destinam-se a promover uma melhor compreensão da presente invenção. Embora a presente invenção esteja descrita com referência às modalidades ilustradas, deve ficar entendido que a invenção não se limita às mesmas. Os especialistas na técnica e aqueles que têm acesso aos ensinamentos desta invenção vão reconhecer modificações e modalidades adicionais dentro do seu escopo. Por conseguinte, a presente invenção só está limitada pelas reivindicações em anexo.

EXEMPLOS Exemplo 1: Formação e purificação de um complexo ternário estável agonista-β 2AR-Gs

[0207] A formação de um complexo estável (vide figura 2) foi realizada misturando-se o heterotrímero Gs a uma concentração de aproximadamente 100 μM com T4L-β2AR ligado a BI-167107 (ou β2AR-365) em excesso molar (aproximadamente 130 μM) em 2 ml de tampão (10 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl , 0,1 % de DDM, 1 mM de EDTA, 3 mM de MgCl2, 10 mM de BI-167107) e incubando-se por 3 horas à temperatura ambiente. O BI-167107, que foi identificado por rastreamento e caracterização de aproximadamente 50 agonistas de β2AR diferentes, tem uma meia-vida de dissociação de aproximadamente 30 horas proporcionando um grau mais alto de estabilização ao receptor ligado à proteína G ativa do que outros agonistas completos tais como isoproterenol (Rasmussen et al., 2011). Para manter o estadolivre de nucleotídeos de alta afinidade do complexo, apirase (25 mU/ml, NEB) foi adicionada depois de 90 minutos para hidrolisar o GDP residual liberado da Gas com a ligação ao receptor. O GMP resultante da hidrólise de GDP pela apirase tem uma afinidade muito pobre para a proteína G no complexo. Religação do GDP pode causar dissociação do complexo R:G (figura 3a).

[0208] O complexo R:G em DDM mostra dissociação significativa depois de 48 horas a 4°C (figura 4a). Foram rastreados e caracterizados mais de 50 anfifílicos (dados não mostrados) e caracterizados o MNG-3 (NG-310, Affymetrix-Anatrace; Chae et al., 2011) e seus análogos estreitamente relacionados como detergentes que estabilizam substancialmente o complexo (figura 4a,b). O complexo foi trocado por MNG-3 por adição da mistura R:G (2 ml) a 8 ml de tampão (20 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de BI-167107) contendo 1% de MNG-3 por 1 hora à temperatura ambiente.

[0209] Neste estágio a mistura contém o complexo R:G, Gs não funcional, e um excesso de β2AR. Para separar o complexo R:G funcional da Gs não funcional e para completar a troca de detergente, o complexo R:G foi imobilizado na resina M1 Flag e lavado em tampão em tampão (20 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de BI-167107, e 3 mM de CaCl2) contendo 0,2% de MNG-3. Para prevenir a agregação dos complexos R:G mediada pela ponte de cisteína, 100 mM de TCEP foram adicionados à proteína eluída antes de se concentrar a mesma com um concentrador MWCO Millipore de 50 kDa. O procedimento final de cromatografia por exclusão de tamanhos para separar o excesso de receptor livre do complexo R:G (figura 5b) foi efetuado em uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com tampão contendo 0,02 % de MNG-3, 10 mM de HEPES pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de BI-167107, e 100 mM de TCEP. As frações de pico foram reunidas (figura 5b) e concentradas até aproximadamente 90 mg ml-1 com um concentrador MWCO Viva- spin de 100 kDa e analisadas por SDS-PAGE/coloração com azul brilhante de Coomassie (figura 5a) e filtração em gel (figura 5c). Para confirmar uma preparação pura, homogênea e desfosforilada, o complexo R:G foi analisado como de rotina por cromatografia de troca iônica (figura 5d).

Exemplo 2: Geração de nanocorpos ligando-se ao complexo ternário agonista:β 2AR:Gs

[0210] A partir da imagem de EM da mancha negativa (dados não mostrados), observou-se que o domínio helicoidal alfa da Gas era flexível. A estabilização vetorizada deste domínio foi obtida gerando-se nanocorpos que se ligam ao complexo ternário agonista-β2AR-Gs. Nanocorpos são anticorpos de domínio simples, derivados de anticorpos apenas de cadeia pesada de lhamas (Muyldermans, 2001). Para identificar nanocorpos que se ligam à proteína Gs acoplada com o receptor (carregado com agonista), foram imunizadas duas lhamas (Llama glama) com o complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 reticulado com bis(sulfossuccinimidil)glutarato (BS2G, Pierce). Os dois animais foram imunizados com 4 doses quinzenais de 50 a 100 μg. Depois de completar a imunização, linfócitos do sangue periférico foram isolados dos animais imunizados para extrair RNA total e preparar cDNA. RNA total foi isolado de cerca de 107 linfócitos da maneira descrita por Chomczynski & Sacchi (1987). A síntese do primeiro cordão de cDNA foi preparada usando um iniciador dN6 e o sobrescrito RT de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os fragmentos codificando genes VHH foram amplificados a partir deste cDNA por PCR usando-se iniciadores específicos previamente descritos (Conrad et al., 2001). Usando PCR aninhada, Pst1 e BstEII foram geneticamente modificadas no início e no final da fase de leitura de aberta de VHH, respectivamente. VHHs foram clonados como fragmentos Pst1-BstEII no vetor de exibição de fago pMESy4. Para cada lhama, foi construída uma biblioteca de exibição de fagos separada ancorando o respectivo repertório de nanocorpos como uma fusão geneIII (Domanska et al. 2011). Nanocorpos específicos para o complexo R:G foram enriquecidos por duas rodadas de "biopanning" i) no complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 incrustado em partículas de lipoproteína de alta densidade biotiniladas com ApoL (rHDL, Whorton et al. 2007) ou ii) no complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 reticulado com BS2G. Para a primeira estratégia de "biopanning", partículas rHDL biotiniladas contendo o complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 foram imobilizadas em uma placa Maxisorp revestida com neutravidina (Nunc) a ^g/poço em 20mM de Hepes (pH 8,0), 100mM de NaCl, 1mM de EDTA, 100μM de TCEP, e 100nM de BI167107. Para a segunda estratégia de "biopanning" o complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 reticulado com BS2G foi aplicado como revestimento em fase sólida a uma placa Maxisorp a ^g/poço. Para cada rodada de"biopanning", 1011 fagos foram adicionados a antígenos imobilizados e incubados por uma a duas horas. Em seguida, o fago não ligado foi removido dos poços contendo antígeno e os poços foram lavados 14 vezes com 20mM de HEPES, 100mM de NaCl, pH8 e finalmente incubados por 10 minutos com 200μL de Hepes 20mM (pH 8,0), NaCl 100mM, EDTA 1mM, TCEP 100μM, e BI167107 100nM para remover específicos. Para eluir fagos complexo-específicos, os poços foram tratados com tripsina, o fago foi recuperado e usado para infectar células TG1 exponencialmente crescentes (OD600±0,5). De cada biblioteca enriquecida, foram aleatoriamente coletadas 48 colônias e cultivadas em 1 ml de 2xTY contendo ampicilina e glicose. As culturas foram induzidas com IPTG a induzir a expressão dos nanocorpos e extratos periplasmáticos contendo um nanocorpo parcialmente purificado foram preparados. Os nanocorpos contidos nestes extratos periplasmáticos foram analisados quanto à ligação ao complexo ternário agonista:β2AR:Gs por ELISA.

[0211] Nanocorpos enriquecidos em partículas de rHDL biotiniladas contendo o complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 foram analisados por ELISA comparativo no mesmo complexo imobilizado em placas Maxisorb revestidas com neutravidina versus partículas de rHDL vazias. Nanocorpos enriquecidos no complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 reticulado com BS2G revestida com fase sólica foram analisados por ELISA comparativo no mesmo complexo revestido com fase sólida versus poços não revestidos. Das colônias que foram classificadas positivas no ELISA comparativo, clones simples foram preparados, o DNA foi extraído e as seguências dos genes dos nanocorpos codificados foram analisadas usando métodos de rotina (sequências aminoacídicas mostradas nas Tabelas 2-3). Para Nb35, Nb36 e Nb37, a ligação ao complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 foi ainda confirmada por gelfiltração analítica (Figuras 3d, 3e, 3f, 3g).

Exemplo 3: Nb35, Nb36 e Nb37 se ligam à Gs e previnem a dissociação do complexo por GTPyS

[0212] Para determinar se os nanocorpos produzidos contra o complexo ternário β2AR:Gs:BI167107 (Tabela 2) se ligam ao receptor ou à Gs, monitora-se, em seguida, a ligação desses nanocorpos em ELISA em receptor purificado isolado. Todos os nanocorpos da Tabela 2 classificados negativos em β2AR-356 ligado a agonista revestido com fase sólida (Maxisorb, Nunc) se reconstituíram à alta densidade em vesículas de fosfolipídios (Rasmussen et al., 2011). Nb80, um nanocorpo β2AR-especifico (Rasmussen et al. 2011) foi classificado positivo neste ELISA. Nenhum dos ligantes de β2AR:Gs:BI167107 descritos na Tabela 2 se ligou ao receptor reconstituído isolado, indicando que eles se ligam a epítopos contidos na Gs. Cromatografia por exclusão de tamanhos mostra que o Nb35 e o Nb37 se ligam a epítopos separados no heterotrímero Gs para formar um complex R:G:Nb35:Nb37 (Figura 3d). Similarmente, o Nb36 e o Nb37 se ligam a epítopos separados no heterotrímero Gs para formar um complex R:G:Nb36:Nb37 (Fig 3e).

[0213] GDP, GTP e análogos de GTP não hidrolisáveis rompem o complexo the β2AR:Gs (Figura 3a), causando dissociação dos complexos GPCR proteína G in vitro e in vivo. Os efeitos mútuos dos Nbs e do análogo de GTP não hidrolisável GTPyS na integridade do complexo ternário agonista:β2AR:Gs foi analisado por cromatografia por exclusão de tamanhos analítica na presença e na ausência de GTPyS. Foi constatado que os nanocorpos 35, 36 e 37 protegem o complexo β2AR:Gs:BI167107 contra dissociação por GTPyS (Figuras 3d, 3e & 3g).

Exemplo 4. Cristalização do complexo β2AR-Gs auxiliado por nanocorpo

[0214] Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são responsáveis pela maioria das respostas celulares a hormônios e neutrotransmissores assim como a todos os sentidos de visão, olfato e paladar. O paradigma da sinalização do GPCR é a ativação de uma proteína de ligação do GTP heterotrimérico (proteína G) por um receptor ocupado por um agonista. Em um esforço para entender a base estrutural para a sinalização do GPCR, cristalizou-se o complexo β2AR-Gs para resolver sua estrutura por cristalografia de raios-X.

[0215] Um desafio para cristalogênese foi preparar um complex β2AR:Gs estável em solução detergente. O β 2AR e a Gs acoplam-se com eficência em bicamadas de lipídios, mas não em detergentes usados para solubilizar e purificar essas proteínas (Exemplo 1). Foi constatado que um complexo β2AR:Gs relativamente estável poderia ser preparado misturando-se GDP-Gs purificdo (concentração final de aproximadamente 100 μM) com um excesso molar de β 2AR purificado ligado a um agonista de alta afinidade (BI167107; Rasmussen et al. 2011) em uma solução de dodecilmaltosídeo. Apirase, uma purina pirofosfatase não seletiva, foi adicionada para hidrolisar o GDP liberado da Gs formando um complexo com o β2AR. O complexo foi subsequentemente purificado por cromatografia por afinidade com anticorpo e cromatografia por exclusão de tamanhos em sequência. A estabilidade do complexo foi melhorada colocando-se o mesmo em um detergente maltose neopentil glicol (NG-310, Anatrace) recentemente desenvolvido (Chae et al. 2010). Este complexo pôde ser incubado à temperatura ambiente por 24 horas sem qualquer degradação perceptível; no entanto, os esforços iniciais para cristalizar o complexo usando telas de matriz esparsa em micelas, bicelas e fase cúbica lipídica (LCP) de detergente falharam.

[0216] Para avaliar ainda a qualidade do complexo, a proteína foi analisada por microscopia eletrônica (EM) de partículas simples. Os resultados confirmaram que o complexo era monodisperso (dados não mostrados), mas revelaram outros possíveis gargalos para obter a difração de cristalis de qualidade. Em primeiro lugar, o detergente usado para estabilizar o complexo formou uma micela grande, deixando pouca superfície polar no lado extracelular do complexo β2AR:Gs para a formação de contatos na rede cristalina. Por isso, substituíu-se o aminoterminal não estruturado do β2AR pela lisozima T4 (T4L), usou-se previamente T4L para facilitar a cristalogênese do β2AR inativo inserindo T4L entre as extremidades citoplasmáticas dos segmentos transmembrana (TMs) 5 e 6 (Rosenbaum et al. 2007). Esta proteína de fusão (T4L-β2AR) exibiu propriedades normais de ligação ao ligante e acolamento com Gs. Ensaios de cristalização foram realizados em LCP usando uma monoleína modificada (7.7 MAG, fornecida por Martin Caffrey) desenhada para acomodar o componente hidrofílico grande do complexo T4L-β2AR:Gs (Misquitta et al. 2004). Embora se tenha conseguido obter cristais pequenos que difrataram a 7Â, não se conseguiu melhorar sua qualidade por meio do uso de aditivos e outras modificações.

[0217] Um outro possível problema para cristalogênese revelado por análise por EM de partículas simples foi a variabilidade aumentada no posicionamento do componente helicoidal α da subunidade Gas. A Gas consiste em dois domínios, o domínio GTPase ras-like (GasRas), que interage com o β2AR e a subunidade Gβ, e o domínio helicoidal α (GasAH) (Sprang et al. 1997). A interface dos dois subdomínios Gas forma a bolsa de ligação a nucleotídeo (Figura 1), e EM 2D médias e reconstruções 3D sugerem que na ausência de nucleotídeo de guanina, a GasAH tem uma posição variável em relação ao complexo de T4L-β2AR-GαsRAS-Gβy (Fig. 1b).

[0218] Em um esforço para facilitar ainda a cristalogênese do complexo, tentato a cocristalização do complexo com o nanocorpo 35. O Nb35 protege o complexo contra dissociação pelo GTPyS, sugestivo de uma interação Gs:Nb estabilizante (figura 3a). O complexo T4L- β2AR:Gs ligado a BI-167107 e o Nb35 foram misturados em uma proporção moar de 1:1,2 (vide Figuras 6 e 7). O pequeno excesso molar de Nb35 foi verificado por gel filtração analítica (Figura 7b). A mistura foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente antes de ser misturada com 7.7 MAG (fornecido por Martin Caffrey) contendo 10% de colesterol (C8667, Sigma) em uma proporção (p/p) de 1:1 de proteína para lipídio usando o método de misturação em seringa dupla relatado previamente (Caffrey 2009). A concentração do complexo R:G:Nb em 7.7 MAG foi de aproximadamente 25 mg/ml. A mistura proteína:lipídio foi distribuída através de um robô dispensador de LCP (Gryphon, Art Robbins Instruments) em gotas de 40 nl para placas sanduíche de vidro de 24 poços ou de 96 poços e sobrepostas en-bloc com 0,8 μl de solução de precipitante. Sondas ("leads") de cristalização múltipla foram inicialmente identificadas usando telas internas parcialmente baseadas em reagentes do kit "StockOptions Salt" (Hampton Research). Cristais para coleta de dados foi cultivados em 18 a 22% de PEG 400, 100 mM de MES pH 6,5 (figura 1c), 350 a 450 mM de nitrato de potássio, 10 mM de foscarnet (figura 3b), 1 mM de TCEP, e 10 μM de BI167107. Os cristais atingiram o tamanho completo em 3-4 dias a 20°C (Figura 8) e foram recolhidos de uma mesofase semelhante à esponja e congelados instantaneamente sem crioprotetor adicional em nitrogênio líquido.

Exemplo 5: Nb35 facilita a formação de cristais do complexo R:G

[0219] O complexo T4L-β2AR:Gs:Nb35 ligado a BI-167107 cristalizou no grupo espacial P21, com um único complexo em cada unidade assimétrica. A Figura 9a mostra as interações do acondicionamento cristalográfico. A Figura 9b mostra a estryutura do complexo completo incluindo T4L e Nb35, e a Figura 9c mostra o complexo β2AR:Gs isolado.

[0220] Os complexos T4L-β2AR:Gs:Nb35 ligados a BI-167107 são dispostos em camadas aquosas lipídicas alternadas com contatos de rede formados quase que exclusivamente entre os componentes solúveis do complexo, deixando moléculas de receptor suspensas entre camadas de proteína G e bastante separadas umas das outras no plano da membrana. Contatos de rede extensos são formados entre todas as proteínas solúveis, sendo provavelmente responsáveis pela forte difração geral e densidade de elétrons extraodinariamente nítida para a proteína G.

[0221] O Nb35 e a T4L facilitaram a formação de cristais do complexo T4L-β2AR:Gs:Nb35 ligado a BI-167107. O Nb35 se liga a um epítopo conformacional na Gs e se acondiciona na interface das subunidades Gβ e Ga com região determinante de complementaridade (CDR, definida segundo a numeração IMTG; Lefranc, 2003) 1 interagindo principalmente com Gβ (Fig 10a) e uma alça CDR3 comprida interagindo com as duas subunidades Gβ e Ga (Fig 10b). Algumas regiões de estrutura do Nb35 também interagem com a Ga do mesmo complexo (Fig 10C). Outras regiões de estrutura de um complexo interagem com subunidades Ga de dois complexos adjacentes (Fig 11), contribuindo consideravemente para os contatos de cristal no interior da rede cristalina. A T4L forma interações relativamente esparsas com o aminoterminal do receptor, mas se acondiciona contra o aminoterminal da subunidade Gβ de um complexo, o terminal carboxil da subunidade gy de um outro complexo, e a subunidade Ga de ainda um terceiro complexo.

Exemplo 6. Estrutura do β2AR no estado ativo

[0222] A estrutura do β2AR:Gs fornece a primeira visão de alta resolução sobre o mecanismo de transdução de sinal através da membrana plasmática por um GPCR, e a base estrutural para as propriedades funcionais do complexo ternário. A Figura 12a compara as estruturas do receptor ligado a agonista no complexo β2AR:Gs e do β2AR ligado a carazolol inativo. A maior diferença entre as estruturas inativa e ativa é um movimento para fora de 14 Â do TM6 quando medido no carbono de Ca do E268. Há um movimento para fora e um prolongamento menores da extremidade citoplasmática da hélice TM5 por 7 resíduos. Uma extensão de 26 aminoácidos na terceira alça intracelular (ICL3) é desordenada. Uma outra diferença extraordinária entre as estruturas inativa e ativa é a segunda alça intracelular (ICL2), que forma uma alça prolongada na estrutura do β 2AR inativa e uma hélice α no complexo β2AR:Gs. Esta hélice também é observada na estrutura do β2AR-Nb80 (Fig. 12b); no entanto, este pode não ser um aspecto que seja único para o estado ativo, uma vez que ele também é observado na estrutura inativa do β1AR aviário altamente homólogo (Warne et al., 2008).

[0223] A qualidade dos mapas de densidade de elétrons para o β2AR é melhor nesta interface β2AR-GαsRas, e muito mais fraca para a metade extracelular, possivelmente devido à falta de contatos da crista cristalina com a superfície extracelular (Fig. 9a). Como resultado, não se conseguiu traçar um modelo confiável do agonista de alta afinidade (BI-167107) na bolsa de ligação ao ligante. No entanto, a estrutura geral do β2AR no complexo T4L-β2AR:Gs é muito semelhante a nossa recente estrutura de β2AR no estado ativo estabilizada por um nanocorpo mimético da proteína G (Nb80). Estas estruturas divergem principalmente nas extremidades citoplasmáticas de TMs 5 e 6 (Fig 12b), possivelmente devido à presença de T4L que substitui a ICL3 na estrutura do β2AR-Nb80. Não obstante, o complexo β2AR-Nb80 apresenta a mesma alta afinidade para o agonista isoproterenol que o complexo β2AR:Gs (Rasmussen et al., 2011), consistente com elevada homologia estrutural em torno da bolsa de ligação ao ligante. Os mapas de densidade de elétrons para os cristais de β2AR-Nb80 oferecem uma vista mais confiável dos rearranjos conformacionais de aminoácidos em torno da bolsa de ligação ao ligante e entre a bolsa de ligação ao ligante e a interface de acoplamento com Gs (Rasmussen et al., 2011).

[0224] A Figura 12c mostra a posição dos motivos de sequência altamente conservados incluindo D/ERY e NPxxY no complexo β2AR:Gs em comparação com o complexo β 2AR-Nb80 (vide também Fig. 13). Já foi proposto que estas sequências conservadas são importantes para a ativação ou para a manutenção do receptor no estado inativo (Hofmann et al., 2009). As posições desses aminoácidos são essencialmente idênticas nessas duas estruturas demonstrado que o Nb80 é um substituto muito bom para a proteína G. Apenas o Arg131 difere entre estas duas estruturas. Na estrutura do β2AR-Nb80 o Arg131 interagem com o Nb80, ao passo que na estrutura do β2AR:Gs o Arg131 se acondiciona contra o Tyr391 da Gas (Fig. 13).

[0225] O estado ativo do β2AR é estabilizado por extensas interações com (GasRas) (Fig. 14). Não há interações diretas com as subunidades Gβ ou Gy. A superfície enterrada total da interface de β2AR-GαsRas é 2576 Â2 (1300 Â2 para GasRas e 1276 Â2 para o β2AR). Esta interface é formada por ICL2, TM5 e TM6 do β2AR, e pela hélice a5, a junção aN-β 1, o topo do cordão β3, e a hálice a4 de GasRas (vide Tabela 6 para interações específicas). Já foi mostrado que as sequências de β2AR envolvidas nesta interação desempenham um papel no acoplamento com a proteína G; no entanto, não existe uma sequência de consenso clara para a especificidade de acoplamento com a Gs quando esses segmentos são alinhados com outros GPCRs. Talvez isto não seja surpreendente considerando que o β2AR também se acopla com a Gi e que muitos GPCRs se acoplam com mais de uma isoforma da proteína G. A base estrutural para a especificidade de acoplamento com a proteína G deve portanto envolver aspectos mais sutis da estrutura secundária e terciária. Não obstante, uma interação notável envolve o Phe139, que fica localizado no início da hélice ICL2 e repousa em uma bolsa hidrofóbica formada pelo His41 da Gas no início do cordão β 1, Val213 no início do cordão β3 e Phe376, Arg380 e Ile383 na hélice a5 (Fig 14c). O mutante de β2AR F139A apresenta acoplamento severamente prejudicado com a Gs (Moro et al., 1993). O resíduo correspondente ao Phe139 é um Phe ou Leu em quase todos os receptores acoplados à Gs, mas é mais variável em GPCRs que sabidamente se acoplam a outras proteínas G. O interessante é que a hélice ICL2 é estabilizada por uma interação entre o Asp130 da sequência DRY conservada e o Tyr141 no meio da hélice ICL2 (Fig. 14c). Já foi mostrado que o Tyr141 é um substrato para a tirosina quinase receptora de insulina (Baltensperger et al., 1996); no entanto, o significado funcional desta fosforilação ainda é desconhecido.

Exemplo 7. Estrutura da Gs ativada

[0226] A observação mais surpreendente no complexo β2AR:Gs é o grande deslocamento da GasAH em relação à GasRas (uma rotação de aproximadamente 180° em torno da junção entre os domínios) (Fig. 15a). Na estrutura cristalina da Gas, a bolsa de ligação a nucleotídeo é formada pela interface entre GasRas e GasAH. A ligação ao nucleotídeo de guanina estabiliza a interação entre estes dois domínios. A perda deste efeito estabilizante da ligação ao nucleotídeo de guanina é consistente com a alta flexibilidade observada para a GasAH na análise por EM de partículas simples do complexo solubilizado com detergente (dados não mostrados). Isso também é coerente com o aumento na troca de deutério na interfac3e entre esses dois domínios mediante a formação do complexo (dados não mostrados). Recentemente, Hamm, Hubbell e colaboradores, usando espectroscopia de ressonância duplo-eletrônica (DEER), documentaram grandes alterações (até 20Â) na distância entre sondas de nitróxido posicionadas nos domínios Ras e a-helicoidal da Gi mediante formação de um complexo com rodopsina ativada por luz (Van Eps 2011). Portanto, talvez não surpreende que a GasAH seja deslocada em relação à GαsRas; no entanto, sua localização nesta estrutura cristalina provavelmente reflete a influência das interações de acondicionamento do cristal em vez de uma conformação fisiológica.

[0227] As ligações conformacionais entre o β2AR e a bolsa de ligação a nucleotídeo envolvem principalmente as hélices amino- e carboxil-terminais da Gas (Fig 14). A Figura 15b concentra-se na região da GasRAS que sofre a maior alteração conformacional quando se compara a estrutura da GasRAS do complexo Gs-β2AR com aquela do complexo Gas-GTPyS (Sunahara et al. 1997). A maior diferença é observada para a hélice a5, que é deslocada 6Â em direção ao receptor e gira quando a extremidade carboxil-terminal se projeta para dentro do núcleo transmembrana do β2AR. Associado a este movimento, a alça β6-a5, que interage com o anel da guanina na estrutura Gas-GTPyS, é deslocada para fora, longe da bolsa de ligação a nucleotídeo (Fig. 15b-d). O movimento da hélice a5 também é associado a alterações nas interações entre esta hélice e a lâmina β6, a alça aN-β 1, e a hélice a1. O cordão β 1 forma uma outra ligação entre o β2AR e bolsa de ligação a nucleotídeo. A extremidade C- terminal deste cordão altera a conformação em torno do Gly47, e ocorrem outras alterações na alça β 1-a1 (alça P) que coordena o y-fosfato na forma ligada ao GTP (Fig. 15 b-d). As observações na estrutura cristalina são coerentes com as experiências de troca de deutério em que ocorre troca de deutério melhorada na lâmina β 1 e na extremidade amino-terminal da hélice a5 mediante a formação do complexo β2AR:Gs livre de nucleotídeos (dados não mostrados).

[0228] A estrutura de um heterotrímero Gs ainda não foi determinada, de modo que não é possível comparar diretamente a interface Gαs-Gβy antes e depois da formação do complexo β 2AR:Gs. Com base na estrutura do heterotrímero Gi ligado ao GDP (Wall et al. 1995), não foram observadas grandes alterações nas interações entre GaRAS e Gβy mediante a formação do complexo com β2AR. Isto também é consistente com estudos de troca de deutério (dados não mostrados). Deve-se observar que o Nb35 se liga na interface entre GαsRas e Gβ (Fig. 2b). Portanto, não se pode excluir a possibilidade de que o Nb35 pode influenciar a orientação relativa da interface GαsRas-Gβy na estrutura cristalina. No entanto, estudos de EM de partículas simples fornecem evidências de que o Nb35 não rompe as interações entre GαsAH e GasRas (dados não mostrados).

Exemplo 8: Nb35 e Nb37 ligam-se a epítopos diferentes na Gs e inibem a ligação ao nucleotídeo

[0229] Para investigar o efeito de nanocorpos (Nb35 e Nb37) na Gs isolada, nanocorpos foram adicionados junto com bodipy-GTPyS- FL e várias preparações da proteína Gs em 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM de MgCh, 1 mM de DTT em um volume final de 200 μL. Amostras contendo uma proteína Gs heterotrimérica também incluíam 0,1% de DDM. Bodipy-GTPyS-FL é um análogo fluorescente estável de GTP (Àex=470nm, Àem=515nm). Sua intensidade de fluorescência aumenta com a ligação à proteína G e o Bodipy-GTPyS-FL pode portanto ser usado para medições em tempo real da ligação de nucleotídeos a proteínas G (McEwen et al. 2001). A fluoresc dados não mostrados encia foi medida em um formato de placa de microtitulação de 96 poços em uma leitora de placa de fluorescência M5 (Molecular Precision).

[0230] Em uma primeira experiência (figura 16), quantidades crescentes de Nb37 foram incubadas com 1 μM de GaS purificada e 100 nM de Bodipy-GTPyS-FL e o aumento da fluorescência foi medida em uma escala de tempo curta (300 segundos) para minimizar o acúmulo do produto de hidrólise bodipy-fosfato (Jameson et al. 2005). A subunidade Gas da proteína Gs heterotrimérica foi purificada de maneira já descrita anteriormente (Sunahara et al. 1997). Por esta experiência parece que o Nb37 bloqueia a ligação do GTPyS à Ga isolada de maneira dose-dependente. Estes resultados também indicam que o epítopo de ligação do Nb37 fica confinado à subunidade Gsa da proteína Gs heterotrimérica. Em uma experiência similar (figura 17), quantidades crescentes de Nb35 foram incubadas com 1 μM de GaS purificada e 100 nM de Bodipy-GTPyS-FL. Consistente com a observação de que o Nb35 se liga a um epítopo composto de elementos de GasRAS e Gβ (vide Exemplo 7), o Nb35 não tem qualquer efeito na ligação do GTPyS à subunidade GaS isolada.

[0231] Em uma outra experiência (figura 18), quantidades crescentes de Nb35 foram incubadas com 1 μM do heterotrímero Gs áβy purificado e 100 nM de Bodipy-GTPyS-FL. Esta experiência indica que o Nb35 bloqueia a ligação de GTPyS ao heterotrímero Gsaβy livre de maneira dose-dependente.

Exemplo 9. Nb35 estabiliza outros complexos agonista- GPCR-Gs

[0232] A subunidade Gs alfa (ou proteína Gs) é uma subunidade da proteína G heterotrimérica que ativa a via cAMP-dependente ativando a adenilato ciclase. Os receptores acoplados à proteína G que se acoplam à Gs incluem: receptores de 5-HT tipos 5-HT4 e 5- HT7, receptor de ACTH, receptor da adenosina tipos A2a e A2b, receptor 2 da arginina vasopressina, receptores β-adrenérgicos tipos β 1, β2 e β3, receptor da calcitonina, receptor do peptídio relacionado com o gene da calcitonina, receptor do hormônio liberador de corticotropina, família D1-like de receptores de dopamina (D1 r D5), receptor de FSH, receptor do polipeptídio inibitório gástrico, receptor do glucagon, receptor do peptídio 1 glucagon-like (GLP1-R), receptor da histamina H2, receptor do hormônio luteinizante/coriogonadotropina, receptor da melanocortina, receptor 1 do hormônio paratireoidiano, receptor da prostaglandina tipos D2 e I2, receptor da secretina, receptor da tirotropina, entre outros.

[0233] Para determinar se os nanocorpos que se ligam à Gs no complexo β2AR:Gs:BI167107 também estabilizam outros complexos GPCR:Gs:agonista, foi preparado um complexo do receptor 2 da arginina vasopressina (Acesso número P30518; V2R_HUMAN) em complexo com Gs, Nb35 e arginina vasopressina (AVP:NT4LV2R:Gs) e demonstrada a estabilidade deste complexo em SEC. A arginina vasopressina (AVP), também conhecida como vasopressina, argipressina ou hormônio antidiurético, é um ligante natural que ativa o receptor 2 da arginina vasopressina.

[0234] A formação de um complexo estável (figura 19a) foi efetuada misturando-se o heterotrímero Gs com tag His a uma concentração de aproximadamente 90 μM com NT4LV2R ligado a AVP (90 μM) e NB35 (100 μM) em 0,1 ml de tampão (10 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl , 0,1 % de DDM, 1 mM de EDTA, 3 mM de MgCl2, 10 mM de AVP) e incubado por 2 horas à temperature ambiente. Em seguida, o complexo AVP:NT4LV2R:Gs foi purificado em duas etapas sucessivas de purificação por afinidade. A purificação foi monitorada por SDS-PAGE (figura 19). Primeiro, o complexo foi aplicado a uma coluna Ni-NTA depois da adição de 300 μl de MNG a 1% em tampão 10 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl à mistura reacional. Subsequente à abundante lavagem com o tampão, o complexo foi eluído em 0,2% de MNG, 10 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl AVP 10 μM com 200 mM de imidazol. Em seguida o complexo foi aplicado a uma coluna de afinidade com FLAG-tag, lavado abundantemente no mesmo tampão contendo 0,01 % de MNG e eluído com o FLAG-peptídio. Este procedimento foi monitorado por SDS-PAGE (figura 19b) e mostra que um complexo contendo NT4LVTR, GαS, Gβ, Gy e Nb35 pode ser purificado de acordo. Este complexo foi ainda purificado por SEC em uma coluna superdex200 em 10 mM de HEPES, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,01 % de MNG, 1 mM de EDTA, 3 mM de MgCl2, 1 mM de AVP). Este procedimento foi monitorado por SDS-PAGE (figura 19c) e mostra que um complexo monodisperso contendo NT4LVTR, GαS, Gβ, Gy e Nb35 pode ser purificado de acordo.

[0235] Para confirmar a estabilidade do complex AVP:NT4LV2R:Gs, foram incubados a amostra purificada por 25 horas sobre gelo e reaplicamos à mesma à SEC para confirmar seu caráter monodisperso e seu MW (Figura 20). Como esperado, uma quantidade excessiva do antagonista SR121463 (10 μM) rompe o complex AVP:NT4LV2R:Gs.

Exemplo 10. Rastreamento melhorado por agonistas ou moduladores alostéricos positivos usando nanocorpos que estabilizam complexos GPCR:proteína G.

[0236] Um nanocorpo que estabiliza seletivamente um confômero não proeminente de GPCRs vai permitir um rastreamento mais eficiente por ligantes que interagem seletivamente com este confômero de baixa abundância particular. Além disso, nanocorpos confôrmero- seletivos também poderiam ser usadas para revelar sítios drogáveis alostéricos ou ocultos ou ao contrário camuflar bolsas de ligação indesejadas para rastreamento de fármacos. Caso o confôrmero particular esteja em um estado ativo, os ligantes identificados terão uma grande probabilidade de se comportarem como agonistas, suportado por experiências de docagem in silico descritas por Costanzi & Vilar (2011). Na verdade, seus resultados indicam que estruturas ativadas favorecem a identificação de agonistas sobre antagonistas, ao passo que estruturas inativas favorecem a identificação de bloqueadores de receptor sobre agonistas.

[0237] Existem evidências de que o Nb35 estabilizado o complex entre o β2AR ativado e a proteína G ligante a interface das subunidades Gas e Gβy. Um exemplo de um ensaio de rastreamento para identificar ligantes que interagem seletivamente com o confômero no estado ativo pouco abundante de β2AR pode ser um ensaio de radioligando usando Nb35 para desviar a população de β2AR mais em direção ao seu estado ativo. Tal ensaio de radioligando pode ser executado de maneira semelhante àqueles descrito por Seifert e colaboradores (1998) com pequenas modificações. Descreveu-se aqui um ensaio envolvendo β2AR como o alvo escolhido substituindo o β2AR por qualquer outro GPCR que interage com a subunidade Gas, permitindo a implementação de métodos de rastreamento similares para identificar ligantes agonísticos contra aquele GPCR particular. Uma molécula pequena (peso molecular do composto tipicamente entre 250 e 1000Da) ou mesmo uma biblioteca baseada em fragmentos (peso molecular do composto tipicamente < 250Da) pode ser rastreada para identificar candidatos a agonistas. A estabilização do confômero não proeminente vai aumentar o desempenho dos rastreamentos das bibliotecas de fragmentos consideravelmente, especialmente porque os resultados iniciais no rastreamento de fármacos baseados em fragmentos possuem uma potência/afinidade baixa. O Nb35 vai aumentar seletivamente a afinidade daqueles compostos que são específicos para o confômero drogável seletivo tendo assim um profundo efeito na identificação de fragmentos de novo.

[0238] Uma quantidade apropriada (tipicamente 10μg) de extratos de membrana homogeneizada de β2AR humano de células HEK293T contendo as subunidades de proteína G ancoradas na membrana anchored G é paralelamente incubada com Nb35 ou com um nanocorpo não relacionado (que não estabiliza a conformação do GPCR ativo) por 1 hora a 30°C em tampão de incubação (50mM de Hepes pH7,4, 1mM de CaCl2, 5mM de MgCl2, 100mM de NaCl e 0,5% p/v de BSA). Os nanocorpos são oferecidos exogenamente em grande excesso molar (por exemplo = 1μM) versus o receptor adrenérgico. Subsequentemente, as membranas ligadas aos nanocorpos são adicionadas a placas de 96 poços contendo compostos da biblioteca e 2 nM do radioligando antagonístico 3H-di-hidroalprenolol (DHA). O volume total por poço é ajustado com tampão de incubação em 100μl e a mistura reacional é ainda incubada por mais uma hora a 30°C. Subsequentemente, o radioligante ligado à membrana é coletado usando-se placas-filtro de fibra de vidro GF/C de 96 poços (Perkin Elmer) pré-impregnadas com 0,3% de polietilenoimina. As placas-filtro são lavadas com tampão de lavagem gelado (50mM de Tris-HCl pH7,4), e secadas por 30 minutos a 50°C. Depois da adição de 25 μl de fluido de cintilação (MicroScint™-O, Perkin Elmer), a radioatividade (cpm) é medida em um contador de cintilação Wallac MicroBeta TriLux. Os compostos da biblioteca que reduziram significativamente a cpm na presença de Nb35 sem o uso do nanocorpo não relacionado são considerados ligantes agonísticos. Os resultados candidatos a agonista identificados via o rastreamento da biblioteca primária serão novamente rastreados em termos de dose-resposta. Os valores de IC50 das curvas de % de deslocamento do radioligando para cada candidato a agonista na presença de Nb35 e do nanocorpo não relacionado serão calculados usando-se o software Graphpad Prism. Para provar o agonismo efetivo dos compostos de novo identificados, o efeito dose-dependente desses compostos em um ensaio de sinalização de β2AR celular será avaliado. Um exemplo de tal ensaio baseia-se na detecção de moléculas mensageiras secundárias tais como cAMP depois da sinalização mediada por Gas (por exemplo a tecnologia do ensaio de cAMP HitHunter, DiscoverX). Em vez de usar extratos de membrana e Nb35 aplicado de forma exógena, o ensaio de radioligando pode ser feito em uma linhagem celular expressando β2AR cotransfectada com Nb35 como um intracorpo (ou membranas derivadas) a fim de desviar a população de β 2AR para seu estado ativo. Alternativamente, proteína G recombinante e β2AR podem ser usados para estabilizar via Nb35 o estado ativo do β2AR.

Material e Métodos para os Exemplos Expressão e purificação de β2AR, heterotrímero Gs, e nanocorpo-35

[0239] Uma construção lisozima T4-β2AR N-terminalmente fundida truncada na posição 365 (T4L-β2AR, descrito em detalhes abaixo) foi expressa em culturas de células de inseto Sf-9 infectadas com baculovírus recombinante (BestBac, Expression Systems), e solubilizada em n-dodecil-β-D-maltosideo (DDM) de acordo com métodos já previamente descritos (Kobilka et al. 1995) (vide figura 6 para um panorama da purificação) http://www.nature.com/nature/journal/v469/n7329/full/nature09648.html - ref26. Uma construção β2AR truncada depois do resíduo 365 (β2AR- 365; SEQ ID N°: 55) foi usada para a maioria das experiências analíticas e para experiências de troca de deutério. Cromatografia por afinidade com M1 Flag (Sigma) foi usada como a etapa de purificação inicial seguida por cromatografia em alprenolol-Sepharose para seleção do receptor funcional. Uma etapa subsequente de cromatografia por afinidade com M1 Flag foi usada para trocar o alprenolol ligado ao receptor pelo agonista BI-167107 de alta afinidade. O receptor ligado ao agonista foi eluído, dialisada contra tampão (20 mM de HEPES pH7,5, 100 mM de NaCl, 0,1% de DDM e 10 μM de BI-167107), tratada com lambda fosfatase (New England Biolabs), e concentrado até aproximadamente 50 mg ml-1 com um concentrador Millipore de corte de peso molecular de 50 kDa (MWCO). Antes da concentração por centrifugação a construção β 2AR-365, mas não a T4L-β2AR, foi tratada com PNGaseF (New England Biolabs) para remover a glicosilação N-ligada amino-terminal. O receptor purificado foi analisado como de rotina por SDS-PAGE/coloração com azul brilhante de Coomassie (vide figura 5a).

[0240] Gas bovino curto, Gβ 1 de rato fundido a um tag His6, e Gy2 de rato (vide Tabela 5) foram expressos em células de insetos High 5 (Invitrogen) cultivadas em meio livre de soro Insect Xpress (Lonza). As culturas cresceram até uma densidade de 1,5 milhão de células por ml e foram então infectadas com três vírus de poliedrose nuclear Autographa californica separados cada um deles contendo o gene para uma das subunidades da proteína G a uma multiplicidade de infecção de 1:1 (os vírus foram uma oferta generosa do Dr. Alfred Gilman). Depois de 40-48 horas de incubação as células infectadas foram coletadas por centrifugação e ressuspendidas em 75 ml de tampão de lise (50 mM de HEPES pH 8,0, 65 mM de NaCl, 1,1 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 1x PTT (35 μg/ml de fluoreto de fenilmetanossulfonila, 32 μg/ml de tosil fenilalanil clorometil cetona, 32 μg/ml de tosil lisil clorometil cetona), 1x LS (3,2 μg/ml de leupeptina e 3,2 μg/ml de inibidor da tripsina da soja), 5 mM de β-ME, e 10 μM de GDP) por litro de volume de cultura. A suspensão foi pressurizado com 41,34 bar ("600 psig") de N2 por 40 minutos em uma bomba de cavitação de nitrogênio (Parr Instrument Company). Depois da despressurização, o lisado foi centrifugado para remover os núcleos e as células não lisadas, e então ultracentrifugado a 180.000 x g por 40 minutos. As membranas pelotizadas foram ressuspendidas em 30 ml de tampão de lavagem (50 mM de HEPES pH 8,0, 50 mM de NaCl, 100 μM de MgCh, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP) por litro de volume de cultura usando um homogeneizador Dounce e centrifugadas mais uma vez a 180.000 x g por 40 minutos. A pelota lavada foi ressuspendida em um volume mínimo de tampão de lavagem e congelada instataneamente com nitrogênio líquido.

[0241] As membranas congeladas foram descongeladas e diluídas até uma concentração de proteínas totais de 5 mg/ml com tampão de lavagem fresco. O detergente colato de sódio foi adicionado à suspensão a uma concentração final de 1,0%, MgCl2 foi adicionado até atingir uma concentração final de 5 mM, e 0,05 mg de fosfatase proteica purificada 5 (preparado na casa) foi adicionado por litro de volume de cultura. A amostra foi agitada em gelo por 40 minutos, e em seguida centrifugada a 180.000 x g por 40 minutos para remover os detritos insolúveis. O sobrenadante foi diluído 1 para 5 com tampão de carga Ni-NTA (20 mM de HEPES pH 8,0, 363 mM de NaCl, 1,25 mM de MgCl2, 6,25 mM de imidazol, 0,2% de Anzergent 3-12, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP), com o cuidado de se adicionar o tampão lentamente para evitar a queda muito rápida da concentração de colato abaixo de sua concentração micelar crítica. 3 ml da resina Ni- NTA (Qiagen) pré-equlibrada no tampão de lavagem Ni-NTA 1 (20 mM de HEPES pH 8,0, 300 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 5 mM de imidazol, 0,2% de colato, 0,15% de Anzergent 3-12, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP) por litro de volume de cultura foram adicionados e a amostra foi agitada em gelo por 20 minutos. A resina coletada em uma coluna de gravidade e lavada com 4x volumes de coluna do tampão de lavagem Ni-NTA 1, do tampão de lavagem Ni- NTA 2 (20 mM de HEPES pH 8,0, 50 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de imidazol, 0,15% de Anzergent 3-12, 0,1% de DDM, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP), e do tampão de lavagem Ni-NTA 3 (20 mM de HEPES pH 8,0, 50 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 5 mM de imidazol, 0,1% de DDM, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP). A proteína foi eluída com o tampão de eluição Ni-NTA (20 mM de HEPES pH 8,0, 40 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 200 mM de imidazol, 0,1% de DDM, 1x PTT, 1x LS, 5 mM de β-ME, 10 μM de GDP). As frações contendo proteína foram reunidas e MnCl2 foi adicionado até uma concentração final de 100 μM. 50 μg de lambda fosfatase proteica purificada (preparada na casa) foram adicionados por litro de volume de cultura e o eluato foi incubado em gelo com agitação por 30 minutos. O eluato foi passado por um filtro de 0,22 μm e carregado diretamente em uma coluna MonoQ HR 16/10 (GE Healthcare) equilibrada no tampão A MonoQ (20 mM de HEPES pH 8,0, 50 mM de NaCl, 100 μM de MgCl2, 0,1% de DDM, 5 mM de β-ME, 1x PTT). A coluna foi lavada com 150 ml de tampão A a 5 ml/min e as proteínas ligadas foram eluídas sobre 350 ml com um gradiente linear até 28% do tampão B MonoQ B (o mesmo que o tampão A porém com 1 M de NaCl). As frações foram recolhidas em tubos manchados com GDP suficiente para obter uma concentração final de 10 μM. As frações contendo Gs foram concentradas até 2 ml usando uma célula de ultrafiltração agitada com uma membrana de celulose regenerada NMWL de 10 kDa (Millipore). A amostra concentrada foi carregada em uma coluna Superdex 200 prep grade XK 16/70 (GE Healthcare) equilibrado no tampão S200 (20 mM de HEPES pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1,1 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 0,012% de DDM, 100 mM de TCEP, 2 mM de GDP). As frações contendo Gs pura foram reunidas, glicerol foi adicionado até atingir uma concentração final de 10%, e em seguida a proteína foi concentrada até pelo menos 10 mg/ml usando um dispositivo de ultrafiltração centrífuga Amicon de celulose renegerada MWCO de 30 kDa. A amostra concentrada foi dividida em alíquotas, concentrada instantaneamente, e armazenada a -80°C. Um rendimento típico do heterotrímero Gs purificado a partir de 8 litros de volume de cultura de células foi de 6 mg.

[0242] O nanocorpo-35 (Nb35) (SEQ ID N°: 1) foi expresso no periplasma de Escherichia coli cepa WK6, extraído, e purificado por cromatografia por afinidade com níquel de acordo com métodos já previamente descritos (Rasmussen et al. 2011) seguido por cromatografia de troca iônica (figura 7a) usando uma coluna Mono S 10/100 GL (GE Healthcare). Frações selecionadas de Nb35 foram dialisadas contra um tampão (10 mM de HEPES pH7,5, 100 mM de NaCl) e concentradas até aproximadamente 65 mg ml-1 com um concentrador Millipore MWCO de 10 kDa.

Modificação genética de proteínas

[0243] Para aumentar a probabilidade de obter cristais do complexo R:G estabeleceu-se aumentar a área superficial polar da superfície extracelular dos receptores usando duas estratégias. A abordagem foi substituir o terminal N flexível e presumivelmente não estruturado pela lisozima T4 (T4L) da proteína globular usada previamente para cristalizar e resolver o receptor ligado a carazolol (Rosenbaum et al. 2007). A construção usada aqui (T4L-β2AR) continha a sequência de sinal clivável seguida pelo epítopo M1 Flag (DYKDDDDA; SEQ ID N°: 70), a sequência de reconhecimento da protease TEV (ENLYFQG; SEQ ID N°: 71), a lisozima T4 de bacteriofago de N2 a Y161 incluindo as mutações C54T e C97A, e um ligante de alanina de dois resíduos fundido à sequência de β2AR humano D29 a G365 (a construção de fusão T4L-β2AR definida pela SEQ ID N°: 69). O sítio de glicosilação inaccessível PNGaseF do β2AR em N187 foi mutado para Glu. M96 e M98 na primeira alça extracelular foram substituídos por Thr para aumentar o nível de expressão do contrário baixo de T4L-β2AR. As mutações na treonina não afetaram a afinidade de ligação ao ligante para 3H-di-hidro-alprenolol, mas provocaram uma pequena diminuição de aproximadamente duas vezes na afinidade para isoproterenol (dados não mostrados). Observe que o β2AR de referência do tipo selvagem que é usado aqui é definida pela SEQ ID N°: 72.

Coleta e processamento de dados de microcristalografia.

[0244] A coleta de dados foi feita no Advanced Photon Source beamline 23 ID-B. Centenas de cristais foram rastreados, e um conjunto final de dados foi compilado usando cunhas de difração de tipicamente 10 graus de 20 cristais que difratam fortemente. A redução de todos os dados foi feita usando HKL2000 (Otwinowski et al. 1997). Embora em muitos casos difração para além de 3 Â tenha sido visto em em quadros iniciais, danos de radiação e difração anisotrópica resultaram em integralidade baixa em conchas ("shells") de resolução mais alta. A análise do conjunto final de dados pelo servidor de anisotropia de difração UCLA (Strong et al. 2006) indicou que a difração ao longo do eixo recíproco a* foi superior àquela em outras direções. Com base em um corte F/sigF de 3 ao longo de cada eixo espacial recíproco, as reflexões foram submetidas a um truncamento anisotrópico com limites de resoluçãao de 2,9, 3,2, e 3,2 Angstroms ao longo de a*, b*, e c* antes de serem usadas no refinamento. Devido à baixa integralidade em conchas ("shells") de alta resolução, foi retirada esta estrutura com uma resolução total de apenas 3,3 Â, embora devase observar que alguns dados de difração para 2,9 Â foram incluídos durante o refinamento e cálculo do mapa.

Resolução e refinamento da estrutura

[0245] A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando Phaser (McCoy et al. 2007a, b). A ordem da busca por substituição molecular mostrou-se crítica na resolução da estrutura. Na ordem usada, os modelos de busca foram: a estrutura das subunidades beta e gama da estrutura de uma proteína G heterotrimérica Gi (PDB ID: 1GP2), o domínio alfa ras da Gs (PDB ID: 1AZT), o receptor adrenérgico beta2 no estado ativo (PDB ID: 3P0G), o nanocorpo de ligação à beta2 (PDB ID: 3P0G), a lisozima T4 (PDB ID: 2RH1), o domínio helicoidal alfa da Gs (PDB ID: 1AZT). Subsequente à determinação da estrutura inicial por substituição molecular, refinamento do corpo rígido e anelamento simulado foram efetuados em Phenix (Afonine et al. 2005) e BUSTER (Blanc et al. 2004), seguido por refinamento refreado e reconstrução manual em Coot (Emsley et al. 2004). Depois do refinamento iterativo e ajustes manuais, a estrutura foi refinada em CNS usando o método DEN. Embora a resolução dessa estrutura exceda aquela para a qual o DEN é tipicamente mais útil, a presença de várias regiões pobremente resolvidas indicou que a incorporação de informações adicionais para guiar o rendimento poderia oferecer resultados melhores. Os modelos de referência do DEN usados foram aqueles indicados acima como modelos de busca por substituição molecular, com exceção do NB35, que era bem ordenado e para o qual não há uma estrutura de resolução mais alta disponível. As figuras foram preparadas usando PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Versão 1.3, Schrodinger, LLC.). As estatística do refinamento estão dadas na Tabela 7.

Ligação

[0246] Membranas expressando o β2AR ou a fusão β2AR- Gspeptídio foram preparadas a partir de células Sf9 infectadas com baculovírus e a ligação a 3H-di-hidroalprenolol (3H-DHA) foi realizada de maneira já descrita previamente (Swaminath et al. 2002). Para ligação competitiva, as membranas foram incubadas com 3H-DHA (1,1 nM final) e concentrações crescentes de (-)-isoproterenol (ISO) por 1 hora antes da coleta em filtros GF/B. Os dados da competição foram ajustados a um modelo de ligação a dois sítios e frações com ISO alto e Ki’s baixos foram calculadas usando GraphPad prism.

Purificação de NT4LV2R

[0247] O constructo T4L V2R N-terminalmente fundida (NT4L-V2R; SEQ ID N°: 73) foi expressa em células Sf9 usando o sistema de baculovírus (PfastBac). As células foram infectadas a uma densidade de 4 x 106 células por ml e os balões de cultura foram agitados a 27°C por 48 horas. Depois da coleta, as células foram lisadas por choque osmótico em um tampão compreendido de 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1 μM de Tolvaptan (Sigma) e 2 mg ml-1 de iodoacetamida para bloquear as cisteínas reativas. A extração de NT4L-V2R das membranas de Sf9 foi feita com um homogeneizador Dounce em um tampão de solubilização compreendido de 0,5% de dodecil maltosídeo (DDM), 0,3% de colato, 0,03% de hemissuccinato de colesterol (CHS), 20 mM de HEPES pH 7,5, 0,5 M de NaCl, 30% v/v de glicerol, 2 mgml-1 de iodoacetamida e 1 μM de Tolvaptan. Depois de centrifugação, níquel-NTA agarose foi adicionado ao sobrenadante, agitado por 2 horas, e então lavado em lotes com 100 g de "spins" por 5 minutos cada com um tampão de lavagem de 0,1% de DDM, 0,03% de colato, 0,01% de CHS, 20 mM de HEPES pH 7,5 e 0,5 M de NaCl. A resina foi despejada em uma coluna de vidro e o receptor ligado foi eluído em tampão de lavagem suplementado com 300 mM de imidazol. Foi usada a resina de afinidade anti-Flag M1 para purificar ainda mais o NT4L-V2R e para trocar o ligante pelo agonista AVP. O eluato Ni- NTA resina foi carregado na resina anti-Flag M1 e lavado abundantemente na presença de 10 μM de AVP. O receptor foi então eluído da resina de afinidade anti-Flag M1 com 0,2 mgml-1 de peptídio Flag e 2 mM de EDTA na presença de 1 μM de AVP e concentrado usando um concentrador MWCO de 100 kDa.Tabela 2. Lista de nanocorposTabela 3. Combinações de FRs e CDRs dos nanocorposTabela 4. Sequências de ácidos nucleicos dos nanocorpos Tabela 5: Exemplos de isoformas de subunidades da proteína G Tabela 6. Potenciais interações intermoleculares na interface R:G Tabela 7. Coleta de dados e estatística de refinamento *As estatísticas de concha ("shell statistics") mais altas estão entre parênteses. A Estas regiões foram omitidas do modelo devido à densidade de elétrons pobremente resolvida. Tags de purificação não modelados não estão incluídos nessas faixas de resíduos. BOs resíduos 1-28 odeβ2AR foram omitidos da construção e T4L foi fundido ao aminoterminal da hélice transmembrana 1 para facilitar a cristalização. cO resíduo de T4L foi omitido da construção. DDefinido pelo MolProbity. REFERÊNCIAS - Afonine, P. V., Grosse-Kunstleve, R. W., & Adams, P. D. (2005). A robust bulk-solvent correction and anisotropic scaling procedure. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, 61, 850-5.. - Baltensperger, K. et al. 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Claims (17)

1. Domínio variável simples de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende 4 regiões estruturais (FR1 a FR4) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3), de acordo com a seguinte fórmula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4 (1), que é direcionado contra e/ou se liga especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, em que o referido domínio variável simples de imunoglobulina se liga especificamente à proteína G, e não ao GPCR no complexo, e em que CDR1 é GFTFSNYK (SEQ ID NO:13), CDR2 é ISQSGASI (SEQ ID NO:25) e CDR3 é ARCPAPFTRDCFDV TSTTYAY (SEQ ID NO:37).

2. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

3. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o complexo compreende ainda um ligante de receptor.

4. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido ligante de receptor é um agonista.

5. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína G está em uma forma livre de nucleotídeos.

6. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a proteína G é selecionada dentre o grupo que consiste em Gs, Gi, Go, Gt, Ggust, Gz, Golf, Gq, G12, G13.

7. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido GPCR é uma proteína humana.

8. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de ligação está compreendido em um polipeptídio.

9. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, uma proteína G e um GPCR.

10. Sequência de ácidos nucleicos, caracterizada pelo fato de que é representada pela SEQ ID NO: 49, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma.

11. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 10.

12. Uso de um domínio variável simples de imunoglobulina como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para estabilizar um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor em uma conformação ativa.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser para prevenir a dissociação do complexo na presença de nucleotídeos, em particular nucleotídeos do tipo guanina ou análogos dos mesmos, tais como GTPyS.

14. Uso de um domínio variável simples de imunoglobulina como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para cristalizar e/ou resolver a estrutura de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor.

15. Uso de um domínio variável simples de imunoglobulina como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para rastrear compostos que modulam a atividade sinalizadora do GPCR.

16. Método de captura e/ou purificação de um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) oferecer um domínio variável simples de imunoglobulina como definido na reivindicação 1 ou 2, e (b) deixar que o domínio variável simples de imunoglobulina se ligue a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G e opcionalmente um ligante de receptor, e (c) opcionalmente, isolar o complexo formado na etapa (b), (d) cristalizar o complexo formado na etapa (b).

17. Método de produção de um domínio variável simples de imunoglobulina direcionado contra e/ou ligando-se especificamente a um complexo compreendendo um GPCR e uma proteína G, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) expressar em um sistema de expressão celular adequado um ácido nucleico, como definido na reivindicação 10, e opcionalmente, (b) isolar e/ou purificar o domínio de ligação.