DK154573B - Fremgangsmaade til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende praeproinsulinanaloge - Google Patents

Description

DK 154573 B

o

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende præproinsulinana-loge.

Fra den europæiske patentansøgning nr. 56.951 ken-5 des der en fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin eller derivater deraf ud fra svineinsulin eller derivater deraf, ved hvilken man omsætter svineinsulin eller et derivat af svineinsulin ved en pH-værdi under dets isoelek-triske punkt i nærværelse af trypsin eller et trypsinlig-10 nende enzym med et overskud af en threoninester eller et derivat deraf og om ønsket derpå fraspalter estergruppen.

Som derivater af svineinsulin defineres sådanne, der "kan fås ved indbygning af beskyttelsesgrupper ved fritliggende funktioner eller ved fraspaltning eller ombytning af 15 enkelte aminosyrer". Præproinsuliner og deres analoge adskiller sig fra insulinerne bl.a. derved, at de er énkædede proteiner, der er krydstværbundet med disulfidbroer, medens insulinet har et tokædet proteins struktur.

Ved hjælp af forskellige metoder kan man gennem i 20 og for sig kendt enzymkatalyseret transamidering omdanne svineinsulin til humaninsulin, jfr. f.eks, tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.104.949. Desuden er disse éttrins-metoder også egnede til dannelse af insulin ud fra proin-sulin og intermediat-insuliner. Med trypsin sker der ved 25 svineinsulin-omdannelsen under bestemte fremgangsmådebe- 329 B30 tingelser en transamidering af Lys -Ala OH til B2 9 -Lys -Thr-O-ester, ud fra hvilken der efter kendte esterspaltningsmetoder fremstilles frit insulin. I tilfælde af proinsulinet eller intermediat-insulinerne sker omamide- 30 ringen af -LysB^-AlaB^-Arg-Arg til LysB^-Thr-O-ester AO Al og derudover til -Lys-Arg -Gly

Det i det menneskelige eller dyriske legeme dannede insulin fremkommer først i form af et lineært præpro-

Bl insulin, idet den til den N-terminale Phe -knyttede præ-35 sekvens er opbygget af ca. 24 aminosyrerester. Som funk-

DK 154573 B

2

O

tion tilskrives der denne molekyldel en signalvirkning såvel ved proteinbiosyntesen som ved transportmekanismen gennem membranen af den syntetiserende celle.

I tiltagende omfang fortrænges den ovennævnte semi-5 syntetiske fremstilling af humaninsulin ud fra naturligt svineinsulin af udvindingen af humaninsulin som kimært genprodukt af modificeret E.-coli-DNA.

Disse genteknologiske metoder tillader ved variation af signalnucleotiddelen fremstillingen af et med det na-10 turlige præproinsulin analogt produkt. Formålet med sådanne aminosyresekvensændringer er biosyntesen af et analogt præpropinsulin, der muliggør den optimale spaltning til insulin. Ved en kendt fremgangsmåde (A.D. Riggs et al. Peptides, 1979, ED. E. Gross og J. Meienhofer, Pierce Chemical 15 Company, Rockford, Illinois, side 985-992) er præsekvensen modificeret således, at den over en methioninrest er knyt-

Bl tet til den N-terminale Phe i proinsulinet, således at Bl -Met-Phe -bindingen kan spaltes ved hjælp af BrCN-metoden (E. Gross, B. Witkop, J. Biol. Chem., 1856 (1962)). Det re-20 suiterende proinsulin omdannes derefter ad enzymatisk vej (A. Kemmler, J. Biol. Chem., 246, 3786 (1971)) til humaninsulin med trypsin og carboxypeptidase B.

Såvel BrCN-spaltningen som den i det andet trin følgende behandling med enzymblandingen kan gennem uspecifik-25 ke reaktioner forårsage betragtelige tab af slutproduktet.

Det er således ønskeligt og den foreliggende opfindelses formål at udvikle en fremgangsmåde til ud fra genteknologisk udvundne præproinsulinanaloge at udvinde insulin i høje udbytter og med færrest mulige reaktionstrin, 30 og opfindelsen tager navnlig sigte på at muliggøre fremstillingen af især humaninsulin ud fra genteknologisk let og i betydelige mængder tilgængelige præproinsulinanaloge, hvilket ikke fremgår af eller kan udledes af det ovennævnte tyske offentliggørelsesskrift nr. 3.104.949.

35 Dette formål opnås ved den her omhandlede fremgangs-

O

DK 154573 B

3 måde til fremstilling af insulin ud fra tilsvarende præ-proinsulinanaloge, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man ved en pH-værdi under det isoelektriske punkt for insulinerne ved hjælp af trypsin eller en trypsinlig-5 nende endopeptidase omsætter tilsvarende præproinsulinana-loge, der ved proinsulinets N-terminal bærer lysin eller arginin eller acylaminoacyl-rester som carboxylende af en præsekvens, med formlen 10 _C-kæde_ I—S-S—i A-kæde „„ I /o Γ, 1 ° _°H (i) i r s s 16 is YB29 K1-*80-i-1- -i B-kæde hvilken Y betyder Lys eller Arg og betyder hydrogen, 20 en L-aminosyre eller resten af et som signalsekvens tjenende peptid, med en ester af de i B30-stilling i naturlige insuliner forekommende aminosyrer, som, når aminosyrer-ne yderligere indeholder aliphatiske OH-grupper, også kan bære disse på beskyttet form, og derefter fraspalter ester-25 gruppen og de eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

Herved indtræder der såvel en transamidering ved de N-terminale peptidbindinger af PheB"*· og GlyA^ som ved C-terminalen af LysB^.

30 Som proinsulin-del egner sig ethvert produkt, der kodes med et naturligt eller syntetisk, efter kendte nu-cleotid-fremstillingsmetoder varieret proinsulin. Analoge præproinsuliner med forkortet C-peptid-segment, således som det f.eks. er tilfældet med C-peptidet for okser i 35 forhold til C-peptidet fra svin, kommer ligeledes på tale 4

DK 154573 B

O

til fremgangsmåden. Ligeledes er human-præproinsulinana-loge egnede. Det er væsentligt for strukturen af C-pepti-det, at det over en basisk L-aminosyre Y=L-Arg eller L-Lys er knyttet til glycinet i insulin-A-kæden, dvs. at der fo-5 religger en struktur Y-(AS)n“Y, hvor AS betyder alle kode-lige aminosyrer, og n = 0-35. Aminosyreestere og/eller deres derivater med en fri aminogruppe kan til fremgangsmåden også vælges således, at der om ønsket dannes en insulinanalog af ikke-naturlig sekvens.

10 Der anvendes som nævnt estere eller derivater af estere af endestillede aminosyrer i de i stilling B30 naturligt forekommende insuliner. Særligt foretrukne er C·^--Cg-alkylesterne, f.eks. tert.butylester, og C^-C^-aral-kylesterne, f.eks. benzhydryl-, trityl- eller fluorenyl-15 estere, især Ala-OtBu og Thr(tBu)OtBu. Eksempler på egnede L-threoninestere er L-threonin-tert.butylester, L-threo-nin-tert.butyl-O-tert.butylester og L-threonin-methylester.

Ved derivater af threoninestere med fri aminogruppe i opfindelsens forstand skal der forstås sådanne, som ved threo-20 ninets OH-funktion bærer en beskyttelsesgruppe, især ether--beskyttelsesgruppen. Særligt foretrukne esterbeskyttelsesgrupper er C^-Cg-alkyl, især tert.butyl, og C^-C^g-aralkyl, især benzhydryl, trityl eller fluorenyl.

Den eventuelt beskyttede aminosyreester med en fri 25 aminogruppe kan anvendes i et molært forhold til insulinet på fra 50 til 500, fortrinsvis i et molært forhold på fra 100 til 250. Reaktionen kan gennemføres ved under en pH-værdi på 5,5, fortrinsvis ved en pH-værdi mellem 3,8 og 5,0, ved en temperatur mellem 2 og 37°C, fortrinsvis mel-30 lem 4 og 10°C.

Foruden trypsin (se "The Enzymes", vol. 4, P.D.

Boyer et al., Eds. (Acad. Press, N.Y., 2. udg. 1960), side 119-132, og ibid., vol. 3 (3. udg. 1971), side 250-275), egner sig til den her omhandlede fremgangsmåde også sådan-35 ne endopeptidaser, der fra litteraturen kendes som værende 5

O

DK 154573 B

trypsinlignende, dvs. sådanne, der specifikt spalter peptidbindinger ved carboxylenden af basiske aminosyrer, (se f.eks. "Kontakte Merck", 1/73, side 8-10, 2/73, side 3-8; 7. Physiol. Chem., 348 (1967), 1319; Comp. Biochem. Physiol., 5 28 (1969), 1275; Z. Physiol. Chem., 352 (1971), 583; Arch.

Biochem. Biophys., 129 (1969), 620; ibid., 126 (1968), 971; Biochem. Biophys. Res. Comm., 3^7 (1969), 99). Mængden af det enzym, der skal anvendes, kan ligge mellem 1:1 og 100:1, idet talværdierne refererer til vægtforholdet mellem præpro-10 insulinanalog og enzym. Med fordel arbejdes der ved et vægtforhold på fra 10:1 til 4:1.

Ifølge opfindelsen foretrækkes det især, at der arbejdes ved en pH-værdi mellem 3,8 og 5,5, at enzym-præpro-insulinanalog-forholdet andrager 1:1 til 1:100, at det mo-15 lære forhold mellem aminosyreester eller dens derivat og præproinsulinanaloge andrager fra 50 til 500, og at reaktionstemperaturen ligger mellem 2 og 37°C, eller at der arbejdes ved en pH-værdi mellem 3,8 og 5,0, at enzympræpro-insulinanalog-forholdet andrager 1:4 til 1:10, at det molæ-20 re forhold mellem aminosyreester eller dens derivat og præproinsulinanaloge andrager fra 100 til 250, og at reaktionstemperaturen ligger mellem 4 og 10°C.

Den her omhandlede omsætning fører til B30-estere eller beskyttelsesholdige B30-estere af insulinerne, som 25 om ønsket ved i og for sig kendte metoder ved spaltning af estergruppen og eventuelt fraspaltning af beskyttelsesgruppen kan omdannes til det tilsvarende frie insulin.

Esterne kan inden deres omdannelse til de frie insuliner underkastes de nødvendige rensningsoperationer, 30 f.eks. ved hjælp af kendte søjlechromatografiske metoder.

Det fremkomne insulin kan omdannes til gængse indgivelsesformér og anvendes som lægemiddel til behandling af diabetes mellitus.

De i de følgende eksempler anvendte præproinsulin-35 analoge fås i det væsentlige efter kendte metoder (V.K.

6

O

DK 154573 B

Naithani et al., Insuline, Ed. D. Brandenburg, A. Wollmer, 1980, W. de Gruyter, Berlin-New York, side 99-106) ved direkte acylering af proinsulin med blandede anhydrider af BOC-Lys(BOC)OH, BOC-Arg(AdOC)2“0H, BOC-Ala-Gln-Lys(BOC)OH, 5 BOC-Ala-Gln-Arg(AdOC)2"0H, BOC-Gln(tBu)-Pro-Lys(BOC)-Pro--Ala-Arg(AdOC)2-0H og BOC-Gln(tBu)-Pro-Lys(BOC)-Pro-Ala--Lys(BOC)-OH. Rensningen af forbindelserne sker over ionbyttere og fraspaltningen af beskyttelsesgrupperne med trifluoreddikesyre. De enkelte aminosyreanalyser svarer 10 til de teoretiske værdier.

Den her omhandlede fremgangsmåde illustreres nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1

BO

15 la) 75 mg Lys -proinsulin fra okse opløses sammen med 250 mg AlaO(tBu) i 0,5 ml vand, og pH-værdien indstilles på 4,8 med iseddike. Til opløsningen sættes der 8 mg trypsin opløst i 0,1 ml vand. Efter 16 timers henstand ved 4°C afbrydes reaktionen ved fældning med 68 ml acetone.

20 Fældningen skilles fra ved centrifugering. Efter vask med ether tørres der i vakuum.

Dette råmateriale chromatograferes over en kiselgel søjle i løbemidlet chloroform:methanol:H20:triethylamin: myresyre i forholdet 600:500:120:15:3. Den først eluerede 25 spids opsamles og koncentreres til et lille rumfang i vakuum. Til opløsningen sættes der 25 ml acetone, og den udfældede okseinsulin-B30-ester skilles fra ved centrifugering.

Udbytte af okseinsulin-B30-tBu: 41 mg.

30 lb) 25 mg af okseinsulin-B3Q-esteren opløses i 0,5 ml trifluoreddikesyre og henstilles i 60 minutter ved s tue temper a tiir. Derpå tilsættes der 5 ml ether, og det udfældede, frie okseinsulin skilles fra ved centrifugering og tørres i vakuum efter vask med ether.

35 Udbytte 23 mg.

Aminosyreanalyse, HPLC-elueringstid og biologisk aktivitet giver med okseinsulin identiske værdier.

DK 154573 B

7

O

Sammenligningseksempel

Til påvisning af det forhold, at der foruden trans-B29 amideringen ved Lys kan ske en proteolyse mellem positionerne B° og B1, udføres følgende forsøg:

BO

5 500 mg Lys -okseinsulin (R. Geiger, Chemiker-Zeit- ung, 100, 111 (1976) og R. Geiger, Molecular Endocrinology,

Ed. Mac Intyre & Selke, 1977, Elsevier /North Holland Biomedical Press, side 27-41) opløses i 3,0 ml vand sammen med 2 g AlaO(tBu). pH-værdien indstilles på 4,5 med eddikesyre.

10 Til insulin-opløsningen sættes der 20 mg trypsin opløst i 0,5 ml vand. Der gås yderligere frem analogt med eksempel la). Udbytterne af råmateriale, der ifølge HPLC-analyse indeholder 67% okseinsulin-B30-Ala0(tBu), andrager 563 mg.

Udbyttet af beriget okseinsulin-B30-Ala0(tBu) andra-15 ger efter søjlechromatografisk rensning 409 mg.

Fraspaltningen af esteren sker analogt med eksempel lb) .

Eksempel 2

BO

20 75 mg Ala-Gln-Lys -proinsulin fra okse (fremstil ling ifølge Naithani et al., jfr. ovenfor) omsættes analogt med eksempel la med trypsin og AlaOtBu, men ved 7°C og pH = 4,5. Efter 16 timers henstand oparbejdes der, og den dannede okseinsulin-B30-ester fraskilles chromatogra-25 fisk.

Udbytte: 4 7 mg.

Aminosyreanalysen af dette materiale svarer til okseinsulinet.

Fraspaltningen af esteren sker analogt med eksem-30 pel lb) .

Eksempel 3

BO

75 mg Ala-Gln-Lys -proinsulin fra svin (fremstillet analogt med eksempel 2) omsættes analogt med eksem-35 pel 2 ved 9°C og pH = 4,4 med AlaOtBu, og der oparbejdes.

8

O

DK 154573 B

Udbyttet af svineinsulinester andrager 39 mg (oparbejd-- ning analogt med eksempel lb)). Reaktionsprodukterne isoleres ved HPLC og analyseres ved aminosyreanalyse.

5 Eksempel 4

BO

75 mg Ala-Gln-Lys -proinsulin fra svin omsættes som i eksempel la) med 500 mg Thr(tBu)OtBu i nærværelse af trypsin. Efter 16 timers reaktionstid kan der isoleres 49 mg humaninsulin-B30-(tBu)-OtBu. Der gås videre 10 frem analogt med eksempel lb). Reaktionsprodukterne isoleres ved HPLC og analyseres ved aminosyreanalyse.

Eksempel 5

BO

75 mg Arg -proinsulin fra okse omsættes med 15 500 mg Thr(tBu)OtBu som i eksempel la) i nærværelse af trypsin. Efter henstand natten over oparbejdes der som i eksempel la). Udbyttet af okseinsulin-B30 Thr(tBu)-OtBu andrager 45 mg, som videreoparbejdes svarende til eksempel lb). Reaktionsprodukterne isoleres ved HPLC og 20 analyseres ved aminosyreanalyse.

Eksempel 6

BO

75 mg Ala-Gln-Arg -proinsulin fra svin bringes til reaktion med 400 mg Thr(tBu)OtBu og 8 mg trypsin 25 som i eksempel la). Efter 20 timer ved 6°C andrager udbyttet af humaninsulin-B30-(tBu)OtBu 39 mg (videre oparbejdning analogt med eksempel lb)). Reaktionsprodukterne isoleres ved HPLC og analyseres ved aminosyreanalyse.

30

Eksempel 7

BO

5 mg Gln-Pro-Lys-Pro-Ala-Gln-Lys -proinsulin fra okse opløses sammen med 15 mg AlaOtBu i 0,1 ml vand. pH-værdien indstilles med et spor af iseddike på 4 til 35 6, der‘tilsættes 1 mg trypsin, og reaktionsblandingen

O

DK 154573 B

9 holdes i 24 timer ved 4°C. Ved hjælp af HPLC måles der 63% okseinsulin-B30-tBu, der viderebehandles som i eksempel lb) .

5 Eksempel 8

BO

5 mg Gln-Pro-Lys-Pro-Ala-Gln-Arg -proinsulin fra svin bringes til reaktion med 25 mg Thr(tBu)OtBu som angivet i eksempel 7. Efter en reaktionstid på 24 timer findes der ved HPLC-analyse 71% humaninsulin-B3Q-(tBu)-10 OtBu. Ved hjælp af præparativ HPLC kan esteren isoleres.

Udbytte: 2,8 mg.

Efter den sædvanlige fraspaltning af de tert.bu-tyl-beskyttelsesgrupper er produktet ved HPLC og ifølge aminosyreanalyse identisk med humaninsulin.

15

Eksempel 9

BO

75 mg Pro-Ala-Ala-Lys -proinsulin fra svin omsættes som i eksempel la) med 500 mg Thr(tBu)OtBu i nærværelse af trypsin. Efter en reaktionstid på 16 timer kan 20 der isoleres 52 mg humaninsulin-B30-(tBu)-OtBu. Der gås videre frem analogt med eksempel lb). Reaktionsprodukterne isoleres ved HPLC og analyseres ved aminosyreanalyse.

25 1 35

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af insuliner ud fra tilsvarende præproinsulinanaloge, kendeteg- 5 net ved, at man ved en pH-værdi under det isoelektriske punkt for insulinerne ved hjælp af trypsin eller en tryp-sinlignende endopeptidase omsætter tilsvarende præproinsulinanaloge / der ved proinsulinets N-terminal bærer ly-sin eller arginin eller acylaminoacyl-rester som carboxyl-10 ende af en præsekvens, med formlen C-kæde__( i—S—S—i A-kæde U*° Γ Ί *-08 ««

15. I s s i S γΒ29 rI-ϊΒΟ-I-!- -I B-kæde 20. hvilken Y betyder Lys eller Arg, og betyder hydrogen, en L-aminosyre eller resten af et som signalsekvens tjenende peptid, med en ester af de i B30-stilling i naturlige insuliner forekommende aminosyrer, som, når ami-nosyrerne yderligere indeholder aliphatiske OH-grupper, 25 også kan bære disse på beskyttet form, og derefter fraspalter estergruppen og de eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-30 net ved, at der som aminosyrederivater anvendes Ala- -OtBu eller Thr(tBu)-OtBu.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der arbejdes ved en pH-værdi 35 mellem·3,8 og 5,5, fortrinsvis mellem 3,8 og 5,0. O u ' DK 154573B

4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at enzym-præproinsulin-analog-forholdet andrager 1:1 til 1:100, fortrinsvis 1:4 til 1:10 vægtdele. 5

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at der anvendes et molært forhold mellem aminosyreesteren eller dens beskyttelsesgrupper bærende derivat og præproinsulinanalogen på fra 10 50-500, fortrinsvis 100-250.

6. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-5, kendetegnet ved, at reaktionstemperaturen ligger mellem 2 og 37°C, fortrinsvis mellem 4 og 10°C. 15

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der arbejdes ved en pH-værdi mellem 3.8 og 5,5, at enzym-præproinsulinanalog-forholdet andrager 1:1 til 1:100 vægtdele, at det molære forhold mellem 20 aminosyreester eller dennes beskyttede derivat og præpro-insulinanaloge andrager fra 50 til 500, og at reaktionstemperaturen ligger mellem 2 og 37°C.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende - 25 tegnet ved, at der arbejdes ved en pH-værdi mellem 3.8 og 5,0, at enzym-præproinsulinanalog-forholdet andrager 1:4 til 1:10 vægtdele, at det molære forhold mellem aminosyreester eller dens beskyttede derivat og præproin-sulinanaloge andrager fra 100 til 250, og at reaktions- 30 temperaturen ligger mellem 4 og 10°C. 35