PL210437B1 - Sposób wytwarzania związków insuliny - Google Patents
Sposób wytwarzania związków insulinyInfo
- Publication number
- PL210437B1 PL210437B1 PL369447A PL36944702A PL210437B1 PL 210437 B1 PL210437 B1 PL 210437B1 PL 369447 A PL369447 A PL 369447A PL 36944702 A PL36944702 A PL 36944702A PL 210437 B1 PL210437 B1 PL 210437B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- insulin
- amino acid
- peptide
- compound
- reaction
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 176
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 78
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 69
- -1 amino acid ester Chemical class 0.000 claims abstract description 49
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 41
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 38
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 32
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 31
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 31
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 18
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 16
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 15
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 claims description 12
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 claims description 12
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 9
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 6
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 claims description 4
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002068 insulin lispro Drugs 0.000 claims description 4
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 claims description 3
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 claims description 3
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 claims description 3
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 claims description 3
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 15
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 54
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 49
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 15
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 15
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 13
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 10
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 7
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 7
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- JNTDLWHHJMGLGD-UHNVWZDZSA-N ethyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O JNTDLWHHJMGLGD-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKTORXLUQLQJCM-UHFFFAOYSA-N 4-phosphonobutylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCCP(O)(O)=O JKTORXLUQLQJCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010065691 Biphasic Insulins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N Glu-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IRDASPPCLZIERZ-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N Gly-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N Lys-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N N,N‐diethylformamide Chemical compound CCN(CC)C=O SUAKHGWARZSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 1
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012431 aqueous reaction media Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- XEMXAGJRXIFZOQ-UHFFFAOYSA-N azanium;2,2-diethylbutanoate Chemical compound [NH4+].CCC(CC)(CC)C([O-])=O XEMXAGJRXIFZOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000004648 butanoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940075397 calomel Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical compound Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- NHTXRWUMLXSOGJ-UHFFFAOYSA-N n-hexylformamide Chemical compound CCCCCCNC=O NHTXRWUMLXSOGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 1
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011112 process operation Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związków insuliny. Jest to ulepszony sposób konwersji prekursora insuliny do związku insuliny, ewentualnie poprzez ester insuliny.
Stan techniki
Insulina jest hormonem trzustkowym zaangażowanym w regulację stężenia glukozy we krwi. Przykładowo, pacjentom cierpiącym na cukrzycę insulinozależną, w celu kontrolowania stężenia glukozy we krwi, podaje się insulinę ludzką, świńską i bydlęcą, analogi insuliny oraz insuliny mieszane.
Insulinę świńską i bydlęcą otrzymuje się zazwyczaj z trzustki. Insulinę ludzką można w sposób półsyntetyczny otrzymać z insuliny świńskiej. Alternatywnie, ludzką insulinę, jak również wiele analogów insuliny, można wytworzyć metodami inżynierii genetycznej. Przy zastosowaniu inżynierii genetycznej, w której można posługiwać się np. bakteriami lub drożdżami, wytwarza się prekursor insuliny który, następnie, poddaje się konwersji do pożądanego produktu. Konwersję tę można przeprowadzić różnymi sposobami.
Jedną możliwością jest tak zwana transpeptydyzacja, w której w tej samej mieszaninie reakcyjnej, w takich samych warunkach reakcji, zachodzi kolejno cięcie i sprzęganie peptydu, patrz, np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4343898 (Novo Industri).
Inną możliwością jest cięcie prekursora insuliny w pierwszym etapie, patrz, np. Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem. 359 (1978), 799, następnie oczyszczenie związku pośredniego, a potem przeprowadzenie pożądanego sprzęgania w innej mieszaninie reakcyjnej niż ta użyta w pierwszym etapie, patrz, np. Nature 280 (1979), 412.
Według europejskiego opisu patentowego nr 87238, reakcję transpeptydyzacji przeprowadza się w układzie rozpuszczalników zawierającym pomiędzy około 75% i 97% (objętościowo) co najmniej jednego nie wodnego, mieszającego się w środowisku reakcji rozpuszczalnika obejmującego co najmniej około 50% (objętościowo) butano-1,4-diolu.
Według opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4579820, proces transpeptydyzacji przeprowadza się stosując L-specyficzną karboksypeptydazę serynową, np. karboksypeptydazę Y.
Według opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4601979 (Nordisk Insulinlaboratorium), transpeptydyzację lub tylko sprzęganie peptydu przeprowadza się w wodnym środowisku reakcji w zasadzie pozbawionym rozpuszczalnika organicznego.
Według międzynarodowego zgłoszenia patentowego 83/00504 (Nordisk Insulinlaboratorium), produkt pochodzenia świńskiego poddano działaniu karboksypeptydazy A, uzyskany produkt insulinę des-alanino-B30 zawieszono w niższym alkoholu, a tę zawiesinę mieszano z roztworem estru L-treoniny oraz trypsyny. We wszystkich specyficznych przykładach, produkt insulinę des-alanino-B30 oczyszczono metodą liofilizacji lub wytrącania.
Celem wynalazku jest przezwyciężenie lub udoskonalenie co najmniej niektórych spośród niedogodności znanych ze stanu techniki. Zatem, nie wszystkie wymienione poniżej w sposób bardziej szczegółowy problemy można całkowicie przezwyciężyć lub udoskonalić.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku insuliny, polegający na tym, że a) w mieszaninie reakcyjnej zawierającej od 55 do 70% wody (wagowo) prekursor insuliny poddaje się cięciu enzymatycznemu, a następnie, bez izolowania związku pośredniego z mieszaniny reakcyjnej, b) ten związek pośredni sprzęga się ze związkiem nukleofilowym w mieszaninie reakcyjnej o zawartości wody w zakresie od 10% do 50% (wagowo), i c) jeśli to pożądane, usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające).
Korzystnie w etapie sprzęgania stosuje się enzym stosowany również w etapie cięcia.
Korzystnie przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania przeprowadza się cięcie od 25% do 95% prekursora insuliny do związku pośredniego.
Korzystnie jako enzym do cięcia enzymatycznego stosuje się trypsynę lub lizylo-specyficzną proteazę, zwłaszcza proteazę I z Achromobacter lyticus.
Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się ester aminokwasu.
Korzystniej jako związek nukleofilowy stosuje się ester treoniny.
Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się amid aminokwasu.
Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się peptyd.
Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się ester peptydu.
Korzystnie jako związek nukleofilowy stosuje się amid peptydu.
PL 210 437 B1
Korzystnie sposób ten obejmuje etap, w którym ze związku insuliny usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające).
Korzystnie sposobem tym otrzymuje się związek insuliny z treoniną w pozycji B30.
Korzystnie sposobem tym jako związek insuliny otrzymuje się insulinę ludzką, insulinę aspart, insulinę lispro, insulinę glargin lub insulinę detemir.
Definicje
Stosowany tu termin „aminokwas odnosi się do aminokwasów, które można zakodować przy zastosowaniu sekwencji nukleotydowych. Analogicznie, stosuje się to do terminu reszta aminokwasowa, który oznacza aminokwas z którego grupy karboksylowej usunięto grupę hydroksylową i/lub z grupy aminowej usunię to atom wodoru.
Podobnie, terminy peptyd i reszta peptydowa obejmują reszty aminokwasowe. Dogodnie, peptyd zawiera nie więcej niż 10 reszt aminokwasowych.
Stosowany tu termin „amid aminokwasu odnosi się do aminokwasu mającego ewentualnie podstawioną C-końcową grupę karboksyamidową.
Stosowany tu termin „amid peptydu odnosi się do peptydu mającego ewentualnie podstawioną C-końcową grupę karboksyamidową.
Stosowany tu termin „prekursor insuliny odnosi się do polipeptydu składającego się z dwóch łańcuchów peptydowych (odpowiadających łańcuchom A i B insuliny i poniżej wskazanych jako łańcuchy A i B), które, podobnie jak insulina, łączą się ze sobą poprzez dwa mostki disiarczkowe (między jedną resztą cysteinową (Cys) a drugą resztą cysteinową) pomiędzy dwoma łańcuchami peptydowymi i, przy tym, tak jak w insulinie, występuje mostek disiarczkowy pomiędzy jedną resztą cysteinową w ł a ń cuchu A a drugą resztą cysteinową w ł a ń cuchu A. W tym prekursorze insuliny w ł a ń cuchu B występuje, co najmniej, jedna reszta lizynowa lub argininowa. Ewentualnie, w tym prekursorze insuliny, łańcuchy A i B łączą się ze sobą poprzez trzeci łańcuch peptydowy (odpowiadający peptydowi łączącemu w insulinę) pomiędzy C-końcem łańcucha B i N-końcem łańcucha A. W przypadku gdy łańcuchy A i B łączą się ze sobą poprzez ten trzeci ł a ń cuch peptydowy, lizyna wystę puje na C-końcu tego trzeciego peptydu. Ewentualnie, w tym prekursorze insuliny, do N-końca łańcucha B może być przyłączony czwarty łańcuch peptydowy. W tym przypadku gdy czwarty łańcuch peptydowy łączy się z N-końcem łańcucha B, wówczas lizyna występuje na C-końcu tego czwartego łańcucha peptydowego.
Ponadto ten prekursor insuliny wykazuje identyczność reszt aminokwasowych co najmniej 80%, dogodnie co najmniej 85%, dogodniej co najmniej 90%, a zwłaszcza co najmniej 95%, z ludzką insuliną, z takim ograniczeniem, że w obliczeniach tych nie bierze się pod uwagę trzeciego i czwartego łańcucha peptydowego. W insulinie ludzkiej mostki disiarczkowe występują pomiędzy CysA6 i CysA11, pomiędzy CysA7 i CysB7 oraz pomiędzy CysA20 i CysB19, a w pozycji B29 występuje lizyna.
Stosowany tu termin „ester aminokwasu odnosi się do aminokwasu niosącego grupę zabezpieczającą C-końcową grupę karboksylową i, ewentualnie, grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową.
Stosowany tu termin „ester peptydu odnosi się do peptydu, w którym przynajmniej C-końcowa grupa karboksylowa niesie grupę zabezpieczającą grupę karboksylową. Ewentualnie, zabezpiecza się każdą grupę hydroksylową i ewentualnie, grupę ε-aminową każdej reszty lizynowej przeprowadza się w pochodną, dogodnie z zastosowaniem grupy hydrofobowej, np. grupy acylowej mającej co najmniej 10 atomów węgla. Ester peptydu dogodnie zawiera nie więcej niż 10 reszt aminokwasowych.
Stosowany tu termin „związek nukleofilowy odnosi się do estru aminokwasu, amidu aminokwasu, peptydu, estru peptydu i amidu peptydu. W każdym z tych estrów aminokwasów, amidów aminokwasów, peptydów, estrów peptydów i amidów peptydów, grupę aminową w każdej grupie lizynowej, przeprowadza się, ewentualnie, w pochodną, dogodnie z zastosowaniem grupy hydrofobowej, np. grupy acylowej mającej co najmniej 10 atomów węgla.
Stosowany tu termin „związek insuliny odnosi się do insuliny pochodzącej z dowolnego gatunku, takiej jak insulina świńska, insulina bydlęca i insulina ludzka, i ich soli, takich jak sole cynku oraz sole z protaminą. Ponadto, stosowany tu termin „związek insuliny odnosi się do związków, które można krótko określić jako „analogi insuliny. Stosowany tu termin analogi insuliny odnosi się do związków insuliny, w których jedną lub więcej reszt aminokwasowych zamieniono na inną resztę aminokwasową i/lub z których usunięto jedną lub więcej reszt aminokwasowych i/lub do których dodano jedną lub więcej reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że ten analog insuliny ma wystarczającą aktywność insuliny. Przykłady analogów insuliny opisano w następujących opisach patentowych i ich równoważnych opisach: opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5618913; europejski opis patentowy 254516; europejski opis patentowy 280534; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5750497; i opis pa4
PL 210 437 B1 tentowy St. Zjedn. Ameryki nr 6011007. Przykłady specyficznych analogów insuliny obejmują insulinę aspart (tj. insulina ludzka[AspB28]), insulinę lispro (tj. insulina ludzka[LysB28, ProB29]) insulinę glargin A21 B31 B32 (tj. insulina ludzka[GlyA21, ArgB31, ArgB32)]. Stosowany tu termin „analog insuliny obejmuje także związki, które można nazwać pochodnymi insuliny, tj. związki, które fachowiec w dziedzinie określiłby zazwyczaj jako pochodne insuliny, patrz ogólne podręczniki, jak np. insulina mająca podstawnik niewystępujący w macierzystej cząsteczce insuliny. Przykłady pochodnych insuliny obejmują insuliny lub analogi insuliny mające ewentualnie podstawioną grupę karboksyamidową. Termin analog insuliny obejmuje także związki, które można uznać zarówno za pochodną insuliny, jak i analog insuliny. Przykłady takich związków opisano w następujących opisach patentowych i ich opisach równoważnych: opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5750497 i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 6011007. Zatem, kolejnym przykładem specyficznego analogu insuliny jest insulina detemir (tj. insulina ludzka des-ThrB30 YLysB29tetradekanoil). Wytworzone związki insuliny według wynalazku mają dostatecznie dużą aktywność przeciwcukrzycową aby stosować je do leczenia cukrzycy. Aktywność przeciwcukrzycową można określić stosując tak zwany test z wykorzystaniem wolnych komórek tłuszczowych.
Stosowany tu termin „wartość pH odnosi się do wartości zmierzonej pehametrem poprzez zanurzenie kombinowanej elektrody kalomelowej i szklanej przyłączonej do pehametru bezpośrednio w roztworze, którego wartość pH ma być zmierzona. Pehametr kalibruje się stosując standardowy wodny bufor.
Krótki opis rysunków
Numer identyfikacyjny sekwencji: 1 oznacza grupę peptydową Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-;
Numer identyfikacyjny sekwencji: 2 oznacza grupę peptydową Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-; i
Numer identyfikacyjny sekwencji: 3 oznacza grupę peptydową Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związków insuliny. Te związki insuliny można stosować jako leki. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku wytwarza się związki insuliny mające treoninę (Thr) na C-końcu łańcucha B.
Każdy fachowiec w dziedzinie np. lekarz, jest w stanie określić, jakie dawki związków insuliny podawać pacjentowi cierpiącemu na cukrzycę oraz kiedy je podawać.
Substancją wyjściową w sposobie według wynalazku jest prekursor insuliny, który poddaje się zarówno reakcji cięcia, jak i sprzęgania peptydu w warunkach sprzyjających obu reakcjom, lecz w których nie zachodzi oddzielanie związku pośredniego. Innymi słowy, prekursor insuliny poddaje się reakcji cięcia, a uzyskany produkt, tj. związek pośredni, poddaje się reakcji sprzęgania. Warunki sprzyjające cięciu nie są identyczne z warunkami sprzyjającymi sprzęganiu peptydu. Zatem, w pierwszym etapie według wynalazku, tj. etapie cięcia lub reakcji cięcia, warunki reakcji w mieszaninie reakcyjnej dobiera się tak, aby sprzyjały cięciu peptydu, a w drugim etapie według wynalazku, tj. etapie sprzęgania lub reakcji sprzęgania, warunki reakcji w mieszaninie reakcyjnej zmienia się tak, aby sprzyjały sprzęganiu peptydu.
W jednym rozwiązaniu według wynalazku, w pierwszym etapie prekursor insuliny rozpuszcza się w środowisku wodnym, w przeważającej mierze, i dodaje enzym w celu cięcia. Ta mieszanina reakcyjna może być wolna lub w zasadzie wolna od rozpuszczalnika organicznego. Alternatywnie, mieszanina reakcyjna może zawierać pewną ilość rozpuszczalnika organicznego, który może zapewnić właściwą rozpuszczalność prekursora insuliny. Jednakże, pożądane jest aby nie stosować rozpuszczalnika organicznego w takiej ilości, która miałaby niepożądany wpływ na cięcie enzymatyczne. W pierwszym etapie sposobu wytwarzania według wynalazku, parametry reakcji, takie jak wartość pH, temperatura i czas, dobiera się tak, aby sprzyjały cięciu przy reszcie lizynowej (resztach lizynowych) lub reszcie argininowej (resztach argininowych).
W trakcie trwania reakcji cięcia w pewnym, pożądanym stopniu, związek nukleofilowy i rozpuszczalnik organiczny mieszają się z mieszaniną reakcyjną (bez uprzedniego oddzielenia związku pośredniego) tak, że zachodzi sprzęganie związku nukleofilowego z resztą lizynową lub argininową pożądanego związku pośredniego. W tym etapie, parametry reakcji dobiera się tak, aby sprzyjały reakcji sprzęgania. W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleofilowym jest ester aminokwasu, np. estry treoniny lub ester peptydu.
Następnie można, jeśli to pożądane, oddzielić od uzyskanego związku grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające).
W porównaniu ze znaną reakcją transpeptydyzacji, zaletą sposobu według wynalazku jest krótszy czas wszystkich reakcji przy tej samej ilości enzymu i podobnej lub większej wydajności. W poPL 210 437 B1 równaniu z reakcją w dwóch naczyniach z cięciem w środowisku wodnym, oddzielanie związku pośredniego i sprzęganie w mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody, zaletami tego sposobu wytwarzania według wynalazku jest krótszy czas wszystkich reakcji, zastosowanie mniejszej ilości enzymu oraz łatwiejszy przebieg procesu.
Szczegółowy opis wynalazku
Jak stwierdzono w zastrz. 1, najpierw zachodzi reakcja cięcia peptydu, a następnie zachodzi reakcja sprzęgania.
W skrócie, reakcję cięcia (tj. cięcie enzymatyczne) przeprowadza się w sposób następujący:
Cięcie enzymatyczne prekursora insuliny (tj. cięcie peptydu) zachodzi w mieszaninie reakcyjnej zawierającej co najmniej około 55%, dogodnie co najmniej około 60%, dogodniej co najmniej 70% wody (wagowo).
W zalecanym rozwią zaniu stężenie prekursora insuliny w mieszaninie reakcyjnej, w której zachodzi cięcie enzymatyczne wynosi co najmniej 2%, dogodnie w zakresie od około 5 do około 10% (wagowo/objętościowo).
Reakcję cięcia przeprowadza się w środowisku obojętnym lub alkalicznym, dogodnie o wartości pH w zakresie od około 6 do około 11, dogodniej w zakresie od około 8 do około 10.
W zalecanym rozwiązaniu ilości enzymu w porównaniu z ilością prekursora insuliny mieszczą się w zakresie od w przybliżeniu 0,05 do w przybliżeniu 5% (wagowo), dogodnie od w przybliżeniu 0,1 do w przybliżeniu 2%.
Enzym trypsynowy nie stanowi materiału do realizacji praktycznej wynalazku. Trypsyna jest dobrze scharakteryzowanym enzymem dostępnym w preparatach o dużym stopniu czystości, szczególnie pochodzenia bydlęcego lub świńskiego. Z mikroorganizmów można otrzymać proteazę I z Acromobacter lyticus (zwaną poniżej ALP). Ponadto, nie stanowi materiału do realizacji praktycznej wynalazku forma enzymu, czy jest to enzym natywny lub aktywny unieruchomiony enzym lub pochodna enzymu. Jeśli pożądane jest cięcie na C-końcu argininy, można stosować trypsynę, a jeśli pożądane jest cięcie na C-końcu lizyny, można stosować albo trypsynę albo ALP. Do cięcia na C-końcu lizyny zalecana jest ALP.
Jako przykłady aktywnych pochodnych enzymu można wymienić acetylowaną trypsynę, sukcynylowaną trypsynę, trypsynę potraktowaną aldehydem glutarowym oraz unieruchomioną trypsynę lub pochodne ALP.
Jeśli stosuje się unieruchomioną trypsynę lub ALP, zawiesza się ją w mieszaninie reakcyjnej lub można ją wprowadzić do kolumny.
Działanie enzymu zależy, w dużym stopniu, od oddziaływań z wodą i rozpuszczalnikiem, wartości pH oraz temperatury w jakiej przebiega reakcja. Zwiększając stężenie rozpuszczalnika organicznego w mieszaninie reakcyjnej i obniżając wartość pH do wartości w przybliżeniu obojętnej przesuwa się kierunek typowej reakcji enzymatycznej od cięcia do sprzęgania. Obniżając temperaturę zmniejsza się szybkość reakcji, lecz można także ograniczyć powstawanie produktu ubocznego oraz denaturację enzymu.
W zalecanym rozwiązaniu prekursor insuliny rozpuszcza się w ś rodowisku wodnym o stężeniu jonów octanowych w zakresie od około 5 mM do około 500 mM, dogodnie w zakresie od około 20 mM do około 200 mM. Przykładowo, można stosować octan sodu, potasu, amonu lub trietylooctan amonu.
W jednym rozwią zaniu prekursor insuliny (peptyd) moż na zilustrować posługują c się następującym wzorem ogólnym I:
R1—Cys—Zn—Cys—R2
I I
R3—Cys—Zm—Cys—R4 (I) w którym Zn i Zm, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera odpowiednio n i m reszt aminokwasowych, R1 oznacza resztę peptydową, przy czym ta reszta 2 peptydowa, ewentualnie, zawiera resztę lizynową lub argininową, R2 oznacza resztę aminokwasową 3 lub resztę peptydową, R3 oznacza resztę peptydową, przy czym ta reszta peptydowa, ewentualnie, zawiera resztę lizynową lub argininową, R4 oznacza resztę lizynową lub argininową lub resztę peptydową, przy czym ta reszta peptydowa zawiera resztę lizynową lub argininową, albo R1 i R4 razem oznaczają resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową, dwie linie pionowe wskazują
PL 210 437 B1 wiązania disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi i ponadto, występuje wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi występującymi w R1 i w Zn.
Zalecane reszty aminokwasowe występujące w prekursorze insuliny o wzorze I to takie, które można zakodować z zastosowaniem sekwencji nukleotydowych.
W zalecanym rozwiązaniu stosuje się prekursor insuliny, w którym liczba reszt aminokwasowych w R1 i R4 łącznie mieści się zakresie od około 8 do około 50. W innym zalecanym rozwiązaniu Zn zawiera sekwencję 12 reszt aminokwasowych. W innym zalecanym rozwiązaniu Zm zawiera sekwencję 11 reszt aminokwasowych. W innym zalecanym rozwiązaniu R2 zawiera 1 resztę aminokwasową, np. Asn lub Gly. W innym zalecanym rozwiązaniu R3 zawiera sekwencję 6 reszt aminokwasowych.
W zalecanym rozwią zaniu prekursorem insuliny jest prekursor o pojedynczym łańcuchu, tj. związek o wzorze I, w którym R1 i R4 razem oznaczają resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową. Zatem dogodnie prekursorem insuliny nie jest insulina ssaka, taka jak insulina świńska, insulina królicza, insulina psia lub insulina wielorybia.
W innym rozwią zaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach.
W innym rozwią zaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 z takim ograniczeniem, że resztą aminokwasową w pozycji B28 jest Asp.
W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach z takim ograniczeniem, ż e resztą aminokwasową w pozycji B28 jest Lys i resztą aminokwasową w pozycji B29 jest Pro.
W innym rozwiązaniu prekursor insuliny o wzorze I zawiera sekwencję takich samych reszt aminokwasowych w pozycjach A1 do A21 i w pozycjach B1 do B29 jakie występują w insulinie ludzkiej w takich samych pozycjach z takim ograniczeniem, ż e resztą aminokwasową w pozycji A21 jest Gly, a resztą aminokwasową zarówno w pozycji B31, jak i B32 jest Arg.
Przykłady specyficznych prekursorów insuliny, które można zastosować w sposobie wytwarzania według wynalazku obejmują ludzką proinsulinę; małpią proinsulinę; świńską proinsulinę [Ala31, Lys32]-des(33-63); świńską insulinę; ludzką proinsulinę [Asp28]-des(30-65) wydłużoną na N-końcu z zastosowaniem Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 1); i ludzką proinsulinę [Asp28,Met30,Trp31,Lys32]-des(33-65) wydłużoną na N-końcu z zastosowaniem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2).
Prekursory insuliny o wzorze I można wytworzyć jak opisano lub jak analogicznie opisano w mię dzynarodowych zgłoszeniach patentowych o numerach WO 01/49742, WO 01/49870, WO 01/079250 i WO 02/079254, zawartość których załącza się niniejszym na zasadzie odsyłacza.
Pożądany związek pośredni (tj. pożądany produkt cięcia) odpowiada prekursorowi insuliny, w którym co najmniej jedną resztę lizynową lub argininową odcięto z wytworzeniem odpowiednio grupy lizylowej lub arginylowej. Ponadto, w pożądanym związku pośrednim, łańcuchy A i B, które łączą się ze sobą poprzez dwa mostki disiarczkowe nie są połączone ze sobą poprzez łańcuch peptydowy pomiędzy C-końcem łańcucha B a N-końcem łańcucha A. W zalecanym rozwiązaniu liczba reszt aminokwasowych występujących w pożądanym związku pośrednim mieści się w zakresie od około 48 do około 52, dogodnie w zakresie od około 49 do około 51, nawet dogodniej 50. W innym zalecanym rozwiązaniu w pożądanym związku pośrednim występuje nie więcej niż 4, dogodnie nie więcej niż 3, dogodniej nie więcej niż 2, a zwłaszcza nie więcej niż 1 reszta aminokwasowa niewystępująca w odpowiedniej pozycji w insulinie ludzkiej.
W jednym rozwią zaniu pożądany związek poś redni (pożądany produkt cię cia) moż na zilustrować posługując się wzorem ogólnym II.
R'1—Cys—Zn—Cys—R'2
I I
R'3—Cys—Zm—Cys—R'4 (II) w którym Zn i Zm, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera n i m reszt aminokwasowych, odpowiednio, R'1 oznacza resztę peptydową, R'2 oznacza resztę aminokwasową lub resztę peptydową, R'3 oznacza resztę peptydową, R'4 oznacza resztę lizynową lub
PL 210 437 B1 argininową lub resztę peptydową zawierającą resztę lizynową lub argininową na C-końcu, dwie pionowe linie wskazują wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi i, ponadto występuje wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi występującymi w R'1 i w Zn.
W zalecanym rozwiązaniu R'1 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od A1 do A6 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte.
W innym rozwiązaniu R'2 oznacza reszty -Asn or -Gly.
W innym zalecanym rozwiązaniu R'3 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B1 do B6 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte.
W innym zalecanym rozwiązaniu R'4 oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B20 do B29 ludzkiej insuliny, z takim ograniczeniem, że w pozycji B28 występuje reszta Lys, przy czym w każdej z tych sekwencji, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową lub z każdej z tych sekwencji jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte, lub część z tych sekwencji pozbawiona jest na swoim C-końcu jednej lub więcej reszt aminokwasowych.
W innym zalecanym rozwiązaniu Zn oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od A8 do A19 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte.
W innym zalecanym rozwiązaniu Zm oznacza sekwencję reszt aminokwasowych od B8 do B18 ludzkiej insuliny, w której, ewentualnie, jedna lub dwie reszty aminokwasowe są wymienione na inną resztę aminokwasową, lub z której jedna lub dwie reszty aminokwasowe są usunięte.
Zarówno podczas reakcji cięcia, jak i reakcji sprzęgania, zakres temperatury przebiegu reakcji wynosi od punktu zamarzania mieszaniny reakcyjnej do około 50°C. Zalecany zakres temperatury wynosi od około 0°C do około 25°C.
W skrócie, reakcję sprzęgania przeprowadza się w sposób następujący:
Gdy co najmniej około 25%, dogodnie co najmniej 50%, dogodniej co najmniej 75%, w szczególności co najmniej 85%, a zwłaszcza co najmniej 95%, prekursora insuliny potnie się do pożądanego związku pośredniego, z jednej strony związek nukleofilowy, z drugiej strony rozpuszczalnik organiczny miesza się z mieszaniną reakcyjną, w której doszło do cięcia tak, że uzyskuje się warunki reakcji dogodne lub sprzyjające etapowi sprzęgania. Procent cięcia (konwersji) zależy od możliwej równowagi w mieszaninie reakcyjnej zastosowanej do cięcia. Zazwyczaj, od rozpoczęcia enzymatycznej reakcji cięcia aż do pewnego punktu czasowego wydajność otrzymywania pożądanego związku pośredniego, tj. pożądanego produktu cięcia, zwiększa się i osiąga stężenie maksymalne. Następnie stężenie pożądanego produktu cięcia może się zmniejszać.
W zalecanym rozwiązaniu z mieszaniny reakcyjnej przed zajściem reakcji sprzęgania nie usuwa się żadnych składników uzyskanych w wyniku reakcji cięcia. Prostym sposobem jest dodanie, po reakcji cięcia, związku nukleofilowego i wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego. W ten sposób, np. enzym zastosowany w etapie cięcia stosuje się także w etapie sprzęgania.
Sposób wytwarzania według wynalazku obejmuje także reakcje sprzęgania w mieszaninie reakcyjnej, która oprócz pożądanego związku pośredniego zawiera małą ilość częściowo pociętego prekursora insuliny i/lub nieprzereagowanego prekursora insuliny.
W innym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleofilowym jest amid aminokwasu lub amid peptydu, przy czym grupa karboksyamidowa nie jest podstawiona albo jest jednolub dwupodstawiona przez grupę alkilową o nie więcej niż 16 atomach węgla, przy czym grupa alkilowa (grupy alkilowe), razem z sąsiadującym atomem azotu, może tworzyć pierścień, albo grupa karboksyamidowa jest jedno- lub dwupodstawiona przez grupę arylową. Zalecane są podstawniki alifatyczne. Przykłady podstawionych grup karboksyamidowych obejmują N,N-dimetylokarboksyamid, N,N-dietylokarboksyamid i N-heksylokarboksyamid.
W korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleotydowym jest ester aminokwasu, w którym zabezpiecza się grupę karboksylową i ewentualnie zabezpiecza się każdą grupę hydroksylową. W następnym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku, związkiem nukleotydowym jest ester treoniny, w którym zabezpiecza się grupę karboksylową i, ewentualnie, zabezpiecza się grupę hydroksylową. Zatem, ester L-treoniny można zilustrować następującym wzorem ogólnym IIIa:
Thr(R5)-OR6 (IIIa)
PL 210 437 B1 w którym R6 oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową i R5 oznacza atom wodoru lub grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową. Dla większej jasności, ester treoniny można zilustrować posługując się wzorem ogólnym CH3-CH(OR5)-CH(NH2)COOR6, w którym R6 i R5 mają znaczenia wymienione powyżej.
Pewne związki nukleofilowe są znane, a inne związki nukleofilowe można wytworzyć analogicznie jak wytwarza się znane związki lub analogicznie według znanych metod.
Związki nukleofilowe można stosować w postaci wolnej zasady, albo jej rozpuszczalnych soli, takich jak chlorowodorki, octany, propioniany i maślany.
Na początku reakcji sprzęgania, pożądane jest aby w mieszaninie reakcyjnej występował znaczny nadmiar związku nukleofilowego, przy stosunku molowym między związkiem nukleofilowym a pożądanym związkiem pośrednim dogodnie przekraczającym około 5:1. Na początku reakcji sprzęgania stężenie związku nukleofilowego w mieszaninie reakcyjnej powinno dogodnie przekraczać 0,1 mola, przy czym górne stężenie ogranicza jego rozpuszczalność.
Istotnym aspektem realizacji praktycznej wynalazku jest osiągnięcie wydajności 60%, a temperatura w której przebiega reakcja, zawartość wody i wartość pH są ze sobą powiązane w opisanych zakresach.
Rozpuszczalniki organiczne odpowiednie do realizacji praktycznej wynalazku obejmują rozpuszczalniki polarne mieszające się z wodą, a dogodnie takie, które mogą zawierać pożądany związek pośredni w dużych stężeniach (np. o wzorze II) oraz związek nukleofilowy. Przykłady odpowiednich rozpuszczalników organicznych obejmują rozpuszczalniki aprotonowe, takie jak N,N-dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, N-metylopirolidon-2 i sulfotlenek dimetylu oraz rozpuszczalniki protonowe, takie jak kwas octowy, etanol, metanol, 2-propanol, 1-propanol, butanol i 1,4-butandiol. Jako rozpuszczalnik organiczny można także stosować dioksan, aceton, tetrahydrofuran, formamid i acetonitryl, a nawet, całkowicie lub częściowo, ester aminokwasu stosowany jako związek nukleofilowy. Własności rozpuszczalnika wpływają na układ jako całość, a oddziaływania odpowiednie dla jednego rozpuszczalnika dające duże wydajności nie muszą stosować się do innego rozpuszczalnika. Najlepsze wydajności otrzymano stosując rozpuszczalniki aprotonowe i są one najbardziej zalecane do realizacji praktycznej wynalazku.
Oczywiście, przy obliczaniu lub określaniu zawartości wody w mieszaninie reakcyjnej, związek nukleofilowy przyjmuje się za rozpuszczalnik organiczny.
Ewentualnie dodaje się kwas, taki jak kwas chlorowodorowy, kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy lub kwas masłowy, albo zasadę, taką jak pirydyna, TRIS, N-metylomorfolina, trietyloamina lub N-etylomorfolina. Dodaje się je do mieszaniny reakcyjnej w celu uzyskania odpowiedniej wartości pH. Chociaż w realizacji praktycznej wynalazku można stosować kwasy lub zasady mineralne, zalecane są kwasy i zasady organiczne, szczególnie te określone powyżej. Najbardziej zalecane są kwasy organiczne.
Na początku reakcji sprzęgania stosunek wagowy pomiędzy trypsyną lub ALP (obliczony dla trypsyny krystalicznej lub ALP lub ilość odpowiedniej pochodnej trypsyny lub ALP) a pożądanym związkiem pośrednim w mieszaninie reakcyjnej mieści się dogodnie w zakresie od około 1:1000 do około 1:10, dogodniej w zakresie od około 1:200 do około 1:50.
W pewnych przypadkach, enzym dodany w etapie cięcia wystarcza do przeprowadzenia reakcji sprzęgania i w tym przypadku, w trakcie etapu sprzęgania nie ma potrzeby dodawania kolejnej porcji enzymu. W innych przypadkach, w trakcie etapu sprzęgania może być pożądane dodanie dodatkowej porcji enzymu.
Ponieważ duże stężenia pożądanego związku pośredniego oraz związku nukleofilowego w roztworze zwiększają szybkość konwersji, wybór rozpuszczalnika ukierunkowany jest na te rozpuszczalniki, w których dobrze rozpuszczają się reagenty. Rozpuszczalność związku nukleofilowego jest szczególnie ważna, ponieważ reagent ten powinien występować w dużym stężeniu. Na początku reakcji sprzęgania stosunek molowy związku nukleofilowego do pożądanego związku pośredniego powinien dogodnie przekraczać 5:1, dogodniej przekraczać 50:1. Na początku reakcji sprzęgania stężenie związku nukleofilowego w mieszaninie reakcyjnej powinno dogodnie wynosić co najmniej 0,1 mola.
W zalecanym rozwiązaniu stosuje się związek nukleofilowy mający grupę zabezpieczającą grupę karboksylową (grupy zabezpieczające grupy karboksylowe), którą można usunąć z otrzymanego związku insuliny, w warunkach, które nie powodują istotnych nieodwracalnych zmian w cząsteczce insuliny. Jako przykłady takich grup zabezpieczających grupy karboksylowe można wymienić niższy alkil, np. metyl, etyl i tert-butyl, podstawione grupy benzylowe, takie jak p-metoksybenzyl, difenylomePL 210 437 B1 tyl i 2,4,6-trimetylobenzyl oraz grupy o wzorze ogólnym -CH2-CH2-SO2R7, w którym R7 oznacza niższy alkil, taki jak metyl, etyl, propyl i n-butyl.
Odpowiednie grupy zabezpieczające grupę hydroksylową obejmują te, które można usunąć w warunkach niepowodujących istotnej nieodwracalnej zmiany w cząsteczce insuliny. Jako przykład takiej grupy można wymienić tert-butyl.
Inne zazwyczaj stosowane grupy zabezpieczające opisał Wunch: Metoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), tom XV/1, pod redakcją Eugena Mullera, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.
W jednym rozwiązaniu sposób wytwarzania według niniejszego wynalazku doprowadzi do związku o wzorze ogólnym IV:
R'1—Cys—Zn—Cys—R'2
I I
R'3—Cys—Zm—Cys—R'4—R'6 (IV) w którym Zn i Zm, niezależnie od siebie, oznaczają dwie grupy peptydowe, przy czym każda zawiera odpowiednio n i m reszt aminokwasowych, R'1 oznacza resztę peptydową, a R'2 oznacza resztę aminokwasową lub resztę peptydową, R'3 oznacza resztę peptydową, R'4 ma znaczenie wymienione powyżej i R'6 oznacza aminokwas niosący grupę zabezpieczającą grupę karboksylową lub resztę peptydową, ewentualnie, niosący grupę zabezpieczającą grupę karboksylową.
Dowolną grupę zabezpieczającą grupę karboksylową (np. R6) i dowolną grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową (np. R5) występującą w związkach insuliny można usunąć stosując znane metody lub metody znane per se. W przypadku gdy grupa zabezpieczająca grupę karboksylową oznacza metyl, etyl lub grupę o wzorze ogólnym -CH2-CH2-SO2R7, w którym R7 ma znaczenie zdefiniowane powyżej, wspomnianą grupę zabezpieczającą można usunąć stosując łagodne warunki zasadowe w środowisku wodnym, dogodnie przy wartości pH w zakresie od około 8 do około 12, np. w około 9,5. Jako zasadę można stosować silne zasady, przykładowo trzeciorzędową aminę, np. trietyloaminę, wodorotlenki metali alkalicznych, takie jak wodorotlenek sodu lub wodorotlenki metali ziem alkalicznych, takie jak wodorotlenek wapnia lub magnezu. W przypadku gdy grupą zabezpieczającą grupę karboksylową jest tert-butyl, podstawiony benzyl, taki jak p-metoksybenzyl lub 2,4,6-trimetylobenzyl lub difenylometyl, wspomnianą grupę można usunąć metodą hydrolizy kwasowej, dogodnie stosując kwas trifluorooctowy. Kwas trifluorooctowy może być niewodny lub może zawierać pewną część wody lub może być rozcieńczony rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak dichlorometan. W przypadku gdy grupą zabezpieczającą grupę hydroksylową (np. R5) jest tert-butyl, wspomnianą grupę można usunąć metodą hydrolizy kwasowej, patrz powyżej.
Dogodnie wytworzone związki insuliny nie posiadają grupy zabezpieczającej grupę hydroksylową.
W zalecanym rozwiązaniu sposób wytwarzania prowadzi do konwersji prekursora insuliny (np. o wzorze I) do związku insuliny (np. wzór IV), posiadającego grupę zabezpieczającą grupę karboksylową na C-końcowej reszcie aminokwasowej w łańcuchu B, który następnie można odbezpieczyć uzyskując związek insuliny nieposiadający grupy zabezpieczającej grupę karboksylową.
Wybierając warunki reakcji według powyższych wskazówek i rozpatrując otrzymane w poniższych przykładach wyniki możliwe jest uzyskanie wydajności związku insuliny powyżej 60%, a nawet powyżej 80%, a w pewnych dogodnych warunkach powyżej 90%.
Stosując sposób wytwarzania według wynalazku można otrzymać związki insuliny o dopuszczalnej czystości, które można dodatkowo oczyścić, jeśli to pożądane, do celów terapeutycznych.
Dokładniej, insulinę aspart można wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny taki jak ludzka proinsulina[Asp28]-des(30-65) wydłużona na N-końcu Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 1) z zastosowaniem ALP i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak ester metylowy L-treoniny, a następnie przeprowadzając hydrolizę.
Insulinę lispro można wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny, taki jak insulina świńska z zastosowaniem trypsyny i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (numer identyfikacyjny sekwencji: 3).
Insulinę glargin można np. wytworzyć np. tnąc enzymatycznie prekursor insuliny, taki jak ludzka proinsulina [Gly86]-des(30-65) z zastosowaniem ALP i sprzęgając ze związkiem nukleofilowym, takim jak Thr-Arg-Arg-OMe, a następnie przeprowadzając hydrolizę.
PL 210 437 B1
Stosowane tu skróty są zgodne z zasadami zatwierdzonymi (1974) przez lUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, patrz Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature lUPAC-IUB, wydanie 2, Maryland 1975.
Stosowane tu słowo „obejmuje powinno być szeroko interpretowane w znaczeniu „obejmuje, „zawiera lub „w tym (patrz, wytyczne EPO C 4,13).
Następujące przykłady podano dla ilustracji, a nie ograniczenia wynalazku.
P r z y k ł a d 1
200 mg świńskiej proinsuliny[Ala31,Lys32]-des(33-63) zawieszono w 1,35 ml wody i wartość pH uregulowano do 9 stosując 10 μΐ trietyloaminy. Łagodnie mieszając dodano mieszaninę 375 μΐ N,N-dimetylo-acetamidu i 460 μl wody i do uzyskanego roztworu dodano 315 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu lizylo-specyficznej proteazy Achromobacter lyticus (EC 3.4.21.50) (wskazanej tu jako ALP). Wartość pH uregulowano do 9,8 stosując 20 μl trietyloaminy i roztwór reakcyjny pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze 23°C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,85 ml N,N-dimetyloacetamidu i wartość pH uregulowano do 6,5 dodając 450 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23°C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do uzyskania wartości pH < 3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu uregulowany do wartości pH 4 stwierdzono po łącznym czasie reakcji wynoszącym 5 godzin wydajność konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny 86%.
Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową:
100 mg świńskiej proinsuliny[Ala31,Lys32]-des(33-63) zawieszono w mieszaninie 887 μl wody i 175 nl N,N-dimetyloacetamidu. W 2,265 ml N,N-dimetyloacetamidu rozpuszczono 150 mg estru metylowyego L-treoniny i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość pH uregulowano do 6,5 stosując 340 μl kwasu octowego i dodano 158 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po upływie 5 godzin, stwierdzono 53% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny, a po upływie 24 godzin konwersja osiągnęła wartość maksymalną 87%.
Wyizolowany ester metylowy ludzkiej insuliny przekształcono do ludzkiej insuliny rozpuszczając w wodzie przy wartości pH 10 w stężeniu 10 mg/ml. Reakcję zakończono po upływie 24 godzin regulując wartość pH do 5,2 stosując 1 N kwas chlorowodorowy i wytrąconą insulinę ludzką wyizolowano poprzez odwirowanie i oczyszczono metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych.
Przy takim samym czasie reakcji, tj. 5 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku, w porównaniu z procesem znanym per se, zwiększono o 62%. Dwa procesy miały prawie taką samą wydajność, jeśli czas reakcji znanej per se konwersji jednoetapowej był prawie 5 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku.
P r z y k ł a d 2
200 mg insuliny świńskiej zawieszono w 1,37 ml wody i łagodnie mieszając dodano mieszaninę 294 nl N-metylo-2-pirolidonu i 326 μl wody. Wartość pH uregulowano do 9,0 stosując 10 μl 2 N wodorotlenku sodu i do uzyskanego roztworu dodano 315 μl 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Wartość pH uregulowano do 9,8 stosując 12 μl 2 N wodorotlenku sodu i roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23°C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,4 ml N-metylo-2-pirolidonu zakwaszono 500 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Powoli dodano roztwór insuliny i wartość pH uregulowano do 6,5 stosując 50 μl 2 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23°C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do wartości pH <3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 nm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu o wartości pH uregulowanej do 4 stwierdzono po łącznym czasie reakcji wynoszącym 8 godzin - 86% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny.
Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową:
100 mg świńskiej insuliny zawieszono w mieszaninie 848 nl wody i 147 nl N-metylo-2-pirolidonu. 150 mg estru metylowego L-treoniny rozpuszczono w 2,2 ml N-metylo-2-pirolidonu i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość pH uregulowano do 6,5 stosując 300 nl kwasu octowego i doPL 210 437 B1 dano 158 μΐ 5,4 mg/ml wodnego roztworu ALP. Roztwór reakcyjny pozostawiono w temperaturze 23°C i po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po 8 godzinach, stwierdzono 54% konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny i po 48 godzinach osiągnięto maksymalną wartość konwersji 86%.
Wyizolowany ester metylowy ludzkiej insuliny można przekształcić do insuliny ludzkiej metodą alkalicznej hydrolizy.
Przy takim samym czasie reakcji, tj. 8 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku zwiększono o 59%, w porównaniu z procesem znanym per se. Dwa procesy mają taką samą wydajność, jeśli czas reakcji konwersji jednoetapowej znanej per se jest 6 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku.
P r z y k ł a d 3
200 mg ludzkiej proinsuliny[Asp28]-des(30-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(numer identyfikacyjny sekwencji: 1), zawieszono w 1,35 ml wody. Łagodnie mieszając dodano mieszaninę 350 μl N,N-dimetyloformamidu i 425 μl wody i wartość pH uregulowano do 9 stosując 45 μl trietyloaminy. Do uzyskanego roztworu dodano 200 μl 8,5 mg/ml wodnego roztworu ALP i wartość pH uregulowano do 9,8 stosując 20 μl trietyloaminy. Roztwór reakcyjny pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze 23°C. Roztwór reakcyjny zakwaszono dodając 70 μl 4 N kwasu chlorowodorowego i ochłodzono w łaźni lodowej. Dodano roztwór 300 mg estru metylowego L-treoniny w 4,95 ml N,N-dimetyloformamidu i wartość pH uregulowano do 6,5 dodając 470 μl 4 N kwasu chlorowodorowego. Roztwór reakcyjny pozostawiono przez 4 godziny w temperaturze 23°C po czym reakcję zatrzymano dodając kwas chlorowodorowy do wartości pH <3. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μl kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem etanol-woda zawierającym 0,125 M siarczanu amonu o wartości pH uregulowanej do 4 po łącznym czasie reakcji wynoszącym 5 godzin stwierdzono wydajność konwersji do estru metylowego ludzkiej insuliny[AspB28] - 87%.
Dla porównania przeprowadzono konwersję jednoetapową:
mg ludzkiej proinsuliny[Asp28]-des(30-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(numer identyfikacyjny sekwencji: 1), zawieszono w mieszaninie 887 μl wody i 175 μl N,N-dimetyloformamidu. 150 mg estru metylowego L-treoniny rozpuszczono w 2,13 ml N,N-dimetyloformamidu i powoli dodano do oziębionej lodem mieszaniny. Wartość pH uregulowano do 6,5 stosując 250 μl kwasu octowego i dodano 118 μl 8,5 mg/ml wodnego roztworu ALP. Po reakcji przeprowadzono analizę RP-HPLC zakwaszonych próbek. Po upływie 5 godzin stwierdzono konwersję do estru metylowego ludzkiej insuliny[AspB28] 47%, a po upływie 24 godzin konwersja osiągnęła wartość maksymalną 81%.
Wyizolowany ester metylowy insuliny można przekształcić do insuliny ludzkiej[AspB28] metodą alkalicznej hydrolizy.
Przy takim samym czasie reakcji, tj. 5 godzin, wydajność przy zastosowaniu sposobu wytwarzania według wynalazku zwiększyła się prawie dwukrotnie, w porównaniu z procesem znanym per se. Porównywalne wydajności w dwóch procesach otrzymano, jeśli czas reakcji konwersji jednoetapowej znanej per se był prawie 5 razy dłuższy, w porównaniu z czasem reakcji dla sposobu wytwarzania według wynalazku.
P r z y k ł a d 4
30 31 32
1,5 g prekursora insuliny aspart, ludzkiej proinsuliny[Asp28,Met30,Trp31,Lys32]-des(33-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2), zawieszono w 3,5 g wody. Łagodnie mieszając i w temperaturze otoczenia, prekursor rozpuszczono dodając stopniowo 4 M wodorotlenek sodu do wartości pH 10,67. Dodano 3,7 g 45% (wagowo) roztworu etanolu w wodzie. Dodano 1,5 ml 5,8 mg/ml wodnego roztworu ALP i mieszaninę pozostawiono na 2 godziny do przereagowania. Wartość pH uregulowano do 4,7 dodając 4 N kwas chlorowodorowy. 2,025 g estru etylowego L-treoniny rozpuszczono w 16,2 ml etanolu i roztwór dodano przy maksymalnej temperaturze 15°C. Wartość pH uregulowano do 6,5 stosując 4 N kwas chlorowodorowy. Temperaturę uregulowano do temperatury otoczenia i mieszaninę reakcyjną pozostawiono w tej temperaturze na 20 godzin. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μl kolumny C18 wypełnionej krzemionką z eluentem acetonitryl-woda zawierającym 200 mM siarczanu sodu o wartości pH uregulowanej do 3,6, po czasie reakcji wynoszącym 1 godzinę stwierdzono wydajność konwersji do estru etylowego insuliny aspart 89,1% i po 20 godzinach stwierdzono wydajność konwersji 90,5%.
Wyizolowany ester etylowy insuliny aspart można przekształcić do insuliny aspart metodą alkalicznej hydrolizy.
PL 210 437 B1
P r z y k ł a d 5
30 31 32
10,9 g prekursora insuliny aspart, ludzkiej proinsuliny[Asp28,Met30,Trp31,Lys32]-des(33-65), wydłużonej na N-końcu peptydem Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys- (numer identyfikacyjny sekwencji: 2), zawieszono w 49,3 g wody. Łagodnie mieszając i w temperaturze otoczenia, prekursor rozpuszczono stopniowo dodając 37,6 g mieszaniny zawierającej 0,36 M wodorotlenek sodu, 0,27 M octan sodu i 36% N-metylo-2-pirolidon. Wartość pH uregulowano do 9,7 stosując 9,2 ml 0,5 M wodorotlenku sodu. Dodano 7,1 ml 7,1 mg/mL wodnego roztworu ALP i mieszaninę pozostawiono do przereagowania na 5 godzin. Utrzymywano stałą wartość pH 9,7, dodają c w trakcie reakcji wię cej 0,5 M wodorotlenku sodu. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 5°C i wartość pH uregulowano do 5,7 dodając 2,73 g 4 N kwasu chlorowodorowego. Dodano 14,02 g estru etylowego L-treoniny i wartość pH uregulowano do 6,0 stosując 4 N kwas chlorowodorowy. Dodano 344 g zimnego (4°C) N-metylo-2-pirolidonu. Temperaturę uregulowano do 22°C i wartość pH uregulowano do 6,5, stosując 4 N kwas chlorowodorowy.
Mieszaninę reakcyjną pozostawiono w tej temperaturze na 9 godzin. Stosując analizę HPLC w układzie faz odwróconych na 4 mm x 250 mm 5 μm kolumnie C18 wypełnionej krzemionką z eluentem acetonitryl-woda zawierającym 200 mM siarczanu sodu o wartości pH uregulowanej do 3,6, po łącznym czasie reakcji wynoszącym 14 godzin stwierdzono wydajność konwersji do estru etylowego insuliny aspart - 87,5%.
Wyizolowany ester etylowy insuliny aspart można przekształcić do insuliny aspart metodą alkalicznej hydrolizy.
<110> <120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Glu Glu 1 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Glu Glu 1 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Gly Phe
Lista sekwencji
Novo Nordisk A/S
Sposób wytwarzania związków insuliny
6325204-WO
Patent w wersji 3,1 1
PRT
Syntetyczny
Peptyd
Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lys 5
PRT
Syntetyczny
Peptyd
Gly Glu Pro Lys 5
PRT
Syntetyczny
Peptyd
Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 5
PL 210 437 B1
Claims (13)
1. Sposób wytwarzania związku insuliny, znamienny tym, że a) w mieszaninie reakcyjnej zawierającej od 55 do 70% wody (wagowo) prekursor insuliny poddaje się cięciu enzymatycznemu, a następnie, bez izolowania związku pośredniego z mieszaniny reakcyjnej, b) ten związek pośredni sprzęga się ze związkiem nukleofilowym w mieszaninie reakcyjnej o zawartości wody w zakresie od 10% do 50% (wagowo), i c) jeśli to pożądane, usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie sprzęgania stosuje się enzym stosowany również w etapie cięcia.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania przeprowadza się cięcie od 25% do 95% prekursora insuliny do związku pośredniego.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że jako enzym do cięcia enzymatycznego stosuje się trypsynę lub lizylo-specyficzną proteazę, zwłaszcza proteazę I z Achromobacter lyticus.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester aminokwasu.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester treoniny.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się amid aminokwasu.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się peptyd.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się ester peptydu.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako związek nukleofilowy stosuje się amid peptydu.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym ze związku insuliny usuwa się grupę zabezpieczającą (grupy zabezpieczające).
12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, znamienny tym, że otrzymuje się związek insuliny z treoniną w pozycji B30.
13. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, znamienny tym, że jako związek insuliny otrzymuje się insulinę ludzką, insulinę aspart, insulinę lispro, insulinę glargin lub insulinę detemir.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200101716 | 2001-11-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL369447A1 PL369447A1 (pl) | 2005-04-18 |
| PL210437B1 true PL210437B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=8160841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL369447A PL210437B1 (pl) | 2001-11-19 | 2002-11-15 | Sposób wytwarzania związków insuliny |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1448786B1 (pl) |
| JP (1) | JP4404631B2 (pl) |
| KR (1) | KR100925381B1 (pl) |
| CN (1) | CN100424179C (pl) |
| AT (1) | ATE464390T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002342597A1 (pl) |
| BR (1) | BR0213583A (pl) |
| CA (1) | CA2464616C (pl) |
| DE (1) | DE60236014D1 (pl) |
| ES (1) | ES2344448T3 (pl) |
| HU (1) | HU228934B1 (pl) |
| IL (2) | IL161358A0 (pl) |
| PL (1) | PL210437B1 (pl) |
| RU (1) | RU2376379C2 (pl) |
| WO (1) | WO2003044210A2 (pl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006031962A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Amidiertes Insulin Glargin |
| DE102006031955A1 (de) * | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende |
| TW200902708A (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
| EP3228320B1 (de) | 2008-10-17 | 2019-12-18 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Kombination von einem insulin und einem glp-1-agonisten |
| CN102471368A (zh) * | 2009-08-11 | 2012-05-23 | 拜康有限公司 | 色谱方法及其纯化的化合物 |
| AR080669A1 (es) | 2009-11-13 | 2012-05-02 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina |
| UY33025A (es) | 2009-11-13 | 2011-06-30 | Sanofi Aventis Deustschland Gmbh | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1 metionina |
| MX339614B (es) | 2010-08-30 | 2016-06-02 | Sanofi - Aventis Deutschland GmbH | Uso de ave0010 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| RU2650616C2 (ru) | 2011-08-29 | 2018-04-16 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Фармацевтическая комбинация для применения при гликемическом контроле у пациентов с сахарным диабетом 2 типа |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| CN102703552B (zh) * | 2012-05-15 | 2014-10-29 | 山东阿华生物药业有限公司 | 重组人胰岛素的制备方法及其产品 |
| CN102816819B (zh) * | 2012-08-13 | 2014-10-29 | 山东阿华生物药业有限公司 | 提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成b30缺苏氨酸人胰岛素产率的方法 |
| CN103305581B (zh) * | 2013-07-04 | 2015-05-27 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种重组人胰岛素的制备方法 |
| US10611813B2 (en) * | 2013-12-23 | 2020-04-07 | Biocon Research Limited | Method of production of human insulin methyl ester |
| CN107206058A (zh) | 2014-12-12 | 2017-09-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 甘精胰岛素/利西拉来固定比率配制剂 |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| TW201726702A (zh) * | 2015-09-24 | 2017-08-01 | 韓美藥品股份有限公司 | 生產胰島素之方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE50892B1 (en) | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
| JPS58501208A (ja) | 1981-08-10 | 1983-07-28 | ノルデイスク インシユリンラボラトリユ−ム | インシユリン誘導体の製造法 |
| DK149824C (da) | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| WO1983002772A1 (en) | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| IT1189353B (it) | 1982-06-07 | 1988-02-04 | Nordisk Insulinlab | Procedimento per la preparazione di insulina umana e suoi esteri |
| DK347086D0 (da) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | Novo Industri As | Novel peptides |
| PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| IL84110A (en) * | 1986-10-14 | 1992-11-15 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to a human insulin |
| DE10075034I1 (de) | 1987-02-25 | 2001-05-23 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
| PL178466B1 (pl) | 1993-09-17 | 2000-05-31 | Novo Nordisk As | Pochodna insuliny i kompozycja farmaceutyczna do leczenia cukrzycy |
| US6011007A (en) | 1993-09-17 | 2000-01-04 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| DE60039074D1 (de) | 1999-12-29 | 2008-07-10 | Novo Nordisk As | Verfahren zur herstellung von insulinvorläufern und von analogen von insulinvorläufern |
| RU2002120513A (ru) | 1999-12-29 | 2004-03-27 | Ново Нордиск А/С (DK) | Способ производства предшественников инсулина и аналогов предшественников инсулина с повышенным выходом ферментации у дрожжей |
| ATE381573T1 (de) | 2000-04-14 | 2008-01-15 | Univ Maryland Biotech Inst | Verbesserte thermostabilität und temperaturresistenz von proteinen |
| WO2002079254A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Janoff Edward N | Human monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae |
-
2002
- 2002-11-15 ES ES02779247T patent/ES2344448T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 RU RU2004118503/13A patent/RU2376379C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-11-15 PL PL369447A patent/PL210437B1/pl unknown
- 2002-11-15 KR KR1020047007129A patent/KR100925381B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-15 CA CA2464616A patent/CA2464616C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-15 CN CNB028229622A patent/CN100424179C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 IL IL16135802A patent/IL161358A0/xx unknown
- 2002-11-15 WO PCT/DK2002/000765 patent/WO2003044210A2/en active Application Filing
- 2002-11-15 JP JP2003545831A patent/JP4404631B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 EP EP02779247A patent/EP1448786B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 DE DE60236014T patent/DE60236014D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 BR BR0213583-3A patent/BR0213583A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-11-15 AU AU2002342597A patent/AU2002342597A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-15 HU HU0500037A patent/HU228934B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-11-15 AT AT02779247T patent/ATE464390T1/de not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-04-14 IL IL161358A patent/IL161358A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005509687A (ja) | 2005-04-14 |
| CN1589328A (zh) | 2005-03-02 |
| HU228934B1 (hu) | 2013-06-28 |
| KR100925381B1 (ko) | 2009-11-09 |
| IL161358A (en) | 2011-05-31 |
| HUP0500037A2 (hu) | 2005-03-29 |
| HUP0500037A3 (en) | 2010-01-28 |
| PL369447A1 (pl) | 2005-04-18 |
| RU2376379C2 (ru) | 2009-12-20 |
| AU2002342597A1 (en) | 2003-06-10 |
| BR0213583A (pt) | 2004-08-24 |
| EP1448786B1 (en) | 2010-04-14 |
| RU2004118503A (ru) | 2005-06-10 |
| CA2464616A1 (en) | 2003-05-30 |
| EP1448786A2 (en) | 2004-08-25 |
| ES2344448T3 (es) | 2010-08-27 |
| IL161358A0 (en) | 2004-09-27 |
| JP4404631B2 (ja) | 2010-01-27 |
| WO2003044210A3 (en) | 2004-03-25 |
| WO2003044210A2 (en) | 2003-05-30 |
| DE60236014D1 (de) | 2010-05-27 |
| KR20050044855A (ko) | 2005-05-13 |
| AU2002342597A8 (en) | 2003-06-10 |
| CA2464616C (en) | 2012-07-24 |
| CN100424179C (zh) | 2008-10-08 |
| ATE464390T1 (de) | 2010-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL210437B1 (pl) | Sposób wytwarzania związków insuliny | |
| ES2611040T3 (es) | Derivados de insulina | |
| CN102256992B (zh) | 胰岛素类似物 | |
| EP0216832B1 (en) | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives | |
| AU612141B2 (en) | Novel insulin derivatives | |
| EP1692168B1 (en) | Single-chain insulin | |
| US7402565B2 (en) | Processes for making acylated insulin | |
| JPH09502867A (ja) | アシル化インスリン | |
| JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
| KR101269540B1 (ko) | 인슐린 접합체의 제조를 위한 방법 | |
| IE841890L (en) | Treatment of diabetes mellitus | |
| ZA200106971B (en) | Covalently bridged insulin dimers. | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| EP3845240A1 (en) | Novel pro-insulin aspart structure and method for preparing insulin aspart | |
| US8410048B2 (en) | Method for producing insulin analogs having a dibasic B chain terminus | |
| US4639332A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives | |
| JPH0587239B2 (pl) | ||
| CA2724510A1 (en) | Processes for refolding of insulin | |
| US7396903B2 (en) | Process for preparing insulin compounds | |
| DK154573B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende praeproinsulinanaloge | |
| PL167810B1 (pl) | Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL | |
| JP2008502594A (ja) | 改善されたフォールディングの空気ガス処理によってインスリンを抽出する方法 | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| JPS58501208A (ja) | インシユリン誘導体の製造法 | |
| CN114867743A (zh) | 形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |