HU185668B - Process for the enzymatic substitution of aminoacid in position b-30 of - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a különböző fajokból származó inzulinok B-láncban levő C-terminális aminosav (B—30 aminosav) enzimatikus helyettesítésére.

Ismert, hogy a különböző gerincesekből — beleértve az emlősöket és az emberi nemet is — származó inzulinok elsődleges szerkezete különböző. Sanger 1958-ban határozta meg a marha inzulin elsődleges szerkezetét (4. ábra), azóta más gerinces fajokból származó inzulinok elsődleges szerkezetét is felderítették. A leírásban az aminosavak rövidítésére a nemzet- I közileg elfogadott jelölést használjuk.

A IV. táblázatban összesített eredmények szerint a sertés inzulin példája bizonyítja, hogy az egyik láncon belül több helyzetben fordulhat elő aminosav-csere. Azonban bizonyos szerkezeti vonások közösek az ί összes inzulinban, például a három diszulfid-kötás helyzete, az A-lánc N-terminális szakasza, a C-terminális szakasz B—23—B—26 szekvenciarészlete, és így tovább.

Néhány gyakran vizsgált inzulin elsődleges szerke- ^;; zetében fellelhető különbség a IV. táblázatban látható:

IV. táblázat

A-lánc B-lánc

Faj	4	8	9	10	3	29	30
Marha	Glu	Alá	Ser	Val	Asn	Lys	Alá
Birka	Glu	Alá	Gly	Val	Asn	Lys	Alá
Ló	Glu	Thr	Gly	Ileu	Asn	Lys	Alá
Bálna	Glu	Alá	Ser	Thr	Asn	Lys	Alá
Sertés	Glu	Thr	Ser	Ileu	Asn	Lys	Alá
Bálna sper-	Glu	Thr	Ser	Ileu	Asn	Lys	Alá
mium
Kutya	Glu	Thr	Ser	Leu	Asn	Lys	Alá
Ember	Glu	Thr	Ser	Ileu	Asn	Lys	Thr
Nyúl	Glu	Thr	Ser	Ileu	Asn	Lys	Ser
Patkány 1	Asp	Thr	Ser	Ileu	Lys	Lys	Ser
Patkány 2	Asp	Thr	Ser	Ileu	Lys	Met	Ser

A találmányban alább részletesen leírjuk a sertés in zulin átalakítását emberi inzulinná, azaz a B—30-ala nin treoninnal való helyettesítését. A találmány szerinti eljárás alkalmazható más inzulinok átalakítására i is, például patkány inzulint emberi inzulinná vagy marha inzulint (B—30—THR)-marha inzulinná lehet alakítani.

A sertés inzulin emberi inzulinná alakítása félszintetikus eljárással az inzulin-kémiában nagyon jelentős ί probléma volt.

Az emberi inzulin csak egy aminosavval különbözik a sertés inzulintól, mégpedig a B-lánc C-terminális aminosavja az emberi inzulinban treonin, míg a sertés inzulinban alanin. Az alanin treoninra történő kiese- h rélését kezdetben kémiai módszerrel végezték, újabban enzimatikus eljárást használnak erre a célra. Ruttenberg [Science 177, 623 (1972)] szerint a sertés inzulin emberi inzulinná alakítása kémiai módszerrel a következő lépésekből állt: észterezés inzulin-hexametil- , -észterré, tripszines hidrolízis dezoktapeptid-inzulin (rövidítve DOI)-pentametil-észterré, az aminocsoportok védése, kapcsolás a megfelelő, emberi inzulin szekvenciát tartalmazó szintetikus oktapeptiddel, amino-védőcsoportok savas hasítása, végül a metil- ,

-észter-csoportok lúgos elszappanosltása. Azonban soha senki nem volt képes tiszta emberi inzulint előállítani ezzel a módszenei, mivel a kémiai reakciólépések és különösen az utolsó lépésben végrehajtott lúgos - elszappanosítás következtében az inzulin molekula komolyan károsodott, és az A-lánc C-terminális aminosavjában izoaszparagin is képződött [Gattner és munkatársai, Semisynthetic peptides and proteins, Eds. RE Offord and C-Di Bello, Acad. Press, New - York 1978. 181. oldal]. A káros hatások elkerülése céljából Obermeier és Geiger [Hoppe-Seyler’s Z, Physiol. Chem 357, 759 (1976)] az oktapeptid kapcsolását a DOI-oldallánc karboxilcsoportjainak védése nélkül hajtották végre. így alapos tisztítás után tiszta emben ü inzulint tudtak izolálni, de igen alacsony kitermeléssel. Gattner és munkatársai is próbálkoztak hasonló eljárással, különböző inzulin-fragmenseket alkalmazva. Azonban kémiai módszerekkel ezidáig még senkinek sem sikerült nyomnyi mennyiségnél több tiszta ’ó emberi inzulint előállítani.

Bodanszky, M. és munkatársai a 3276961. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertettek egy eljárást emberi inzulin előállítására, amely szerint az emberi inzulint más állati inzulinokból állították elő enzimatikus úton, karboxipeptidáz A és tripszin segítségével, treonin jelenlétében. Ezzel az eljárással nem valószínű, hogy emberi inzulint elő lehet állítani, mivel a tripszin és a karboxipeptidáz A nemcsak a lizil-alanin (B—29—B—30) peptidkötést ö hidrolizálja, hanem az inzulin egyéb helyein lévő kötéseket is, a fenti bejelentésben leírt körülmények között. A tripszin inkább az arginil-glicin (B22—B23) peptidkötést hidrolizálja, a lizil-arginin (B—29—B30) peptidkötés helyett. Emellett a karboxipeptidáz A ') nem tudja a B-lánc C-terminális végéről az alanint lehasítani az A-lánc C-terminális aszparaginjának lehasítása nélkül. A reakciót ammónium-hidrogén-karbonát pufferoldatban kell végrehajtani ahhoz, hogy az aszparagin lehasadását elkerüljük. Ezt a körülmény u Schmitt 1978-ban fedezte fel [Schmitt: HoppeSeyler’s Z. Physiol. Chem. 359. 799 (1978)]. Továbbá peptid szintézis aligha mehet végbe, mivel ilyen körülmények között a hidrolízis sebessége nagyobb, mint a szintézis sebessége.

<, Inouye és munkatársai [J. AM. Chem? Soc. 101, 751 (1979)] sertés inzulinból nyert, N-terminálison védett DOI-t az emberi inzulin B—23—B—30 szekvenciájának megfelelő oktapeptiddel kapcsolva tripszin katalizátor jelenlétében emberi inzulint állítottak elő.

, Azonban ez az eljárás nehézkes, mivel a sertés inzulint először tripszinnel emésztik, a kapott DOI-t N-terminálisán BOC—N,-dal (terc-butoxi-karbonil-azid) acilezve védik, maja az így kapott terméket 20 órán át inkubálják egy külön szintetizált olyan emberi B—23— , —B—30 oktapeptiddel, amelyben a B—29 lizin BOCcsoporttal van védve. A kapott (BOQj-emberi inzulinból ezután trifíuor-ecetsav-anizol elegyben 0 °C-on 60 percen át tartó hidrolízissel eltávolítják a védőcsoportokat. A felhasznált (BOC)₂-DOI-ra számított ki,, termelés 49% volt,

A fentihez hasonló módon Morihara és munkatársai [Natúré 280, 412 (1979)] karboxipeptidáz A-val 8 órán át emésztett sertés inzulinból származó (B—30dezalanin)-inzulinból (DAI) szintetizáltak emberi inzulint. 10 mmól/1 DAI-t nagy feleslegben levő 0,5 mól/1 treonin-terc-butil-észterrel [(Thr—Obu')] 37 °C-on 20 órán keresztül inkubáltak, nagy feleslegben lévő szerves társ-oldószer jelenlétében. A keletkezett (B—30-Thr—OBu')-inzulinból a védőcsoportot trifluor-ecetsavval távolították el anizol jelenlétében. A kitermelés 41% volt. Hasonló kísérletben (B—30— Thr)-marha inzulint állítottak elő 60%-os kitermeléssel.

Azonban a fenti eljárás is nehézkes, mivel a kiindulási inzulint előzetesen kezelni kell, a kapcsolási idő hosszú és a védőcsoportokat is el kell távolítani. Nagy mennyiségben szerves társ-oldószereket is használni kell, hogy az enzim hidrolitikus aktivitását a lehető legkisebbre csökkentsék.

Egy másik kísérletben Morihara és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Comm. 92, 396 (1980)] enzimatikus katalizátorként Achromobacter proteáz I-et használtak fel a DAI nagy feleslegben lévő Thr-terc-butil-észterrel történő kapcsolására, a kapott (B—30Thr-OBu‘)-inzulint a fentiekhez hasonló módon izolálták, majd a védőcsoportot eltávolították. Noha nagy kitermelést értek el (52%), a reakcióidő hosszú, 20 óra volt.

Egy hasonló kísérletben marha inzulinból kiindulva (B—30-Thr-Obu‘)-marha inzulint sikerült előállítani 58% kitermeléssel.

Az előző két irodalmi utalásban leírt eljárások megtalálhatók az 1980. október 29-én közzétett EP 17938. számú európai szabadalmi bejelentésben és a dán 1556/80. számú szabadalmi bejelentésben is.

Űjabban kimutatták, hogy a karboxipeptidáz Y enzim is hatékony katalizátor a peptid-szintézisben [Widmer és Johansen, Carlsberg Rés. Comm. 44, 37 (1979) és a dán 1443/79. számú szabadalmi bejelentés, elsőbbsége 1979. április 6.]. Továbbá kimutatták azt is, hogy ez az enzim bizonyos körülmények között elősegíti egy peptidlánc C-terminális aminosavjának más aminosavra vagy aminosav-származékra történő cseréjét, transzpeptidációs reakcióban [PCT/DK 80/00020. számú, 1980. április 1-én bejelentett, 1980. október 16-án WO 80/02151 szám alatt közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés; EP 17485. számú, 1980. október 15-én közzétett európai szabadalmi bejelentés; és a fenti PCT/DK 80/00020. számú bejelentésen alapuló 136611. számú, 1980. április 2-i elsőbbségű és 220022. számú, 1980. december 2-i elsőbbségű amerikai egyesült állomokbeli szabadalmi bejelentések].

Az alapvető reakcióelvet a feltalálók, Breddam és munkatársai a Carlsberg Rés. Comm. 45, 237 (1980) irodalmi helyen sokkal részletesebben kifejtették. Breddam és munkatársai fedezték fel a karboxipeptidáz Y eddig ismeretlen peptidil-aminosav-amid-hidroláz aktivitását.

Noha az enzim-katalizálta transzpeptidációs reakciót a fenti nemzetközi és amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben leírták és példákkal alátámasztották, a reakció alkalmazhatóságát az inzulinnal kapcsolatban nem említették, sem példákkal nem illusztrálták.

A találmány tárgya eljárás az inzulinok B—30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére. Az eljárás mentes a fentebb említett hasonló jellegű eljárások hátrányaitól, vagyis nem szükséges a kiindulási inzulint előkezelni, a reakcióidő nem hosszú és a védőcsoportokat nem kell kémiai úton eltávolítani.

Még pontosabban a találmány tárgya egyedülálló és egyszerű eljárás a sertés inzulin nagy tisztaságú humán inzulinná alakítására, jó kitermeléssel.

A találmány tárgya továbbá tökéletesített eljárás a B—30 aminosavon védett karboxilcsoportot tartalmazó inzulinok védőcsoportjának eltávolítására, különösen az amidszármazékok dezamidálására, tekintet nélkül az inzulin eredetére.

Összefoglalóan a találmány tárgya eljárás inzulinok B—30 aminosavjának enzimatikus helyettesítésére, azzal jellemezve, hogy valamely Inz-X általános képletü inzulint — a képletben X jelentése egy B—30 aminosav — egy

a) H—B—NH₂ általános képletü aminosav-amiddal — a képletben

B aminosav-maradékot jelent

b) H-B-OR³ általános képletü aminosav-észterrel — a képletben

B aminosav-maradékot jelent,

R³ jelentése alkil-, cikloalkil-, aril-, heteroaril-vagy aralkilcsoport — reagáltatunk élesztőből izolált vagy állati, növényi vagy mikrobás eredetű L-specifikus szerin- vagy tiolkarboxipeptidáz enzim jelenlétében, körülbelül 7—10,5 . pH-értéken vizes oldatban vagy diszperzióban, majd a kapott Inz-B-NH₂, Inz-B-B-NH₂ vagy Inz-B-OR³ általános képletü inzulin-származékokról az -NH₂, B-NH₂ vagy -OR³ védőcsoportokat eltávolítjuk,

A fenti védőcsoport lehasítási lépés természetesen nemcsak az előző transzpeptidációs lépésben előállított inzulin-származékokra korlátozódik, hanem alkalmazható bármely hasonló származékra, tekintet nélkül azok eredetére, különösen az EP 17938. számú szabadalmi leírás szerint előállított származékokra, amint az az 5. példában látható.

A találmány azon a meglepő felismerésen alapul, hogy a fent említett karboxipeptidáz enzim képes a sertés inzulin humán inzulinná alakítására, a B—30alanint egyetlen lépésben treoninra cserélve, anélkül, hogy az eljárás során köztiterméket kellene izolálni vagy a termékről védőcsoportot kellene eltávolitani. Adott esetben egy inzulin-amid köztitermék izolálható, ís kívánt esetben dezamidálható, ugyanezt a karboxipeptidáz enzimet alkalmazva.

Mint az alább részletesen kimutatjuk, az átalakításra legmegfelelőbb treonin-származék a treonin-amid.

Az átalakítás végén az emberi inzulin mellett egy bizonyos mennyiségű kiindulási sertés inzulin is marad a reakcióelegyben, amit bonyolult elválasztani a terméktől, ugyanakkor a keletkező inzulin-amid közti termék előnyösen elválasztható az átalakulatlan sertés inzulint tartalmazó reakcióelegyből, majd ezt követően dezamidálható, előnyösen ugyanazzal a karboxipepfidáz Y enzimmel.

A karboxipeptidáz Y enzim széles peptidáz-specificitásának következtében, amit az idézett irodalmi utalásokban és szabadalmakban alaposan és részletesen leírtak, a találmány szerinti eljárás nem korlátozódik a sertés inzulin kiindulási anyagra, hanem bármely egyéb inzulin, így a fentebb említett különböző fajokból izolált inzulinok is és más aminosavak is alkal-3185668 mazhatók kiindulási anyagként a helyettesítési reakcióban.

Más enzimeket is használhatunk, mint azt később leírjuk.

A találmány szerinti eljárás egyszerűsége valóban meglepő, még a PCT/DK80/00020. számú szabadalmi bejelentés és a 3276961. számú amerikai egyesült állomokbeli (Bodanszky-féle) szabadalmi bejelentés ismeretében is, mivel joggal várható volt, hogy nemcsak a B—30 aminosavat, hanem az A—21-aszparagint is — ami az összes említett inzulinban közös — megtámadja az enzim.

A fent említett korábbi szabadalmi leírásokban a kívánt enzimatikus jellemzőket általános peptidszintézisre való tekintettel írták le részletesen, és azt állították, hogy a karboxipeptidázok többsége különböző enzimatikus aktivitást mutat, ami erősen függ a pH-tól, például bázikus közegben pH 8 és 10,5 között túlnyomóan észteráz vagy amidáz tulajdonságuk érvényesül, pH 9 és 10,5 között nem, vagy csak jelen téktelen karboxipeptidáz aktivitásuk van, ami azon bán egyre kifejezettebbé válik, ahogy a pH 9 alá csökken. Jelen összefüggésben az észteráz aktivitás kevés bé jelentős, de egyébként ezeket a tulajdonságokat előnyösen lehet alkalmazni a találmány szerinti eljárásban, mivel ezek közrejátszanak abban, hogy az egy lépéses eljárást jó hozammal lehessen megvalósítani.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható karboxipeptidázok L-specifikus szerin- vagy tioíkarboxipeptidázok. Ilyen enzimeket az élesztőgombák termelnek, de lehetnek állati, növényi vagy mikrobás eredetűek is.

Különösen előnyős az élesztőgombából származó karboxipeptidáz Y (CPD—Y) enzim. Ezt az enzimet már leírták az előző bejelentésekben, többek között utalnak Johansen [Carlsberg Rés. Comm. 41, 1 (1976)] és munkatársai cikkére, akik különösen előnyös tisztítási eljárást dolgoztak ki, az enzimet affinitási kromatográfiás módszerrel tisztítva, műgyanta hordozóból és az ahhoz kapcsolt benzil-szukcinilcsoportokból álló gyantaágyon. A CPD—Y-ra — ami egy szerin-enzim — jellemző, hogy pH 9-en különböző, fentebb említett enzimaktivitásokkal rendelkezik, és nincs endopeptidáz aktivitása. A CPD—Y másik előnye, hogy nagy mennyiségben előállítható és viszonylag nagy stabilitású. További részietek a következő irodalmi helyeken találhatók: Widmer, F., Johansen, J. T.: Carlsberg Rés. Commun., 44, 37 (1979) és Breddam, K., Widmer, F., Johansen, J. T.: Carlsberg Rés. Comm. 45, 237 (1980).

A CPD—Y mellett a jelen találmány szerinti eljárás más, alább felsorolt karboxipeptidázokkal is kivitelezhető:

Enzim

Penicillokarboxipeptidáz S—1

Penicillokarboxipeptidáz S—2

Karboxipeptidáz(ok) Karboxipeptidáz(ok) Karboxipeptidáz(ok) C

Eredet

Gomba

Penicillium janthinellum

Penicillium janthinellum

Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae Növény narancslevél narancshéj

Karboxipeptidáz C^, Citrus natsudaidai Hayata

Phaseolain zöldbablevél

Karboxipeptidáz(ok) csírázó árpa csírázó gyapot ü paradicsom görögdinnye Bromelain (ananász) por

A fenti karboxipeptidázok közötti rokonságot Ku10 bota és munkatársai [J. Biochem. 74, 757 (1973)] vizs- ‘ gálták.

A találmány szerinti eljárás elvileg bármely természetes, félszintetikus vagy szintetikus eredetű inzulin szubsztráttal kivitelezhető.

i b Megjegyezzük, hogy az inzulin kiindulási anyagot alkotó egyes aminosavakban jelenlévő ionizálható csoportok kívánt esetben önmagában ismert módon védhetők, a csoport jellegétől függően. Azonban ez egyáltalán nem szükséges, éppen ez a jelen eljárás egyik előnye. Ha mégis bizonyos okokból védeni kell a funkciós csoportokat, a fent említett szabadalmi leírásokban, különösen a WO 80/02151. számú szabadalmi leírásban találhatunk alkalmas védőcsoportokat.

A reakció másik résztvevője az úgynevezett aminkomponens, ami egy

a) H-B-NH₂ általános képletű aminosav-amid — a képletben

B aminosav-maradékot jelent —

b) H-B-OR³ általános képletű aminosav-észter — a képletben

B aminosav-maradékot jelent,

R³ jelentése alkil-, cikloalkil-, aril-, heteroaríí-vagy aralkilcsoport — jf_: lehet.

Az amin-komponensként említett aminosav bármely ismert természetes aminosav lehet, így például leucin, izoleucin, alanin, glicin, szerin, valin, treonin, lizin, arginin, aszparagin, glutamin, glutaminsav, metionin, fenilalanin, tirozin, triptofán, vagy hisztidin.

Alkilcsoporton egyenes vagy elágazó szénláncú, előnyösen 1—6 szénatomos alkilcsoportot — például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, terc-butilamil- vagy hexil csoportot — értünk.

A cikloalkiicsoport 3—8 szénatomos cikloalkilcsoportot jelent, például ciklopropil-, ciklobutilcsoportot és így tovább.

Arilcsoporton előnyösen fenilcsoportot értünk.

Az aralkilcsoport benzil-, fenetilcsoportot vagy ha. _d sonló csoportokat jelent,

Heteroarilcsoport alatt például piridil-, pirrolidií-, pirimidinil-, morfolinil-, pirazinil- vagy imidazililcsoport értendő.

Az összes fenti csoport szubsztituálható az enzim szempontjából közömbös szubsztituensekkel, például halogénatommal (fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal), nitrocsoporttal, alkoxicsoporttal (metoxi-, etoxicsoporttal), vagy alkilcsoporttal (metil-, etilcsoporttal).

3_(í Az -OR³ csoport előnyösen alkoxicsoportot, például metoxi-, etoxi-, vagy terc-butoxi-csoportot, fenoxi-vagy benzoxicsoportot jelent. A csoportok adott esetben közömbös szubsztituensekkel, például nitrocsoporttal (p-nitro-benzoxi-csoport) lehetnek _i3. szubsztituálva.

185 668

Mint a fentebb említettük, a találmány szerinti eljárást 7 és 10,5 közötti pH-értéken, előnyösen 7,5—10,5 pH-η vitelezzük ki. Az előnyös pH-érték gyakran igen szűk pH-intervallumon belül van, ami a használt enzim különböző enzimaktivitásainak pH-optimumától és pH-minimumától függ. A pH-t úgy kell megválasztani, hogy az aktivitások az előzőeknek megfelelően egymással egyensúlyban legyenek. Enzimként CPD— Y-t használva a pH-érték előnyösen 7,5—10,5, különösen előnyös a 9,0—10,5 érték, amint azt később megmagyarázzuk. Ha az inzulin-amid köztiterméket kívánjuk izolálni, az előnyös pH-tartományon belüli alacsonyabb pH-értékek, vagyis a pH 7,5 körüli értékek különösen megfelelőek.

A választott pH-t előnyösen az egész kapcsolási reakció alatt állandó értéken kell tartani, majd a termék kicsapására vagy a védőcsoportok lehasítására meg lehet változtatni. Választhatunk olyan pH-t, hogy az enzim amidáz aktivitást mutasson, és emellett a képződött inzulin-amid ne csapódjon ki, ezáltal előnyösen résztvegyen a kívánt inzulin egy lépésben végbemenő képződésében. A pH-t úgy is megválaszthatjuk, hogy az enzim túlnyomóan peptidáz aktivitást mutasson, és a stabil inzulin-amid köztitermék képződése kerüljön előtérbe.

A pH kívánt értéken tartását a reakcióközegbe vitt, megfelelő pH-tartományt biztosító alkalmas pufferoldattal biztosíthatjuk, például hidrogén-karbonát pufferrel.

A pH-értéket úgy is biztosíthatjuk, hogy a reakció folyamán savat, például sósavat vagy bázist, például nátrium-hidroxidot adagolunk a reakcióelegybe. Ezt a műveletet pH-sztát közbeiktatásával kényelmesen elvégezhetjük.

A fenti, valamint a Carlsberg Rés. Comm, 44, 37 (1979) és 45, 237 (1980) irodalmi helyen található adatok ismeretében egy szakember ki tudja választani a legmegfelelőbb reakciókörülményeket, különös tekintettel a pH-ra, amelyek között a különböző enzimaktivitások (amidáz, peptidáz, észteráz, karboxipeptidáz és peptidil-aminosavamid-hidroláz) legjobban hasznosithatók, az inzulin szubsztrát-komponenstől, az amin-komponenstől és attól függően, hogy köztitermék vagy a végtermék keletkezését tűztük ki célul.

Általában a kedvező pH-tartományon belül az alacsonyabb pH-értékeknél az inzulin-amid köztitermék keletkezése és kicsapódása kerül előtérbe, míg a magasabb pH-értékeknél a karboxipeptidáz enzim kifejezettebb amidáz aktivitása következtében az amidkötés elhasad és inzulin keletkezik.

A körülményeket az enzim koncentrációja, a reakcióidő és a többi körülmények is befolyásolják.

A reakciót vizes közegben hajtjuk végre, amely kívánt esetben 0—50 térfogati szerves oldószert is tartalmazhat. Előnyös szerves oldószerek az alkanolok — például metanol és etanol —, a glikolok — például etilénglikol vagy polietilénglikolok —, a dimetilformamid, dimetii-szulfoxid, tetrahidrofurán, dioxán vagy dimetoxi-etán.

A reakcióközeg összetételének megválasztása különösen a reakciókomponensek és az inzulin-termékek pH-jától, oldhatóságától és hőmérsékletétől és az enzim stabilitásától függ.

A reakcióközegben lehet egy olyan összetevő is, ami az enzimet oldhatatlanná teszi, az enzimaktivitás jelentős részének megtartása mellett, ilyen például egy ioncserélő gyanta. Az enzimet ismert módon — például a Methods in Enzymology, Vol. 44, (1976) irodalmi helyen ismertetett módon — immobilizálhatjuk is, például egy térhálósított dextrán vagy agaróz hordozóhoz, szilikagélhez, poliamidhoz vagy cellulózhoz kötve, vagy poliakrilamidba, alginátba vagy rostokba zárva. Emellett az enzimet kémiailag is módosíthatjuk, hogy megnöveljük a stabilitását vagy enzimatikus sajátságait megjavítsuk.

Abban az esetben, ha az inzulin-amid köztitermék kicsapódásának megakadályozása a cél, a reakcióközeg 0—3 mól/1 karbamidot vagy guanidin-hidrokloridot tartalmazhat. Ez előnyös lehet a pH-értékek szempontjából is, vagy olyan reakcióközegben, ahol az inzulin szubsztrát-komponens oldékonysága korlátozott.

A két reakciópartner koncentrációja széles határokon belül változhat, mint azt alább részletezzük. Az inzulin szubsztrát kiindulási koncentrációja előnyösen 0,002—0,05 mól/1, az amin-komponens kiindulási koncentrációja előnyösen 0,05—3 mól/1.

Az enzimaktivitás változhat, de a koncentráció előnyösen 10“⁶—10~⁴ mól/1, különösen előnyös a 10^-3 mól/1 koncentráció. A legelőnyösebb aktivitás többek között a szubsztrátkoncentrációtól, az aminokoncentrációtól.és a reakcióidőtől függ.

A találmány szerinti eljárásban a reakcióhőmérséklet előnyösen 20—40 °C. Az egy adott szintézishez legelőnyösebb reakcióhőmérsékletet kísérleti úton lehet meghatározni, de különösen a használt aminkomponenstől és az enzim koncentrációjától függ. Általában 20—30 °C a megfelelő hőmérséklet, előnyöien 25 °C. 20 °C alatti hőmérsékleteken a reakcióidő túlságosan hosszú, míg 40 °C feletti hőmérsékleteken gyakran az enzim és/vagy a reagensek vagy a reakciótermékek stabilitása jelent problémát.

A reakcióidő is hasonlóképpen változhat, a reakció körülményeitől, különösen az enzimkoncentrációtól függ erősen. A reakcióidő a találmány szerinti eljárásban 2—6 óra lehet.

Megemlítjük, hogy abban az esetben, mikor aminkomponensként amidot vagy helyettesített amidot használunk, a képződött inzulinról az amid csoportot rendszerint specifikusan kell eltávolítani. Ebből a szempontból a karboxipeptidáz, különösen a CPD— Y nagyon megfelelő, mivel mint fentebb leírtuk, a CPD—Y amidáz aktivitással is rendelkezik pH > 9 értéknél, ugyanakkor karboxipeptidáz aktivitása elhanyagolható.

Ugyanilyen okból a karboxipeptidáz általában alkalmazható az -OR³ észtercsoportok lehasítására a keletkezett inzulin-észter köztitermékből, hogy a kívánt, szabad C-terminálist tartalmazó inzulinhoz jussunk.

Kiindulási anyagok

A sertés inzulint a Nordisk Insulin-laboratóriumtól kaptuk, Koppenhágából. A karboxipeptidáz Y enzimet pékélesztőből (a Carlsberg Breweries kereskedelmi készítménye) izoláltuk, Johansen és munkatársai [Carlsberg Rés. Comm. 41, 1 (1976)1 affinitási kromatográfiás módszerének módosításával, a terméket

-5185 668 liofilizált por alakjában kaptuk (10% enzim nátriumcitrátban). Az enzimet felhasználás előtt Sephadex* G—25 (1,5x25 cm) oszlopon sómentesltettük, vízzel ekvilibrálva és eluálva. Az enzim koncentrációját spektrofotometriás módszerrel határoztuk meg, E^l%280 nm“ 14,8. Az enzim-készítmény nem mutatóit proteáz A aktivitást Lee és Riordan [Biochem. Biophys. Rés. Comm. 85, 1135 (1978)5 módszerével vizsgálva. Az L-treonin-amid a Vega-Fox, Arizona, USA terméke, az L-treonin-metil-észter a Fluka, Svájc, tz L-treonin, denzil-kíorid, karboxipeptidáz A és a tripszin a Sigma, USA terméke volt. A kromatográfiás anyagok a Pharmacia, Svédország termékei voltak. Az összes többi oldószerek és reagensek a Merck cég, NSZK analitikai tisztaságú termékei voltak.

Aminosav-analízis

Az aminosav mintákat 6 mól/1 hidrogén-kloridba λ 110 °C-on vákuumban 24 órán át bidrolizáltuk és Durrum D—500 aminosav analizátorban vizsgáltuk. Az aminosav-összetéttelt az ismert mennyiségben jelenlévő aszparaginsav és glicin alapján határoztuk meg. A reakciókkal a treonin, lizin, és alanin mutalható csak ki. Ezeknek az aminosavaknak az értéke sertés (emberi) inzulinban a következő volt; Thr-1,93 (2,87), Lys-0,97 (0,98) és Alá “-2,00 (1,05). Az átalakulatlan sertés inzulin mennyiségét a reakcióelegyben Sephadex* G—50-en végzett kromatográfia után az inzulin alanin tartalmának analízisé bői határoztuk meg. A kitermelést úgy kapjuk, hog egy adott termék mennyiségét osztjuk a reakcióban felhasznált összes inzulin mennyiségével.

Emésztés karboxipeptidáz A-val (2. és 3. példa)

100 μΐ inzulin vagy inzulin-származékot tartalmazó oldathoz (0,7 mg inzulin vagy inzulin-származék/1 mi 0,1 mól/1 Tris-HCl puffer) (pH 7,5) 10 pg karboxi peptidáz A-í adtunk. Szobahőmérsékleten 6 órán á: inkubáltuk, a reakciót azonos térfogatban adott 0.5 mól/l sósavval leállítottuk és a szabaddá vált amino savax mennyiségét aminosav-analízissel meghatároz tűk.

Inzulin-származékok enzimatikus emésztése (4. példa,

A különböző inzulin-származékok emésztését kar boxipeptidáz A-val vagy karboxipeptidáz Y-nal 0,05 mól/1 Tris pufferben (pH 7,5) szobahőmérsékleten végeztük, körülbelül 1,5 mmól/1 inzulint és 5 pmól/í karboxipeptidázt alkalmazva, a reakcióidő 3 óra volt a CPD—A és 1,5 óra a CPD—Y esetén. Ilyen körülmények között hasadt le a C-terminális aminosavakból a legnagyobb mennyiség. Sósavas savanyítás után az alikvot mennyiségeket közvetlenül az aminosav analizátorba vittük.

A különböző inzulin-származékok C-terminális részének aminosav szekvenciáját úgy határoztuk meg, hogy tripszines emésztés után az elegyet denzil-kloriddal (Dnz-klorid) reagáltattuk és a denzil-peptideket azonosítottuk. (Denzil — 5-(dimetil-amino)-l-nafta6 linszulfanil.) Az inzulin-származékok tripszines emésztését 0,1 mól/1 nátriumhidrogén-karbonát oldatban (pH 8,2) végeztük, 1 mmól/1 inzulint, 40 pmól/l DPCC-tripszint (DPCC-tripszin: olyan tripszin, amelynek maradék kirnotripszin-aktivitását difenil-karbamoil-kiorid hozzáadásával inaktiváltuk), és 1 órás inkubációs időt alkalmazva. Sertés inzulinnal végzett előkísérletek alapján bizonyítottuk, hogy ilyen körülmények között a B-lánc C-terminális ala^; ninja teljes mértékben szabaddá válik. A szabaddá vált aminosavakat vagy dipeptideket a következők szerint denziíáltuk: 100 μΐ tripszinnel emésztett elegyben a reakciót 100 μΐ 0,5 mól/1 sósav hozzáadásával leállítottuk. Az alikvot részeket szárazra pároltuk és 100 μΐ 0,1 mól/1 nátrium-hidrogén-karbonátban (pH 8,2) újraoldottuk, 100 μΐ denzil-kloridot (5 mg/ml aceton) adtunk hozzá és a reakeióelegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A reakeióelegyet ezután nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel ' ’ analizáltuk, Waters folyadékkromatográfiás rendszert alkalmazva, ami egy injektorból (Model U6K), két szivattyúból (Model 6000 A), programozott oldószer-adagolóból (Model 660), ultraibolyadetektorból (Model 450), adat-kiíróból (Waters Data Modulé) és egy kromatográfiás oszloppal [Waters Radial Pák A (C—18 reverse phase)] felszerelt kompresszor egységből [Waters Radial compression Modulé (RCM 100)5 állt.

A következő standard vegyületeket szintetizáltuk: Dnz-Ala-OH, Dnz-Thr-OH, Dnz-Ala-Thr-OH, Dnz-Thr-Thr-OH, Dnz-Thr-NH_2> Dnz-Thr-Thr-NH₂ és Dnz-Ala-Thr-NH₂. Az enzimesen emésztett inzulin denzílezésére fentebb leírt eljárást alkalmazva a fenti származékok közül hármat szintetizáltunk H-Ala-OH-bóí, H-Thr-OH-ból és H-Thr-NH₂-ból. A denziiált dipeptideket Dnz-Ala-OMe-ből és Dnz-Thr-OMeből kiindulva az alábbiak szerint szintetizáltuk: 1 mmól H-Ala-OMe-HCl-ot 0,1 mól/1 NaHCO, oldatban oldottunk, 5 mmól denzil-kloridot adtunk hozzá és a reakeióelegyet 2 órán át inkubáltuk, A Dnz-Ala-OMe-t etil-acetáttaí extraháltuk az elegyből, majd az extraktumot szárazra pároltuk. Magas nyomású folyadékkromatográfiás módszerrel bizonyítottuk az elválasztott anyag tisztaságát. Ugyanilyen eljárással állítottuk elő a Dnz-Thr-OMe-t ís. A két kapott vegyületet ezután az előzőleg leirt [Widmer és Johansen, Carlsberg Rés. Comm. 41, 37 (1979) és Breddam és munkatársai, Carlsberg Rés. Comm. 45, 237 (1980)] enzimatikus peptid-szintézis eljárásait alkalmazva H-Thr-OH-hoz kapcsolva Dnz-Ala-Thr-OH-t és Dnz-Thr-Thr-OH-t, H-Thr-NH₂-hoz kapcsolva pedig Dnz-Ala-Thr-NH₂-t és Dnz-Thr-Thr-NH₂-t állítottunk elő, az alábbi körülmények között: 5 mmól/1 szubsztrát, 0,5 mól/1 nukleofil, 0,1 mól/1 KC1, 2 mmól/1 EDTA, 1 gmól/l CPD—Y, pH 9,0, 10% etanol. Mind a hét denzil-származékot könnyen el lehetett választani HPLC módszerrel, két különböző programot alkalmazva.

Az 1. ábra a reakció lefolyását mutatja abban az esetben, mikor sertés inzulint L-treonin-amiddal reagáltatunk CPD—Y, mint katalizátor jelenlétében. Az aminosav-analízis eredményét ábrázoljuk az idő függvényében.

A 2. ábra hasonló reakció lefolyást mutat, L-treonin-metil-észtert alkalmazva amin-komponensként.

i

A 3. ábra a sertés inzulin és a treonin-amid reakciótermékének ioncserélő kromatográfiás elúciós profilját mutatja. (Az ábra magyarázata a 4. példánál található.)

1. példa

Sertés inzulint karboxipeptidáz Y-nal inkubálunk 25 °C-on, pH 5—7 értéken (az enzim ebben a pH-tartományban maximális peptidáz aktivitást mutat). A B-lánc C-terminális végéről a következő aminosavak válnak szabaddá: 1,0 alanin, 1,0 lizin, 1,0 prolin, 1,0 treonin, 1,0 tirozin és 2,0 fenilalanin. A B—23 helyzetnél (glicin) a karboxipeptidáz megáll, így az inzulin B-lánc első hét aminosavjának tökéletes szabaddá válását érjük el. Meglepő módon az A-lánc C-terminális aszparaginja (A—21) egyáltalán nem válik szabaddá. A B-lánc C-terminális alaninja pH 9,5 értéknél sokkal gyorsabban válik szabaddá, mint a következő aminosavak. Fontos megjegyezni, hogy a Leu-Tyr (B—15— B—16) kötés nem hasad el, mivel a használt tisztított CPD—Y enzim proteáz A-tól (endopeptidáz) mentes, ellentétben sok kereskedelemben kapható, más forrásokból nyert enzimmel.

2. példa

Ebben a példában bemutatjuk a sertés inzulin emberi inzulinná alakítását, amin-komponensként treonin-amidot használva, az inzulin-amid köztitermék izolálása nélkül.

Cink-mentes sertés inzulin (2 mmól/l-es) 10 mmól/1 EDTA-t és 0,5 mól/1 L-treonin-amidot tartalmazó 0,1 mól/1 KCl-os oldatához, pH 9,5-ön és 25 °C-on 50 pmól/l karboxipeptidáz-Y-t adunk. A reakció pH-ját 0,5 mól/1 NaOH adagolásával állandó értéken tartjuk, az adagolást pH-sztáttal végezzük. A reakció lefolyásának követésére különböző időpontokban alikvotokat veszünk a reakcióelegyből, 6 mól/l-es HC1val a pH-t 1—2-re állítva a reakciót leállítjuk. A mintát ezután 1 mól/1 ecetsawal ekvilibrált Sephadex G—50-en (1 x 30 cm) kromatografáljuk, ezáltal az inzulint az enzimtől és a szabad aminosavaktól elválasztjuk. Az inzulin-tartalmú frakciókat liofilizáljuk, majd az aminosav-összetételt a fentebb leírt módon meghatározzuk.

A reakció lefolyását az 1. ábra mutatja. Az aminosav-analízis eredményekből kiszámítottuk, hogy a treonin tartalom 1 mól inzulinra számítva 0,7 móllal növekedett, míg az alanin tartalom 0,8 móllal, a lizin tartalom 0,2 móllal csökkent. Az eredményekből kitűnik, hogy 6,5 óra reakcióidő után a sertés inzulin 20%-a változatlan, míg az inzulin 20%-ában az alanin mellett a következő aminosav, a lizin is szabaddá vált. A 0,8 mól alanin szabaddá válását 0,7 mól treonin beépülése kíséri.

A reakciótermékeket tovább analizáltuk karboxipeptidáz A enzimes emésztéssel. A karboxipeptidáz A csak a szabad karboxilcsoportot tartalmazó aminosavakat hidrolizálja, és nem teszi szabaddá a lizint. A fenti specificitással összhangban, a sertés inzulin karboxipeptidáz A-val végzett emésztése során a B-lánc C-terminálisáról csak az alanin, az A-lánc C-terminálisáról csak az aszparagin válik szabaddá. Ezért a 6,5 órás reakció után vett inzulin mintát inkubálva az aszparagin mellett csak az átalakulatlan sertés inzulinnak megfelelő mennyiségben fog alanin szabaddá válni. Meglepő módon az alanin mellett treonin is szabaddá vált, a humán inzulin-amid köztiterméket képező beépült treonin-amiddal ekvivalens mennyiségben. Ez annak tulajdonítható, hogy a karboxipeptidáz Y peptidáz és észteráz aktivitása mellett peptid-amid-hidroláz aktivitással is rendelkezik [Breddam és munkatársai, Carlsberg Rés. Comm. 45, 237 (1980)]. Nyilvánvalóan a sertés inzulin karboxipeptidáz Y jelenlétében végbemenő reakciója során a C-terminális alanin először treonin-amiddal kicserélődik, transzpeptidációs reakcióban, emberi inzulin-amidot adva, melyet aztán a karboxipeptidáz Y hidrolizál, a reakció eredménye mintegy 60% emberi inzulin, 20% átalakulatlan sertés inzulin és 20% egyéb hidrolízistermék. A reakció fenti sorrendben történő lefolyását más kísérletek is megerősítik. Kevesebb enzimet vagy rövidebb reakcióidőt alkalmazva a reakciótermékek a karboxipeptidáz Aval végzett emésztésének eredménye kisebb treonin felszabadítást mutatott, a treonin beépüléssel összehasonlítva, vagyis az emberi inzulin-amid képződés került túlsúlyba.

A reakció termékek elválasztására a 6,5 órás reakcióban kapott mintát nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk. „Lichrosorb RP—18” 5 μιη-es, fordított fázisú oszlopot (0,4 x 30 cm), „Waters Model 6000 A” szivattyút és 220 nm hullámhosszon működő „Model 450” UV-detektort használva. Eluensként 28,75% metil-nitril [5 mmól/1 n-butil-nátrium-szulfonátot és 50 mmól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 5 mmól/l-es tartarát pufferben (pH 3,0)] oldatot használunk [Inouye és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 101, 751 (1979)]. Az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc. Ebben a rendszerben a sertés és az emberi inzulint nem lehet elválasztani, de az összes többi melléktermék elválasztható. A kromatografált anyag aminosav-analízise az I. táblázatban látható. Az analízis jó egyezést mutat az elméletileg várható értékekkel. A 2,6 mól treonin és 1,3 mól alanin tartalom arra utal, hogy a minta mintegy 70% emberi és 30% sertés inzulint tartalmaz.

I. táblázat

Inzulin aminosav-összetétele

Aminosav	mól aminosav/mól inzulin	Sorrend
sertés	emberi
Aszparaginsav	3,1	3	3
Treonin	2,6	2	3
Szerin	3,1	3	3
Glutaminsav	7,2	7	7
Prolin	1,2	1	1
Glicin	4,0	4	4
Alanin	1,3	2	1
Valin	3,5*	4	4
Izoleucin	1,4*	2	2
Leucin	6,1 ’	6	6
Tirozin	3,6	4	4
Fenilalanin	3,0	3	3
Hisztidin	1,9	2	2
Lizin	1,0	1	1
Arginin	1,0	1	1

-7i 85 66 a

3. példa

Ebben a példában a sertés inzulin emberi inzulinná alakítását mutatjuk be, amin-komponensként íreo nin-metil-észtert alkalmazva, a közíitermékek eiva íasztása nélkül.

mmól/1 cink-mentes sertés inzulin oldathoz (K mmól/1 EDTA-t és 0,5 mól L-treonin-metil-észter tartalmazó 0,1 mól/l-es KCl-oldatban oldva) pH 9,í értéken és 25 °C-on 60 umól/l karboxipeptidáz Y-: adunk. A reakcióelegy pH-ját 0,5 mól/1 NaOH ada golással állandó értéken tartjuk, az adagolást pHsztáttal végezzük. A reakció lefolyásának követésére ε reakcióelegybol különböző időpontokban alikvotoka: veszünk, és 6 mól/l-es HCl-val a pH-ί 1—2-re állítva í reakciót leállítjuk. A mintát ezután 1 mól/1 eceísawai ekvilibrált Sephadex* G—-50-en (1 x 30 cm) kroma tografáljuk, ezáltal az. inzulint a szabad aminosavak tói és az enzimtől elválasztjuk. Az inzulin tartalmi frakciókat liofilizáljuk, az aminosav-összetételt a fen tebb leírtak szerint meghatározzuk.

A reakció lefolyását a 2. ábrán mutatjuk be. A reakció lefolyása nagyon hasonló a fentebb leírt, amin komponensként treonin-amidot tartalmazó reakció lefolyásához: a treonin beépülését az aianin és csekély mennyiségű lizin felszabadulása kíséri. A 17 órás reakcióidő eltelte után vett minta karboxipeptidáz A-vai végzett emésztése aianin és treonin felszabadulását eredményezte, ebből arra következtettünk, hogy a Biánc C-terminális alaninja először a treonm-metil-észterre! kicserélődve emberi inzuiin-monometil-észtert aa, ami ezt követően a karboxipeptidáz Y hatására emberi inzulinná hidrolizálódik. Noha a reakció minőségileg hasonló az előző példában teírt, treoninamiddal végzett reakcióhoz, a végső reakcióelegy csak 40% emberi inzulint tartal naz 40% áíaSakuiatlan sertés inzulin és 20% egyéb hidrolízistermék mellett.

4. példa

Ebben a példában a sertés inzulin emberi inzulinná alakítását mutatjuk be, amin-komponensként treo;.;.„-amidot alkalmazva, az inzulin-amid kőzutermék elválasztásával, mmól/1 cink-mentes sertés inzulin oldathoz Í2 mmól/1 EDTA-ban, 0,1 mól/1 KCl-ban és 0,5 mól/1 treonin-amidot (L-Thr-NH₂) tartalmazó 1,5 mól/1 guanidin-hidrokloridban oldva] pH 7,5 értéken 25 °C-on 15 mmól/ karboxipeptidáz Y-t adunk. A reakcióelegy pH-ját 0,5 mól/1 NaOH adagolásával pHszí át segítségével állandó értéken tartjuk. A reakció lefolyásának követésére a reakcióelegyből különböző időpontokban alikvotokat veszünk, A reakciót 2 óra elteltével leállítjuk, a pH-í 1,5—2,0 értékre állítva 1 mól/1 HCl-val. .Az inzulin tartalmú frakciókat az enzimtől és az alacsony molekulasúlyú vegyületektől 1 mól/1 ecetsavval ekvilibrált „Sephadex* G—50 fine” töltetű oszlopon (1 x 30 cm) végzett kromatográfiával választjuk eí, majd liofilizáljuk. A liofilizált inzulin aminosavösszetételének meghatározása arra enged következtetni, hogy a sertés inzulin 78%-a átalakult a reakcióban.

Az inzulinban jelenlévő reagensek további analízise céljából az inzulint DEAJE-Sephadex* A—25 töltetű oszlopon ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, Morihara és munkatársai [Natúré 280, 412 (1979)] módszere szerint. 75 mg liofilizált inzulin mintát 0,01 aiól/1 Tris puffért, 2,5 mól/1 karbamldot és 0,05 mól/1 NaCl-ot tartalmazó oldatban oldunk, pH 7,5ön és egy DEAE-Sephadex^R A—25 töltettel ellátott (azonos összetételű pufferrel ekvilibrált) oszlopra (2,5x25 cm) visszük. Az inzulint 0,05—0,30 mól/1 NaCl gradienssel (azonos pufferben oldva) eluáljuk, Sephadex* G—25 oszlopon 8 ml-es frakciókat gyűjtünk és liofilizáljuk.

Az elúciós profil a 3. ábrán látható. Három csúcsot figyelhetünk meg. Meghatároztuk az egyes csúcsok aminosav-összetételét, valamint a CPD—Y-nal és CPD—A-val fentebb leírt módon végzett emésztések eredményeként kapott csúcsok aminosav-összetételét is. Mivel ezekben a reakciókban csak az inzulin B ián^: cának C-terminális aminosavja vesz részi, a sertés inzulin jelölésére -Pro-Lys-Ala-OH rövidítést alkalmaztunk, Ennek megfelelően a többi inzulint az alábbiak szerint rövidítjük: -Pro-Lys-Thr-OH — emberi inzulin, -Pro-Lys-Thr-NH₂ “ emberi inzulin-amid és így tovább. A kiindulási inzulin és az egyes csúcsok aminosav-összetétele a következő:

Aminosav	Kiindulási inzulin	I. csúcs	II. csúcs	Π1. csúcs
Treonin	2,55	3,65	2,52	2,50
.Aianin	1,22	1,09	1,52	1,02
Lizin	0,55	0,99	0,74	0,06
Terület (%)		21	61	18

Az egyes csúcsok összetétele a következő:

1. csúcs: 65% -Pro-Lys-Thr-Thr-NH₂ 35% -Pro-Lys-Thr-NHj

L. csúcs: 52% -Pro-Lys-Ala-OH 26% -Pro-Lys-Thr-ÖH 22% -Pro-Thr-NK.

HL csúcs: bomlási termékek

Látható, hogy a reakció lefolytatásához használt pH 7,5 értéken, ahol a CPD—Y amidáz aktivitása általában alacsonyabb a peptidáz aktivitásánál, a képződött peptid-amid eléggé stabil, mivel az Ϊ. csúcs a teljes inzulin tartalomnak körülbelül 20%-át tartalmazza. A reakció során a sertés inzulinnak mintegy 75%-a átalakul. Azonban mivel az L csúcs treonin tartalma (3,65) magasabb, mint az emberi inzulinban mért tartalom (3,0) nyilvánvaló, hogy a kezdeti transzpeptitíációs termék (-Pro-Lys-Thr-NHj) nem eléggé stabil, így egy ctligomer képződés (-Pro-LysThr-Thr-NH₂ keletkezése) is végbemegy.

Az amid közíitermékek elegyének a fentiek szerinti képződése alapján arra következtethetnénk, hogy a korábbiakban leírt, CPD—Y-nal végbemenő dezamidálás során nem. keletkezhet tiszta emberi inzulin, mivel a dezamidáció eredménye várhatóan egy -Pro-LysThr-OH-ból és -Pro-Lys-Thr-Thr-OH-ból álló elegy lesz, Azonban ha az L csúcsnak megfelelő frakciókat dezarnidálásnak vetjük alá, 10 μηαόΐ/ΐ CPD—Y-enzimmeí, pH 19,0 értéken, 9,1 mól/1 HCI-at és 2 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban, 20 percig, meglepő módon majdnem tiszta emberi inzulint kapunk. A kísérletet az alábbiak szerint végezzük:

Az átalakult inzulint az enzimtől és az alacsony molekulasúlyú anyagoktól Sephadex^R G—50-en végzett kromatográfiával elválasztjuk, majd az anyagot DEAE-Sephadex” A—25 oszlopon kromatografáljuk, a 3. ábránál leírt eljárást alkalmazva. AII. csúcsban eluálódik, mint az várható, a reakciótermék, míg az átalakulatian inzulin (<10%) az I. csúcsban eluálódik. Nem kapunk III. csúcsot, vagyis nem keletkeznek lizint nem tartalmazó inzulin-származékok. Mint a 2. táblázat adataiból látható, CPD—A-val, CPD—Y-nal és tripszinnel végzett emésztések eredményeként csak a treonin tartalom változik jelentősen. Ez az eredmény összhangban van azzal, hogy az alkalmazott pH-η a CPD—Y nem rendelkezik peptidáz aktivitással.

emberi inzulin-amid dezamidálását mutatjuk be ebben a példában.

Annak bizonyítására, hogy az inzulin-amidok előnyös CPD—Y-katalizálta dezamidálása nem korlátozódik a találmány szerinti transzpeptidációs eljárással kapott inzulin-amidokra, Morihara és munkatársai [EP 17 938. számú európai szabadalmi leírás és Biochem. Biophys. Rés. Comm. 92, 396 (1980), valamint Natvre 280, 412 (1979)] módszere szerint is előállítottunk emberi inzulint. Megjegyezzük, hogy az EP 17 938. számú szabadalmi leírásban az aminokat treonin karboxilcsoportjának egyik lehetséges védőcsoportjaként megemlítették ugyan, de alkalmazhatóságát nem támasztották alá példákkal, az egyetlen példában a treonin-terc-butil-észterrel foglalkoztak.

A reakciót a következő reakcióvázlattal szemléltetjük:

II. táblázat

A 3. ábra szerinti I., II., III. csúcs és az I. csúcs frakcióinak dezamidálásával kapott II. csúcs aminosav-összetétele

Aminosav	I. csúcs	II. csúcs	III. csúcs	I. csúcs dezamidálása után kapott II. csúcs
Aszparaginsav	2,99	2, 99	3,01	3,01
Treonin	3,62	2,52	2,50	2,79
Szerin	2,93	2,92	2,92	2,93
Glutaminsav	6,88	7,16	7,18	7,01
Prolin	1,00	0,98	0,71	0,87
Glicin	4,00	4,00	4,00	4,00
Alanin	1,16	1,52	1,03	1,09
Valin	2,42	2,82	2,81	2,50
Izoleucin	0,94	1,04	1,09	1,19
Leucin	5,80	6,21	6,18	6,10
Tirozin	3,80	3,86	3,67	4,02
Fenilalanin	2,74	2,82	2,65	2,64
Hisztidsn	1,96	1,90	1,93	1,89
Lizin	0,99	0,74	0,06	1,01
Arginin	0,96	1,00	0,98	0,89

A dezamidálás után kapott II. csúcs aminosavösszetétele közel azonos az emberi inzulin analízisénél kapott eredményekkel: Thr = 2,87, Alá =1,05, Lys — 0,98. A dezamidált termék CPD—Y-nal, CPD—A-val és tripszinnel végzett emésztése azt jelzi, hogy a minta 90—95%-ban tiszta emberi inzulint tartalmaz. Ebből arra következtethetünk, hogy a ProLys-Thr-Thr-NH₂ inzulin-származék majdnem kizárólag az enzim peptidil-aminosav-amid-hidroláz aktivitása útján, míg a -Pro-Lys-Thr-NH₂ majdnem kizárólag az amidázaktivitás útján lép reakcióba. A sertés inzulin emberi inzulinná alakulásának teljes kitermelése körülbelül 30%, az átalakult inzulinra vonatkoztatva.

5. példa

A (B—30-dezalanin)-sertés inzulin (DAI) és a treonin-amid tripszin-katalizálta kondenzációjával kapott

Tnpszm-Thr-NH₂ DAI--->· pH 6,5

CPD_Y

DAI-Thr-NH₂-► DAI-Thr

- DAI

Ennek az eljárásnak jelentős előnye az EP 17938. számú szabadalmi leírásban szereplő módszerrel szemben az, hogy az enzimes dezamidálás sokkal enyhébb körülmények között megy végbe, mint a Morihara és munkatársai által alkalmazott sav-katalizálta dezészterezés.

A DAI-Thr-NH₂ előállítása

400 mg treonin-amid-hidrokloridot 2 ml 60%-os dimetil formamidban szuszpendálunk. A ρΗ-t 6,5-re állítjuk 20 pl piridinnel és 50 μΐ 6 mól/1 NaOH-dal, majd 100 mg tripszint és 100 mg DAI-t adunk a szuszpenzióhoz, 0,5 óra elteltével a reakciót 1 ml hangyasav hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet Sephadex¹’ G—50 oszlopon 1 mól/1 ecetsawal frakcionáljuk. A következő frakciókat kapjuk:

Tripszin frakció 60 mg

Inzul n frakció 102 mg

Maradék 371 mg

A ’02 mg inzulin frakciót ioncserélős kromatográfiás módszerrel tisztítjuk 7 mól/1 karbamiddal ekvilibrál DEAE-Sephadex^R A—25 oszlopon NaCl gradienssel eluálva, az EP 17938. számú szabadalmi leírás szerint.

59,2 mg tiszta emberi inzulin-amidot (DAI-ThrNH₂) kapunk, melyet aminosav-analízissel mutatunk ki.

DAI-Thr (emberi inzulin) előállítása mg DAI-Thr-NH₂-t 2 ml 1 mmól/1 EDTA-t és 2 mmó;/l KCl-ot tartalmazó oldatban oldunk. A pH-t 9,0-ra állítjuk 51 μΐ 0,5 mól/1 NaOH-dal, majd 50 μΐ,

13,6 mg/ml koncentrációjú CPD—Y-t adunk az oldathoz. 15 perc elteltével a reakciót 25 μΐ 6 mól/1 HC1 hozzáadásával a pH-t 1,2-re csökkentve leállítjuk. A reakcióelegyet Sephadex” G—50 oszlopon 1 M ecetsavval eluálva választjuk el. 8 mg emberi inzulint kapunk Az aminosav-analizis eredménye a III. táblázatban látható.

-9185 668

ΠΙ. táblázat Aminosav-analízis

Aminosav	Emberi inzulin (képlet)	DAI	Amid	Emberi inzulin
Aszparaginsav	3	2,97	3,05	3,04
Treonin	3	1,91	2,94	2,90
Szerin	3	2,86	2,86	2,95
Glutaminsav	7	7,27	7,23	7,04
Prolin	1	0,94	0,95	0,85
Glicin	4	4,000	4,000	4,0)0
Alanin	1	1,00	1,00	1,04
Cisztein	6	5,31	5,19	5,02
Valin	4	3,37	3,11	3,24
Izoleucin	2	1,36	1,22	1,40
Leucin	6	6,28	6,20	6,13
Tirozin	4	3,64	3,97	3,7 1
Fenilalanin	3	2,82	2,92	2,8’
Hisztidin	2	1,96	1,96	1,8”
Lizin	1	0,94	1,00	0.9.
NH3	6	8,12	6,46	6,98
Arginin	1	0,98	0,99	0,8'
Thr/Ser	1,00	1,003 (X3/2)	1,027	0,984

6. példa

Cinktartalmú sertés inzulin 7 mg/ml-es, 1,0 mól/1es treonin-amiddal készült oldatához (pH 6,5) 0,43 mg/ml végkoncentrációban Penicillium janthinelluniból származó karboxipeptidáz P-t (CPD—P) adunk, és a reakcióelegyet 25 °C-on 2,5 órán át inkubáljuk. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a sertés inzulin 50%-a emberi inzulinná alakul a fenti idő alatt.

Claims (15)

1. Eljárás inzulinok B—30 helyzetű aminosavjának enzimatikus helyettesítésére, azzal jellemezve, hogy a kívánt Inz—X általános képletü inzulin szubsztrátct — a képletben X egy B—30 aminosavat jelent — egy

a) Η-β-ΝΗ₂ általános képletü aminosav-amíddd — a képletben

H aminosav-maradékot jelent — vagy

o) H-B-OR³ általános képletü aminosav-észterrel — a képletben

B aminosav-maradékot jelent,

R³ jelentése alkil-, cikloalkil-, arii-, heteroaril-vagv aralkilcsoport — reagáltatunk egy L-specifikus szerin- vagy tiol-kar boxipeptidáz enzim jelenlétében, 7—10,5 pH-értéken vizes oldatban vagy diszperzióban, majd a kapott Inz B-NH₂, Inz-B-B-NHj vagy Inz-B-OR³ általános képle tű inzulin-származékokról — a képletben a szubszti tuensek jelentése a fenti — az -NH₂, -B-NH₂ vagy -OR³ védőcsoportokat eltávolítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás módja, azzal jellemez ve, hogy az -NH₂, -B-NH₂ vagy —OR³ általános képletü csoportok — a képletekben B és R³ jelentése az 1. igénypont szerinti — eltávolítására egy karboxipeptidáz enzimet használunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás^ módja, azzal jellemezve, hogy pH 9,0 értéken amidáz aktivitást mutató karboxipeptidáz enzimet használunk.

4. Az 1, igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy pH 4—9 értéken peptidáz aktivitást mutató karboxipeptidáz enzimet használunk.

5. Az 1, igénypont szerinti eljárás foganatosítási ^! módja, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként élesztőből származó karboxipeptidáz Y-t használunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy műgyanta hordozóból '¹ és az ahhoz kapcsolt benzil-szukcinil-csoportokból álló gyantán végzett affinitási kromatográfiás módszerrel tisztított karboxipeptidáz Y enzimet használunk.

7. Az 1. igénypont-szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz en'' zimként Penicillium janthinellumból származó penicillokarboxipeptidáz S— 1-et vagy S—2-t használunk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az oldat vagy diszperzió pH-ját 7,5—10,5 értéken tartjuk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 7,5—10,5 pH-η hajtjuk végre, vagy pH 7,5—10,5 tartományon belül egy kívánt pH-értéken, melyet a vizes oldathoz a reakcióelegyben mért pH-értéknek megfelelően sav ^iu vagy lúg hozzáadásával állandó értéken tartunk.

10. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0—50 térfogat% szerves oldószert tartalmazó vizes oldatban vagy diszperzióban hajtjuk végre a reakciót.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként dimetil-formamidot használunk.

12. Az I—10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 0—3 mól/1 karbamidot vagy guanidin-hidtokloridot tartalmazó vizes oldatot vagy diszperziót használunk.

13. Az 1—12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakció lefolytatásához 0,002—0,5 mól/1 inzulin szubsztrát és 0,05—3 mól/1 amin-komponens kiindulási koncentrációkat használunk.

14. Az 1—13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, ezzel jellemezve, hogy a reakció lefolytatásához 10~⁶—1Q~* mól/1 karboxipepti·> dáz enzim koncentrációt használunk.

15. Az 1—14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szubsztrát-komponensként sertés inzulint, amin-komponensként treonin-amidot használunk.

v:, 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az Inz-B-NH₂, Inz-BB-NH₂ vagy Inz-B-OR³ általános képletü inzulin-származékokról — a képletekben B és R³ jelentése az 1. igénypont szerinti — a védőcsoportok lehasítására a g; származékokat valamely L-specifikus szerin- vagy tiol-karboxipeptidáz enzimmel 7-10,5 pH-jú vizes oldatban vagy diszperzióban kezeljük.