ES2230607T3 - Metodo selectivo de acilacion. - Google Patents
Metodo selectivo de acilacion.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO SELECTIVO DE ALCILACION DE INSULINA, DE UN ANALOGO DE INSULINA Y DE SU PRECURSOR QUE TIENE UN GRUPO EP - AMINA LIBRE DE UN RESIDUO LYS, Y POR LO MENOS UN GRUPO AL - AMINO LIBRE. DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN PROVOCAR LA REACCION DEL GRUPO EP AMINA LIBRE CON UNA AMIDA ACTIVADA EN UN DISOLVENTE POLAR EN PRESENCIA DE UNA BASE.
Description
Método selectivo de acilación.
La presente invención se refiere a un método de
introducción de un grupo acilo en un péptido. De forma más
particular, la invención se refiere a un método mejorado para
acilar el grupo \varepsilon-amino de un residuo de
lisina contenido en una insulina de origen natural o un análogo o
un precursor suyo.
La insulina humana y las insulinas relacionadas
de forma cercana tienen tres grupos amino primarios en la molécula
es decir los grupos \alpha-amino de Gly^{A1} y
Phe^{B1}, respectivamente, y el grupo
\varepsilon-amino de Lys^{B29}. La
N-acilación de una insulina desprotegida puede
-dependiendo de las condiciones- conducir a una mezcla compleja de
productos mono-, di- e incluso triacilados. No obstante, aunque
cierta preferencia para la acilación de una posición específica
puede a menudo ser observada la preferencia no es siempre lo
suficientemente pronunciada para hacer esta acilación directa útil
como método para producir insulinas monoaciladas puesto que la
formación del producto deseado puede ir acompañada de la formación
de cantidades considerables de subproductos relacionados de forma
cercana. Cuando se forman los subproductos, esto se produce a
expensas del producto deseado y puede conducir a problemas en la
purificación del producto deseado.
La acilación de sólo uno o dos grupos amino
específicos en la molécula de insulina puede conseguirse si se
dispone de un intermediario protegido de forma adecuada. Un
intermediario adecuado puede ser un derivado insulínico en el que
el(los) grupo(s) amino que no debe ser acilado
es(son) bloqueado(s) con un grupo de protección que
puede ser eliminado selectivamente después de que se haya producido
la acilación. Un intermediario protegido de este tipo puede ser sea
un precursor de insulina o un derivado insulínico en el que haya
sido posible introducir uno o dos grupos de protección de forma
específica. Por cuestiones económicas, es muy atractivo el hecho de
evitar el uso de grupos específicos de protección si se puede.
Friesen HJ et al. (Semisynthetic Peptides
and Proteins (Offord RE, DiBello C, eds.) 161-179,
1978, Londres) describen la acilación de insulina con ésteres de
N-hidroxisuccinimida (a continuación denominados
ONSu-ésteres) y otros ésteres activados bajo varias condiciones,
según se resume en las tablas 4 y 5 l.c. Se observa cierta
selectividad pero se obtienen de forma invariable los productos A1
monosustituídos y B29 monosustituídos mezclados entre sí y con
productos disustituídos. La producción total máxima de productos
monosustituidos observada es del 75% pero de los cuales el 85% eran
el isómero Al. En otros casos la producción total de productos
monosustituídos estaban en la gama del 45-55% de
los cuales el 70-72% eran el isómero
E-B29. [0005] Según está demostrado por Friesen HJ
et al. (en: Chemistry, Structure and Function of Insulin and
Related Hormones, Proceedings of the Second International Insulin
Symposium (Brandenburg D, Wollmer A, eds.), Nueva York, 1980), el
pH del medio de la reacción tiene una fuerte influencia en el curso
de la reacción cuando se acila la insulina con ONSu- ésteres u otros
agentes acilantes. Así, a un pH 5-6 la
monoacilación preferiblemente se desarrolla en el grupo amino de B1
y el producto diacilado preferiblemente será insulina
A1,B1-diacilada. A un pH 6.8-9.2, la
monoacilación preferiblemente se desarrolla en el grupo amino de Al
mientras que el producto diacilado puede ser insulina A1,B1- o
A1,\varepsilon-B29-diacilada.
Finalmente, a un pH superior a 10, la monoacilación preferiblemente
se produce en el grupo \varepsilon-amino de
Lys^{B29} mientras que otro grupo acilo preferiblemente va al
grupo amino de A1.
Un método que permite la acilación selectiva de
proinsulina, insulina o un análogo de insulina que tiene un grupo
E-amino libre se describe en EP 0 712 861 A2 y EP 0
712 862 A2 (ambos de Eli Lilly and Company). Según el método, las
insulinas desprotegidas son aciladas con ésteres de ácido graso
soluble, activados, en particular los ONSu-ésteres, bajo
condiciones básicas en un solvente polar.
EP 0 511 600 A2 (Kuraray Co., Ltd.) describe i.a.
derivados proteínicos de la fórmula [proteína][Z]_{n}
donde [proteína] representa una proteína que tiene varios grupos
amino, [Z] es un residuo representado por la fórmula
-CO-W-COOH donde W es un grupo
hidrocarburo de cadena larga bivalente que puede también contener
algunos átomos hetero y n representa una media del número de
enlaces de amida entre [Z] y [proteína]. Los derivados son
preparados por reacción entre la proteína precursora y un éster de
imida de ácido carboxílico de cadena larga en una solución acuosa
de una sal que contiene también un solvente orgánico de forma
opcional. Ninguna especificidad de la acilación está mencionada y
el hecho de que n deba ser un número medio parece indicar que no se
consigue ninguna especificidad. Se ha mencionado, que la insulina es
una de las proteínas a partir de las cuales, según la invención, se
pueden hacer derivados, pero ningún derivado insulínico específico
está descrito en EP 0 511 600 ni tampoco se encuentra aquí
cualquier indicación de una [Z] preferida o una posición preferida
en la que [Z] deba ser introducida para obtener un derivado
insulínico útil.
Ejemplos de derivados insulínicos, acilados en el
grupo \varepsilon-amino del residuo Lys contenido
en él, están descritos en WO 95/07931 (NOVO NORDISK A/S). Los
derivados pueden ser producidos por acilación de la correspondiente
insulina (A1,B1)-diBoc, preparada a partir de la
insulina correspondiente por reacción p. ej. con
di-tert-butilo dicarbonato y
eliminando posteriormente los grupos de protección y por acilación
de un precursor de insulina de cadena única que posteriormente
tiene que ser procesado adicionalmente. Ahora se ha hallado de
forma sorprendente que se pueden obtener altos rendimientos de
insulinas, monoaciladas en el grupo
\varepsilon-amino de un residuo Lys contenido en
él, gracias al método de la presente invención.
En su aspecto más amplio, la presente invención
se refiere a un método para acilar una insulina de forma selectiva,
un análogo de insulina o un precursor suyo que tiene un grupo
\varepsilon-amino libre de un residuo Lys
contenido en él y al menos un grupo \alpha-amino
libre, método que comprende la reacción del grupo
\varepsilon-amino con una amida activada en un
solvente polar en presencia de una base, la amida activada siendo
sea la benzotriazolida o sea una benzotriazolida sustituida del
ácido correspondiente al grupo acilo a introducir.
En una forma de realización preferida, la
insulina original (es decir la insulina de origen natural, análogo
de insulina o precursor de insulina a acilar usando el método según
la invención) es insulina humana des(B30). Ejemplos de otras
insulinas originales preferidas son insulina humana, insulina
porcina y otras insulinas de origen natural y también análogos de
insulina o precursores de insulina en los que al menos un Lys que
tiene un grupo \varepsilon-amino libre y un
residuo aminoácido que tiene un grupo \alpha-amino
libre están presentes.
Un grupo particularmente preferido de insulinas
originales son análogos de insulina en los que el residuo
aminoácido en la posición B1 ha sido eliminado.
Otro grupo particularmente preferido de insulinas
originales son análogos de insulina que tienen Lys en la posición
B28 y Pro en la posición B29. Un ejemplo preferido de este grupo es
insulina humana Lys^{B28} Pro^{B29}.
Otro grupo particularmente preferido de insulinas
originales son análogos de insulina que tienen Asp en la posición
B28. Un ejemplo preferido de este grupo es insulina humana
Asp^{B28}.
Otros grupos particularmente preferidos de
insulinas originales son análogos de insulina en los que en los que
la A-cadena y/o la B-cadena tienen
una extensión N-terminal y análogos de insulina en
los que la A-cadena y/o la B-cadena
tienen una extensión C-terminal.
Otros análogos de insulina que pueden ser útiles
como insulinas originales en el método de la presente invención son
aquellos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos,
preferiblemente uno, dos o tres de éstos, han sido sustituidos por
otro residuo aminoácido codificable. Así, en la posición A21 una
insulina original puede tener en vez de Asn un residuo aminoácido
seleccionado del grupo que comprende Ala, Gln, Glu, Gly, su, Ile,
Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular un residuo
aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gly, Ala, Ser y
Thr. Análogos de insulina útiles como insulinas originales en el
método de la presente invención pueden también ser modificados por
una combinación de los cambios subrayados más arriba.
Por "análogo de insulina" según se utiliza
en este caso se entiende un péptido que tiene una estructura
molecular similar a la de la insulina humana incluyendo los puentes
disulfuro entre Cys^{A7} y Cys^{B7} y entre Cys^{A20} y
Cys^{B19} y un puente disulfuro interno entre Cys^{A6} y
Cys^{A11}, y que tiene actividad insulínica. Cuando el aminoácido
en la posición B1 es eliminado, la posición de los aminoácidos
restantes de la B-cadena no es renumerada.
La expresión "un residuo aminoácido
codificable" según se utiliza en este caso designa un residuo
aminoácido que puede ser codificado por el código genético, es
decir un triplete ("codón") de nucleótidos.
La insulina humana des(B30) análoga de
insulina original preferida puede ser preparada por diferentes
métodos, i.a. por hidrólisis enzimática de insulina humana, insulina
porcina y derivados insulínicos. Enzimas que facilitan esta
hidrólisis son endopeptidasas de lisilo, como tripsina y proteasas
de Achromobacter lyticus. Además, la insulina humana
des(B30) puede ser preparada en un proceso enzimático de un
precursor de insulina de cadena única de la fórmula
B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
donde B(1-29) designa la secuencia de
aminoácidos de la posición 1 a la posición 29 de la
cadena-B de insulina humana y
A(1-21) designa la secuencia de amino ácidos
de la posición 1 a la posición 21 de la cadena-A de
insulina humana. Este precursor puede ser obtenido según se
describe en EP 163.529. Una enzima adecuada para el proceso es la
proteasa 1 de Achromobacter lyticus, código EC No. 3.4.21.50.
La enzima puede ser usada en forma soluble, o inmovilizada en una
Sefarosa activada de N-hidroxisuccinimida. Tras la
finalización de la reacción, la insulina humana des(B30)
formada puede ser aislada de varias formas, i.a. por precipitación
por adición de zinc o sales sódicas.
La reacción de acilación es normalmente realizada
con una concentración de la insulina original de aproximadamente el
0.1% p/p a aproximadamente el 25% p/p, preferiblemente de
aproximadamente el 2% p/p a aproximadamente el 12% p/p, más
preferido de aproximadamente el 3% p/p a aproximadamente el 8% p/p
al principio de la reacción.
En una forma de realización preferida de la
invención, el grupo acilo a introducir en el grupo
\varepsilon-amino de un residuo Lys es el grupo
acilo de un ácido monocarboxílico de la fórmula general (1):
(I)M-COOH
donde M es un grupo hidrocarburo de
cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más
grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se
compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre. Más preferido,
el grupo acilo es el grupo acilo de un ácido monocarboxílico de
cadena recta, alifático que tiene de 6 a 24 átomos de carbono, en
particular un grupo acilo seleccionado del grupo que comprende
CH_{3}(CH_{2})_{8}CO,
CH_{3}(CH_{2})_{9}
CO, CH_{3}(CH_{2})_{10}CO, CH_{3}(CH_{2})_{11}CO, CH_{3}(CH_{2})_{12}CO, CH_{3}(CH_{2})_{13}CO, CH_{3}(CH_{2})_{14}CO, CH_{3}(CH_{2})_{15}CO, CH_{3}(CH_{2})_{16}
CO, CH_{3}(CH_{2})_{17}CO, CH_{3}(CH_{2})_{18}CO, CH_{3}(CH_{2})_{19}CO, CH_{3}(CH_{2})_{20}CO, CH_{3}(CH_{2})_{21}CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.
CO, CH_{3}(CH_{2})_{10}CO, CH_{3}(CH_{2})_{11}CO, CH_{3}(CH_{2})_{12}CO, CH_{3}(CH_{2})_{13}CO, CH_{3}(CH_{2})_{14}CO, CH_{3}(CH_{2})_{15}CO, CH_{3}(CH_{2})_{16}
CO, CH_{3}(CH_{2})_{17}CO, CH_{3}(CH_{2})_{18}CO, CH_{3}(CH_{2})_{19}CO, CH_{3}(CH_{2})_{20}CO, CH_{3}(CH_{2})_{21}CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.
En otra forma de realización preferida de la
invención, el grupo acilo a introducir en el grupo
\varepsilon-amino de un Lys residuo es uno de los
grupos acilo de un ácido dicarboxílico de la fórmula general
(II):
(II)HOOC-D-COOH
donde D es un grupo hidrocarburo de
cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más
grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se
compone de un átomo de oxígeno y un átomo de azufre. Más preferido,
el grupo acilo es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico
de la fórmula general (II) donde D es un grupo hidrocarburo
alifático de cadena recta, bivalente que tiene de 6 a 22 átomos de
carbono, en particular un grupo acilo seleccionado del grupo que
comprende HOOC(CH_{2})_{6}CO,
HOOC(CH_{2})_{8}CO,
HOOC(CH_{2})_{10}CO,
HOOC(CH_{2})_{12}CO,
HOOC(CH_{2})_{14}CO,
HOOC(CH_{2})_{16}CO,
HOOC(CH_{2})_{18}CO,
HOOC(CH_{2})_{20}CO y
HOOC(CH_{2})_{22}CO.
En otra forma de realización preferida de la
invención, el grupo acilo que debe ser introducido en el grupo
\varepsilon-amino de un residuo Lys es un grupo
de la fórmula general (III):
(III)CH_{3}(CH_{2})_{X}CONHCH(COOR^{1})CH_{2}CH_{2}CO
donde x es un número entero del 8
al 24 y R^{1} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con
hidrógeno después de que la acilación haya sido realizada, por
ejemplo metilo, etilo o tert-butilo. Los valores
preferidos de x son 10, 12 y 14. Cuando la acilación ha sido
realizada y R' es diferente de hidrógeno, el grupo éster del cual
R^{1} es una parte puede ser hidrolizado para dar el ácido libre
correspondiente y el alcohol R^{1}OH por métodos conocidos per
se. Así, cuando R^{1} es metilo o etilo, la hidrólisis puede
ser realizada bajo condiciones alcalinas y cuando R^{1} es
tert-butilo, la hidrólisis puede llevarse a cabo
usando ácido
trifluoroacético.
En otra forma de realización preferida de la
invención, el grupo acilo que debe ser introducido en el grupo
\varepsilon-amino de un residuo Lys es un grupo de
la fórmula general (IV):
(IV)litocoloil-NHCH(COOR^{2})CH_{2}CH_{2}CO
donde R^{2} es hidrógeno o un
grupo que puede ser cambiado con hidrógeno después de que la
acilación haya sido realizada, por ejemplo metilo, etilo o
tert-butilo. Cuando la acilación ha sido realizada y
R^{2} es diferente de hidrógeno, el grupo éster del cual R^{2}
es una parte puede ser hidrolizado para dar el ácido libre
correspondiente y el alcohol R^{2}OH por métodos conocidos per
se. Así, cuando R^{2} es metilo o etilo, la hidrólisis puede ser
realizada bajo condiciones alcalinas y cuando R^{2} es
tert-butilo, la hidrólisis puede realizarse usando
ácido
trifluoroacético.
La acilación de la insulina original se realiza
usando un agente acilante que es una amida activada, más
particularmente un azólido del ácido correspondiente al grupo acilo
a introducir. Estos azólidos (1-acilazolos) pueden
ser preparados según métodos conocidos, ver por ejemplo Staab HA
Angew. Chem. 74 (1962) 407-423. Ejemplos de
azoles que pueden ser usados en la preparación de los agentes
acilantes de esta invención son pirazol, imidazol, 1,2,3 triazol,
1,2,4-triazol, tetrazol, feniltetrazol y -donde sea
posible- los compuestos con benzanol correspondientes p. ej. 1
H-indazol, bencimidazol y benzotriazol. Azotes
preferidos para la preparación del agente acilante son
1,2,4-triazol, benzotriazol y benzotriazoles
sustituidos. Opcionalmente, los azoles mencionados pueden ser
sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que
comprende alquilo (C_{1}-C_{5}, ramificado o de
cadena recta, en particular metilo, etilo, propilo e isopropilo),
halógeno (p. ej. fluoro, cloro y bromo, en particular fluoro y
cloro), nitro, alcoxi (C_{1}-C_{5}, ramificado o
de cadena recta, en particular metoxi, etoxi, propoxi y
isopropoxi), amino dialquilado (C_{1}-C_{5},
ramificado o de cadena recta), ácido sulfónico, carboxi y
alcoxicarbonilo (C_{1}-C_{5}, ramificado o de
cadena recta). Un grupo preferido de agentes acilantes son
1-acil benzotriazoles y un agente acilante
preferido es 1-tetradecanoil benzotriazol. Otros
1-acilo benzotriazoles preferidos son aquellos que
derivan de benzotriazoles mono- o disustituidos, p. ej.
benzotriazoles 5-sustituidos o
6-sustituidos o 5,6-disubstituídos
como 5-metilbenzotriazol,
5-clorobenzotriazol,
6-clorobenzotriazol,
5-nitrobenzotriazol,
5,6-dimetilbenzotriazol y
5,6-diclorobenzotriazol.
La acilación se realiza en un solvente polar que
puede ser una mezcla de agua y al menos un solvente orgánico
mezclable en agua. Ejemplos de disolventes mezclables en agua que
pueden ser útiles bien solos o mezclados son alcoholes inferiores,
p. ej. metanol, etanol y 2-propanol, cetonas de
cadena lineal inferior y ramificada, p. ej. acetona, éteres
cíclicos, p. ej. tetrahidrofurano y dioxano, amidas de cadena
lineal y cíclica, p. ej. dimetilformamida, dimetilacetamida y
N-metil-2-pirrolidona,
nitrilos p. ej. acetonitrilo y sulfóxidos, p. ej. dimetilsulfóxido.
Muy preferidos entre los disolventes orgánicos mezclables en agua
son
N-metil-2-pirrolidona,
dimetilformamida, dimetilacetamida y dimetilsulfóxido.
La cantidad de agua en el medio de reacción puede
variar dentro de una gama amplia de modo que el medio en general
contiene de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 99% p/p
de agua. Cuando
N-metil-2-pirrolidona
se usa como solvente orgánico mezclable en agua la cantidad de agua
del medio es preferiblemente de aproximadamente el 1% p/p a
aproximadamente el 90% p/p, más preferiblemente de aproximadamente
el 10% p/p o aproximadamente el 20% p/p a aproximadamente el 75%
p/p.
La acilación se realiza ante un exceso de un
medio fuerte o base fuerte que puede ser bien una base inorgánica o
una base orgánica. Ejemplos de bases inorgánicas son hidróxido
sódico, hidróxido potásico, carbonato sódico y carbonato potásico.
Ejemplos de bases orgánicas son aminas terciarias, p. ej.
etildiisopropilamina, trietilamina y dietiletanolamina.
Preferiblemente, se usa una base orgánica. La cantidad de base
usada es generalmente más de 5 mol por mol de insulina original, p.
ej. 10 a 30 mol o incluso 100 mol de base por mol de insulina
original.
Básicamente, el límite inferior de la temperatura
a la que la acilación puede llevarse a cabo está determinada por el
punto de congelación del medio mientras que el límite superior está
determinado por la temperatura en la que la insulina original o la
insulina acilada será deteriorada. Esto nuevamente dependerá i.a.
de la composición del medio. Así, mientras que puede ser posible
llevar a cabo la reacción a temperaturas entre -30°C y 70°C es
normalmente más conveniente llevar a cabo la reacción a una
temperatura entre aproximadamente -5°C y aproximadamente
30°C.
30°C.
El aislamiento y purificación de los productos
preparados por el método de la presente invención pueden realizarse
por métodos conocidos per se, incluyendo la filtración en
gel y cromatografía.
La presente invención se ilustra con más detalle
mediante los ejemplos siguientes que, no obstante, no deben ser
construidos como limitadores del objetivo de protección. Las
características descritas en la descripción precedente y en los
ejemplos siguientes pueden, bien separadamente o en cualquier forma
combinada, ser un material para realizar la invención de varias
maneras.
Las mezclas de reacción -excepto en el ejemplo 4-
fueron analizadas por RP-HPLC según se describe
abajo usando un aparato Merck/Hitachi equipado con un Diode Array
Detector.
Columna: 4.0 X 125 mM, accionada a 60°.
Material de columna: dimetil butil dimetil silil
sustituido 100 \ring{A}, 5 mM de sílice.
Sistema gradiente eluyente:
Eluyente A: acetonitrilo (7.8%) en agua que
contiene sulfato amónico (2.0%) a un pH 2.5.
Eluyente B: acetonitrilo (53.9%) en agua.
Velocidad de flujo: 1.0 ml/min.
Detección: Absorción de UV a 280 nm.
Duración del ciclo: 65 minutos.
Los rendimientos expuestos están basados en el
área de los valores máximos en los cromatogramas.
La identidad de las insulinas aciladas fue
determinada por su duración de retención en RP-HPLC
y por aislamiento y espectrometría de masas/cartografía peptídica
que se realizó en los productos acilados 1) sin pretratamiento, 2)
después del pre-tratamiento con ditiotreitol para
reducir los enlaces de disulfuro y 3) después del pretratamiento
con ditiotreitol y proteasa V8 de Staphylococcus aureus para
la disociación de la cadena-B entre la posición 21
y la posición 22.
Benzotriazol (59.6 g, 0.50 mol) fue disuelto en
tert-butil metil éter (950 ml) a 20° y se añadió
trietilamina (50.6 g, 0.50 mol). Se añadió cloruro de
tetradecanoilo (125.0 g, 0.51 mol) en un periodo de 30 minutos,
manteniéndose la temperatura a 20-30°C para su
enfriamiento. El precipitado resultante fue extraído por
filtración, y el filtrado concentrado por evaporación con presión
reducida a 60°C. El residuo fue disuelto en acetona (375 ml) a 60°C.
Tras el enfriamiento a 0°C, los cristales resultantes fueron
aislados por filtración, lavados con acetona (120 ml) y secados a
peso constante con presión reducida a 20°C.
Producción: 142.3 g (86%) de
1-tetradecanoilbenzotriazol blanco cristalino,
fusión a 58.0°C (valor máximo) determinado por Calorimetría
Diferencial de Barrido (DSC).
Bajo condiciones de reacción similares, los
triazoles acilados siguientes fueron también preparados:
1-tetradecanoil-1,2,4-triazol,
DSC: 59.7°C (recrist. de tetrahidrofurano),
5-metil-1-tetradecanoilbenzotriazol,
DSC: 69.5°C (recrist. de 2-propanol),
5-cloro-1-tetradecanoilbenzotriazol
(datos de RMN parecen indicar que el producto también contenía
algún
6-cloro-1-tetradecanoilbenzotriazol),
DSC: 52.1°C (recrist. de 2-propanol),
5-nitro-1-tetradecanoilbenzotriazol,
DSC: 117.5°C (recrist. de acetona),
5,6-dichloro-1-tetradecanoilbenzotriazol,
DSC: 60.6°C (recrist. de tetrahidrofurano),
5,6-dimetil-1-tetradecanoilbenzotriazol,
DSC: 61.6°C (recrist. de acetona),
1-dodecanoilbenzotriazol, DSC:
43.9°C (recrist. de n-heptano) y
1-hexadecanoilbenzotriazol, DSC
62.4°C (recrist. de acetato de tert-butilo).
Una solución de ácido eicosanodioico (3.43 g,
10.0 mmol), diciclohexilcarbodimida (2.06 g, 10.0 mmol),
benzotriazol (1.19 g, 10.0 mmol) e hidrocloruro
dimetilamino-piridina en tetrahidrofurano anhídrico
(200 ml) fue agitada durante dos días a temperatura ambiente. La
suspensión resultante fue filtrada, y el filtrado concentrado por
evaporación con presión reducida. El residuo fue suspendido en
diclorometano (100 ml), y el material no disuelto fue aislado por
filtración. La torta de filtro seca (2.0 g) fue recristalizada a
partir de acetona (200 ml) dando 0.70 g (16%) de
1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol
cristalino blanco, fusión a 111.9°C (valor máximo de DSC).
Bajo condiciones de reacción similares a las del
ejemplo 2, pero usando ácido octadecanodioico en vez de ácido
eicosanodioico, se preparó
1-(17-carboxiheptadecanoil)-benzotriazol.
El compuesto tiene un punto de fusión de 105.2°C (valor máximo de
DSC).
Precursor de insulina de cadena única de la
fórmula
B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)
donde B(1-29) designa la secuencia de
aminoácidos de la posición 1 a la posición 29 de la
cadena-B de insulina humana y
A(1-21) designa la secuencia de aminoácidos
de la posición 1 a la posición 21 de la cadena-A de
insulina humana se obtuvo según se describe en EP 163.529.
5 g de torta de sal mojada que contiene
aproximadamente 1.5 g del precursor de cadena única mencionado
arriba fueron disueltos en 25 mM de hidrogenocarbonato de sodio
(350 ml) a temperatura ambiente. El valor de pH de la solución fue
ajustado a 9.0 por adición de 1.0 M de hidróxido sódico (1 ml). Se
añadió proteasa 1 de Achromobacter lyticus, inmovilizada en
Sefarosa activada de N-hidroxisuccinimida (10 ml de
gel con una densidad de enzima de aproximadamente 1.0 mg/I). La
mezcla reactiva fue agitada durante 23 horas a temperatura ambiente
y la enzima inmovilizada fue luego eliminada por filtración. El
filtrado fue analizado por RP-HPLC según se
describe
abajo.
abajo.
En base al área de los valores máximos en el
cromatograma, la cantidad relativa de insulina humana
des(B30) encontrada en la mezcla reactiva fue del 95.2%
(tiempo de retención: 27.7 minutos) y la cantidad relativa de
material precursor fue del 0.1% (tiempo de retención: 15.0
minutos).
La mezcla reactiva fue analizada por
RP-HPLC en un equipo proporcionado por Waters.
Columna: 4.0 x 250 mM, accionado a 50°.
Material de columna: YMC 120 A, 5 my OdDMe gel de
sílice sililado.
Sistema gradiente eluyente:
Eluyente A: 0.20 M de sulfato de sodio, 0.04 M de
ácido fosfórico en acetonitrilo (10%) en agua, pH 2.3.
Eluyente B: acetonitrilo (50%) en agua.
Tiempo transcurrido: 60 minutos
Velocidad de flujo: 1.0 ml/min
Detección: Absorción de UV a 214 nm
gradiente: 00.00 minutos 64% A + 36% B
\hskip1.4cm40.00 minutos 40% A + 60% B
\hskip1.4cm41.00 minutos 64% A + 36% B
Se disolvió Insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y agua (3.5 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se
añadió trietilamina (0.40 ml).
1-Tetradecanoilbenzotriazol (1.50 ml de un 0.10 M
solución en
N-metil-2-pirrolidona)
fue añadido en un periodo de 30 minutos. La mezcla reactiva turbia
fue agitada a 0°C durante 30 minutos, luego a 20°C durante otros 30
minutos.
La mezcla reactiva fue analizada por
RP-HPLC con los resultados siguientes:
| Tiempo de retención, min | Compuesto | % de producción |
| 11.00 | material precursor | 7.3 |
| 25.20 | insulina humana N^{A1}-tetradecanoil des(B30) | 1.8 |
| 29.66 | insulina humana NE^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30) | 71.0 |
| 49.85 | insulina humana diacilada des(B30) | 7.7 |
| >50 | total de productos desconocidos | 10.4 |
Se disolvió nsulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 66% \sim 0.58 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.5 mi) y agua (1.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml).
En una parte se añadió
1-Tetradecanoil-1,2,4-triazol
(1.0 ml de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La mezcla reactiva homogénea fue agitada a 20°C durante 10 minutos
y luego analizada por RP-HPLC con los resultados
siguientes:
\newpage
| Tiempo de retención, min | Compuesto | % de producción |
| 11.43 | material precursor | 30.0 |
| 25.89 | insulina humana N^{AT}-tetradecanoil des(B30) | 8.4 |
| 30.37 | insulina humana NE^{\varepsilon B29}-tetradecanoil des(B30) | 43.8 |
| 50.20 | insulina humana diacilada des(B30) | 8.7 |
| >50.20 | total de productos desconocidos | 3.8 |
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en dimetil
sulfóxido (7.0 ml) y agua (3.5 ml) a 20°C y se añadió trietilamina
(0.40 ml). Se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol
(1.80 ml de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
durante un periodo de 2 minutos. La mezcla reactiva turbia fue
agitada a 20°C durante 90 minutos. La mezcla reactiva homogénea
resultante fue analizada por RP-HPLC mostrando una
producción del 59.4% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-tetradecanoil des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en dimetilformamida
(7.0 ml) y 6M de úrea acuosa (2.0 ml) a 20°C. La solución fue
enfriada a 0°C, y se añadió trietilamina (0.40 ml). Se añadió en
una parte 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.10 ml de
una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona.
La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 60 minutos. La
mezcla reactiva resultante ligeramente turbia fue analizada por
RP-HPLC mostrando una producción del 74.2% de
insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil
des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se
añadió trietilamina (0.20 ml). En una parte se añadió
1-tetradecanoilbenzotriazol (1.00 ml de una solución
0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 65 minutos. La
mezcla reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC
mostrando una producción del 68.3% de insulina humana
N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil
des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y 3M de úrea acuosa (3.5 ml) a 20°C. Se añadió
etildiisopropilamina (0.50 ml). Se añadió
1-tetradecanoilbenzotriazol (1.50 mI de una solución
0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
durante un periodo de 2 minutos. La mezcla reactiva turbia fue
agitada a 20°C durante 90 minutos. La mezcla reactiva resultante fue
analizada por RP-HPLC mostrando una producción del
61.9% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-tetradecanoil des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0
g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(20.0 ml) a 20°C. Tras el enfriamiento a 0°C, se añadió
trietilamina (1.50 ml).
5-nitro-1-tetradecanoilbenzotriazol
(3.20 ml de una solución de 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
fue añadida en un periodo de 10 minutos. La mezcla reactiva fue
agitada a 0°C durante 30 minutos. La mezcla reactiva resultante fue
analizada por RP-HPLC mostrando una producción del
58.3% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-Tetradecanoii des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0
g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(20.0 ml) a 20°C. Tras el enfriamiento del agua a 0°C (7.5 ml) y se
añadió trietilamina (1.50 ml). Se añadió
5-Cloro-1 tetradecanoilbenzotriazol
(4.5 ml de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
durante un periodo de 15 minutos. La mezcla reactiva turbia fue
agitada a 0°C durante 3 horas. La mezcla reactiva resultante fue
analizada por RP-HPLC mostrando una producción del
77.7% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-tetradecanoil des(B30).
Se disolvió nsulina humana (50 mg, 0.009 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(0.7 ml) y agua (0.35 ml) a 0°C. Se añadió trietilamina (0.040 ml).
En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol
(0.150 mi de una solución 0.10 M en
N-metil-2 pirrolidona). La mezcla
reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 150 minutos. La mezcla
reactiva homogénea resultante fue analizada por
RP-HPLC mostrando una producción del 64.0% de
insulina humana N^{\varepsilon B29}-tetradecanoil
(tiempo de retención: 27.75 minutos).
Se disolvió insulina porcina (50 mg, 0.009 mmol)
en
N-metil-2-pirrolidona
(0.7 ml) y agua (0.35 ml) a 0°C. Se añadió trietilamina (0.040 ml).
En una parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol
(0.150 mI de una solución 0.10 M en
N-metil-2 pirrolidona). La mezcla
reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 155 minutos. La mezcla
reactiva homogénea resultante fue analizada por
RP-HPLC mostrando una producción del 62.5% de
insulina porcina N^{\varepsilon
B29}-Tetradecanoil (tiempo de retención: 28.99
minutos).
Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0
g, ensayo: aproximadamente 34%\sim0.30 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(30.0 ml) y agua (6.9 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (1.10 ml).
En una parte se añadió
1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol (5.0
mI de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La mezcla reactiva fue agitada a 20°C durante 4.5 horas. La mezcla
reactiva resultante fue analizada por RP-HPLC
mostrando una producción del 30.0% de insulina humana
N^{\varepsilon B29}-(19-carboxinonadecanoil)
des(B30) (tiempo de retención: 32.19 minutos). La cantidad de
material precursor fue del 57.3%.
Bajo condiciones de reacción similares a las del
ejemplo 15, pero usando
1-(17-carboxiheptadecanoil)benzotriazol en
vez de
1-(19-carboxinonadecanoil)benzotriazol, la
mezcla reactiva resultante fue analizada por
RP-HPLC mostrando una producción del 24.9% de
insulina humana N^{\varepsilon
B29}-(17-carboxiheptadecanoil) des(B30)
(tiempo de retención: 26.41 minutos). La cantidad de material
precursor fue del 68.3%.
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo: aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y 3M de úrea acuosa (3.5 ml) a 20°C. Se añadió
trietilamina (0.40 ml), y la solución fue enfriada a -13°C. En una
parte se añadió 1-tetradecanoilbenzotriazol (1.80 ml
de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La suspensión resultante fue agitada a -13°C durante 47 horas. La
mezcla reactiva fue analizada por RP-HPLC mostrando
una producción del 65.2% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-tetradecanoil des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a
0°C.
Se añadió trietilamina (0.40 ml). En una parte
se añadió
5-metil-1-tetradecanoilbenzotriazol
(1.00 mI de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La mezcla reactiva turbia fue agitada a 0°C durante 2 horas. La
solución resultante fue analizada por RP-HPLC
mostrando una producción del 66.8% de insulina humana
N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil
des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.50
g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.070 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(7.0 ml) y agua (2.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (0.40 ml).
En una parte se añadió
5,6-Dicloro-1-tetradecanoilbenzotriazol
(1.10 mI de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona).
La mezcla reactiva turbia fue agitada a 20°C durante 1 hora. La
solución resultante fue analizada por RP-HPLC
mostrando una producción del 68.8% de insulina humana
N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil
des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (5.0
g, ensayo aproximadamente 30%\sim0.26 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(30.0 ml) y agua (6.0 ml) a 20°C. Se añadió trietilamina (1.08 ml).
Se añadió
5,6-Dimetil-1-tetradecanoilbenzotriazol
(4.00 ml de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
durante un periodo de 15 minutos. La mezcla reactiva turbia fue
agitada a 20°C durante 1 hora. La solución resultante fue analizada
por RP-HPLC mostrando una producción del 54.6% de
insulina humana N^{\varepsilon B29}-Tetradecanoil
des(B30).
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.10
g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.014 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(1.4 ml) y agua (0.4 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se
añadió trietilamina (0.08 ml). Se añadió
1-dodecanoilbenzotriazol (0.20 ml de una solución
0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
en un periodo de 3 minutos. La mezcla reactiva turbia fue agitada a
0°C durante 40 minutos. La solución resultante fue analizada por
RP-HPLC mostrando una producción del 58.9% de
insulina humana N^{\varepsilon B29}-dodecanoil
des(B30) (tiempo de retención: 23.17 minutos), y del 23.7%
de material precursor.
Se disolvió insulina humana des(B30) (0.10
g, ensayo aproximadamente 80%\sim0.014 mmol) en
N-metil-2-pirrolidona
(1.4 ml) y agua (0.4 ml) a 20°C. La solución fue enfriada a 0°C. Se
añadió trietilamina (0.08 ml). Se añadió 1 hexadecanoilbenzotriazol
(0.20 ml de una solución 0.10 M en
N-metil-2-pirrolidona)
durante un periodo de 3 minutos. La mezcla reactiva turbia fue
agitada a 0°C durante 60 minutos. La mezcla reactiva todavía turbia
fue analizada por RP-HPLC mostrando una producción
del 32.6% de insulina humana N^{\varepsilon
B29}-hexadecanoil des(B30) (tiempo de
retención: 33.41 minutos), y del 59.2% de material precursor.
Claims (27)
1. Un método para acilar selectivamente una
insulina, un análogo de insulina o un precursor de ésta que tiene
un grupo \alpha-amino libre de un residuo Lys
contenido en él y al menos un grupo \alpha-amino
libre, dicho método comprende la reacción del grupo
\varepsilon-amino con una amida activada en un
solvente polar en presencia de una base, la amida activada siendo
sea la benzotriazolida o una benzotriazolida sustituida del ácido
correspondiente al grupo acilo a introducir.
2. El método según la reivindicación 1, donde la
benzotriazolida es 1-tetradecanoil
benzotriazol.
3. El método según la reivindicación 1, donde la
benzotriazolida está derivada de un benzotriazol mono- o
disustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que
comprende C_{1}-C_{4} alquilo, halógeno y
nitro.
4. El método según la reivindicación 1, donde la
benzotriazolida está derivada del grupo que comprende
5-metilbenzotriazol, 5 clorobenzotriazol,
5-nitrobenzotriazol,
5,6-dimetilbenzotriazol y
5,6-diclorobenzotriazol.
5. El método según la reivindicación 1 donde la
insulina es insulina humana.
6. El método según la reivindicación 1 donde la
insulina es insulina porcina.
7. El método según la reivindicación 1 donde la
insulina original es un análogo de insulina.
8. El método según la reivindicación 7 donde la
insulina original es insulina humana des(B30).
9. El método según la reivindicación 7 donde la
insulina tiene Lys en la posición 828 y Pro en la posición B29.
10. El método según la reivindicación 7 donde la
insulina es un análogo de insulina en el que Phe^{81} ha sido
eliminado.
11. El método según la reivindicación 7 donde la
insulina es un análogo de insulina en el que la
cadena-A y/o la cadena-B tiene una
extensión N-terminal.
12. El método según la reivindicación 7 donde la
insulina es un análogo de insulina en el que la
cadena-A y/o la cadena-B tiene una
extensión C-terminal.
13. El método de según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el grupo acilo a introducir es
el grupo acilo de un ácido monocarboxílico de la fórmula
general
(I)M-COOH
donde M es un grupo hidrocarburo de
cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más
grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se
compone de un átomo de oxígeno y un átomo de
azufre.
14. El método según la reivindicación 13 donde el
grupo acilo a introducir es el grupo acilo de un ácido
monocarboxílico alifático de cadena recta que tiene de 6 a 24
átomos de carbono.
15. El método según la reivindicación 13 donde el
grupo acilo a introducir está seleccionado del grupo que comprende
CH_{3}(CH_{2})_{8}CO,
CH_{3}(CH_{2})_{10}CO,
CH_{3}(CH_{2})_{12}CO,
CH_{2}(CH_{2})_{14}CO ,
CH_{3}(CH_{2})_{16}CO,
CH_{3}(CH_{2})_{19}CO,
CH_{3}
(CH_{2})_{20} CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.
(CH_{2})_{20} CO y CH_{3}(CH_{2})_{22}CO.
16. El método según la reivindicación 15 donde el
grupo acilo a introducir es
CH_{2}(CH_{2})_{12}CO.
17. El método según cualquier las
reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a
introducir es uno de los grupos acilo de un ácido dicarboxílico de
la fórmula general:
(II)HOOC-D-COOH
donde D es un grupo hidrocarburo de
cadena larga que puede opcionalmente ser interrumpido por uno o más
grupos cada uno independientemente seleccionado del grupo que se
compone de un átomo de oxígeno y un átomo de
azufre.
18. El método según la reivindicación 17 donde el
grupo acilo a introducir es uno de los grupos acilo de un ácido
dicarboxílico de la fórmula general (II) donde D es un grupo
hidrocarburo alifático de cadena recta, bivalente que tiene de 6 a
22 átomos de carbono.
19. El método según la reivindicación 17 donde el
grupo acilo a introducir está seleccionado del grupo que comprende
HOOC(CH_{2})_{4}CO,
HOOC(CH_{2})_{6}CO,
HOOC(CH_{2})_{8}CO,
HOOC(CH_{2})_{10}CO,
HOOC(CH_{2})_{12}CO, HOOC
(CH_{2})_{14}CO, HOOC(CH_{2})_{16}CO, HOOC(CH_{2})_{5}CO, HOOC(CH_{2})_{20}CO y HOOC(CH_{2})_{22}CO.
(CH_{2})_{14}CO, HOOC(CH_{2})_{16}CO, HOOC(CH_{2})_{5}CO, HOOC(CH_{2})_{20}CO y HOOC(CH_{2})_{22}CO.
20. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a
introducir es un grupo de la fórmula general (III):
(III)CH_{2}
(CH_{2})_{X}CONHCH(COOR^{1})CH_{2}CH_{2}CO
donde x es un número entero de 8 a
24 y R^{1} es hidrógeno o un grupo que puede ser cambiado con
hidrógeno cuando la acilación haya sido
realizada.
21. El método según la reivindicación 20 donde x
es 10, 12 ó 14.
22. El método según la reivindicación 20, donde
R^{1} es metilo, etilo o tert-butilo.
23. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-12 donde el grupo acilo a
introducir es un grupo de la fórmula general (IV):
(IV)litocoloil-NHCH(COOR^{2})CH_{2}CH_{2}CO
donde R^{2} es hidrógeno o un
grupo que puede ser cambiado con hidrógeno cuando la acilación haya
sido
realizada.
24. El método según la reivindicación 23 donde
R^{2} es metilo, etilo o tert-butilo.
25. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el solvente orgánico está
seleccionado del grupo que comprende
N-metil-2-pirrolidona,
dimetilformamida. dimetilacetamida y dimetilsulfóxido.
26. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el medio contiene de
aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 99% p/p de agua.
27. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el solvente es
N-metil-2-pirrolidona
que contiene de aproximadamente el 1% p/p a aproximadamente el 90%
p/p, preferiblemente de aproximadamente el 20% p/p a
aproximadamente el 75% p/p de agua.
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