JPS642360B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ 基質成分として、ブタインスリンIns−Ala
−OHを、 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中、Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中、Ｂはスレオニン残基を表わし、そして
R3はアルキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステルよりなる群より選択
したアミン成分と、約７から10.5までのPHの水溶
液または分散液中で、Ｌ−特異的セリンまたはチ
オールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在で反応
させて、インスリン誘導体 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−Ｂ−NH2、または Ins−Ｂ−OR3 とし、所望により、ついで、基−NH2、−Ｂ−
NH2または−OR3を開裂させることを特徴とす
る、ブタインスリン中のＢ−30アミノ酸を酵素的
におきかえる方法。 ２ カルボキシペプチダーゼ酵素を用いて、基−
NH2、−Ｂ−NH2または−OR3を除去することを
特徴とする、上記１項記載の方法。 ３ PH＞9.0においてアミダーゼ活性を示すカル
ボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴とす
る、上記１項に記載の方法。 ４ PH４から９においてペプチダーゼ活性を示す
カルボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴
とする、上記１項記載の方法。 ５ カルボキシペプチダーゼ酵素として、酵母ま
たは動物、植物または微生物由来のセリンまたは
チオールカルボキシペプチダーゼを用いることを
特徴とする、上記１項記載の方法。 ６ カルボキシペプチダーゼ酵素として、酵母か
らのカルボキシペプチダーゼＹを用いることを特
徴とする、上記５項記載の方法。 ７ 複数のカツプルされたベンジルスクシニル基
を有する重合体樹脂マトリツクスを含有するアフ
イニテイ樹脂上のアフイニテイクロマトグラフイ
ーにより精製されたカルボキシペプチダーゼＹを
用いることを特徴とする上記６項記載の方法。 ８ Penicillium janthinellumよりのペニシロカ
ルボキシペプチダーゼＳ−１およびＳ−２、
Aspergillus saitoiまたはAspergillus oryzaeよ
りのカルボキシペプチダーゼ、オレンジの葉また
は果皮よりのカルボキシペプチダーゼC.citrus
natsudaidai Hayataよりのカルボキシペプチダ
ーゼCN、フレンチ豆の葉からのフアゼオリン、
発芽大麦、発芽棉植物、トマト、ウオーターメロ
ンおよびBromelain（パインアツプル）粉よりの
カルボキシペプチダーゼよりなる群より選択した
カルボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴
とする、上記５項記載の方法。 ９ 固定化カルボキシペプチダーゼ酵素を用いる
ことを特徴とする、上記１項記載の方法。 １０ 溶液または分散液のPHを7.5から10.5に保
つことを特徴とする、上記１項記載の方法。 １１ PH7.5から10.5までの緩衝液中かまたは反
応混合物中の測定PH値に従い、水溶液に酸または
塩基を加えることで一定にした、7.5から10.5ま
での範囲内にある望むPHで反応を行なうことを特
徴とする、上記１０項記載の方法。 １２ ０から50容量％の有機溶媒を含有する水性
反応溶液または分散液を用いることを特徴とす
る、上記１から１０項までのいずれか一項に記載
の方法。 １３ アルカノール、ジメチルスルホキサイド、
ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン、エチレングリコー
ルおよびポリエチレングリコールよりなる群より
選択した有機溶媒を用いることを特徴とする、上
記１２項記載の方法。 １４ 尿素またはグアニジン塩酸塩を３モル以下
の濃度で含有する水溶液または分散液を用いるこ
とを特徴とする、上記１から１２項までのいずれ
か一項に記載の方法。 １５ 0.01から0.5モルのインスリン基質成分お
よび0.05から３モルのアミン成分の出発濃度で反
応を行なうことを特徴とする、上記１から１４項
までのいずれか一項に記載の方法。 １６ 10-6から10-4モルのカルボキシペプチダー
ゼ酵素濃度で反応を行なうことを特徴とする、上
記１から１５項までのいずれか一項に記載の方
法。 １７ アミン成分がスレオニンアミドであること
を特徴とする、上記１から１６項のいずれか一項
に記載の方法。 １８ 式 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−Ｂ−NH2または Ins−Ｂ−OR3 （式中ＢおよびR3は上記の意味を有する） で示されるインスリン誘導体を、約７から約10.5
のPHの水溶液または分散液中で、酵母または動
物、植物または微生物由来のＬ−特異的セリンま
たはチオールカルボキシペプチダーゼ酵素で処理
することを特徴とする、上記１項記載の方法。 発明の背景 １ 発明の分野 本発明は、一般的に、種々の種よりのインスリ
ンのＢ−鎖（Ｂ−30）中のＣ−末端アミノ酸を酵
素的に置き代える方法に関する。 哺乳動物およびヒトを含めた種々の哺乳動物の
種よりのインスリンがそれらの１次構造において
異なつていることがよく知られている。1958年に
Sangerがウシインスリンの１次構造を決定して
以来、他の哺乳動物のインスリンの１次構造が決
定された。
−OHを、 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中、Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中、Ｂはスレオニン残基を表わし、そして
R3はアルキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステルよりなる群より選択
したアミン成分と、約７から10.5までのPHの水溶
液または分散液中で、Ｌ−特異的セリンまたはチ
オールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在で反応
させて、インスリン誘導体 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−Ｂ−NH2、または Ins−Ｂ−OR3 とし、所望により、ついで、基−NH2、−Ｂ−
NH2または−OR3を開裂させることを特徴とす
る、ブタインスリン中のＢ−30アミノ酸を酵素的
におきかえる方法。 ２ カルボキシペプチダーゼ酵素を用いて、基−
NH2、−Ｂ−NH2または−OR3を除去することを
特徴とする、上記１項記載の方法。 ３ PH＞9.0においてアミダーゼ活性を示すカル
ボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴とす
る、上記１項に記載の方法。 ４ PH４から９においてペプチダーゼ活性を示す
カルボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴
とする、上記１項記載の方法。 ５ カルボキシペプチダーゼ酵素として、酵母ま
たは動物、植物または微生物由来のセリンまたは
チオールカルボキシペプチダーゼを用いることを
特徴とする、上記１項記載の方法。 ６ カルボキシペプチダーゼ酵素として、酵母か
らのカルボキシペプチダーゼＹを用いることを特
徴とする、上記５項記載の方法。 ７ 複数のカツプルされたベンジルスクシニル基
を有する重合体樹脂マトリツクスを含有するアフ
イニテイ樹脂上のアフイニテイクロマトグラフイ
ーにより精製されたカルボキシペプチダーゼＹを
用いることを特徴とする上記６項記載の方法。 ８ Penicillium janthinellumよりのペニシロカ
ルボキシペプチダーゼＳ−１およびＳ−２、
Aspergillus saitoiまたはAspergillus oryzaeよ
りのカルボキシペプチダーゼ、オレンジの葉また
は果皮よりのカルボキシペプチダーゼC.citrus
natsudaidai Hayataよりのカルボキシペプチダ
ーゼCN、フレンチ豆の葉からのフアゼオリン、
発芽大麦、発芽棉植物、トマト、ウオーターメロ
ンおよびBromelain（パインアツプル）粉よりの
カルボキシペプチダーゼよりなる群より選択した
カルボキシペプチダーゼ酵素を用いることを特徴
とする、上記５項記載の方法。 ９ 固定化カルボキシペプチダーゼ酵素を用いる
ことを特徴とする、上記１項記載の方法。 １０ 溶液または分散液のPHを7.5から10.5に保
つことを特徴とする、上記１項記載の方法。 １１ PH7.5から10.5までの緩衝液中かまたは反
応混合物中の測定PH値に従い、水溶液に酸または
塩基を加えることで一定にした、7.5から10.5ま
での範囲内にある望むPHで反応を行なうことを特
徴とする、上記１０項記載の方法。 １２ ０から50容量％の有機溶媒を含有する水性
反応溶液または分散液を用いることを特徴とす
る、上記１から１０項までのいずれか一項に記載
の方法。 １３ アルカノール、ジメチルスルホキサイド、
ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン、エチレングリコー
ルおよびポリエチレングリコールよりなる群より
選択した有機溶媒を用いることを特徴とする、上
記１２項記載の方法。 １４ 尿素またはグアニジン塩酸塩を３モル以下
の濃度で含有する水溶液または分散液を用いるこ
とを特徴とする、上記１から１２項までのいずれ
か一項に記載の方法。 １５ 0.01から0.5モルのインスリン基質成分お
よび0.05から３モルのアミン成分の出発濃度で反
応を行なうことを特徴とする、上記１から１４項
までのいずれか一項に記載の方法。 １６ 10-6から10-4モルのカルボキシペプチダー
ゼ酵素濃度で反応を行なうことを特徴とする、上
記１から１５項までのいずれか一項に記載の方
法。 １７ アミン成分がスレオニンアミドであること
を特徴とする、上記１から１６項のいずれか一項
に記載の方法。 １８ 式 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−Ｂ−NH2または Ins−Ｂ−OR3 （式中ＢおよびR3は上記の意味を有する） で示されるインスリン誘導体を、約７から約10.5
のPHの水溶液または分散液中で、酵母または動
物、植物または微生物由来のＬ−特異的セリンま
たはチオールカルボキシペプチダーゼ酵素で処理
することを特徴とする、上記１項記載の方法。 発明の背景 １ 発明の分野 本発明は、一般的に、種々の種よりのインスリ
ンのＢ−鎖（Ｂ−30）中のＣ−末端アミノ酸を酵
素的に置き代える方法に関する。 哺乳動物およびヒトを含めた種々の哺乳動物の
種よりのインスリンがそれらの１次構造において
異なつていることがよく知られている。1958年に
Sangerがウシインスリンの１次構造を決定して
以来、他の哺乳動物のインスリンの１次構造が決
定された。
【表】
ブタインスリンをモデルに用いる後図に要約す
る結果は、いずれかの鎖においても、多くの位置
において、アミノ酸の置換がおこりうることを示
す。しかし、ある構造的特徴は、すべてのインス
リンに共通している。つまり、３個のジスルフア
イド結合の位置、Ａ−鎖のＮ−末端部分、Ｂ−鎖
のＣ−末端中のB23−26配列等である。 いくつかのふつうのインスリンの１次構造中の
差を次表に示す。
る結果は、いずれかの鎖においても、多くの位置
において、アミノ酸の置換がおこりうることを示
す。しかし、ある構造的特徴は、すべてのインス
リンに共通している。つまり、３個のジスルフア
イド結合の位置、Ａ−鎖のＮ−末端部分、Ｂ−鎖
のＣ−末端中のB23−26配列等である。 いくつかのふつうのインスリンの１次構造中の
差を次表に示す。
【表】
本発明は、ブタインスリンのヒトインスリンへ
の特異的変換、つまり、Ｂ−30アラニンをスレオ
ニンに置き換えることに関連して以下により詳細
に記載するけれども、容易に理解されうるよう
に、本発明の方法は、他の型のインスリン、にも
同様に適用しいる。たとえば、ウサギのインスリ
ンをヒトインスリンに変えうるし、ウシインスリ
ンをＢ−30（スレオニン）ウシインスリンに変え
うる等である。 ２ ブタインスリンのヒトインスリンへの変換に
特に関連した、本発明の背景 半合成的操作により、ブタインスリンをヒトイ
ンスリンに変換することは、インスリン化学の分
野で魅力ある問題であつた。 上記したように、ヒトインスリンはブタインス
リンより１個だけのアミノ酸が異なる。つまりＢ
−鎖のＣ−末端残規がヒトではスレオニンで、ブ
タではアラニンである。アラニンのスレオニンへ
の変換は、最初化学的に行なわれたが、最近にな
り酵素的操作も用いられている。Ruttenberg
（1972）（参照文献１）は、ブタインスリンのヒト
インスリンへの化学的変換を記載している。つま
り、インスリンヘキサメチルエステルへのエステ
ル化、デスオクタペプチドインスリン（DOI）−
ペンタメチルエステルへのトリプシンを用いる水
解、アミノ末端残基の保護、相当するヒトインス
リン配列の合成オクタペプチドとの化学的カツプ
リング、アミノ基の酸性脱保護、そして最後に、
メチルエステル基のアルカリ性けん化である。し
かし、この方法で純粋なインスリンを製造するこ
とは、誰も成功していない。その理由は、化学的
操作、特に、最後のアルカリけん化の段階は、イ
ンスリン分子を著しく損傷し、さらに、Ａ−鎖の
Ｃ−末端残基の部分にイソアスパラギンが形成す
るからである（Gattner等、参照文献２）。この
影響を防ぐために、ObermeierおよびGeiger
（1976）（参照文献３）は、DOIの側鎖カルボキシ
ル基を保護しないで、フラグメント縮合を行なつ
た。反復精製のあとにヒトインスリンを分離しえ
たけれども、非常に低収量で得られたのみであつ
た。同様なアプローチを、Gattner等（参照文献
２）は、種々のインスリンフラグメントを用いて
実施している。しかし、化学的方法によつては、
純粋なヒトインスリンを痕跡量しか得ていない。 M.Bodanszky等は、U.S.特許No.3276961にヒト
インスリンを製造する方法を提供している。ここ
で、スレオニンの存在で、カルボキシペプチダー
ゼＡおよびトリプシンのような酵素の作用によ
り、他の動物インスリンよりヒトインスリンが製
造されたとされている。この方法がヒトインスリ
ンを生成するようには思われない。その理由は、
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡは、
リジル−アラニン（Ｂ−29−B30）のペプチド結
合のみならず、インスリンの他の位置をも、上記
条件で水解してしまうようであるゆえである。ト
リプシンは、リジル−アラニン（B29−B30）の
ペプチド結合よりも、アルギニル−グリシン
（B22−B23）のペプチド結合を優先的に水解す
る。他方、カルボキシペプチダーゼＡは、Ａ鎖の
Ｃ−末端のアスパラギンを遊離さすことなしに、
Ｂ鎖のＣ−末端のアラニンのみを遊離させえな
い。特殊な条件、つまり重炭酸アンモニウム緩衝
液中で反応さすことが、アスパラギンの放出を防
止するのに必要である。この条件は、1978年に発
見された（Schmitt、Hoppe−Seyler′s Z.
Physiol.Chem.、359、799−802（1978））。さら
に、この条件では、水解の割合が合成の割合より
速いので、ペプチド合成はほとんどおこり得な
い。Inouye等（参照文献４）は、トリプシンを
触媒に用い、ブタインスリンよりのＮ−末端保護
DOIとヒトインスリンのＢ−23−B30残基に対応
する合成オクタペプチドをカツプリングさせて、
ヒトインスリンが得られることを示した。 しかし、この方法は、つぎの点で面倒である。 つまり、まず、ブタインスリンのトリプシン触
媒消化でDOIを形成させ、これを、BOC−N3で
アシル化してＮ−末端保護し、ついで、B29リジ
ンがBOC保護されている、別に合成させたヒト
B23−B30オクタペプチドと20時間インキユベー
トせねばならない。得られる（BOC）3−ヒトイ
ンスリンは、ついで、０℃で60分間トリフルオル
酢酸／アニソールで脱保護する。収量は、用いた
（BOC）2−DOI基準で49％であつた。 同様に、Morihara等（参照文献５）は、ブタ
インスリンをカルボキシペプチダーゼＡで８時間
消化して得られたデス−アラニン（Ｂ−30）−イ
ンスリン（DAI）よりヒトインスリンを合成し
た。DAI（10ｍＭ）を、有機共溶媒の高濃度の存
在で、37℃で20時間、大過剰（0.5M）のスレオ
ニン−OButエステルとインキユベートした。生
成したインスリン（Thf−OBut−Ｂ−30）より、
ついで、アニソールの存在でトリフルオル酢酸で
脱保護した。収量は41％であつた。同様な実験
で、〔Thr−Ｂ−30〕ウシインスリンを60％収率
で得た。 この方法もまた、最初のインスリンを予備処理
する必要、カツプリング時間の長いこと、別に除
保護の段階が必要な点で面倒である。さらに、酵
素の水解活性をできるだけ少なく抑制するため
に、大量の有機共−溶媒が必要である。 同様な実験でMorihara等（参照文献６）は、
〔Thr−OBut−Ｂ−30〕インスリン形成下の、
DAIと大過剰のThr−OButとのカツプリングの
ための酵素触媒としてAchromobacter Protease
Ｉを用いたが、ついで生成物を分離し除保護して
いる。高収率（52％）を達成しうるが、反応時間
は20時間である。 ウシインスリンを用いる同様な実験は、58％収
率で〔Thr−OBut−Ｂ−30〕を与えている。 参照文献５および６に記載の方法は、1980年10
月29日公告のヨーロツパ特許願No.EP17938および
オランダ特許願No.1556／80に記載されている。 最近、WidmerおよびJohansen（参照文献７）
および1979年４月６日願オランダ特許願No.1443／
79に、酵素カルボキシペプチダーゼ−Ｙがペプチ
ド合成に有効な触媒であることが示されている。
さらに、その酵素は、ある条件では、ペプチド転
移反応で、ペプチドのＣ−末端アミノ酸を別のア
ミノ酸またはアミノ酸誘導体との交換を触媒する
ことが示された。（1980年４月１日出願の、
WO80／02151として1980年10月16日公告の国際
特許願No.PCT／DK80／00020、1980年10月15日
公告ヨーロツパ特許願No.EP17485、1980年４月２
日願US特許願シリーズNo.136611および1980年12
月２日願の、上記PCT／DK80／00020を基礎と
するシリースNo.220022を参照せよ）。基礎となつ
ている反応の原則は、発明者のBreddam等（参
照文献11）によりくわしく説明されている。彼等
はまた、これまでに知られていなかつた、CPD
−Ｙのペプチジル−アミノ酸−アミド水解活性を
見出だした。上記の特許願および発明者による論
文は、本明細書の参考として採用する。 酵素触媒ペプチド転移反応の一般的原則は、上
記のPCTおよびUS特許願に記載され例示されて
いるけれども、インスリンに関連してのそれらの
応用の可能性については述べられていないし、示
されてもいない。 本発明の要約 本発明の目的は、インスリンのＢ−30アミノ酸
を酵素的に置き代える方法を提供するが、この方
法は、上記したような欠点がなく、より具体的に
は、インスリン出発材料の予備処理、長い反応時
間および化学的除保護の段階を必要としない。 より具体的には、本発明の目的は、高収量そし
て高純度に、ブタインスリンをヒトインスリンに
変換するための独特かつ簡単な方法を提供するこ
とである。 本発明の別の目的は、種々のインスリンを、そ
れらの由来にかかわりなく、Ｂ−30カルボキシル
基の保護されたインスリン誘導体を開裂する、特
にアミド誘導体を脱アミドするための改良方法を
提供する。 簡潔に述べれば、本発明の上記目的および他の
目的は、インスリン中のＢ−30アミノ酸を酵素的
におき換えることで達成可能で、つぎの段階を包
含する。 基質成分として、ブタインスリンIns−Ala−
OHを、 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中Ｂはスレニオン残基であり、そしてR3は
アルキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステルよりなる群より選択
したアミン成分と、約７から10.5までのPHの水溶
液または分散液中で、Ｌ−特異的セリンまたはチ
オールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在で反応
させて、インスリン誘導体、 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−BrNH2または Ins−Ｂ−OR3 とし、所望により、ついで、基−NH2、−Ｂ−
NH2または−OR3を開裂させることからなる。 上記した開裂段階は、もちろん、第１のペプチ
ド転移段階で製造されたインスリン誘導体に限定
されず、その由来にかかわりなく、そのような誘
導体のいずれにも、特に、例５に下記するような
EP17938に準じ製造される誘導体に応用される。 有利な具体例の詳細な記載 本発明は、中間体の分離および引続く除保護処
理なしに、単一段階で、上記した酵素カルボキシ
ペプチダーゼＹが、Ｂ−30アラニンをスレオニン
で交換することにより、ブタインスリンとヒトイ
ンスリンに変換しうることの驚くべき認識を基礎
としている。場合により、インスリンアミド中間
体を分離でき、そして望むならば、引続き、同じ
酵素カルボキシペプチダーゼＹを用いて脱アミド
しうる。 以下にさらにくわしく記すように、本発明にも
つとも適しているスレオニン誘導体は、スレオニ
ンアミドである。しかし、この変換で、しばし
ば、ヒトインスリンとある量の未反応ブタインス
リンとの混合物を生じ、それらを分けるのは困難
である。それで、なるべくは、生成したインスリ
ンアミド中間体を、反応混合物、つまり未反応ブ
タインスリンを含有する混合物より分け、そし
て、ついで、以下にやはり、くわしく記すよう
に、なずべくは同じ酵素カルボキシペプチダーゼ
Ｙを用いて脱アミドする。 上記特許願および論文に詳しく記載されたよう
に、CPD−Ｙのペプチダーゼ特異性は広いので、
本発明は、出発物質としてブタインスリンに限定
されず、他のインスリン、つまり上記した他の種
に由来するインスリンも使用でき、任意の他のア
ミノ酸を交換反応に用いうる。 下記するように、さらに他の酵素も使用しう
る。 本発明の方法の単純さは、たとえ、特許願
PCT／DK80／00020およびU.S.特許No.3276961
（Bodanszky）が背景にあるにしても、驚くべき
ものがある。つまり、Ｂ−30アミノ酸のみならず
すべての上記した既知のインスリンに共通の、Ａ
−21アスパラギンもまた、その酵素により攻撃さ
れうると期待されるところであるからである。 上記した以前の特許願において、一般的ペプチ
ド合成に関連する望ましい酵素の特性は詳記され
ており、それで、多くのカルボキシペプチダーゼ
は、PHにきわめて影響されやすい種々の酵素活性
を示し、つまり、PH８から10.5までの基本的環境
では、それらの酵素は、主として、アミダーゼま
たはエステラーゼ活性を示し、そして、９から
10.5のPHでは、まつたくカルボキシペプチダーゼ
活性を示さないか、ほととんど示さず、この活性
は、９よりPHが低くなると共に、より顕著になつ
てくる。エステラーゼ活性は、こここではあまり
重要でないが、しかし、別様には、これらの性質
を、好収量の１段階方法の達成に役立つので、本
発明の方法に用いて有利でありうる。 本発明方法で用いうるカルボキシペプチダーゼ
は、Ｌ−特異的セリンまたはチオールカルボキシ
ペプチダーゼである。これらの酵素は酵母により
生産されうるし、動物、植物または微生物由来で
ありうる。 特に便宜な酵素は、酵母に由来するカルボキシ
ペプチダーゼＹ（CPD−Ｙ）である。この酵素
は、以前の特許願つまりJohansen等（参照文献
８）に記載されている。彼等は、ベンジルスクシ
ニル基のカツプルした重合体樹脂マトリツクスを
含有するアフイニテイ樹脂上のアフイニテイクロ
マトグラフイーによる、特に便宜な精製方法を開
発した。セリン酵素であるCPD−Ｙは、PH９に
おいて異なる酵素活性のあいだの上記関係を有す
ることおよびエンドペプチダーゼ活性がまつたく
ないことを特徴としている。CPD−Ｙの別の利
点は、大量に使用でき、比較的大きい安定性をを
示すということである。さらに詳細については、
参照文献７および11に記してある。 現在のところ有利な酵素であるCPD−Ｙに加
えて、本発明方法は、つぎの一覧表に示すような
他のカルボキシペプチダーゼを用いても可能であ
る。 由 来酵 素 か び ペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−１
Penicillium janthinellum ペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−２
Penicillium janthinellum カルボキシペプチダーゼ Aspergillus saitoi カルボキシペプチダーゼ Aspergillus oryzae 植 物 カルボキシペプチダーゼＣ オレンジ葉 オレンジ皮 カルポキシペプチダーゼCN
Citrus natsudaidai Hayata フアゼオレイン（Phaseolain） フレンチ豆の葉 カルボキシペプチダーゼ 発芽大麦 発芽棉植物 トマト ウオーターメロン Bromelain（パイナツプル）粉末 上記カルボキシペプチダーゼの多くのものの密
接な関係はKubota等（参照文献12）により論ぜ
られており、上記各カルボキシペプチダーゼの製
法および性質はそれぞれ、下記の文献に記載され
ている： Penicillum janthinellum由来のカルボキシラ
ーゼ：S.Yokoyama等によるAppl.Microbiol.27
（1974年）953〜960頁およびS.Yokoyama等によ
るAgr.Biol.Chem.、39（1975年）、1211〜1217
頁； Aspergillus saitoiおよびAspergillus Oryzae
由来のカルボキシペプチダーゼ： T.Arai等によるJ.Biochem.、76（1974年）、
765〜769頁およびE.IchishimaによるBiochim、
Biophys.Acta、258（1972年）、274〜288頁； Citrus natsudaidai Hayata由来のカルボキシ
ペプチダーゼＣおよびフレンチ豆、発芽大麦、お
よび発芽棉植物由来のカルボキシペプチダーゼ：
Y.Kubota等によるJ.Biochem.74（1973年）、757
〜770頁。 本発明方法は、原理的に、天然、半合成または
合成のインスリンのいずれを基質成分としても実
施しうる。 インスリン出発物質の成分である個々のアミノ
酸に存在するイオン化しうる基は、望むならば、
基の型に応じて既知の方法で保護しうることを述
べておく。しかし、このことは絶対に必要なわけ
でなく、このことは、本発明方法の利点となる。
ある理由から、官能基を保護したいならば、適当
な保護基は、上記の特許願特に、WO80／02151
に見出だしえよう。 反応に関与する第２の成分は、いわゆるアミン
成分で、それらは、つぎの群より選択する。 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中Ｂはスレオニン残基を表わし、そしてR3
はアリキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステル。 本明細書で、“アルキル基”とは、直鎖または
枝分れ鎖状のアルキル基、なるべくは、１から６
炭素原子数の基、たとえば、メチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イ
ソブチル基、３級ブチル基、アミル基、ヘキシル
基および類似の基を意味する。 従つて、基−OR3はアルコキシ基、たとえばメ
トキシ基、エトキシ基または３級ブトキシ基より
選ばれる。これらの基には、、場合により、不活
性の置換基、たとえばニトロ基、が存在していて
もよい。 上記のように、本発明方法は、PH7.0から10.5、
なるべくは7.5から10.5で実施する。有利なPH範
囲は、しばしばせまいけれども、用いる酵素の異
なる酵素活性について、最高となるPHおよび最抵
となるPHに応じて選択する。上記に説明したよう
に、活性が釣合うようにPH値を選択すべきであ
る。 CPD−Ｙを酵素として用いるなら、PH値は、
なるべくは、下記に説明するように、7.5から
10.5、特に9.0から10.5とする。しかし、インスリ
ンアミド中間体の分離を望むならば、有利な範囲
内の低いPHたとえば約7.5が特に便利である。 カツプリング反応中ずつと選択したPHを保つべ
きで、ついで、反応生成物の沈殿、保護基の開裂
等のために値を変えうる。酵素がアミダーゼ活性
を示すようにPH値を選択しうる。そうすれば、生
成インスリンアミドの沈殿が防がれ、それで、望
むインスリンを１段階で形成するのに役立つ。さ
らに、酵素が支配的にペプチダーゼ活性を示すよ
うにPHを選択しうる。そうすると、安定なインス
リンアミド中間体の形成に有利となる。 PHを調節するには、重炭酸塩緩衝液のような選
択したPH範囲の緩衝液を反応媒体に用いる。 PH値を保つのに、HClのような酸、NaOHのよ
うな塩基を反応中に添加してもよい。その際に
は、PH−スタツトを用いるのが便宜である。 上記の記載および、参照文献７および11に準じ
て、特にPHに関連して、もつとも適当な反応条件
を選択することができる。それにより、種々の酵
素活性（アミダーゼ、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ、カルボキシペプチダーゼ、およびペプチジル
−アミノ酸アミドヒドロラーゼ）を、インスリン
基質成分、アミン成分に応じて、そして中間体の
形成を抑制または促進しようとする意図に関連し
て、もつとも良く利用しうる。 一般的に言つて、上記範囲内での低いPHは、イ
ンスリンアミド中間体の形成および沈殿に有利
で、より高い値は、カルボキシペプチダーゼ酵素
のアミダーゼ活性がより強まるのでアミド基の開
裂にみちびく。 しかし、これらの状態は、また、酵素濃度、反
応時間等でも変化してくる。 上記のように、反応は、水性反応媒体中で実施
しうる。媒体は望むならば、50容量％までの有機
溶媒を含有しうる。有利な有機溶媒は、アルカノ
ール、たとえば、メタノールおよびエタノール、
グリコールたとえばエチレングリコールまたはポ
リエチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロフラン、
ジオキサンおよびジメトキシエタンでありうる。 反応媒体の組成は、特に、反応成分の溶解度、
温度およびPHに応じて、そして目的とするインス
リン生成物および酵素の安定性に応じて選択す
る。 反応媒体は、さらに、酵素を不溶とするが、顕
著な割合の酵素活性を保つ成分、たとえばイオン
交換樹脂を含有しうる。別様には、酵素を、既知
の方法；たとえば、Methods of Enzymology、
44巻、1976年に記載の方法で、マトリツクス、た
とえば架橋デキストランまたはアガロース、また
はシリカ、ポリアミド、またはセルロースに結合
さすかまたは、ポリアクリルアミド、アルギネー
トまたはフアイバー中に封入し、固定しうる。さ
らに、化学的手段で酵素を修飾して、安定性また
は、性質を改良しうる。 インスリンアミド中間体の沈殿を抑えるために
は、反応媒体は、３モルまでの濃度に尿素または
グアニジン塩酸塩を含有しうる。このことは、イ
ンスリン基質成分の溶解度が限定されてしまうPH
値および媒体中では有利である。 反応に関与する２つの成分の濃度は、下に説明
するように広く変動しうる。インスリン基質成分
の有利な出発濃度は、0.002から0.05モルで、ア
ミン成分は、0.05から３モルである。 酵素活性も変化しうる。しかし、10-6から10-4
モル、特に10-5モルが有利である。もつとも有利
な活性は、なかんずく、基質濃度、アミン濃度お
よび反応時間で変化する。 本発明によれば反応温度はなるべくは20から40
℃とする。ある合成についてもつとも有利な反応
温度は実験で定めうる。特に、用いたアミン成分
および酵素濃度で変わる。適当な温度は、ふつ
う、約20から30℃、なるべくは約25℃とする。20
℃より低い温度では、反応時間は不相応に長くな
り、40℃を超えると、酵素および反応剤の安定性
および（または）反応生成物に関して問題が生ず
る。 反応時間についても同様に変化しうる。これ
は、反応のパラメーター、特に酵素濃度でおおい
に変化する。標準反応時間は、約２から６時間で
ある。 つけ加えるべきこととして、アミン成分として
アミドを用いる時には、生成インスリンアミドよ
り、アミド基を特異的に開裂さすのがふつうは望
ましい。この点に関してもまた、カルボキシペプ
チダーゼ、特に、CPD−Ｙは、非常に適当であ
る。その理由は、CPD−Ｙは、＞９のPHでアミダ
ーゼ活性を示し、しかも、カルボキシペプチダー
ゼ活性は無視しうるからである。 同じ意味で、生成インスリンエステル中間体よ
り、定義のようなエステル基CR3を開裂させ、Ｃ
−末端の保護されていない最終インスリンをうる
のに、カルボキシペプチダーゼを一般的に用いえ
よう。 本発明を実施例で説明するより前に、出発材
料、測定方法の一般を説明する。 出発材料 ブタインスリンは、Nordisk Insulin−
laboratorium、Cophenhagenより提供された。
Carlsberg Breweriesの市販品である、パン酵母
由来のカルボキシペプチダーゼＹは、Johansen
等のアフイニテイクロマトグラフ法（参照文献
８）の変法で分離され、凍結乾燥粉末（くえん酸
ナトリウム中10％酵素）として得られた。使用前
の酵素は、“Sephadex Ｇ−25”カラム（1.5×25
cm）を水で平衡させ溶出することにより脱塩し
た。酵素濃度は、Ｅ１％ 280nm＝14.8を用い分光光度
的に測定した。使用酵素調製物は、Leeおよび
Riordanの分析法（参照文献９）でProtease Ａ
不含であることをたしかめた。Ｌ−スレオニンア
ミドは、USA、Arizona、Vega−Foxより購入
した。Ｌ−スレオニンメチルエステルは、スイ
ス、Flukaより、Ｌ−スレオニン、Dansyl
chloride.カルボキシペプチダーゼおよびトリプ
シンは、USA、Sigmaより得た。クロマトグラ
フ用材料は、スエーデンPharmaciaの製品であ
る。他の試薬および溶媒をはすべて、西ドイツ
Merckより得た。 アミノ酸分析 アミノ酸分析用試料は、減圧110℃で6M HCl
中24時間水解した。Durrum Ｄ−500アミノ酸分
析計で分析した。アミノ酸組成は、既知含量のア
スパラギン酸およびグリシンを基礎とした。
Thr.LysおよびAlaだけが反応により影響された。
ブタ（ヒト）インスリンについてのこれらのアミ
ノ酸の値は、Thr＝1.93（2.87）、Lys＝0.97（0.98）
およびAla＝2.00（1.05）である。反応混合物中の
未変換ブタインスリンは、“Sephadex Ｇ−50”
上のクロマトグラフイーのあとのインスリンプー
ルのアラニン分析で測定した。カツプリング収量
は、所与の生成物の量を反応で消費された全イン
スリン量で割つた値として定義される。 カルボキシペプチダーゼ消化（下記の例２および
３） PH7.5の0.1Mトリス−HCl中のインスリンまた
はインスリン誘導体の溶液（0.7mg／ml）100μ
に10μｇのカルボキシペプチダーゼＡを加えた。
室温で６時間消化したあとで、同容量の0.5M
HClを加えて反応を止めた。アミノ酸の放出は、
アミノ酸分析で測定した。 インスリン誘導体の酵素消化（例４） PH7.5の0.05Mトリス緩衝液中、約1.5ｍＭのイ
ンスリンおよび5μMのカルボキシペプチダーゼ
を用い、カルボキシペプチダーゼＡおよびＹを用
いる種々のインスリン誘導体の消化を試みた。反
応時間は、CPD−Ａで３時間、CPD−Ｙで1.5時
間である。これらの条件下でＣ−末端アミノ酸の
放出は最大となつた。HClで酸性としてから、１
部を直接にアミノ酸分析計にかけた。 トリプシン消化のあと、ダンシルクロライドで
消化物を処理し、ダンシルペプチドを同定するこ
とにより、種々のインスリン誘導体のＣ−末端部
分の配列を測定した。インスリン誘導体のトリプ
シン消化は、１ｍＭインスリン、40μMDPCC−
トリプシンを用い、PH8.2の0.1M NaHCO3中で
実施した。インキユベーシヨン時間は１時間であ
る。予備的な実験から、ブタインスリンのＢ−鎖
よりＣ−末端アラニル残基を完全に放出さすの
に、これらの条件が十分であることが分つた。放
出されたアミノ酸またはジペプチドはつぎのよう
にダンシル化した。トリプシン消化混合物の
100μ試料を、100μの0.5M HClを添加して反
応を停止させた。試料の１部を蒸発乾こさせて
100μの0.1M NaHCO3、PH8.2に再溶解し、ダ
ンシルクロライドアセトン溶液（５mg／）の
100μを添加した。反応混合物は37℃で２時間
インキユベートした。反応混合物はHPLCで分析
した。それには、Watersの液体クロマトグラフ
イーシステムを用いた。これは、Model U6Kイ
ンジエクター、２個のModel6000Aポンプ、
Model660ソルベントプログラマー、
Model450UVデイテクター、Waters Data
ModuleおよびWaters Radial Compression
Module（RCM100）ハウジングを備え、Waters
Radial Pak Ａ（Ｃ−18リバースフエース）カラ
ムを備えている。 つぎの標準化合物を合成した。Dns−Ala−
OH、Dns−Thr−OH、Dns−Ala−Thr−OH、
Dns−Thr−Thr−OH、Dns−Thr−NH2、Dns
−Thr−Thr−NH2およびDns−Ala−Thr−
NH2。インスリン消化物のダンシル化のための
上記操作を用い、これら誘導体のうちの３種は、
Ｈ−Ala−OH、Ｈ−Thr−OHおよびＨ−Thr−
NH2より合成された。ダンシル化ジペプチドは、
Dns−Ala−OMeおよびDns−Thr−OMeより合
成された。つまり、７ｍmolのＨ−Ala−OMe・
HClを0.1M NaHCO3に溶解し、５ｍmolのダン
シルクロライドを添加した。反応混合物は２時間
インキユベートした。Dns−Ala−OMeは、反応
混合物より酢酸エチルで抽出し、蒸発乾こした。
分離された物質は純粋であることがHPLCで示さ
れた。同じ操作を用いてDns−Thr−OMeを合成
した。以前に記載されたのと類似の酵素的ペプチ
ド合成操作（参照文献７および11）を用いて、こ
れら２つの化合物をついでＨ−Thr−OHにカツ
プルさせ、Dns−Ala−Thr−OHおよびDns−
Thr−Thr−OHとし、Ｈ−Thr−NH2をカツプ
ルさせDns−Ala−Thr−NH2およびDns−Thr−
Thr−NH2とする。条件はつぎのようである。５
ｍＭ基質、0.5M親核試薬、0.1M KCl、２ｍＭ
EDTA、1μM CPD−Ｙ、PH9.0、10％エタノー
ル。全部で７種のダンシル誘導体は、異なる２つ
のプログラムを用いるHPLCで容易に分けうる。
の特異的変換、つまり、Ｂ−30アラニンをスレオ
ニンに置き換えることに関連して以下により詳細
に記載するけれども、容易に理解されうるよう
に、本発明の方法は、他の型のインスリン、にも
同様に適用しいる。たとえば、ウサギのインスリ
ンをヒトインスリンに変えうるし、ウシインスリ
ンをＢ−30（スレオニン）ウシインスリンに変え
うる等である。 ２ ブタインスリンのヒトインスリンへの変換に
特に関連した、本発明の背景 半合成的操作により、ブタインスリンをヒトイ
ンスリンに変換することは、インスリン化学の分
野で魅力ある問題であつた。 上記したように、ヒトインスリンはブタインス
リンより１個だけのアミノ酸が異なる。つまりＢ
−鎖のＣ−末端残規がヒトではスレオニンで、ブ
タではアラニンである。アラニンのスレオニンへ
の変換は、最初化学的に行なわれたが、最近にな
り酵素的操作も用いられている。Ruttenberg
（1972）（参照文献１）は、ブタインスリンのヒト
インスリンへの化学的変換を記載している。つま
り、インスリンヘキサメチルエステルへのエステ
ル化、デスオクタペプチドインスリン（DOI）−
ペンタメチルエステルへのトリプシンを用いる水
解、アミノ末端残基の保護、相当するヒトインス
リン配列の合成オクタペプチドとの化学的カツプ
リング、アミノ基の酸性脱保護、そして最後に、
メチルエステル基のアルカリ性けん化である。し
かし、この方法で純粋なインスリンを製造するこ
とは、誰も成功していない。その理由は、化学的
操作、特に、最後のアルカリけん化の段階は、イ
ンスリン分子を著しく損傷し、さらに、Ａ−鎖の
Ｃ−末端残基の部分にイソアスパラギンが形成す
るからである（Gattner等、参照文献２）。この
影響を防ぐために、ObermeierおよびGeiger
（1976）（参照文献３）は、DOIの側鎖カルボキシ
ル基を保護しないで、フラグメント縮合を行なつ
た。反復精製のあとにヒトインスリンを分離しえ
たけれども、非常に低収量で得られたのみであつ
た。同様なアプローチを、Gattner等（参照文献
２）は、種々のインスリンフラグメントを用いて
実施している。しかし、化学的方法によつては、
純粋なヒトインスリンを痕跡量しか得ていない。 M.Bodanszky等は、U.S.特許No.3276961にヒト
インスリンを製造する方法を提供している。ここ
で、スレオニンの存在で、カルボキシペプチダー
ゼＡおよびトリプシンのような酵素の作用によ
り、他の動物インスリンよりヒトインスリンが製
造されたとされている。この方法がヒトインスリ
ンを生成するようには思われない。その理由は、
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡは、
リジル−アラニン（Ｂ−29−B30）のペプチド結
合のみならず、インスリンの他の位置をも、上記
条件で水解してしまうようであるゆえである。ト
リプシンは、リジル−アラニン（B29−B30）の
ペプチド結合よりも、アルギニル−グリシン
（B22−B23）のペプチド結合を優先的に水解す
る。他方、カルボキシペプチダーゼＡは、Ａ鎖の
Ｃ−末端のアスパラギンを遊離さすことなしに、
Ｂ鎖のＣ−末端のアラニンのみを遊離させえな
い。特殊な条件、つまり重炭酸アンモニウム緩衝
液中で反応さすことが、アスパラギンの放出を防
止するのに必要である。この条件は、1978年に発
見された（Schmitt、Hoppe−Seyler′s Z.
Physiol.Chem.、359、799−802（1978））。さら
に、この条件では、水解の割合が合成の割合より
速いので、ペプチド合成はほとんどおこり得な
い。Inouye等（参照文献４）は、トリプシンを
触媒に用い、ブタインスリンよりのＮ−末端保護
DOIとヒトインスリンのＢ−23−B30残基に対応
する合成オクタペプチドをカツプリングさせて、
ヒトインスリンが得られることを示した。 しかし、この方法は、つぎの点で面倒である。 つまり、まず、ブタインスリンのトリプシン触
媒消化でDOIを形成させ、これを、BOC−N3で
アシル化してＮ−末端保護し、ついで、B29リジ
ンがBOC保護されている、別に合成させたヒト
B23−B30オクタペプチドと20時間インキユベー
トせねばならない。得られる（BOC）3−ヒトイ
ンスリンは、ついで、０℃で60分間トリフルオル
酢酸／アニソールで脱保護する。収量は、用いた
（BOC）2−DOI基準で49％であつた。 同様に、Morihara等（参照文献５）は、ブタ
インスリンをカルボキシペプチダーゼＡで８時間
消化して得られたデス−アラニン（Ｂ−30）−イ
ンスリン（DAI）よりヒトインスリンを合成し
た。DAI（10ｍＭ）を、有機共溶媒の高濃度の存
在で、37℃で20時間、大過剰（0.5M）のスレオ
ニン−OButエステルとインキユベートした。生
成したインスリン（Thf−OBut−Ｂ−30）より、
ついで、アニソールの存在でトリフルオル酢酸で
脱保護した。収量は41％であつた。同様な実験
で、〔Thr−Ｂ−30〕ウシインスリンを60％収率
で得た。 この方法もまた、最初のインスリンを予備処理
する必要、カツプリング時間の長いこと、別に除
保護の段階が必要な点で面倒である。さらに、酵
素の水解活性をできるだけ少なく抑制するため
に、大量の有機共−溶媒が必要である。 同様な実験でMorihara等（参照文献６）は、
〔Thr−OBut−Ｂ−30〕インスリン形成下の、
DAIと大過剰のThr−OButとのカツプリングの
ための酵素触媒としてAchromobacter Protease
Ｉを用いたが、ついで生成物を分離し除保護して
いる。高収率（52％）を達成しうるが、反応時間
は20時間である。 ウシインスリンを用いる同様な実験は、58％収
率で〔Thr−OBut−Ｂ−30〕を与えている。 参照文献５および６に記載の方法は、1980年10
月29日公告のヨーロツパ特許願No.EP17938および
オランダ特許願No.1556／80に記載されている。 最近、WidmerおよびJohansen（参照文献７）
および1979年４月６日願オランダ特許願No.1443／
79に、酵素カルボキシペプチダーゼ−Ｙがペプチ
ド合成に有効な触媒であることが示されている。
さらに、その酵素は、ある条件では、ペプチド転
移反応で、ペプチドのＣ−末端アミノ酸を別のア
ミノ酸またはアミノ酸誘導体との交換を触媒する
ことが示された。（1980年４月１日出願の、
WO80／02151として1980年10月16日公告の国際
特許願No.PCT／DK80／00020、1980年10月15日
公告ヨーロツパ特許願No.EP17485、1980年４月２
日願US特許願シリーズNo.136611および1980年12
月２日願の、上記PCT／DK80／00020を基礎と
するシリースNo.220022を参照せよ）。基礎となつ
ている反応の原則は、発明者のBreddam等（参
照文献11）によりくわしく説明されている。彼等
はまた、これまでに知られていなかつた、CPD
−Ｙのペプチジル−アミノ酸−アミド水解活性を
見出だした。上記の特許願および発明者による論
文は、本明細書の参考として採用する。 酵素触媒ペプチド転移反応の一般的原則は、上
記のPCTおよびUS特許願に記載され例示されて
いるけれども、インスリンに関連してのそれらの
応用の可能性については述べられていないし、示
されてもいない。 本発明の要約 本発明の目的は、インスリンのＢ−30アミノ酸
を酵素的に置き代える方法を提供するが、この方
法は、上記したような欠点がなく、より具体的に
は、インスリン出発材料の予備処理、長い反応時
間および化学的除保護の段階を必要としない。 より具体的には、本発明の目的は、高収量そし
て高純度に、ブタインスリンをヒトインスリンに
変換するための独特かつ簡単な方法を提供するこ
とである。 本発明の別の目的は、種々のインスリンを、そ
れらの由来にかかわりなく、Ｂ−30カルボキシル
基の保護されたインスリン誘導体を開裂する、特
にアミド誘導体を脱アミドするための改良方法を
提供する。 簡潔に述べれば、本発明の上記目的および他の
目的は、インスリン中のＢ−30アミノ酸を酵素的
におき換えることで達成可能で、つぎの段階を包
含する。 基質成分として、ブタインスリンIns−Ala−
OHを、 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中Ｂはスレニオン残基であり、そしてR3は
アルキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステルよりなる群より選択
したアミン成分と、約７から10.5までのPHの水溶
液または分散液中で、Ｌ−特異的セリンまたはチ
オールカルボキシペプチダーゼ酵素の存在で反応
させて、インスリン誘導体、 Ins−Ｂ−NH2、Ins−Ｂ−BrNH2または Ins−Ｂ−OR3 とし、所望により、ついで、基−NH2、−Ｂ−
NH2または−OR3を開裂させることからなる。 上記した開裂段階は、もちろん、第１のペプチ
ド転移段階で製造されたインスリン誘導体に限定
されず、その由来にかかわりなく、そのような誘
導体のいずれにも、特に、例５に下記するような
EP17938に準じ製造される誘導体に応用される。 有利な具体例の詳細な記載 本発明は、中間体の分離および引続く除保護処
理なしに、単一段階で、上記した酵素カルボキシ
ペプチダーゼＹが、Ｂ−30アラニンをスレオニン
で交換することにより、ブタインスリンとヒトイ
ンスリンに変換しうることの驚くべき認識を基礎
としている。場合により、インスリンアミド中間
体を分離でき、そして望むならば、引続き、同じ
酵素カルボキシペプチダーゼＹを用いて脱アミド
しうる。 以下にさらにくわしく記すように、本発明にも
つとも適しているスレオニン誘導体は、スレオニ
ンアミドである。しかし、この変換で、しばし
ば、ヒトインスリンとある量の未反応ブタインス
リンとの混合物を生じ、それらを分けるのは困難
である。それで、なるべくは、生成したインスリ
ンアミド中間体を、反応混合物、つまり未反応ブ
タインスリンを含有する混合物より分け、そし
て、ついで、以下にやはり、くわしく記すよう
に、なずべくは同じ酵素カルボキシペプチダーゼ
Ｙを用いて脱アミドする。 上記特許願および論文に詳しく記載されたよう
に、CPD−Ｙのペプチダーゼ特異性は広いので、
本発明は、出発物質としてブタインスリンに限定
されず、他のインスリン、つまり上記した他の種
に由来するインスリンも使用でき、任意の他のア
ミノ酸を交換反応に用いうる。 下記するように、さらに他の酵素も使用しう
る。 本発明の方法の単純さは、たとえ、特許願
PCT／DK80／00020およびU.S.特許No.3276961
（Bodanszky）が背景にあるにしても、驚くべき
ものがある。つまり、Ｂ−30アミノ酸のみならず
すべての上記した既知のインスリンに共通の、Ａ
−21アスパラギンもまた、その酵素により攻撃さ
れうると期待されるところであるからである。 上記した以前の特許願において、一般的ペプチ
ド合成に関連する望ましい酵素の特性は詳記され
ており、それで、多くのカルボキシペプチダーゼ
は、PHにきわめて影響されやすい種々の酵素活性
を示し、つまり、PH８から10.5までの基本的環境
では、それらの酵素は、主として、アミダーゼま
たはエステラーゼ活性を示し、そして、９から
10.5のPHでは、まつたくカルボキシペプチダーゼ
活性を示さないか、ほととんど示さず、この活性
は、９よりPHが低くなると共に、より顕著になつ
てくる。エステラーゼ活性は、こここではあまり
重要でないが、しかし、別様には、これらの性質
を、好収量の１段階方法の達成に役立つので、本
発明の方法に用いて有利でありうる。 本発明方法で用いうるカルボキシペプチダーゼ
は、Ｌ−特異的セリンまたはチオールカルボキシ
ペプチダーゼである。これらの酵素は酵母により
生産されうるし、動物、植物または微生物由来で
ありうる。 特に便宜な酵素は、酵母に由来するカルボキシ
ペプチダーゼＹ（CPD−Ｙ）である。この酵素
は、以前の特許願つまりJohansen等（参照文献
８）に記載されている。彼等は、ベンジルスクシ
ニル基のカツプルした重合体樹脂マトリツクスを
含有するアフイニテイ樹脂上のアフイニテイクロ
マトグラフイーによる、特に便宜な精製方法を開
発した。セリン酵素であるCPD−Ｙは、PH９に
おいて異なる酵素活性のあいだの上記関係を有す
ることおよびエンドペプチダーゼ活性がまつたく
ないことを特徴としている。CPD−Ｙの別の利
点は、大量に使用でき、比較的大きい安定性をを
示すということである。さらに詳細については、
参照文献７および11に記してある。 現在のところ有利な酵素であるCPD−Ｙに加
えて、本発明方法は、つぎの一覧表に示すような
他のカルボキシペプチダーゼを用いても可能であ
る。 由 来酵 素 か び ペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−１
Penicillium janthinellum ペニシロカルボキシペプチダーゼＳ−２
Penicillium janthinellum カルボキシペプチダーゼ Aspergillus saitoi カルボキシペプチダーゼ Aspergillus oryzae 植 物 カルボキシペプチダーゼＣ オレンジ葉 オレンジ皮 カルポキシペプチダーゼCN
Citrus natsudaidai Hayata フアゼオレイン（Phaseolain） フレンチ豆の葉 カルボキシペプチダーゼ 発芽大麦 発芽棉植物 トマト ウオーターメロン Bromelain（パイナツプル）粉末 上記カルボキシペプチダーゼの多くのものの密
接な関係はKubota等（参照文献12）により論ぜ
られており、上記各カルボキシペプチダーゼの製
法および性質はそれぞれ、下記の文献に記載され
ている： Penicillum janthinellum由来のカルボキシラ
ーゼ：S.Yokoyama等によるAppl.Microbiol.27
（1974年）953〜960頁およびS.Yokoyama等によ
るAgr.Biol.Chem.、39（1975年）、1211〜1217
頁； Aspergillus saitoiおよびAspergillus Oryzae
由来のカルボキシペプチダーゼ： T.Arai等によるJ.Biochem.、76（1974年）、
765〜769頁およびE.IchishimaによるBiochim、
Biophys.Acta、258（1972年）、274〜288頁； Citrus natsudaidai Hayata由来のカルボキシ
ペプチダーゼＣおよびフレンチ豆、発芽大麦、お
よび発芽棉植物由来のカルボキシペプチダーゼ：
Y.Kubota等によるJ.Biochem.74（1973年）、757
〜770頁。 本発明方法は、原理的に、天然、半合成または
合成のインスリンのいずれを基質成分としても実
施しうる。 インスリン出発物質の成分である個々のアミノ
酸に存在するイオン化しうる基は、望むならば、
基の型に応じて既知の方法で保護しうることを述
べておく。しかし、このことは絶対に必要なわけ
でなく、このことは、本発明方法の利点となる。
ある理由から、官能基を保護したいならば、適当
な保護基は、上記の特許願特に、WO80／02151
に見出だしえよう。 反応に関与する第２の成分は、いわゆるアミン
成分で、それらは、つぎの群より選択する。 (a)式 Ｈ−Ｂ−NH2 （式中Ｂはスレオニン残基を表わす） で示されるアミノ酸アミド、および (b)式 Ｈ−Ｂ−OR3 （式中Ｂはスレオニン残基を表わし、そしてR3
はアリキル基を表わす） で示されるアミノ酸エステル。 本明細書で、“アルキル基”とは、直鎖または
枝分れ鎖状のアルキル基、なるべくは、１から６
炭素原子数の基、たとえば、メチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イ
ソブチル基、３級ブチル基、アミル基、ヘキシル
基および類似の基を意味する。 従つて、基−OR3はアルコキシ基、たとえばメ
トキシ基、エトキシ基または３級ブトキシ基より
選ばれる。これらの基には、、場合により、不活
性の置換基、たとえばニトロ基、が存在していて
もよい。 上記のように、本発明方法は、PH7.0から10.5、
なるべくは7.5から10.5で実施する。有利なPH範
囲は、しばしばせまいけれども、用いる酵素の異
なる酵素活性について、最高となるPHおよび最抵
となるPHに応じて選択する。上記に説明したよう
に、活性が釣合うようにPH値を選択すべきであ
る。 CPD−Ｙを酵素として用いるなら、PH値は、
なるべくは、下記に説明するように、7.5から
10.5、特に9.0から10.5とする。しかし、インスリ
ンアミド中間体の分離を望むならば、有利な範囲
内の低いPHたとえば約7.5が特に便利である。 カツプリング反応中ずつと選択したPHを保つべ
きで、ついで、反応生成物の沈殿、保護基の開裂
等のために値を変えうる。酵素がアミダーゼ活性
を示すようにPH値を選択しうる。そうすれば、生
成インスリンアミドの沈殿が防がれ、それで、望
むインスリンを１段階で形成するのに役立つ。さ
らに、酵素が支配的にペプチダーゼ活性を示すよ
うにPHを選択しうる。そうすると、安定なインス
リンアミド中間体の形成に有利となる。 PHを調節するには、重炭酸塩緩衝液のような選
択したPH範囲の緩衝液を反応媒体に用いる。 PH値を保つのに、HClのような酸、NaOHのよ
うな塩基を反応中に添加してもよい。その際に
は、PH−スタツトを用いるのが便宜である。 上記の記載および、参照文献７および11に準じ
て、特にPHに関連して、もつとも適当な反応条件
を選択することができる。それにより、種々の酵
素活性（アミダーゼ、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ、カルボキシペプチダーゼ、およびペプチジル
−アミノ酸アミドヒドロラーゼ）を、インスリン
基質成分、アミン成分に応じて、そして中間体の
形成を抑制または促進しようとする意図に関連し
て、もつとも良く利用しうる。 一般的に言つて、上記範囲内での低いPHは、イ
ンスリンアミド中間体の形成および沈殿に有利
で、より高い値は、カルボキシペプチダーゼ酵素
のアミダーゼ活性がより強まるのでアミド基の開
裂にみちびく。 しかし、これらの状態は、また、酵素濃度、反
応時間等でも変化してくる。 上記のように、反応は、水性反応媒体中で実施
しうる。媒体は望むならば、50容量％までの有機
溶媒を含有しうる。有利な有機溶媒は、アルカノ
ール、たとえば、メタノールおよびエタノール、
グリコールたとえばエチレングリコールまたはポ
リエチレングリコール、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロフラン、
ジオキサンおよびジメトキシエタンでありうる。 反応媒体の組成は、特に、反応成分の溶解度、
温度およびPHに応じて、そして目的とするインス
リン生成物および酵素の安定性に応じて選択す
る。 反応媒体は、さらに、酵素を不溶とするが、顕
著な割合の酵素活性を保つ成分、たとえばイオン
交換樹脂を含有しうる。別様には、酵素を、既知
の方法；たとえば、Methods of Enzymology、
44巻、1976年に記載の方法で、マトリツクス、た
とえば架橋デキストランまたはアガロース、また
はシリカ、ポリアミド、またはセルロースに結合
さすかまたは、ポリアクリルアミド、アルギネー
トまたはフアイバー中に封入し、固定しうる。さ
らに、化学的手段で酵素を修飾して、安定性また
は、性質を改良しうる。 インスリンアミド中間体の沈殿を抑えるために
は、反応媒体は、３モルまでの濃度に尿素または
グアニジン塩酸塩を含有しうる。このことは、イ
ンスリン基質成分の溶解度が限定されてしまうPH
値および媒体中では有利である。 反応に関与する２つの成分の濃度は、下に説明
するように広く変動しうる。インスリン基質成分
の有利な出発濃度は、0.002から0.05モルで、ア
ミン成分は、0.05から３モルである。 酵素活性も変化しうる。しかし、10-6から10-4
モル、特に10-5モルが有利である。もつとも有利
な活性は、なかんずく、基質濃度、アミン濃度お
よび反応時間で変化する。 本発明によれば反応温度はなるべくは20から40
℃とする。ある合成についてもつとも有利な反応
温度は実験で定めうる。特に、用いたアミン成分
および酵素濃度で変わる。適当な温度は、ふつ
う、約20から30℃、なるべくは約25℃とする。20
℃より低い温度では、反応時間は不相応に長くな
り、40℃を超えると、酵素および反応剤の安定性
および（または）反応生成物に関して問題が生ず
る。 反応時間についても同様に変化しうる。これ
は、反応のパラメーター、特に酵素濃度でおおい
に変化する。標準反応時間は、約２から６時間で
ある。 つけ加えるべきこととして、アミン成分として
アミドを用いる時には、生成インスリンアミドよ
り、アミド基を特異的に開裂さすのがふつうは望
ましい。この点に関してもまた、カルボキシペプ
チダーゼ、特に、CPD−Ｙは、非常に適当であ
る。その理由は、CPD−Ｙは、＞９のPHでアミダ
ーゼ活性を示し、しかも、カルボキシペプチダー
ゼ活性は無視しうるからである。 同じ意味で、生成インスリンエステル中間体よ
り、定義のようなエステル基CR3を開裂させ、Ｃ
−末端の保護されていない最終インスリンをうる
のに、カルボキシペプチダーゼを一般的に用いえ
よう。 本発明を実施例で説明するより前に、出発材
料、測定方法の一般を説明する。 出発材料 ブタインスリンは、Nordisk Insulin−
laboratorium、Cophenhagenより提供された。
Carlsberg Breweriesの市販品である、パン酵母
由来のカルボキシペプチダーゼＹは、Johansen
等のアフイニテイクロマトグラフ法（参照文献
８）の変法で分離され、凍結乾燥粉末（くえん酸
ナトリウム中10％酵素）として得られた。使用前
の酵素は、“Sephadex Ｇ−25”カラム（1.5×25
cm）を水で平衡させ溶出することにより脱塩し
た。酵素濃度は、Ｅ１％ 280nm＝14.8を用い分光光度
的に測定した。使用酵素調製物は、Leeおよび
Riordanの分析法（参照文献９）でProtease Ａ
不含であることをたしかめた。Ｌ−スレオニンア
ミドは、USA、Arizona、Vega−Foxより購入
した。Ｌ−スレオニンメチルエステルは、スイ
ス、Flukaより、Ｌ−スレオニン、Dansyl
chloride.カルボキシペプチダーゼおよびトリプ
シンは、USA、Sigmaより得た。クロマトグラ
フ用材料は、スエーデンPharmaciaの製品であ
る。他の試薬および溶媒をはすべて、西ドイツ
Merckより得た。 アミノ酸分析 アミノ酸分析用試料は、減圧110℃で6M HCl
中24時間水解した。Durrum Ｄ−500アミノ酸分
析計で分析した。アミノ酸組成は、既知含量のア
スパラギン酸およびグリシンを基礎とした。
Thr.LysおよびAlaだけが反応により影響された。
ブタ（ヒト）インスリンについてのこれらのアミ
ノ酸の値は、Thr＝1.93（2.87）、Lys＝0.97（0.98）
およびAla＝2.00（1.05）である。反応混合物中の
未変換ブタインスリンは、“Sephadex Ｇ−50”
上のクロマトグラフイーのあとのインスリンプー
ルのアラニン分析で測定した。カツプリング収量
は、所与の生成物の量を反応で消費された全イン
スリン量で割つた値として定義される。 カルボキシペプチダーゼ消化（下記の例２および
３） PH7.5の0.1Mトリス−HCl中のインスリンまた
はインスリン誘導体の溶液（0.7mg／ml）100μ
に10μｇのカルボキシペプチダーゼＡを加えた。
室温で６時間消化したあとで、同容量の0.5M
HClを加えて反応を止めた。アミノ酸の放出は、
アミノ酸分析で測定した。 インスリン誘導体の酵素消化（例４） PH7.5の0.05Mトリス緩衝液中、約1.5ｍＭのイ
ンスリンおよび5μMのカルボキシペプチダーゼ
を用い、カルボキシペプチダーゼＡおよびＹを用
いる種々のインスリン誘導体の消化を試みた。反
応時間は、CPD−Ａで３時間、CPD−Ｙで1.5時
間である。これらの条件下でＣ−末端アミノ酸の
放出は最大となつた。HClで酸性としてから、１
部を直接にアミノ酸分析計にかけた。 トリプシン消化のあと、ダンシルクロライドで
消化物を処理し、ダンシルペプチドを同定するこ
とにより、種々のインスリン誘導体のＣ−末端部
分の配列を測定した。インスリン誘導体のトリプ
シン消化は、１ｍＭインスリン、40μMDPCC−
トリプシンを用い、PH8.2の0.1M NaHCO3中で
実施した。インキユベーシヨン時間は１時間であ
る。予備的な実験から、ブタインスリンのＢ−鎖
よりＣ−末端アラニル残基を完全に放出さすの
に、これらの条件が十分であることが分つた。放
出されたアミノ酸またはジペプチドはつぎのよう
にダンシル化した。トリプシン消化混合物の
100μ試料を、100μの0.5M HClを添加して反
応を停止させた。試料の１部を蒸発乾こさせて
100μの0.1M NaHCO3、PH8.2に再溶解し、ダ
ンシルクロライドアセトン溶液（５mg／）の
100μを添加した。反応混合物は37℃で２時間
インキユベートした。反応混合物はHPLCで分析
した。それには、Watersの液体クロマトグラフ
イーシステムを用いた。これは、Model U6Kイ
ンジエクター、２個のModel6000Aポンプ、
Model660ソルベントプログラマー、
Model450UVデイテクター、Waters Data
ModuleおよびWaters Radial Compression
Module（RCM100）ハウジングを備え、Waters
Radial Pak Ａ（Ｃ−18リバースフエース）カラ
ムを備えている。 つぎの標準化合物を合成した。Dns−Ala−
OH、Dns−Thr−OH、Dns−Ala−Thr−OH、
Dns−Thr−Thr−OH、Dns−Thr−NH2、Dns
−Thr−Thr−NH2およびDns−Ala−Thr−
NH2。インスリン消化物のダンシル化のための
上記操作を用い、これら誘導体のうちの３種は、
Ｈ−Ala−OH、Ｈ−Thr−OHおよびＨ−Thr−
NH2より合成された。ダンシル化ジペプチドは、
Dns−Ala−OMeおよびDns−Thr−OMeより合
成された。つまり、７ｍmolのＨ−Ala−OMe・
HClを0.1M NaHCO3に溶解し、５ｍmolのダン
シルクロライドを添加した。反応混合物は２時間
インキユベートした。Dns−Ala−OMeは、反応
混合物より酢酸エチルで抽出し、蒸発乾こした。
分離された物質は純粋であることがHPLCで示さ
れた。同じ操作を用いてDns−Thr−OMeを合成
した。以前に記載されたのと類似の酵素的ペプチ
ド合成操作（参照文献７および11）を用いて、こ
れら２つの化合物をついでＨ−Thr−OHにカツ
プルさせ、Dns−Ala−Thr−OHおよびDns−
Thr−Thr−OHとし、Ｈ−Thr−NH2をカツプ
ルさせDns−Ala−Thr−NH2およびDns−Thr−
Thr−NH2とする。条件はつぎのようである。５
ｍＭ基質、0.5M親核試薬、0.1M KCl、２ｍＭ
EDTA、1μM CPD−Ｙ、PH9.0、10％エタノー
ル。全部で７種のダンシル誘導体は、異なる２つ
のプログラムを用いるHPLCで容易に分けうる。
第１図は、CPD−Ｙを触媒に用い、ブタイン
スリンとＬ−スレオニンアミドとを反応させた時
の反応経過を示す。アミノ酸の分析結果を反応時
間に対して目盛つてある。 第２図は、Ｌ−スレオニンメチルエステルをア
ミン成分として用いた時の類似の反応経路を示
す。 第３図は、ブタインスリンとスレオニンアミド
との反応生成物のイオン交換クロマトグラフイー
よりの溶出プロフイールを示す。 例 １ （背景となつた研究） ブタインスリンを、25℃でPH５−７でカルボキ
シペプチダーゼ−Ｙとインキユベートした。PH範
囲は、酵素が極大のペプチダーゼ活性を示す範囲
である。これにより、Ｂ−鎖の末端からつぎのア
ミノ酸が放出された。1.0アラニン、1.0リジン、
1.0プロリン、1.0スレオニン、1.0チロシン、2.0
フエニルアラニン。Ｂ−23（グリシン）で、カル
ボキシペプチダーゼ−Ｙの作用は止まつた。それ
で、インスリンＢ−鎖中の最初の７個のアミノ酸
が完全に放出されたことになる。驚くべきこと
に、Ａ−鎖のＣ−末端アスパラギン（Ａ−21）は
まつたく放出されない。PH9.5で、Ｂ−鎖のＣ−
末端アラニンが、他のアミン酸よりずつと速く放
出された。重要なこととして、Leu−Tyr（Ｂ−
15−16）結合はまつたく水解されない。その理由
は、用いた精製CPD−Ｙ調製物は、他の由来の
市販されている多くの調製物と対照的に、プロテ
アーゼＡ（エンドペプチダーゼ）を含有しないか
らである。参照文献11をみよ。 例 ２ （インスリンアミド中間体を分離しないで、ア
ミン成分としてスレオニンアミドを用い、ブタ
インスリンのヒトインスリンへの変換） 亜鉛不含ブタインスリン（２ｍＭ）を、0.5ML
−スレオニン含有0.1M KCl、10ｍＭ EDTA溶
液に、PH9.5で25℃で、カルボキシペプチダーゼ
−Ｙ（50μM）を添加した。PHスタツトを用い
0.5M NaOHを加え反応のPHを一定に保つた。反
応を追跡するために、種々の時点でサンプルを取
り、6M HClを加えPHを１−２にして反応を止め
た。試料はついで、1M酢酸で平衡させた
“Sephadex Ｇ−50”（１×30cm）上でクロマト
グラフし、インスリンより、酵素および遊離アミ
ノ酸を分けた。インスリン含有分画を凍結乾燥
し、上記したようにアミノ酸組成を測定した。 第１図に反応の経過を示した。アミノ酸分析よ
り計算して、インスリン１モルについて0.7モル
スレオニン含量が増加し、0.2モルのリジンとあ
わせて0.8モルのアラニンが消失した（第１図）。
これらの結果から、6.5時間反応させたあと、ブ
タインスリンの20％は未反応のままで、インスリ
ンの20％は、アラニンに加えてつぎのアミノ酸リ
ジンをも失つていることになる。0.8モルのアラ
ニンの消失にともなつて、0.7モルのスレニオニ
ンが導入されている。 反応生成物はさらにカルボキシペプチダーゼＡ
消化で分析した。カルボキシペプチダーゼＡは、
遊離α−カルボキシル基を有するアミノ酸のみを
放出させ、リジンは遊離させない。この特異性に
従つて、ブタインスリンをカルボキシペプチダー
ゼＡで消化すると、Ｂ−鎖およびＣ−鎖のＣ−末
端の端から、アラニンおよびアスパラギンのみが
それぞれ放出される。それで、6.5時間の反応
（第１図）のあとに得られるインスリン試料をイ
ンキユベーシヨンすると、アスパラギンに加え、
未反応ブタインスリンの分画に相当する量のアラ
ニンが放出されるはづである。驚くべきことに、
アラニンに加えて、導入されて中間体ヒトインス
リンアミドを形成したスレオニンアミドに相当す
る量のスレオニンも放出された。このことは、カ
ルボキシペプチダーゼ−Ｙが、ペプチダーゼおよ
びエステラーゼ活性に加えて、ペプチドアミド水
解活性もを有するという事実に因るのであろう。
参照文献11をみられたい。恐らく、カルボキシペ
プチダーゼ−Ｙの存在でブタインスリンが反応す
る間に、Ｃ−末端アラニンは、最初、ペプチド転
移反応においてスレオニンアミドと交換され、ヒ
トインスリンアミドを形成し、これがついでカル
ボキシペプチダーゼ−Ｙにより水解されて、約60
％の全収率でヒトインスリンを与えるのであろ
う。20％は未反応ブタインスリンで、20％は他の
分解生成物である。この反応順序は他の実験によ
つても確かめられている。酵素をより少なくする
かまたは反応時間を短かくすると、反応生成物の
カルボキシペプチダーゼ消化で、スレオニン導入
に比してのスレオニン放出は少なくなり、ヒトイ
ンスリンが支配的に形成されることが分る。 反応生成物を分けるために、6.5時間反応後
（第１図）の試料を、“Lichrosorb RP−18”、
5μM、逆相カラム（0.4×30cm）およびWaters
Model6000Aポンプおよび220nｍModel450UVデ
イテクターを用いる、高性能液体クロマトグラフ
イーに処した。溶出液は、５ｍMn Bu−SO3Na
および50ｍＭ Na2SO4含有PH3.05ｍＭ酒石酸緩
衝液中28.75％CH3CN含有溶液である。（Inouye、
参照文献４をみよ）。流速は1.0ml／分であつた。
このシステムを用いて、ヒトおよびブタインスリ
ンは分けられなかつたけれど、他の副生成物はす
べて除かれた。クロマトグラフされた材料のアミ
ノ酸分析結果を表１に示す。分析結果は、理論値
より期待される組成とよく一致している。2.6モ
ルのスレオニンおよび1.3モルのアラニンの含量
は、試料が約70％のヒトおよび30％のブタインス
リンを含有することを示す。
スリンとＬ−スレオニンアミドとを反応させた時
の反応経過を示す。アミノ酸の分析結果を反応時
間に対して目盛つてある。 第２図は、Ｌ−スレオニンメチルエステルをア
ミン成分として用いた時の類似の反応経路を示
す。 第３図は、ブタインスリンとスレオニンアミド
との反応生成物のイオン交換クロマトグラフイー
よりの溶出プロフイールを示す。 例 １ （背景となつた研究） ブタインスリンを、25℃でPH５−７でカルボキ
シペプチダーゼ−Ｙとインキユベートした。PH範
囲は、酵素が極大のペプチダーゼ活性を示す範囲
である。これにより、Ｂ−鎖の末端からつぎのア
ミノ酸が放出された。1.0アラニン、1.0リジン、
1.0プロリン、1.0スレオニン、1.0チロシン、2.0
フエニルアラニン。Ｂ−23（グリシン）で、カル
ボキシペプチダーゼ−Ｙの作用は止まつた。それ
で、インスリンＢ−鎖中の最初の７個のアミノ酸
が完全に放出されたことになる。驚くべきこと
に、Ａ−鎖のＣ−末端アスパラギン（Ａ−21）は
まつたく放出されない。PH9.5で、Ｂ−鎖のＣ−
末端アラニンが、他のアミン酸よりずつと速く放
出された。重要なこととして、Leu−Tyr（Ｂ−
15−16）結合はまつたく水解されない。その理由
は、用いた精製CPD−Ｙ調製物は、他の由来の
市販されている多くの調製物と対照的に、プロテ
アーゼＡ（エンドペプチダーゼ）を含有しないか
らである。参照文献11をみよ。 例 ２ （インスリンアミド中間体を分離しないで、ア
ミン成分としてスレオニンアミドを用い、ブタ
インスリンのヒトインスリンへの変換） 亜鉛不含ブタインスリン（２ｍＭ）を、0.5ML
−スレオニン含有0.1M KCl、10ｍＭ EDTA溶
液に、PH9.5で25℃で、カルボキシペプチダーゼ
−Ｙ（50μM）を添加した。PHスタツトを用い
0.5M NaOHを加え反応のPHを一定に保つた。反
応を追跡するために、種々の時点でサンプルを取
り、6M HClを加えPHを１−２にして反応を止め
た。試料はついで、1M酢酸で平衡させた
“Sephadex Ｇ−50”（１×30cm）上でクロマト
グラフし、インスリンより、酵素および遊離アミ
ノ酸を分けた。インスリン含有分画を凍結乾燥
し、上記したようにアミノ酸組成を測定した。 第１図に反応の経過を示した。アミノ酸分析よ
り計算して、インスリン１モルについて0.7モル
スレオニン含量が増加し、0.2モルのリジンとあ
わせて0.8モルのアラニンが消失した（第１図）。
これらの結果から、6.5時間反応させたあと、ブ
タインスリンの20％は未反応のままで、インスリ
ンの20％は、アラニンに加えてつぎのアミノ酸リ
ジンをも失つていることになる。0.8モルのアラ
ニンの消失にともなつて、0.7モルのスレニオニ
ンが導入されている。 反応生成物はさらにカルボキシペプチダーゼＡ
消化で分析した。カルボキシペプチダーゼＡは、
遊離α−カルボキシル基を有するアミノ酸のみを
放出させ、リジンは遊離させない。この特異性に
従つて、ブタインスリンをカルボキシペプチダー
ゼＡで消化すると、Ｂ−鎖およびＣ−鎖のＣ−末
端の端から、アラニンおよびアスパラギンのみが
それぞれ放出される。それで、6.5時間の反応
（第１図）のあとに得られるインスリン試料をイ
ンキユベーシヨンすると、アスパラギンに加え、
未反応ブタインスリンの分画に相当する量のアラ
ニンが放出されるはづである。驚くべきことに、
アラニンに加えて、導入されて中間体ヒトインス
リンアミドを形成したスレオニンアミドに相当す
る量のスレオニンも放出された。このことは、カ
ルボキシペプチダーゼ−Ｙが、ペプチダーゼおよ
びエステラーゼ活性に加えて、ペプチドアミド水
解活性もを有するという事実に因るのであろう。
参照文献11をみられたい。恐らく、カルボキシペ
プチダーゼ−Ｙの存在でブタインスリンが反応す
る間に、Ｃ−末端アラニンは、最初、ペプチド転
移反応においてスレオニンアミドと交換され、ヒ
トインスリンアミドを形成し、これがついでカル
ボキシペプチダーゼ−Ｙにより水解されて、約60
％の全収率でヒトインスリンを与えるのであろ
う。20％は未反応ブタインスリンで、20％は他の
分解生成物である。この反応順序は他の実験によ
つても確かめられている。酵素をより少なくする
かまたは反応時間を短かくすると、反応生成物の
カルボキシペプチダーゼ消化で、スレオニン導入
に比してのスレオニン放出は少なくなり、ヒトイ
ンスリンが支配的に形成されることが分る。 反応生成物を分けるために、6.5時間反応後
（第１図）の試料を、“Lichrosorb RP−18”、
5μM、逆相カラム（0.4×30cm）およびWaters
Model6000Aポンプおよび220nｍModel450UVデ
イテクターを用いる、高性能液体クロマトグラフ
イーに処した。溶出液は、５ｍMn Bu−SO3Na
および50ｍＭ Na2SO4含有PH3.05ｍＭ酒石酸緩
衝液中28.75％CH3CN含有溶液である。（Inouye、
参照文献４をみよ）。流速は1.0ml／分であつた。
このシステムを用いて、ヒトおよびブタインスリ
ンは分けられなかつたけれど、他の副生成物はす
べて除かれた。クロマトグラフされた材料のアミ
ノ酸分析結果を表１に示す。分析結果は、理論値
より期待される組成とよく一致している。2.6モ
ルのスレオニンおよび1.3モルのアラニンの含量
は、試料が約70％のヒトおよび30％のブタインス
リンを含有することを示す。
【表】
【表】
＊ 不完全水解により値が低い
例 ３ （中間体を分離しないで、アミン成分としてス
レオニンメチルエステルを用いる、ブタインス
リンのヒトインスリンへの変換） 0.5M Ｌ−スレオニンメチルエステル含有
0.1M KCl、10ｍＭ EDTA中に、PH9.5そして25
℃で、亜鉛不含ブタインスリン（８ｍＭ）を含有
する溶液に、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ
（60μM）を添加した。反応のPHは、PH−スタツ
トを用い0.5M NaOHを加え一定に保つた。反応
を追跡するために、試料を種々の時点で取り、
6M HClを加えPHを１から２として反応を止め
た。試料は、1M酢酸中で平衡させた“Sephadex
Ｇ−50（１×30cm）でクロマトグラフし、インス
リンより酵素および遊離アミノ酸を除いた。イン
スリン含有分画は凍結乾燥し、上記のようにアミ
ノ酸組成を測定した。 反応経過は第２図に示す。この反応の結果は、
スレオニンアミドを用いた、上記の結果と非常に
類似している。スレオニンは、アラニンおよび少
量のリジンの放出と同時的に導入される。17時間
反応後の試料のカルボキシペプチダーゼＡ消化
で、アラニンとスレオニンの両方が遊離され、Ｂ
−鎖のＣ−末端アラニンが、まずスレオニンメチ
ルエステルを交換されて、ヒトインスリンモノメ
チルエステルを形成し、ついでこれがカルボキシ
ペプチダーゼ−Ｙで消化されてブタインスリンを
与えることが示される。反応は定性的には、スレ
オニンアミドについて上記したものと類似する
が、反応の最終生成物は、40％だけのヒトインス
リンを含有し、ブタインスリンの40％は変換され
ず、20％は他の生成物に水解された。 例 ４ （中間体インスリンアミドを分離しアミン成分
としてスレオニンアミドを用いる、ブタインス
リンのヒトインスリンへの変換） ２ｍＭ EDTA、0.1M KClおよび1.5Mグアニ
ジン塩酸塩中亜鉛不含ブタインスリン（２ｍＭ）
を含有し、そして、0.5Mスレオニンアミド（Ｌ
−Thr−NH2）を含有し、PH7.5、25℃の溶液に、
CPD−Ｙ（15μM）を加えた。反応のPHは、PH−
スタツトを用い、0.5M NaOHを加え、一定に保
つた。反応経過を追うために、種々の時点で試料
を取り、２時間後、1M HClを加えてPHを1.5か
ら2.0にして反応を止めた。インスリン分画は、
酵素および低分子量化合物より、1M酢酸と平衡
させた“Sephadex Ｇ−50フアイン”（１×30
cm）上でクロマトグラフイーして分け、凍結乾燥
した。上記のような凍結乾燥“インスリンプー
ル”のアミノ酸分析で、ブタインスリンの78％が
反応で消費されたことが分る。 “インスリンプール”中に存在する反応物をさ
らに分析するために、Morihara等（参照文献５）
の記載に本質的に準じて、“DEAE−Sephadex
Ａ−25”でクロマトグラフした。つまり、凍結乾
燥インスリン試料（75mg）を0.01Mトリス、
2.5M尿素、0.05M NaCl、PH7.5に溶解し、同じ
緩衝液で平衡させた“DEAE Sephadex Ａ−
25”カラム（2.5×25cm）に加えた。インスリン
は、同じ緩衝液中0.05から0.30MのNaClグラジエ
ントで溶出し、８ml宛分画を集め、凍結乾燥し
た。 溶出プロフイールは第３図に示した。３個のピ
ークが認められた。上記したようなCPD−Ｙお
よびCPD−Ａを用いた消化実験の結果としての
各ピークのアミノ酸組成およびピーク組成も示さ
れてある。これらの反応でインスリンのＢ−鎖の
Ｃ−末端のみがこれらの反応に関与するので、−
Pro−Lys−Ala−OHをブタインスリンの略号と
して用いる。それで他のインスリン誘導体もつぎ
のように略称する。 −Pro−Lys−Thr−OH＝ヒトインスリン、−
Pro−Lys−Thr−NH2＝ヒトインスリンアミド
等である。反応に用いたPH7.5そして、CPD−Ｙ
のアミダーゼ活性がペプチダーゼ活性より一般的
に低い状態で、生成ペプチドアミドは十分に安定
である。つまり、ピークは全インスリンプール
の約20％を含有した。この反応でブタインスリン
出発材料の約75％が変換した。しかし、ピーク
のスレオニン含量（3.65）はヒトインスリンの
3.0より大なので、最初のペプチド転移生成物
（−Pro−Lys−Thr−NH2）は、（−Pro−Lys−
Thr−Thr−NH2）の形成をともなうオリゴマー
化を避けるほど十分には安定でないことは明らか
である。 アミド中間体をこのように形成することは、
CPD−Ｙを用いる、以前に記載された脱アミド
段階によつては均一なヒトインスリンが形成され
ぬことを示す。つまり、脱アミドで−Pro−Lys
−Thr−OHと−Pro−Lys−Thr−Thr−OHの
混合物が生ずると予期される。しかし、ピーク
混合物を、0.1M HCl、２ｍＭ EDTA中PH10.0
で10μM CPD−Ｙを用いる脱アミド処理に20分
間処すると、驚くべきことに、ほとんど純粋なヒ
トインスリンが得られた。実験はつぎのように実
施した。 インスリンより酵素および低分子量物を、
“Sephadex Ｇ−50”カラムで除いたあと、第３
図と同じ操作を用い“DEAE Sephadex Ａ−25”
でクロマトグラフした。反応生成物は予期通りピ
ークに溶出された。他方未反応物（＜10％）は
ピークに溶出された。ピークは存在しない。
つまり、リジン不含のインスリン誘導体はまつた
く形成されなかつた。CPD−Ａ、CPD−Ｙおよ
びトリプシン消化で得られる表の結果から分る
ように、これらの反応でスレオニン含量のみ著し
く影響される。このことは、このPHでペプチダー
ゼ活性が存在しないという期待通りである。 脱アミド反応からのピークのアミノ酸組成
は、ヒトインスリンの分析結果に近い。つまり、
Thr＝2.87、Ala＝1.05、Lys＝0.98。脱アミド生
成物のCPD−Ｙ、CPD−Ａおよびトリプシン消
化の結果は、この試料が純ヒトインシユリンを90
から95％含有することを示す。このことは、イン
スリン誘導体−Pro−Lys−Thr−Thr−NH2は、
ほとんど、ペプチジル−アミノ−酸−アミドヒド
ロラーゼ活性のみを経由して反応すること、他
方、−Pro−Lys−Thr−NH2は大部分アミダーゼ
活性を経由し反応することを示す。ブタインスリ
ンのヒトインスリンへの変換の全体としての収率
は、変換されたインスリンの量を基礎として約30
％である。
例 ３ （中間体を分離しないで、アミン成分としてス
レオニンメチルエステルを用いる、ブタインス
リンのヒトインスリンへの変換） 0.5M Ｌ−スレオニンメチルエステル含有
0.1M KCl、10ｍＭ EDTA中に、PH9.5そして25
℃で、亜鉛不含ブタインスリン（８ｍＭ）を含有
する溶液に、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ
（60μM）を添加した。反応のPHは、PH−スタツ
トを用い0.5M NaOHを加え一定に保つた。反応
を追跡するために、試料を種々の時点で取り、
6M HClを加えPHを１から２として反応を止め
た。試料は、1M酢酸中で平衡させた“Sephadex
Ｇ−50（１×30cm）でクロマトグラフし、インス
リンより酵素および遊離アミノ酸を除いた。イン
スリン含有分画は凍結乾燥し、上記のようにアミ
ノ酸組成を測定した。 反応経過は第２図に示す。この反応の結果は、
スレオニンアミドを用いた、上記の結果と非常に
類似している。スレオニンは、アラニンおよび少
量のリジンの放出と同時的に導入される。17時間
反応後の試料のカルボキシペプチダーゼＡ消化
で、アラニンとスレオニンの両方が遊離され、Ｂ
−鎖のＣ−末端アラニンが、まずスレオニンメチ
ルエステルを交換されて、ヒトインスリンモノメ
チルエステルを形成し、ついでこれがカルボキシ
ペプチダーゼ−Ｙで消化されてブタインスリンを
与えることが示される。反応は定性的には、スレ
オニンアミドについて上記したものと類似する
が、反応の最終生成物は、40％だけのヒトインス
リンを含有し、ブタインスリンの40％は変換され
ず、20％は他の生成物に水解された。 例 ４ （中間体インスリンアミドを分離しアミン成分
としてスレオニンアミドを用いる、ブタインス
リンのヒトインスリンへの変換） ２ｍＭ EDTA、0.1M KClおよび1.5Mグアニ
ジン塩酸塩中亜鉛不含ブタインスリン（２ｍＭ）
を含有し、そして、0.5Mスレオニンアミド（Ｌ
−Thr−NH2）を含有し、PH7.5、25℃の溶液に、
CPD−Ｙ（15μM）を加えた。反応のPHは、PH−
スタツトを用い、0.5M NaOHを加え、一定に保
つた。反応経過を追うために、種々の時点で試料
を取り、２時間後、1M HClを加えてPHを1.5か
ら2.0にして反応を止めた。インスリン分画は、
酵素および低分子量化合物より、1M酢酸と平衡
させた“Sephadex Ｇ−50フアイン”（１×30
cm）上でクロマトグラフイーして分け、凍結乾燥
した。上記のような凍結乾燥“インスリンプー
ル”のアミノ酸分析で、ブタインスリンの78％が
反応で消費されたことが分る。 “インスリンプール”中に存在する反応物をさ
らに分析するために、Morihara等（参照文献５）
の記載に本質的に準じて、“DEAE−Sephadex
Ａ−25”でクロマトグラフした。つまり、凍結乾
燥インスリン試料（75mg）を0.01Mトリス、
2.5M尿素、0.05M NaCl、PH7.5に溶解し、同じ
緩衝液で平衡させた“DEAE Sephadex Ａ−
25”カラム（2.5×25cm）に加えた。インスリン
は、同じ緩衝液中0.05から0.30MのNaClグラジエ
ントで溶出し、８ml宛分画を集め、凍結乾燥し
た。 溶出プロフイールは第３図に示した。３個のピ
ークが認められた。上記したようなCPD−Ｙお
よびCPD−Ａを用いた消化実験の結果としての
各ピークのアミノ酸組成およびピーク組成も示さ
れてある。これらの反応でインスリンのＢ−鎖の
Ｃ−末端のみがこれらの反応に関与するので、−
Pro−Lys−Ala−OHをブタインスリンの略号と
して用いる。それで他のインスリン誘導体もつぎ
のように略称する。 −Pro−Lys−Thr−OH＝ヒトインスリン、−
Pro−Lys−Thr−NH2＝ヒトインスリンアミド
等である。反応に用いたPH7.5そして、CPD−Ｙ
のアミダーゼ活性がペプチダーゼ活性より一般的
に低い状態で、生成ペプチドアミドは十分に安定
である。つまり、ピークは全インスリンプール
の約20％を含有した。この反応でブタインスリン
出発材料の約75％が変換した。しかし、ピーク
のスレオニン含量（3.65）はヒトインスリンの
3.0より大なので、最初のペプチド転移生成物
（−Pro−Lys−Thr−NH2）は、（−Pro−Lys−
Thr−Thr−NH2）の形成をともなうオリゴマー
化を避けるほど十分には安定でないことは明らか
である。 アミド中間体をこのように形成することは、
CPD−Ｙを用いる、以前に記載された脱アミド
段階によつては均一なヒトインスリンが形成され
ぬことを示す。つまり、脱アミドで−Pro−Lys
−Thr−OHと−Pro−Lys−Thr−Thr−OHの
混合物が生ずると予期される。しかし、ピーク
混合物を、0.1M HCl、２ｍＭ EDTA中PH10.0
で10μM CPD−Ｙを用いる脱アミド処理に20分
間処すると、驚くべきことに、ほとんど純粋なヒ
トインスリンが得られた。実験はつぎのように実
施した。 インスリンより酵素および低分子量物を、
“Sephadex Ｇ−50”カラムで除いたあと、第３
図と同じ操作を用い“DEAE Sephadex Ａ−25”
でクロマトグラフした。反応生成物は予期通りピ
ークに溶出された。他方未反応物（＜10％）は
ピークに溶出された。ピークは存在しない。
つまり、リジン不含のインスリン誘導体はまつた
く形成されなかつた。CPD−Ａ、CPD−Ｙおよ
びトリプシン消化で得られる表の結果から分る
ように、これらの反応でスレオニン含量のみ著し
く影響される。このことは、このPHでペプチダー
ゼ活性が存在しないという期待通りである。 脱アミド反応からのピークのアミノ酸組成
は、ヒトインスリンの分析結果に近い。つまり、
Thr＝2.87、Ala＝1.05、Lys＝0.98。脱アミド生
成物のCPD−Ｙ、CPD−Ａおよびトリプシン消
化の結果は、この試料が純ヒトインシユリンを90
から95％含有することを示す。このことは、イン
スリン誘導体−Pro−Lys−Thr−Thr−NH2は、
ほとんど、ペプチジル−アミノ−酸−アミドヒド
ロラーゼ活性のみを経由して反応すること、他
方、−Pro−Lys−Thr−NH2は大部分アミダーゼ
活性を経由し反応することを示す。ブタインスリ
ンのヒトインスリンへの変換の全体としての収率
は、変換されたインスリンの量を基礎として約30
％である。
【表】
例 ５
（Des−アラニン（B30）ブタインスリン
（DAI）とスレオニンアミドとのトリプシン触
媒縮合で得られたヒトインスリンアミドの脱ア
ミド） 有利な、インスリンアミドのCPD−Ｙ触媒脱
アミドが本発明のペプチド転移プロセスで得られ
るインスリンアミドに限定されぬことを実質的に
示すために、Morihara等の一般的な教示
（EP17938および参照文献５および６）に準じて、
ヒトインスリンアミドを調製した。しかし、
EP17938において、アミドはスレオニン中のカル
ボキシル基のための他に考えられる保護基のうち
のひとつにおいて触れられているが、その応用は
実施例で示されておらず、ただひとつの例でスレ
オニン３級ブチルエステルが扱われているのみで
あることに留意したい。 反応はつぎのスキームで示される。 この方法は、EP17938に例示された方法に比し
て著しい利点を有する。この酵素的脱アミドは、
Morihara等の酸触媒脱エステルよりずつと温和
である。 DAI−ThrNH2の調製 スレオニンアミド塩酸塩（400mg）を60％ジメ
チルホルムアミド（DMF）（２ml）に懸濁させ、
PHをピリジン（20μ）および6M NaOH（50μ
）で6.5に調整し、トリプシン（100mg）および
DAI（100mg）を添加した。1/2時間後、ギ酸（１
ml）を加えて反応を止めた。反応混合物は、1M
酢酸を用い“Sephadex Ｇ−50”で分画した。つ
ぎの分画を集めた。 トリプシン分画：60mg インスリン分画：102mg 残り 371mg インスリン分画（102mg）は7M尿素で平衡させ
た“DEAE−Sephadex Ａ−25”のイオン交換ク
ロマトグラフイーで精製した。EP17938に従い、
NaClグラジエントで溶出した。 59.2mgの純ヒトインスリンアミド（DAI−Thr
−NH2、アミノ酸分析で検出）を得た。 DAI−Thr（ヒトインスリン）の調製 DAI−Thr−NH2（11mg）を１ｍＭ ETAおよ
び２ｍＭ KCl（２ml）に溶解した。PHは0.5M
NaOH（51μ）で9.0に調整した。CPD−Ｙ（5.0μ
、13.6mg／ml）を加えた。15分後、6M HCl
（25μ）を加え、PHを1.2に低下させ反応を止め
た。反応混合物は“Sephadex Ｇ−50”で分け、
1M酢酸で溶出した。８mgのヒトインスリンを得
た。アミノ酸分析結果を次表に示す。
（DAI）とスレオニンアミドとのトリプシン触
媒縮合で得られたヒトインスリンアミドの脱ア
ミド） 有利な、インスリンアミドのCPD−Ｙ触媒脱
アミドが本発明のペプチド転移プロセスで得られ
るインスリンアミドに限定されぬことを実質的に
示すために、Morihara等の一般的な教示
（EP17938および参照文献５および６）に準じて、
ヒトインスリンアミドを調製した。しかし、
EP17938において、アミドはスレオニン中のカル
ボキシル基のための他に考えられる保護基のうち
のひとつにおいて触れられているが、その応用は
実施例で示されておらず、ただひとつの例でスレ
オニン３級ブチルエステルが扱われているのみで
あることに留意したい。 反応はつぎのスキームで示される。 この方法は、EP17938に例示された方法に比し
て著しい利点を有する。この酵素的脱アミドは、
Morihara等の酸触媒脱エステルよりずつと温和
である。 DAI−ThrNH2の調製 スレオニンアミド塩酸塩（400mg）を60％ジメ
チルホルムアミド（DMF）（２ml）に懸濁させ、
PHをピリジン（20μ）および6M NaOH（50μ
）で6.5に調整し、トリプシン（100mg）および
DAI（100mg）を添加した。1/2時間後、ギ酸（１
ml）を加えて反応を止めた。反応混合物は、1M
酢酸を用い“Sephadex Ｇ−50”で分画した。つ
ぎの分画を集めた。 トリプシン分画：60mg インスリン分画：102mg 残り 371mg インスリン分画（102mg）は7M尿素で平衡させ
た“DEAE−Sephadex Ａ−25”のイオン交換ク
ロマトグラフイーで精製した。EP17938に従い、
NaClグラジエントで溶出した。 59.2mgの純ヒトインスリンアミド（DAI−Thr
−NH2、アミノ酸分析で検出）を得た。 DAI−Thr（ヒトインスリン）の調製 DAI−Thr−NH2（11mg）を１ｍＭ ETAおよ
び２ｍＭ KCl（２ml）に溶解した。PHは0.5M
NaOH（51μ）で9.0に調整した。CPD−Ｙ（5.0μ
、13.6mg／ml）を加えた。15分後、6M HCl
（25μ）を加え、PHを1.2に低下させ反応を止め
た。反応混合物は“Sephadex Ｇ−50”で分け、
1M酢酸で溶出した。８mgのヒトインスリンを得
た。アミノ酸分析結果を次表に示す。
【表】
【表】
例 ６
1.0Mスレオニンアミド中のブタZn−インスリ
ン（７mg／ml）の溶液、PH6.9にペニシリウム
ジヤンチネルム（penicillium janthinellum）に
由来するカルボキシペプチダーゼＰ（CPD−Ｐ）
を最終濃度が0.42mg／mlになるまで加える。25℃
で、2.5時間反応させた後に、HPLCで確認して、
ブタインスリンの50％がヒトインスリンに変換さ
れた。 １ Ruttenberg、M.A.：Human insulin：
Facile synthesis by modification of porcine
insulin、Science177、623−25（1972） ２ Gattner、H.−G.、Schmitt、E.W.、
Naithani、V.K.、in Semisynthetic peptides
and proteins、Eds.RE Offord and Ｃ−Di
Bello、Academic Press、New York1978、
181. ３ Obermeier、R.、Geiger、R.（1976）、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.、357、759
−67. ４ Inouye、K.、Watanabe、K.、Morihara、
K.、Tochino、Y.、Kanaya、T.、Emura、
J.：Enzyme−assisted semisynthesis of
human insulin、Journal of the American
Chemical Society、（1979）、vol.101、751−
52. ５ Morihara、V.：Semi−synthesis of
human insulin by trypsin−catalyzed
replacement of Ala−B30 by Thr in
porcine insulin、Nature、Vol.280、No.5721、
1979、412−13. ６ Morihara、K.、Oka、T.、Tsuzuki、H.、
Tochino、Y.、Kanaya、T.：Achromobacter
protease Ｉ−catalyzed conversion of
porcine insulin into human insulin、
Biochemical and Biophysical Research
Comm.Vol.92、No.２、1980、396−402. ７ Widmer、F.、Johansen、J.T.：Enzymatic
peptide synthesis carboxypeptidase Ｙ
catalyzed formation of peptide bonds、
Carlsberg Res.Commun、Vol.44、April23、
1979、37−46. ８ Johansen、J.T.、Breddam、K.、Ottesen、
M.：Isolation of Carboxypeptidase Ｙ by
affinity chromatography、Carlsberg Res.
Commun.、Vol.41、No.１、1976、１−13. ９ Lee、H.M.、Riordan、J.F.：Does
carboxypeptidase Ｙ have intrinsic
endopeptidase activity？Biochemical and
Biophysical Research Comm.、Vol.85、No.
３、1978、1135−1142. 10 Obermeier、Rainer：Des−octapeptide−
（B23−30）−insulin、starting material for
human insulin and analogues；studies on
synthesis purification and properties、Eds.
RE Offord and Ｃ−Di Bello、Academic
Press、New York、1978、201−11. 11 Breddam、K.、Widmer、F.、Johansen、J.
T.：Carboxypeptidase Ｙ Catalyzed
transpeptidations and enzymatic peptide
synthesis、Carlsberg Res.Comm.Vol.45、
November4、1980、p.237−247. 12 Kubota et al.Carboxypeptidase CN、J.
Biochem.、Vol.74、No.４（1973）、p.757−770.
ン（７mg／ml）の溶液、PH6.9にペニシリウム
ジヤンチネルム（penicillium janthinellum）に
由来するカルボキシペプチダーゼＰ（CPD−Ｐ）
を最終濃度が0.42mg／mlになるまで加える。25℃
で、2.5時間反応させた後に、HPLCで確認して、
ブタインスリンの50％がヒトインスリンに変換さ
れた。 １ Ruttenberg、M.A.：Human insulin：
Facile synthesis by modification of porcine
insulin、Science177、623−25（1972） ２ Gattner、H.−G.、Schmitt、E.W.、
Naithani、V.K.、in Semisynthetic peptides
and proteins、Eds.RE Offord and Ｃ−Di
Bello、Academic Press、New York1978、
181. ３ Obermeier、R.、Geiger、R.（1976）、
Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.、357、759
−67. ４ Inouye、K.、Watanabe、K.、Morihara、
K.、Tochino、Y.、Kanaya、T.、Emura、
J.：Enzyme−assisted semisynthesis of
human insulin、Journal of the American
Chemical Society、（1979）、vol.101、751−
52. ５ Morihara、V.：Semi−synthesis of
human insulin by trypsin−catalyzed
replacement of Ala−B30 by Thr in
porcine insulin、Nature、Vol.280、No.5721、
1979、412−13. ６ Morihara、K.、Oka、T.、Tsuzuki、H.、
Tochino、Y.、Kanaya、T.：Achromobacter
protease Ｉ−catalyzed conversion of
porcine insulin into human insulin、
Biochemical and Biophysical Research
Comm.Vol.92、No.２、1980、396−402. ７ Widmer、F.、Johansen、J.T.：Enzymatic
peptide synthesis carboxypeptidase Ｙ
catalyzed formation of peptide bonds、
Carlsberg Res.Commun、Vol.44、April23、
1979、37−46. ８ Johansen、J.T.、Breddam、K.、Ottesen、
M.：Isolation of Carboxypeptidase Ｙ by
affinity chromatography、Carlsberg Res.
Commun.、Vol.41、No.１、1976、１−13. ９ Lee、H.M.、Riordan、J.F.：Does
carboxypeptidase Ｙ have intrinsic
endopeptidase activity？Biochemical and
Biophysical Research Comm.、Vol.85、No.
３、1978、1135−1142. 10 Obermeier、Rainer：Des−octapeptide−
（B23−30）−insulin、starting material for
human insulin and analogues；studies on
synthesis purification and properties、Eds.
RE Offord and Ｃ−Di Bello、Academic
Press、New York、1978、201−11. 11 Breddam、K.、Widmer、F.、Johansen、J.
T.：Carboxypeptidase Ｙ Catalyzed
transpeptidations and enzymatic peptide
synthesis、Carlsberg Res.Comm.Vol.45、
November4、1980、p.237−247. 12 Kubota et al.Carboxypeptidase CN、J.
Biochem.、Vol.74、No.４（1973）、p.757−770.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK319780A DK319780A (da) | 1980-07-24 | 1980-07-24 | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57501161A JPS57501161A (ja) | 1982-07-08 |
| JPS642360B2 true JPS642360B2 (ja) | 1989-01-17 |
Family
ID=8120166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56502653A Expired JPS642360B2 (ja) | 1980-07-24 | 1981-07-23 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4645740A (ja) |
| EP (1) | EP0045187B1 (ja) |
| JP (1) | JPS642360B2 (ja) |
| AT (1) | ATE9820T1 (ja) |
| AU (1) | AU543687B2 (ja) |
| CA (1) | CA1175372A (ja) |
| DE (1) | DE3166608D1 (ja) |
| DK (1) | DK319780A (ja) |
| ES (2) | ES8300858A1 (ja) |
| HU (1) | HU185668B (ja) |
| IE (1) | IE51620B1 (ja) |
| SU (2) | SU1554766A3 (ja) |
| WO (1) | WO1982000301A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA815066B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| WO1982004069A1 (en) * | 1981-05-20 | 1982-11-25 | Andresen Finn Hede | A process for the preparation of insulin derivatives |
| DK353781A (da) * | 1981-08-10 | 1983-02-11 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
| JPS58501455A (ja) * | 1981-09-15 | 1983-09-01 | ノルデイスク インシユリンラボラトリユ−ム | 人インシユリンまたはそのｂ−３０エステルの製造法 |
| WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3327709A1 (de) * | 1983-07-29 | 1985-02-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Insulin-derivat-kristallsuspensionen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DK113585D0 (da) * | 1985-03-12 | 1985-03-12 | Novo Industri As | Nye peptider |
| DK119785D0 (da) * | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Nordisk Gentofte | Insulinpraeparat |
| PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| DK220890D0 (da) * | 1990-09-14 | 1990-09-14 | Ole Buchardt | Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider |
| US5580751A (en) * | 1990-09-14 | 1996-12-03 | Carlsberg A/S | Process for the preparation of C-terminally amidated peptides |
| US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| WO1995007931A1 (en) * | 1993-09-17 | 1995-03-23 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| US6011007A (en) * | 1993-09-17 | 2000-01-04 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| AU1112597A (en) * | 1996-07-25 | 1998-02-20 | Firma "Nika-Universal" | Binary techniques for producing biologically active peptides |
| US6323311B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-11-27 | University Of Utah Research Foundation | Synthesis of insulin derivatives |
Family Cites Families (6)
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