JPS58190398A - インシユリンへのプレプロインシユリン類似体の変換法 - Google Patents
インシユリンへのプレプロインシユリン類似体の変換法Info
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- JPS58190398A JPS58190398A JP58039298A JP3929883A JPS58190398A JP S58190398 A JPS58190398 A JP S58190398A JP 58039298 A JP58039298 A JP 58039298A JP 3929883 A JP3929883 A JP 3929883A JP S58190398 A JPS58190398 A JP S58190398A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はツレプロインシュリン類似体をインシュリンの
％電点以下のｐＨでトリプシンまたは類似のエンドＲプ
チグー七の存在下に天然アミノ酸のエステルまたはその
誘導体と反応させそして次にエステル基および場合によ
り存在ゴる他の保詐基を除去することを特徴とするプレ
ツロインシュリン類似体からのインシュリンの製法に関
する。
％電点以下のｐＨでトリプシンまたは類似のエンドＲプ
チグー七の存在下に天然アミノ酸のエステルまたはその
誘導体と反応させそして次にエステル基および場合によ
り存在ゴる他の保詐基を除去することを特徴とするプレ
ツロインシュリン類似体からのインシュリンの製法に関
する。
種々の方法を用いてそれ自体既知の酵素触媒されたアミ
ド交換により豚インシュリンを変換しうる〔例えばドイ
ツ特許出願公開第３１０４４９号明１ＩＥ１１５および
Ｒ、Ｏｂｓｒｍｅｉｅｒ氏他著［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓＮｅｕｅ Ｉｎ５ｕｌｘｎｅＪ １９８１年版癖照］
。それと並んでプロインシュリンおよび中間体インシュ
リンからインシュリンを生成させる１段階法も過当であ
る。トリプシンを用いると、庖定の方法による条件下洗
豚インシュリン変換させるに際しＬｙ、Ｂ ２９− Ａ
Ｉ、Ｂ ｓＤ○Ｈの−Ｌｙｅ −Ｔｈｒ−０−−ｍ
ステルへのアミド交換が起り、このものから既知のエス
テル分解法により遊離のインシュリンが豹トされる。ソ
ロインシュリンまたは中間体インシュリンの場合は−Ｌ
ｙｓ）３２９− Ａｌａ”０− Ａｒｙ。
ド交換により豚インシュリンを変換しうる〔例えばドイ
ツ特許出願公開第３１０４４９号明１ＩＥ１１５および
Ｒ、Ｏｂｓｒｍｅｉｅｒ氏他著［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓＮｅｕｅ Ｉｎ５ｕｌｘｎｅＪ １９８１年版癖照］
。それと並んでプロインシュリンおよび中間体インシュ
リンからインシュリンを生成させる１段階法も過当であ
る。トリプシンを用いると、庖定の方法による条件下洗
豚インシュリン変換させるに際しＬｙ、Ｂ ２９− Ａ
Ｉ、Ｂ ｓＤ○Ｈの−Ｌｙｅ −Ｔｈｒ−０−−ｍ
ステルへのアミド交換が起り、このものから既知のエス
テル分解法により遊離のインシュリンが豹トされる。ソ
ロインシュリンまたは中間体インシュリンの場合は−Ｌ
ｙｓ）３２９− Ａｌａ”０− Ａｒｙ。
ＡｒｇのＬｙｓ −Ｔｂｒ −０−エステルおよびさ
ら処ヒトまたは動物の体内で形成されるインシュリンは
はじめは線状のプレプロインシュリンの形態で人手され
、その場合Ｎ−末端Ｐｈｅ”に結合したブレ順列は約２
４個のアミノ醇基から構成される。機態としては蛋白質
生合成ならびに合成細胞の膜による輸送メカニズムにお
ける信号作用がこの分子によるものとされる。
ら処ヒトまたは動物の体内で形成されるインシュリンは
はじめは線状のプレプロインシュリンの形態で人手され
、その場合Ｎ−末端Ｐｈｅ”に結合したブレ順列は約２
４個のアミノ醇基から構成される。機態としては蛋白質
生合成ならびに合成細胞の膜による輸送メカニズムにお
ける信号作用がこの分子によるものとされる。
天然の豚インシュリンからのヒトインシュリンの上記半
合成的Ｍは変形された大腸菌ＤＮＡのキメラ遺伝因子生
成物としてのヒトインシュリンの取得によりますます排
除されてき【いる。
合成的Ｍは変形された大腸菌ＤＮＡのキメラ遺伝因子生
成物としてのヒトインシュリンの取得によりますます排
除されてき【いる。
この遺伝子工学的方法は、シグナルヌクレオチド部分を
変化させることにより天然のプレブロインシュリ／撃似
生成物を産生させることができる。かかるアミノ酸順列
変更の目標は、インシュリンへの至適分解ができる類似
プレプロインシュリンの生合成である。既知方法（Ａ、
Ｄ。
変化させることにより天然のプレブロインシュリ／撃似
生成物を産生させることができる。かかるアミノ酸順列
変更の目標は、インシュリンへの至適分解ができる類似
プレプロインシュリンの生合成である。既知方法（Ａ、
Ｄ。
Ｒ１ｇｇｇ＋氏他著「ＰｅｐｔｉｄｅｓＪ １９７９年
版第９８５〜９９２頁奈照うでは、プレ順列を変形させ
てメチオニン基を介してプロインシュリンのＮ−末端Ｐ
ｈｉ”に結合させるので、−Ｍｅｔ −ＰｈｅＢｌ−結
合はＢｒＣＮ法（［Ｊ 、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、Ｊ第
２３７巻第１８５６負（１９６２年）参照〕により分解
されうる。生ずるプロインシュリンは次に酵素的方法［
Ｊ Ｊ、Ｂｉｏｌ。
版第９８５〜９９２頁奈照うでは、プレ順列を変形させ
てメチオニン基を介してプロインシュリンのＮ−末端Ｐ
ｈｉ”に結合させるので、−Ｍｅｔ −ＰｈｅＢｌ−結
合はＢｒＣＮ法（［Ｊ 、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、Ｊ第
２３７巻第１８５６負（１９６２年）参照〕により分解
されうる。生ずるプロインシュリンは次に酵素的方法［
Ｊ Ｊ、Ｂｉｏｌ。
ｃｈｅｍ、Ｊ第２４６巻第３７８６ｊＪ（１９７１年）
癖照〕でトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを
用いてヒトインシュリンに変換される。
癖照〕でトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを
用いてヒトインシュリンに変換される。
Ｂｒ ＣＮ分解そして第２段階での続く酵ｌＬａ金物で
の処理も非特異的反応により最終生成物のがなりの損失
が惹起されさる。それゆえ、遺伝子工学的に取得された
類似プレプロインシュリンから高収紮で、すなわちでき
るだけ少ない反応工程でインシュリンを取得する方法を
開発するのが望ましい。
の処理も非特異的反応により最終生成物のがなりの損失
が惹起されさる。それゆえ、遺伝子工学的に取得された
類似プレプロインシュリンから高収紮で、すなわちでき
るだけ少ない反応工程でインシュリンを取得する方法を
開発するのが望ましい。
この課題は、相当するプレプロインシュリンにおいて所
望のアミノ酸エステルの存在下にトリプシンまたは類似
酵素によりＰｈｅ”’およびＧｌｙＡｌのＮ−末端ペプ
チド結合のアミド交換およびＬｙ ｓ Ｂ ２９のアミ
ド交換を１拍時に実施することを特徴とする、プレプロ
インシュリン類似体からのインシュリンの製法（こより
触法された。
望のアミノ酸エステルの存在下にトリプシンまたは類似
酵素によりＰｈｅ”’およびＧｌｙＡｌのＮ−末端ペプ
チド結合のアミド交換およびＬｙ ｓ Ｂ ２９のアミ
ド交換を１拍時に実施することを特徴とする、プレプロ
インシュリン類似体からのインシュリンの製法（こより
触法された。
類似プレプロインシュリンは、プロインシュリンのＮ−
末端にリジンまたはアルキニンまたはそのアシルアミノ
アシル基をブレ順夕１］のカルホキシル末端として侑す
るものである（下記弐Ｂ−頻 式中ＹはＬｙｓまたはＡｒｇでありそしてＲ１は水素、
Ｌ−アミノ酸または以下に記載されるペプチド基Ｘを意
味する。
末端にリジンまたはアルキニンまたはそのアシルアミノ
アシル基をブレ順夕１］のカルホキシル末端として侑す
るものである（下記弐Ｂ−頻 式中ＹはＬｙｓまたはＡｒｇでありそしてＲ１は水素、
Ｌ−アミノ酸または以下に記載されるペプチド基Ｘを意
味する。
Ｘはシグナル順列として役立てられるペプチドのいずれ
でもよい。プロインシュリン部分としては、天然かまた
は合成的に既知のヌクレオチドｐ＋製法により変化され
たプロインシュリンでコード化されるあらゆる生成物が
適する３例えば豚のＣ−ペプチドに対する牛のＣ−はプ
チドの場合にそうであるように短縮されたＣ−ペプチド
順列を有する類似プレプロインシュリンも同様に本方法
にあげられる。声」様にヒトプレプロインシュリン類似
体も適当である。Ｃ−ペプチドの構造にとってそれが塩
基性Ｌ−アミノ酸Ｙ ＝ Ｌ −ＡｒｇまたはＬ −Ｌ
ｙｅを介し工インシュリン人鎖のグリシンと結合する、
すなわち構造Ｙ −（Ａ８）ｎ −Ｙ （ここでＡｓは
コード化司熊なが存在することが必須要件である。遊離
のアミノ基を有するアミノ酸エステルおよヒ／ｌ 九ハ
ゞその誘導体は、所望の場合は天然でない
順列のインシュリン類似体が生ずるように本方法に選択
されうる。
でもよい。プロインシュリン部分としては、天然かまた
は合成的に既知のヌクレオチドｐ＋製法により変化され
たプロインシュリンでコード化されるあらゆる生成物が
適する３例えば豚のＣ−ペプチドに対する牛のＣ−はプ
チドの場合にそうであるように短縮されたＣ−ペプチド
順列を有する類似プレプロインシュリンも同様に本方法
にあげられる。声」様にヒトプレプロインシュリン類似
体も適当である。Ｃ−ペプチドの構造にとってそれが塩
基性Ｌ−アミノ酸Ｙ ＝ Ｌ −ＡｒｇまたはＬ −Ｌ
ｙｅを介し工インシュリン人鎖のグリシンと結合する、
すなわち構造Ｙ −（Ａ８）ｎ −Ｙ （ここでＡｓは
コード化司熊なが存在することが必須要件である。遊離
のアミノ基を有するアミノ酸エステルおよヒ／ｌ 九ハ
ゞその誘導体は、所望の場合は天然でない
順列のインシュリン類似体が生ずるように本方法に選択
されうる。
好ましいのは天然に存在するインシュリンのＢ２Ｏ位の
末端アミノ酸・のエステルまたはエステルの誘導体であ
る。好ましいのは（０１〜Ｃ６）−アルキルエステル（
例えば第３ブチルエステル）および（０７〜Ｃ１９）−
アラルキルエステル（例えばベンズヒドリル、トリチル
ま九はフルオレニルエステル）、特にＡｈａ−ＯｔＢｕ
およびＴｈｒ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕである。適当なＬ−
スレオニンエステルの例はＬ−スレオニン第３ブチルエ
ステル、Ｌ−スレオニン第５ブチル−〇−第５ブチルエ
ステルおよびＬ−スレオニンメチルエステルである。本
発明の意味における遊１のアミノ基を育するスレオニン
エステルの誘導体にハ、スレオニンのＯＨ官能基に保護
基特にエーテル保護基を有するものがある。特に好まし
いエステル保護基は（０１〜Ｃ６）−アルキル特に第３
ブチルおよび（ｃ７〜０１９）−アラルキル特にベンズ
ヒドリル、トリチルまたはフルオレニルである。
末端アミノ酸・のエステルまたはエステルの誘導体であ
る。好ましいのは（０１〜Ｃ６）−アルキルエステル（
例えば第３ブチルエステル）および（０７〜Ｃ１９）−
アラルキルエステル（例えばベンズヒドリル、トリチル
ま九はフルオレニルエステル）、特にＡｈａ−ＯｔＢｕ
およびＴｈｒ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕである。適当なＬ−
スレオニンエステルの例はＬ−スレオニン第３ブチルエ
ステル、Ｌ−スレオニン第５ブチル−〇−第５ブチルエ
ステルおよびＬ−スレオニンメチルエステルである。本
発明の意味における遊１のアミノ基を育するスレオニン
エステルの誘導体にハ、スレオニンのＯＨ官能基に保護
基特にエーテル保護基を有するものがある。特に好まし
いエステル保護基は（０１〜Ｃ６）−アルキル特に第３
ブチルおよび（ｃ７〜０１９）−アラルキル特にベンズ
ヒドリル、トリチルまたはフルオレニルである。
遊離のアミノ基を有する場合によや保護され九アミノ酸
エステルまたはその誘導体はインシュリンに対するモル
比１：５０〜１ ：５０（）、好ましくは１：１００〜
１：２５０で使用される。この反応はｐＨ５，５以下、
好ましくは褌４８〜５．０にて＋２〜＋３７℃、好まし
くは＋４〜＋１０℃で実施される。
エステルまたはその誘導体はインシュリンに対するモル
比１：５０〜１ ：５０（）、好ましくは１：１００〜
１：２５０で使用される。この反応はｐＨ５，５以下、
好ましくは褌４８〜５．０にて＋２〜＋３７℃、好まし
くは＋４〜＋１０℃で実施される。
トリノ’／ ７ （Ｂｏｙｅｒ氏等＠４ ［Ｔｈｅ Ｋ
ｎｚｙｍａｅ Ｊ第４巻第１１９〜１５２員（第４版）
および同第３巻嶋２５０〜２７５頁（第３版）参照〕と
並んで、文献上トリプシン類似であると知られるもの、
すなわち塩基性アミノ酸のカルボキシル末端で特定のペ
プチド結合を切断するエンドはブチダーゼも本発明方法
に適する〔例えば「ＫｏｎｔａｋｔｅＭｅｒｃｋ Ｊ
１ ／ ７５第８〜１０頁および２／７３第３〜８員、
「Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈａｍ、 Ｊ第３４８
巻第１６１９Ｍ（１９６７年）、「Ｏｏｍｐｔ、 Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｊ第２８巻第１２７
５頁０９６９年） 、［ｚ、 ＰｈｙｓｉｏｌＣｈｅｍ
、 Ｊ第５５２巻第５８６頁（１９７１年）、「Ａｒｃ
ｈ。
ｎｚｙｍａｅ Ｊ第４巻第１１９〜１５２員（第４版）
および同第３巻嶋２５０〜２７５頁（第３版）参照〕と
並んで、文献上トリプシン類似であると知られるもの、
すなわち塩基性アミノ酸のカルボキシル末端で特定のペ
プチド結合を切断するエンドはブチダーゼも本発明方法
に適する〔例えば「ＫｏｎｔａｋｔｅＭｅｒｃｋ Ｊ
１ ／ ７５第８〜１０頁および２／７３第３〜８員、
「Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈａｍ、 Ｊ第３４８
巻第１６１９Ｍ（１９６７年）、「Ｏｏｍｐｔ、 Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｊ第２８巻第１２７
５頁０９６９年） 、［ｚ、 ＰｈｙｓｉｏｌＣｈｅｍ
、 Ｊ第５５２巻第５８６頁（１９７１年）、「Ａｒｃ
ｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｊ第１２９巻第
６２０頁（１９６９年）および第１２６巻第９７１頁（
１９６８年）および「Ｂｉｏｃｈｓｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｅ、 Ｒｅｓ、 Ｏｏｍｍ、Ｊ第５７巻第９９頁（１９
６９年）参照〕。使用される酵素の狐はプレプロインシ
ュリン類似体：酵素のｉｔ比に基づき１：１〜１００：
１でありうる。好ましくは重φ４比１０：１〜４：１で
操作する。
６２０頁（１９６９年）および第１２６巻第９７１頁（
１９６８年）および「Ｂｉｏｃｈｓｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｅ、 Ｒｅｓ、 Ｏｏｍｍ、Ｊ第５７巻第９９頁（１９
６９年）参照〕。使用される酵素の狐はプレプロインシ
ュリン類似体：酵素のｉｔ比に基づき１：１〜１００：
１でありうる。好ましくは重φ４比１０：１〜４：１で
操作する。
本発明による反応ははじめにインシュリンのＢ３０エス
テルを生じ、これが所望の場合はそれ自体既知の方法に
よりエステル基の分解および場合により保護基の除去を
行うことにより相当する遊離のインシュリンに変換され
うる。
テルを生じ、これが所望の場合はそれ自体既知の方法に
よりエステル基の分解および場合により保護基の除去を
行うことにより相当する遊離のインシュリンに変換され
うる。
エステルは遊離のインシュリンに変換されるに先立って
例えば既知のカラムクロマトグラフィー法による必要な
精製操作を受けうる。
例えば既知のカラムクロマトグラフィー法による必要な
精製操作を受けうる。
得られるインシュリンは慣用の投薬形態に―製されそし
て糖尿病治療のための医薬として使用されうる。
て糖尿病治療のための医薬として使用されうる。
後掲の例において使用されるプレプロインシュリン類似
体は実質上既知方法（Ｖ 、Ｋ 、 Ｎａｉ ｔｈａｎ
ｉ氏他著［Ｉｎ５ｕｌｉｎｓ ｊ（Ｄ、Ｂｒａｎｄｅｎ
ｂｕｒｇおよび人。
体は実質上既知方法（Ｖ 、Ｋ 、 Ｎａｉ ｔｈａｎ
ｉ氏他著［Ｉｎ５ｕｌｉｎｓ ｊ（Ｄ、Ｂｒａｎｄｅｎ
ｂｕｒｇおよび人。
Ｗａｌ１ｍａｒ両氏編＞１９８０年版ｆｔ４９９〜１０
６貞参照〕ニ従いプ０ イア シ、：ＬリンをＢＯＣ−
Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ。
６貞参照〕ニ従いプ０ イア シ、：ＬリンをＢＯＣ−
Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ。
ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＡｄＯＣ）７−ＯＨ％ＢＯＣ−Ａｌａ
−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ％ＢＯＣ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ（ｐ、ｄＯＣ）２−ＯＲ，ＢＯＣ−Ｇｉｎ
（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＬｙＳ（ｂＯｃ）−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ（ＡｄＯＣ）２−ＯＨおよびＢＯＣ−Ｇｌ＋
１（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−０Ｈの混合無水物を用いて直
接アシル化することにより得られた。化合物の精製はイ
オン交撲体を用（・て、そして保静基の除去はトリフル
オロ酢酪を用〜・て遂行された。それぞれのアミン販分
析値は理論値と一致した。
−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ％ＢＯＣ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ（ｐ、ｄＯＣ）２−ＯＲ，ＢＯＣ−Ｇｉｎ
（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＬｙＳ（ｂＯｃ）−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ（ＡｄＯＣ）２−ＯＨおよびＢＯＣ−Ｇｌ＋
１（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−０Ｈの混合無水物を用いて直
接アシル化することにより得られた。化合物の精製はイ
オン交撲体を用（・て、そして保静基の除去はトリフル
オロ酢酪を用〜・て遂行された。それぞれのアミン販分
析値は理論値と一致した。
例 １
Ｏ−
ａ）牛のＬｙｓ プロインシュリｙ ７５ＩＩＰを
ＡＩ−ａ。
ＡＩ−ａ。
（ｔＢｑ） ２５０１１ｖと一緒に水０．５ ｗｌｔに
溶解させそしてｐＨ値を氷酢酸を用いて４８にｖ１４Ｓ
する。このｔ Ｐ２１．に水０．１ ｍに溶解した８■
のトリプシンを加える。４℃で１６時開放齢後アセトン
６８―を用いて沈殿させることにより反応を停止させる
。ｗ殿を遠心分離する。エーテルで洗ったのち真空下に
乾恢する。
溶解させそしてｐＨ値を氷酢酸を用いて４８にｖ１４Ｓ
する。このｔ Ｐ２１．に水０．１ ｍに溶解した８■
のトリプシンを加える。４℃で１６時開放齢後アセトン
６８―を用いて沈殿させることにより反応を停止させる
。ｗ殿を遠心分離する。エーテルで洗ったのち真空下に
乾恢する。
この粗製物質をシリカゲルカラム上でクロロホルム／メ
タノール／水／トリエチルアミン／１に酸（＝６００１
５００／１２０／１５／３）溶媒系を用いてクロマトグ
ラフィー処理する。最初に溶出してくるピークを業めそ
して真空下に小量となるまで一縮する。この溶液にアセ
トン２５ｍｇを加えそして沈殿した牛インシュリンＢ５
０−エステルを遠心分離する。この沈殿をエーテルで洗
いそして丼空下に乾燥する。牛インシュリフ −Ｂ ３
０− ｔＢｕの収には４１岬であった。
タノール／水／トリエチルアミン／１に酸（＝６００１
５００／１２０／１５／３）溶媒系を用いてクロマトグ
ラフィー処理する。最初に溶出してくるピークを業めそ
して真空下に小量となるまで一縮する。この溶液にアセ
トン２５ｍｇを加えそして沈殿した牛インシュリンＢ５
０−エステルを遠心分離する。この沈殿をエーテルで洗
いそして丼空下に乾燥する。牛インシュリフ −Ｂ ３
０− ｔＢｕの収には４１岬であった。
ｂ）牛インシュリンＢ５０−ニスグル２５＋＋ｖをトリ
フルオロ酸ｉ（０，５ｍ）に溶解させそして呈温で６０
分間放りする。次にエーテル５ｇＩｔを加えそして沈殿
した遅番の牛インシュリンを遠心分離しそしてエーテル
で洗った後真空下に乾燥する。収ζ２６ｑ０ アミノ酸分析、ＨＰＬＣ溶離時間および生物学的゛ｒ占
性は牛インシュリンと同じ仙−を示す。
フルオロ酸ｉ（０，５ｍ）に溶解させそして呈温で６０
分間放りする。次にエーテル５ｇＩｔを加えそして沈殿
した遅番の牛インシュリンを遠心分離しそしてエーテル
で洗った後真空下に乾燥する。収ζ２６ｑ０ アミノ酸分析、ＨＰＬＣ溶離時間および生物学的゛ｒ占
性は牛インシュリンと同じ仙−を示す。
例 ２
Ｌｙｓ −牛インシュリン（［Ｃｈｅｍｉｋｅｒ−Ｚ
ｅｉｔｕｎｇ Ｊ第１００巻第１１１頁（１９７６年）
およびＲ、Ｇｏ ｉ ｇＱ ｒ代著［Ｍｅｌａｃｕｌａ
ｒ ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙＪ （ＭａｃＩｎｔｙ
ｒｅ＆ ５ｅｌｋｅ両氏＠）挑２７〜４１頁参照〕５０
０ｗＩｆをＡｌａＯ（ｔＢｕ・）： ２ ｔと共に水３
．０−に溶解させる。
ｅｉｔｕｎｇ Ｊ第１００巻第１１１頁（１９７６年）
およびＲ、Ｇｏ ｉ ｇＱ ｒ代著［Ｍｅｌａｃｕｌａ
ｒ ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙＪ （ＭａｃＩｎｔｙ
ｒｅ＆ ５ｅｌｋｅ両氏＠）挑２７〜４１頁参照〕５０
０ｗＩｆをＡｌａＯ（ｔＢｕ・）： ２ ｔと共に水３
．０−に溶解させる。
酢酸を用いてｐＨ４，５に調整する。このインシュリン
溶液に水α５−に溶解したトリプシン２０〜を添加する
。あとは例１ａの記載と一１様にして操作する。ＨＰＬ
Ｃ分析によれば６７％の牛インシュリンＢ ３０− Ａ
ｌａ Ｏ（ｔＢｕ）をフカする粗製物餉の収ｉは５６６
■であった。カラムクロマトグラフィー精製後の収１は
４０９■である。
溶液に水α５−に溶解したトリプシン２０〜を添加する
。あとは例１ａの記載と一１様にして操作する。ＨＰＬ
Ｃ分析によれば６７％の牛インシュリンＢ ３０− Ａ
ｌａ Ｏ（ｔＢｕ）をフカする粗製物餉の収ｉは５６６
■であった。カラムクロマトグラフィー精製後の収１は
４０９■である。
エステルの除去はｖｌｌｂの記載と同様にして遂イテさ
れる。
れる。
例 ３
牛のＡｌａ、−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ −プロインシュリン
（前掲の論製法参敗）７５■を例１の記載と同様であろ
がただし−７℃およびｐＨ４，５においてトリプシンお
よびＡｌａ Ｏｔａｕと反応させる。１６時間放置後、
後処理しそして生成した牛インシュリンＢ５０−エステ
ルをクロマトグラフィー分離する。収量４７ｗｑ。
（前掲の論製法参敗）７５■を例１の記載と同様であろ
がただし−７℃およびｐＨ４，５においてトリプシンお
よびＡｌａ Ｏｔａｕと反応させる。１６時間放置後、
後処理しそして生成した牛インシュリンＢ５０−エステ
ルをクロマトグラフィー分離する。収量４７ｗｑ。
この物質のアミノ酸分析は牛インシュリンのそれと一致
する。
する。
エステルの除去は例１ｂの記載と同様にして逆行される
。
。
例 ４
Ｏ−
豚のＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙａ プロインシュリン（
例３の記載と同様にして調製）７５ｑを＋９℃およびｐ
Ｈ４，４１Ｃおいて例３の記載と同様にしてＡｌａＯｔ
Ｂｕ と反応させそして後処理する。豚インシュリンエ
ステルの収量は３９１１ＩＩであった（後処理は例１ｂ
の記載と同様である）。
例３の記載と同様にして調製）７５ｑを＋９℃およびｐ
Ｈ４，４１Ｃおいて例３の記載と同様にしてＡｌａＯｔ
Ｂｕ と反応させそして後処理する。豚インシュリンエ
ステルの収量は３９１１ＩＩであった（後処理は例１ｂ
の記載と同様である）。
例 ５
豚のＡｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ −プロインシュリン７
５ｗｑを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存在下
にＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ５００ ’１２と反応さ
せる。１６時間反応させたのちヒトインシュリンＢ３０
〜（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ ４９１１Ｆが単離されうる。
５ｗｑを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存在下
にＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ５００ ’１２と反応さ
せる。１６時間反応させたのちヒトインシュリンＢ３０
〜（ｔＢｕ）−ＯｔＢｕ ４９１１Ｆが単離されうる。
これを例１ｂの記載と同様にしてさらに操作する。
例 ６
Ｏ−
牛のＡｒｇ プロインシュリン７５Ｗをトリプシン
の存在下にｆＩＪｌａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢ
ｕ）ＯｔＢｕ ５００ Ｉｖと反応させる。−夜放置後
、例１ａの記載と同様にして後処理する。牛インシュリ
フ Ｂ ３０− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収ｌは４
５ｗｌ１であり、これを例１ｂの記載に従いさらに操作
する。
の存在下にｆＩＪｌａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢ
ｕ）ＯｔＢｕ ５００ Ｉｖと反応させる。−夜放置後
、例１ａの記載と同様にして後処理する。牛インシュリ
フ Ｂ ３０− Ｔｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収ｌは４
５ｗｌ１であり、これを例１ｂの記載に従いさらに操作
する。
例 ７
Ｏ−
豚のＡｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ プロインシュリン７
５ダを例１ａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢｕ）Ｏｔ
Ｂｕ４００１１Ｆと反応させる。６℃で２０時間反応後
のヒトインシュリンＢ ５０ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収
１は３９〜である（以後の掃作は例１ｂの記載と同様処
して行う）。
５ダを例１ａの記載と同様にしてＴｈｒ（ｔＢｕ）Ｏｔ
Ｂｕ４００１１Ｆと反応させる。６℃で２０時間反応後
のヒトインシュリンＢ ５０ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕの収
１は３９〜である（以後の掃作は例１ｂの記載と同様処
して行う）。
例 ８
牛のＧｉｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−ＬｙｓＢｏ−プロインシュリン５１１ＦをＡｌａＯｔ
Ｂｕ １５ ｗ／と共に水［１１１に溶解させる。痕跡
量の木酢幣を用いてｐＨを４〜５に１’！！ｈｌ−そし
てトリプシン１Ｍ９を加えそして４℃で２４時間反応さ
せる。ＨＰＬＣＫよれば６３チの牛インシュリンＢｇｏ
−ｔＢｕが測定され、これを例１ｂの記載と同様にして
さらに処理する。
−ＬｙｓＢｏ−プロインシュリン５１１ＦをＡｌａＯｔ
Ｂｕ １５ ｗ／と共に水［１１１に溶解させる。痕跡
量の木酢幣を用いてｐＨを４〜５に１’！！ｈｌ−そし
てトリプシン１Ｍ９を加えそして４℃で２４時間反応さ
せる。ＨＰＬＣＫよれば６３チの牛インシュリンＢｇｏ
−ｔＢｕが測定され、これを例１ｂの記載と同様にして
さらに処理する。
例 ９
豚のＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｉｎ
−ＡｒｇＢＯ−プロインシュリン５■を例８の記載と１
１ｆｆ＋様にして酎（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ２５ ’１？
と反え、させる。２４ＰＦ間反応させた後ＨＰＬＣＫよ
れば７１チのヒトインシュリンＢ ３０− （ｔＢｕ）
ＯｔＢｕが分析された。製造用几を用いてエステルを単
象できた。収′％２．８ｗｑ０第３ブチル保護基を常法
により除去した後の生成物はＨＰＬＣおよびアミノ酸分
析でヒトインシュリンと同一であった。
−ＡｒｇＢＯ−プロインシュリン５■を例８の記載と１
１ｆｆ＋様にして酎（ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ２５ ’１？
と反え、させる。２４ＰＦ間反応させた後ＨＰＬＣＫよ
れば７１チのヒトインシュリンＢ ３０− （ｔＢｕ）
ＯｔＢｕが分析された。製造用几を用いてエステルを単
象できた。収′％２．８ｗｑ０第３ブチル保護基を常法
により除去した後の生成物はＨＰＬＣおよびアミノ酸分
析でヒトインシュリンと同一であった。
例 １０
豚のＰｒｏ−Ａｌａ−人１ａ−Ｌｙｓ”−プロインシュ
リン７５ηを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存
在下Ｋ Ｔｈｒ（ｔ８ｕ）ＯｔＢｕ ５００ ｗＩ！と
反応させる。
リン７５ηを例１ａの記載と同様にしてトリプシンの存
在下Ｋ Ｔｈｒ（ｔ８ｕ）ＯｔＢｕ ５００ ｗＩ！と
反応させる。
１６時間反応させた後に５２〜のヒトインシュリフ Ｂ
３０− （ｔＢｕ）−０ｔＢｕが単離され得る。これ
を例１ｂの記載と同様にしてさらに操作する。
３０− （ｔＢｕ）−０ｔＢｕが単離され得る。これ
を例１ｂの記載と同様にしてさらに操作する。
特許出願人 ヘキスト・アクチェンケセルシャフド−
〕代゛ 手続補正書 昭和５８年６月９日 特許庁長官 着 杉和 夫 殿 １、＊件の表示 昭和５８１１′、特許願第 ５９２９８ 号２、 発明
ノ名称 インシュリンへのプレプロインクニリン類似
体の変換法 ３、補正をする考 ・１ｆ件との関係 特許出願人 名称 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト４、代理
人 ｉｔ 所 東中部ｒ代１１１１ズ缶Ｉ町３ｒｔｉ２
番地（、相Ｊ１ザ５−ビル）５、補正命令の１１イ・１
（自発） 昭和 年 月 １１（発送１１ 昭＆１４正ｏ
対象 明細蓄の特許請求の範囲の樫７、補正の内容 特許請求の範囲を別紙のとおり補正します。
〕代゛ 手続補正書 昭和５８年６月９日 特許庁長官 着 杉和 夫 殿 １、＊件の表示 昭和５８１１′、特許願第 ５９２９８ 号２、 発明
ノ名称 インシュリンへのプレプロインクニリン類似
体の変換法 ３、補正をする考 ・１ｆ件との関係 特許出願人 名称 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト４、代理
人 ｉｔ 所 東中部ｒ代１１１１ズ缶Ｉ町３ｒｔｉ２
番地（、相Ｊ１ザ５−ビル）５、補正命令の１１イ・１
（自発） 昭和 年 月 １１（発送１１ 昭＆１４正ｏ
対象 明細蓄の特許請求の範囲の樫７、補正の内容 特許請求の範囲を別紙のとおり補正します。
以北
２、ＩＩＩｇ許請求の範囲
１）プレプロインシュリン類似体をインシュリンの等ｔ
、点以下のｐＨでトリプシンまたはトリプシン類似のエ
ンドはプチターゼの存在下に天然アミノ酸のエステ、ｖ
ｊたはその誘導体と反応させそして次にエステル基およ
び場合により存在する他の保護基を除去することを特徴
とする、プレプロインシュリン類（１からのインシュリ
ンの製法。
、点以下のｐＨでトリプシンまたはトリプシン類似のエ
ンドはプチターゼの存在下に天然アミノ酸のエステ、ｖ
ｊたはその誘導体と反応させそして次にエステル基およ
び場合により存在する他の保護基を除去することを特徴
とする、プレプロインシュリン類（１からのインシュリ
ンの製法。
２）使用されるアミノ酸誘導体がＡｈａ−ＯｔＢｕまた
はＴｈｒ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ′ｔ？あること全特徴
とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
はＴｈｒ （ｔＢｕ）ＯｔＢｕ ′ｔ？あること全特徴
とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
３） ｐＨ五８〜Ｓ５で操作が行なわれる前記特許請
求の範囲第１項記載の方法。
求の範囲第１項記載の方法。
４） ｐＨ五８〜５０で操作が行なわれる前記特許請
求の範囲第１項記載の方法。
求の範囲第１項記載の方法。
５）酵素−基ｖＬ重貴比が１：１〜に１００である前記
層許請求の範囲第１項記載の方法。
層許請求の範囲第１項記載の方法。
司 酵素−基買敵飯比が１：４〜１：１０である前記特
許請求の範囲第１項記載の方法。
許請求の範囲第１項記載の方法。
Ｈｓｏ〜ｓｏｎ倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはそ
のａＳ体が使用される前記峙許罷求の範囲＠ｉ項記載の
方法。
のａＳ体が使用される前記峙許罷求の範囲＠ｉ項記載の
方法。
８） １００〜２５０倍モル過剰のアミノ酸エステル
また社その誘導体が使用される前記特許請求の範囲第１
項記載の方法。
また社その誘導体が使用される前記特許請求の範囲第１
項記載の方法。
９）反応温度が＋２〜４−３７℃である前記特許請求の
範囲第１項記載の方法。
範囲第１項記載の方法。
１０）反応温度が＋４〜１１０℃である前記特許請求の
範囲第１項記載の方法。
範囲第１項記載の方法。
１１１ ｐＦｆ＆８〜５５で４作が行なわれ、酵素−
基質ＩＩＩ比が１：１〜１：１ｎＯにあり、５０〜５ｆ
’ｌｎ倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されてして反応温度が１２〜÷３７℃であること
？：％徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
基質ＩＩＩ比が１：１〜１：１ｎＯにあり、５０〜５ｆ
’ｌｎ倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されてして反応温度が１２〜÷３７℃であること
？：％徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の方法。
１２） ｐＦＴ五８〜５．０で操作が行なわれ、酵素
−基１ｉ、重量比が１：４〜１：１０にあり、１００〜
２５０倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されそして反♂温度が＋４〜＋１０℃であること
を特徴とする特許 囲第１項記載の方法。
−基１ｉ、重量比が１：４〜１：１０にあり、１００〜
２５０倍モル過剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体
が使用されそして反♂温度が＋４〜＋１０℃であること
を特徴とする特許 囲第１項記載の方法。
６４７−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）プレプロインシュリン類似体をインシュリンの等電
点以下の坦でトリプシンまたは類似のエンドベプチタ；
ゼの存在下に天然アミノ酸のエステルまたはその誘導体
と反応させそして次にエステル基および場合により存在
する他の保饅基を除去することを！徴とする、プレプロ
インシュリン類似体からのインシュリンの製法。 ２）使用されるアミノ醒誘導体がＡｌａ−ＯｔＢｕまた
はＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯｔＢｕであることを特徴とする特
許３） ｐＨ３．８〜５５で操作が行われ、酵弊一基
簀１を比が１；１〜１：１［１（３にあり、５０〜５０
０倍モル迦剰のアミノ艶・エステルまたはその誘導体が
使用されそして反応温度が＋２〜＋３７℃であることを
待機とする罰記％許膀求の範囲第１項記載の方法。 ４）ｐＨ３．８〜５０で操作が行われ、醇象一基質▲ゑ
比が１：４〜１：１０にあり、１００〜２５０倍モル過
剰のアミノ酸エステルまたはその誘導体が使用されそし
て反応温度が＋４〜＋１０℃であることを特徴とするｐ
＋１記特ト論求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3209184.2 | 1982-03-13 | ||
| DE19823209184 DE3209184A1 (de) | 1982-03-13 | 1982-03-13 | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58190398A true JPS58190398A (ja) | 1983-11-07 |
| JPH0536034B2 JPH0536034B2 (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=6158163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58039298A Granted JPS58190398A (ja) | 1982-03-13 | 1983-03-11 | インシユリンへのプレプロインシユリン類似体の変換法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4639333A (ja) |
| EP (1) | EP0089007B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58190398A (ja) |
| KR (1) | KR900003502B1 (ja) |
| AT (1) | ATE21118T1 (ja) |
| AU (1) | AU553832B2 (ja) |
| CA (1) | CA1195273A (ja) |
| DE (2) | DE3209184A1 (ja) |
| DK (1) | DK154573C (ja) |
| ES (1) | ES8401448A1 (ja) |
| FI (1) | FI79117C (ja) |
| GR (1) | GR78453B (ja) |
| IE (1) | IE54605B1 (ja) |
| IL (1) | IL68103A (ja) |
| ZA (1) | ZA831693B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| US4581165A (en) * | 1984-06-14 | 1986-04-08 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| US4569791A (en) * | 1984-06-14 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| US4569792A (en) * | 1984-06-14 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| AU612141B2 (en) * | 1987-02-25 | 1991-07-04 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives |
| US5514646A (en) * | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
| CZ283234B6 (cs) * | 1990-09-05 | 1998-02-18 | Hoechst Aktiengesellschaft | Enymatický způsob konverse preproinsulinů na insuliny |
| WO2010016069A1 (en) | 2008-08-07 | 2010-02-11 | Biocon Limited | A process for preparation of insulin compounds |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55138393A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | Semisynthesis of insulin |
| JPS56135452A (en) * | 1980-02-11 | 1981-10-22 | Novo Industri As | Manufacture of insulin ester |
| JPS56150051A (en) * | 1980-03-27 | 1981-11-20 | Lilly Co Eli | Manufacture of insulin precursor |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| GB1426061A (en) * | 1972-12-28 | 1976-02-25 | Ici Ltd | Polypeptides |
| US3903068A (en) * | 1972-12-26 | 1975-09-02 | Us Health Education & Welfare | Facile synthesis of human insulin by modification of porcine insulin |
| DK146482C (da) * | 1979-04-13 | 1986-10-06 | Shionogi & Co | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
-
1982
- 1982-03-13 DE DE19823209184 patent/DE3209184A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-03-10 EP EP83102337A patent/EP0089007B1/de not_active Expired
- 1983-03-10 DE DE8383102337T patent/DE3364838D1/de not_active Expired
- 1983-03-10 AT AT83102337T patent/ATE21118T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-10 FI FI830813A patent/FI79117C/fi not_active IP Right Cessation
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- 1983-03-11 AU AU12428/83A patent/AU553832B2/en not_active Ceased
- 1983-03-11 ZA ZA831693A patent/ZA831693B/xx unknown
- 1983-03-11 GR GR70765A patent/GR78453B/el unknown
- 1983-03-11 CA CA000423391A patent/CA1195273A/en not_active Expired
- 1983-03-11 JP JP58039298A patent/JPS58190398A/ja active Granted
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- 1983-03-11 KR KR1019830000978A patent/KR900003502B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-03-11 DK DK117883A patent/DK154573C/da not_active IP Right Cessation
- 1983-03-11 IE IE529/83A patent/IE54605B1/en not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-10-12 US US06/659,865 patent/US4639333A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS56135452A (en) * | 1980-02-11 | 1981-10-22 | Novo Industri As | Manufacture of insulin ester |
| JPS56150051A (en) * | 1980-03-27 | 1981-11-20 | Lilly Co Eli | Manufacture of insulin precursor |
Also Published As
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