JPH1042893A - 新規複合糖質の製造法 - Google Patents
新規複合糖質の製造法Info
- Publication number
- JPH1042893A JPH1042893A JP22310696A JP22310696A JPH1042893A JP H1042893 A JPH1042893 A JP H1042893A JP 22310696 A JP22310696 A JP 22310696A JP 22310696 A JP22310696 A JP 22310696A JP H1042893 A JPH1042893 A JP H1042893A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar chain
- asn
- glcnac
- complex
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 酵素による糖鎖の転移反応を利用して新規な
複合糖ペプチドを製造する方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖を下記式（化１） 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示されるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）残基の結合したＤ−アスパラギン（ｎ＝１）ある
いはＤ−グルタミン（ｎ＝２）を含む糖ペプチド（糖鎖
受容体）に転移させることにより新規複合糖ペプチドを
製造する方法。 【効果】 天然にはない新規な生理活性複合糖ペプチド
の合成に有効である。
複合糖ペプチドを製造する方法を提供する。 【構成】 エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖を下記式（化１） 【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示されるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）残基の結合したＤ−アスパラギン（ｎ＝１）ある
いはＤ−グルタミン（ｎ＝２）を含む糖ペプチド（糖鎖
受容体）に転移させることにより新規複合糖ペプチドを
製造する方法。 【効果】 天然にはない新規な生理活性複合糖ペプチド
の合成に有効である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペプチドの合成反
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた生理活性複
合糖ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に
応用される。
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた生理活性複
合糖ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に
応用される。
【０００２】
【従来の技術】糖質および複合糖質は生物の細胞、体液
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収、分解
等の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を
持つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュ
ープラスミノーゲンアクチベーターがあり、医薬として
利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖鎖を
持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のＬ
−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）にＮ−アセチルグルコサ
ミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して結合している。
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収、分解
等の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を
持つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュ
ープラスミノーゲンアクチベーターがあり、医薬として
利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖鎖を
持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のＬ
−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）にＮ−アセチルグルコサ
ミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して結合している。
【０００３】タンパク質あるいは生理活性ペプチド等に
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。糖鎖を酵素的に改変する方法とし
ては、エンドグリコシダーゼによる方法が考えられる。
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。糖鎖を酵素的に改変する方法とし
ては、エンドグリコシダーゼによる方法が考えられる。
【０００４】エンドグリコシダーゼを用いた糖転移反応
としては、Ｒ．Ｂ．トリムブル（R.B. Trimble）ら［ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. B
iol. Chem.）、第２６１巻、第１２０００〜１２００５
頁（１９８６）］のフラボバクテリウム メニンゴセプ
チカム（Flavobacterium meningosepticum）由来のエン
ド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−
Ｆ）に関するもの、Ｒ．Ｍ．バーデールス（R. M. Bard
ales）ら［ジャーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.）、第２６４巻、第１９８９３〜
１９８９７頁（１９８９）］のディプロコッカス ニュ
ーモニエ（Diprococcus pneumoniae）由来のエンド−α
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに関するものがあ
り、前者はグリセロールが受容体に、また後者はグリセ
ロール、ｐ−ニトロフェノール、セリン、スレオニン等
が受容体になるという報告である。その後、竹川ら［特
開平５−６４５９４号（１９９３）］およびＫ．タケガ
ワ（K. Takegawa）ら［ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、
第３０９４〜３０９９頁（１９９５）］がアルスロバク
ター プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）
由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖転移反応を、また、
Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら［バイオケミカル バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Bioc
hem. Biophys. Res. Commun.）、第２０３巻、第２４４
〜２５２頁（１９９４）］はムコール ヒエマリス（Mu
cor hiemalis）由来のエンド−Ｍによる糖質への糖鎖転
移反応を報告した。
としては、Ｒ．Ｂ．トリムブル（R.B. Trimble）ら［ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. B
iol. Chem.）、第２６１巻、第１２０００〜１２００５
頁（１９８６）］のフラボバクテリウム メニンゴセプ
チカム（Flavobacterium meningosepticum）由来のエン
ド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−
Ｆ）に関するもの、Ｒ．Ｍ．バーデールス（R. M. Bard
ales）ら［ジャーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.）、第２６４巻、第１９８９３〜
１９８９７頁（１９８９）］のディプロコッカス ニュ
ーモニエ（Diprococcus pneumoniae）由来のエンド−α
−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼに関するものがあ
り、前者はグリセロールが受容体に、また後者はグリセ
ロール、ｐ−ニトロフェノール、セリン、スレオニン等
が受容体になるという報告である。その後、竹川ら［特
開平５−６４５９４号（１９９３）］およびＫ．タケガ
ワ（K. Takegawa）ら［ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、
第３０９４〜３０９９頁（１９９５）］がアルスロバク
ター プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）
由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖転移反応を、また、
Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら［バイオケミカル バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Bioc
hem. Biophys. Res. Commun.）、第２０３巻、第２４４
〜２５２頁（１９９４）］はムコール ヒエマリス（Mu
cor hiemalis）由来のエンド−Ｍによる糖質への糖鎖転
移反応を報告した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】複合糖質は糖鎖部分と
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり、あるいは天然にない生物機能が付加されれば医
薬品に応用した場合に有用である。また、複合糖質にお
ける糖鎖のもつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手
段がなかったために、十分には解明されていないが、そ
の役割の解析のための重要な手段を提供する。
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり、あるいは天然にない生物機能が付加されれば医
薬品に応用した場合に有用である。また、複合糖質にお
ける糖鎖のもつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手
段がなかったために、十分には解明されていないが、そ
の役割の解析のための重要な手段を提供する。
【０００６】糖質あるいは複合糖質に糖鎖を新たに付加
あるいは改変する方法としては、エンド−Ａやエンド−
Ｍ等のエンドグリコシダーゼによる方法があり、複合糖
鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転移させる、より
効率的な方法を提供する。
あるいは改変する方法としては、エンド−Ａやエンド−
Ｍ等のエンドグリコシダーゼによる方法があり、複合糖
鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転移させる、より
効率的な方法を提供する。
【０００７】天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドの
糖鎖は、通常Ｎ結合型糖鎖として、Ｌ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｌ
−Ｓｅｒ（Ｌ−Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｌ−Ｓ
ｅｒ（Ｌ−Ｔｈｒ）はＬ−セリンまたはＬ−スレオニン
を示す］のアミノ酸配列のペプチド鎖のＬ−Ａｓｎのア
ミド基に結合したＧｌｃＮＡｃを介して結合している。
即ちこのアミノ酸配列のＬ−Ａｓｎに、末端にＧｌｃＮ
Ａｃ残基を有する糖鎖が付加され更に修飾を受けてＮ結
合型複合糖鎖が生合成される。従って、天然にはこのア
ミノ酸配列のＬ−Ａｓｎに結合した糖鎖以外のＮ結合型
糖鎖は見出されていない。
糖鎖は、通常Ｎ結合型糖鎖として、Ｌ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｌ
−Ｓｅｒ（Ｌ−Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｌ−Ｓ
ｅｒ（Ｌ−Ｔｈｒ）はＬ−セリンまたはＬ−スレオニン
を示す］のアミノ酸配列のペプチド鎖のＬ−Ａｓｎのア
ミド基に結合したＧｌｃＮＡｃを介して結合している。
即ちこのアミノ酸配列のＬ−Ａｓｎに、末端にＧｌｃＮ
Ａｃ残基を有する糖鎖が付加され更に修飾を受けてＮ結
合型複合糖鎖が生合成される。従って、天然にはこのア
ミノ酸配列のＬ−Ａｓｎに結合した糖鎖以外のＮ結合型
糖鎖は見出されていない。
【０００８】上述の酵素による糖鎖の付加あるいは改変
には糖鎖受容体であるタンパク質あるいはペプチドにＧ
ｌｃＮＡｃ残基があることが必要であり、このＧｌｃＮ
Ａｃ残基に糖鎖が転移付加する。ここでＧｌｃＮＡｃ残
基が結合しているアミノ酸残基はＬ−Ａｓｎである。
には糖鎖受容体であるタンパク質あるいはペプチドにＧ
ｌｃＮＡｃ残基があることが必要であり、このＧｌｃＮ
Ａｃ残基に糖鎖が転移付加する。ここでＧｌｃＮＡｃ残
基が結合しているアミノ酸残基はＬ−Ａｓｎである。
【０００９】Ｌ−Ａｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃを結合した
糖ペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ペプチド）を
化学的に合成し、上述の酵素法によりＬ−Ａｓｎに結合
したＧｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を付加した新しい複合糖ペ
プチドを合成できる。また、Ｌ−Ａｓｎに類縁のアミノ
酸であるＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）にＧｌｃＮＡｃ
残基を付けた糖ペプチドを合成すれば、同様の複合糖ペ
プチドが合成できる。
糖ペプチド（ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ペプチド）を
化学的に合成し、上述の酵素法によりＬ−Ａｓｎに結合
したＧｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を付加した新しい複合糖ペ
プチドを合成できる。また、Ｌ−Ａｓｎに類縁のアミノ
酸であるＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）にＧｌｃＮＡｃ
残基を付けた糖ペプチドを合成すれば、同様の複合糖ペ
プチドが合成できる。
【００１０】天然の糖ペプチドは通常Ｌ−アミノ酸から
構成されているが、抗生物質等Ｄ−アミノ酸の含まれる
生理活性ペプチドも多く、また、Ｌ−アミノ酸をＤ−ア
ミノ酸に置換することにより生理活性の強化や安定化が
もたらされることがある。
構成されているが、抗生物質等Ｄ−アミノ酸の含まれる
生理活性ペプチドも多く、また、Ｌ−アミノ酸をＤ−ア
ミノ酸に置換することにより生理活性の強化や安定化が
もたらされることがある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】一方、本発明者らはＧｌ
ｃＮＡｃの結合するアミノ酸がＬ−ＡｓｎでなくそのＤ
−体のアミノ酸であるＤ−Ａｓｎの場合、更にＤ−Ｇｌ
ｎの場合にもこれらに結合したＧｌｃＮＡｃ残基に酵素
により糖鎖が転移し得ることを見出し、本発明を完成し
た。
ｃＮＡｃの結合するアミノ酸がＬ−ＡｓｎでなくそのＤ
−体のアミノ酸であるＤ−Ａｓｎの場合、更にＤ−Ｇｌ
ｎの場合にもこれらに結合したＧｌｃＮＡｃ残基に酵素
により糖鎖が転移し得ることを見出し、本発明を完成し
た。
【００１２】即ち本発明は、糖を結合したＤ−Ａｓｎあ
るいはＤ−Ｇｌｎを少なくとも１個含むペプチドを化学
的に合成し、この足がかりの糖残基へ糖鎖を酵素的に転
移させて新規複合糖ペプチドを合成する方法を提供す
る。
るいはＤ−Ｇｌｎを少なくとも１個含むペプチドを化学
的に合成し、この足がかりの糖残基へ糖鎖を酵素的に転
移させて新規複合糖ペプチドを合成する方法を提供す
る。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明を概説すれば、本発明は
１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基の結合したＤ−
ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドの合成と、
２）このＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖ペプチド（糖鎖受
容体）への酵素による糖鎖の転移反応の２つの構成から
なる。
１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基の結合したＤ−
ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドの合成と、
２）このＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖ペプチド（糖鎖受
容体）への酵素による糖鎖の転移反応の２つの構成から
なる。
【００１４】本発明にいうＧｌｃＮＡｃ残基の結合した
Ｄ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドとは、
下記式（化１）
Ｄ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドとは、
下記式（化１）
【００１５】
【化１】 （式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護基、アミノ酸、ペプチド
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示される化合物である。ｎが１のときＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＤ−Ａｓｎを含む糖ペプチド、２のとき
ＧｌｃＮＡｃが結合したＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドを
示す。
あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基を保護したペプチ
ドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボキシル保護基、アミノ
酸、ペプチドあるいはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基
を保護したペプチドを示す。ｎは１あるいは２であ
る。）で示される化合物である。ｎが１のときＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＤ−Ａｓｎを含む糖ペプチド、２のとき
ＧｌｃＮＡｃが結合したＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドを
示す。
【００１６】ＧｌｃＮＡｃの結合したＤ−Ａｓｎあるい
はＤ−Ｇｌｎ誘導体は、例えばＮ末端をＦｍｏｃ（９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル）で保護したＦｍ
ｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を例にとると、Ｇｌ
ｃＮＡｃのアジドとＤ−アスパラギン酸とからＴ．イナ
ヅ（T.Inazu）ら［シンレット（Synlett）、第８６９〜
８７０頁（１９９３）］に述べた方法に準じて合成され
る。
はＤ−Ｇｌｎ誘導体は、例えばＮ末端をＦｍｏｃ（９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル）で保護したＦｍ
ｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を例にとると、Ｇｌ
ｃＮＡｃのアジドとＤ−アスパラギン酸とからＴ．イナ
ヅ（T.Inazu）ら［シンレット（Synlett）、第８６９〜
８７０頁（１９９３）］に述べた方法に準じて合成され
る。
【００１７】（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基の結合し
たＤ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドの合
成は如何なる方法によってもよいが、例えばＴ．イナヅ
（T.Inazu）ら［ペプチド ケミストリー １９９３（P
eptide Chemistry 1993 ）、第１０１〜１０４頁（１９
９４）］の報告した方法に準じて合成される。
たＤ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドの合
成は如何なる方法によってもよいが、例えばＴ．イナヅ
（T.Inazu）ら［ペプチド ケミストリー １９９３（P
eptide Chemistry 1993 ）、第１０１〜１０４頁（１９
９４）］の報告した方法に準じて合成される。
【００１８】例えば、予め、Ｎ末端をＦｍｏｃで保護し
たＤ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎのアミド基にＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）
あるいはＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）誘導体
を合成しておき、ペプチドの固相合成の段階でＬ−Ａｓ
ｎあるいはＤ−Ｇｌｎの代わりに用いてペプチド合成を
行うと、Ｄ−ＡｓｎあるはＤ−ＧｌｎにＧｌｃＮＡｃ残
基が結合した糖ペプチド誘導体が合成される。
たＤ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎのアミド基にＧｌｃＮ
Ａｃが結合したＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）
あるいはＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）誘導体
を合成しておき、ペプチドの固相合成の段階でＬ−Ａｓ
ｎあるいはＤ−Ｇｌｎの代わりに用いてペプチド合成を
行うと、Ｄ−ＡｓｎあるはＤ−ＧｌｎにＧｌｃＮＡｃ残
基が結合した糖ペプチド誘導体が合成される。
【００１９】このＤ−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎに結合
したＧｌｃＮＡｃに糖鎖を転移させて天然にはない複合
糖ペプチドを合成することが可能となる。
したＧｌｃＮＡｃに糖鎖を転移させて天然にはない複合
糖ペプチドを合成することが可能となる。
【００２０】（化１）のＲ1 にある末端アミノ酸のαア
ミノ基の保護基としては、例えば、９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキ
シカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基等が用いられ
る。Ｎ末端アミノ酸の保護基は糖鎖転移反応後に常法に
より外すか、あるいは予め保護基を外した後に糖鎖転移
反応に供してもよい。
ミノ基の保護基としては、例えば、９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、第３ブチルオキ
シカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−ニトロ−２−ピリジン
スルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、ベンジルオキシカルボニ
ル（Ｚ）基あるいはダンシル（ＤＮＳ）基等が用いられ
る。Ｎ末端アミノ酸の保護基は糖鎖転移反応後に常法に
より外すか、あるいは予め保護基を外した後に糖鎖転移
反応に供してもよい。
【００２１】（化１）のＲ2 にあるカルボキシル基の保
護基としては、第３ブチル（Ｂｕt）基、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）基あるいはメチル（Ｍｅ）基等であるが、水への
溶解性を上げるために保護基を外し、遊離型で用いるこ
とが多い。
護基としては、第３ブチル（Ｂｕt）基、ベンジル（Ｂ
ｚｌ）基あるいはメチル（Ｍｅ）基等であるが、水への
溶解性を上げるために保護基を外し、遊離型で用いるこ
とが多い。
【００２２】本発明の第２の構成は、糖鎖受容体である
合成基質への糖鎖供与体からの糖鎖の転移反応による付
加である。
合成基質への糖鎖供与体からの糖鎖の転移反応による付
加である。
【００２３】エンドグリコシダーゼの存在下、下記式
（式１）：Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式１）［式中、Ｘは複合
糖鎖、Ｙは糖質あるいは複合糖質、Ｚは（化１）に示し
た合成基質］で表される転移反応を行うことを特徴とす
る。
（式１）：Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｚ → Ｘ−Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｚ ＋ Ｙ （式１）［式中、Ｘは複合
糖鎖、Ｙは糖質あるいは複合糖質、Ｚは（化１）に示し
た合成基質］で表される転移反応を行うことを特徴とす
る。
【００２４】本発明に用いるエンドグリコシダーゼとし
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ｍ
やエンド−Ａ等が用いられる。該酵素は下記式（式
２）： Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ａｓｎ−（ペプチドまたはタンパク質 ）（式２） （式中Ｒは複合糖鎖を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）
結合型糖鎖のキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に適当な糖鎖受
容体があると、受容体に糖鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）部分
が転移する。（式１）の反応はそれを利用したものであ
る。
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ｍ
やエンド−Ａ等が用いられる。該酵素は下記式（式
２）： Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｌ−Ａｓｎ−（ペプチドまたはタンパク質 ）（式２） （式中Ｒは複合糖鎖を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）
結合型糖鎖のキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に適当な糖鎖受
容体があると、受容体に糖鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）部分
が転移する。（式１）の反応はそれを利用したものであ
る。
【００２５】エンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応
の糖鎖受容体となるのは、通常、ペプチドのＬ−Ａｓｎ
に結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。
の糖鎖受容体となるのは、通常、ペプチドのＬ−Ａｓｎ
に結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。
【００２６】驚くべきことに、天然には存在しないＤ−
体のＡｓｎやＧｌｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含む
ペプチドのＧｌｃＮＡｃ残基にもＬ−Ａｓｎの場合と同
様に糖鎖の転移反応が起きることが分かった。
体のＡｓｎやＧｌｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含む
ペプチドのＧｌｃＮＡｃ残基にもＬ−Ａｓｎの場合と同
様に糖鎖の転移反応が起きることが分かった。
【００２７】（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質は、かかる知見に基づき調製されたものであ
り、この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応を行う
本発明を完成させた。
合成基質は、かかる知見に基づき調製されたものであ
り、この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応を行う
本発明を完成させた。
【００２８】酵素の糖鎖供与体の基質特異性について
は、エンド−Ｍは複合型、混成型あるいは高マンノース
型糖鎖のいずれにも作用するが、エンド−Ａは高マンノ
ース型糖鎖のみに作用する。
は、エンド−Ｍは複合型、混成型あるいは高マンノース
型糖鎖のいずれにも作用するが、エンド−Ａは高マンノ
ース型糖鎖のみに作用する。
【００２９】これらの酵素の本来の機能は加水分解であ
り、（式１）のＺの代わりに水が入り加水分解反応が転
移反応とともに副反応として進行する。糖鎖転移反応を
効率よく行わせるには加水分解反応を抑えて（式１）の
反応を優先的に行わせることが必要である。与酵素量を
減らし、基質である糖鎖供与体（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−
Ｙ）と糖鎖受容体（Ｚ）の仕込濃度を、そのモル比を１
近くにしつつ高濃度にすることにより反応の場（酵素の
活性中心）における水の影響を排して転移反応を効率よ
く進行させることができる。
り、（式１）のＺの代わりに水が入り加水分解反応が転
移反応とともに副反応として進行する。糖鎖転移反応を
効率よく行わせるには加水分解反応を抑えて（式１）の
反応を優先的に行わせることが必要である。与酵素量を
減らし、基質である糖鎖供与体（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−
Ｙ）と糖鎖受容体（Ｚ）の仕込濃度を、そのモル比を１
近くにしつつ高濃度にすることにより反応の場（酵素の
活性中心）における水の影響を排して転移反応を効率よ
く進行させることができる。
【００３０】本発明に用いる糖鎖供与体としては、複合
型、混成型、高マンノース型いずれの糖鎖も用いられ
る。シアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトトラン
スフェリンや牛フェツイン等から調製され、シアリダー
ゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖鎖が
調製される。また高マンノース型糖鎖は例えば卵白アル
ブミン等から調製される。酵素的あるいは化学的に修飾
された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いること
ができる。
型、混成型、高マンノース型いずれの糖鎖も用いられ
る。シアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトトラン
スフェリンや牛フェツイン等から調製され、シアリダー
ゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖鎖が
調製される。また高マンノース型糖鎖は例えば卵白アル
ブミン等から調製される。酵素的あるいは化学的に修飾
された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いること
ができる。
【００３１】本発明の反応は、基質の糖鎖供与体、糖鎖
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。通常、糖鎖供与体の濃
度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受
容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜３５
ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供
与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与
体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１
０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ
５〜８程度、濃度２５〜２００ｍＭ、望ましくは５０〜
１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの
場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度５０〜１００ｍＭ
の酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。基本
的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍＭ、糖鎖受
容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよび６０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。通常、糖鎖供与体の濃
度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受
容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜３５
ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供
与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与
体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１
０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ
５〜８程度、濃度２５〜２００ｍＭ、望ましくは５０〜
１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの
場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度５０〜１００ｍＭ
の酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。基本
的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍＭ、糖鎖受
容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよび６０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。
【００３２】反応温度は通常、室温〜５０℃程度、好ま
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
【００３３】生成した複合糖質は公知の手段に従って反
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
【００３４】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００３５】
【実施例１】 ヒトトランスフェリン由来シアロ糖鎖のＦｍｏｃ−Ｄ−
Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体と
して、ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナー
ゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過を繰り返して
得たＬ−Ａｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド（Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、分子量２３３８）を調製した。糖鎖受容体
のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ末を保護
したＤ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）とＧｌｃＮＡｃ
のアジドをＴ．イナヅらのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）の合成法に準じて調製した。ＴＦ−ＳＧＰを
１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ
（ＧｌｃＮＡｃ） ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解
し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを
加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
した。転移反応生成物が反応６時間で１３．０％の収率
で得られた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を
糖鎖受容体とした場合の反応収率は１４．２％であっ
た。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分析
の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２５６０にシグナルが観測さ
れ、ジシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃーＤ−Ａｓｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物（分子量２５６０）
であることが確認された。
Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体と
して、ヒトトランスフェリン（生化学工業）をプロナー
ゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過を繰り返して
得たＬ−Ａｓｎ残基のみを有するシアロ糖ペプチド（Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、分子量２３３８）を調製した。糖鎖受容体
のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）はＮ末を保護
したＤ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）とＧｌｃＮＡｃ
のアジドをＴ．イナヅらのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）の合成法に準じて調製した。ＴＦ−ＳＧＰを
１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ
（ＧｌｃＮＡｃ） ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解
し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを
加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後反応液を蒸
留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで分析
した。転移反応生成物が反応６時間で１３．０％の収率
で得られた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を
糖鎖受容体とした場合の反応収率は１４．２％であっ
た。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分析
の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２５６０にシグナルが観測さ
れ、ジシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃーＤ−Ａｓｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物（分子量２５６０）
であることが確認された。
【００３６】
【実施例２】 ヒトトランスフェリン由来アシアロ糖鎖のＦｍｏｃ−Ｄ
−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体
として、ヒトトランスフェリン由来のシアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＳＧＰ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を外
したアシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ、分子量１７
５６） １μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ
−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ） ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍ
Ｍ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌ
に溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６
μｌを加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後、反
応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬ
Ｃで分析した。転移反応生成物が８．５％の収率で得ら
れた。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分
析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１９７９にシグナルが観測
され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物（分子量１９７
８）であることが確認された。
−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体
として、ヒトトランスフェリン由来のシアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＳＧＰ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を外
したアシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ、分子量１７
５６） １μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ
−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ） ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍ
Ｍ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌ
に溶解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６
μｌを加え、３７℃で６時間反応した。反応停止後、反
応液を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬ
Ｃで分析した。転移反応生成物が８．５％の収率で得ら
れた。反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量分
析の結果、ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］１９７９にシグナルが観測
され、アシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物（分子量１９７
８）であることが確認された。
【００３７】
【実施例３】 高マンノース型糖鎖のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮ
Ａｃ）への糖鎖転移反応： 糖鎖供与体として、卵白ア
ルブミンをプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲ
ルろ過、更にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより
分離精製して得た高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−
（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ（分子量１６５１）を１μ
ｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）、糖鎖受容体としてＦｍｏｃ
−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）（分子量５５８）を４０
０ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）、エンド−Ｍを１６０μＵ
（同４ｍＵ／ｍｌ）加え、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．２５）４０μｌ中で３７℃、１８時間反応させた。
加熱処理により反応停止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに
希釈し反応生成物をＨＰＬＣで分析した。５．２％の反
応収率（対糖鎖受容体、モル比）でＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応生成物が得られた。反
応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析の結果、ｍ／ｚ
［Ｍ−Ｈ］１７３２にシグナルが観察され、（Ｍａｎ）
6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−ＡｓｎからＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応生成物、即ち（Ｍａ
ｎ）6 −（ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ（分子
量１７３４）であることが確認された。
Ａｃ）への糖鎖転移反応： 糖鎖供与体として、卵白ア
ルブミンをプロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲ
ルろ過、更にＤｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより
分離精製して得た高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ）6−
（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ（分子量１６５１）を１μ
ｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）、糖鎖受容体としてＦｍｏｃ
−Ｄ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）（分子量５５８）を４０
０ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）、エンド−Ｍを１６０μＵ
（同４ｍＵ／ｍｌ）加え、６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．２５）４０μｌ中で３７℃、１８時間反応させた。
加熱処理により反応停止後、反応液を蒸留水で１ｍｌに
希釈し反応生成物をＨＰＬＣで分析した。５．２％の反
応収率（対糖鎖受容体、モル比）でＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応生成物が得られた。反
応生成物をＨＰＬＣ分取し、質量分析の結果、ｍ／ｚ
［Ｍ−Ｈ］１７３２にシグナルが観察され、（Ｍａｎ）
6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−ＡｓｎからＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応生成物、即ち（Ｍａ
ｎ）6 −（ＧｌｃＮＡｃ）2 −Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ（分子
量１７３４）であることが確認された。
【００３８】
【実施例４】 ヒトトランスフェリン由来複合型糖鎖のＦｍｏｃ−Ｄ−
Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体と
して、ヒトトランスフェリンから調製したシアロおよび
アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰおよびＴＦ−ＡＳＧ
Ｐ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ−
Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶
解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌ
を加え、３７℃で３時間反応した。反応停止後、反応液
を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで
分析した。転移反応生成物がＴＦ−ＳＧＰの場合７．５
％、ＴＦ−ＡＳＧＰの場合１０．６％の収率で得られ
た。転移反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量
分析の結果、ＴＦ−ＳＧＰの転移反応生成物には分子量
２５７４に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２
５７５）が、またＴＦ−ＡＳＧＰの転移反応生成物には
分子量１９９２に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ［Ｍ−
Ｈ］１９９２）が観測され、各々ジシアロ２本鎖複合型
糖鎖がＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移し
た化合物およびアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃ−
Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物であるこ
とが確認された。
Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）への転移反応： 糖鎖供与体と
して、ヒトトランスフェリンから調製したシアロおよび
アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰおよびＴＦ−ＡＳＧ
Ｐ）を１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＦｍｏｃ−Ｄ−
Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）を２００ｎｍｏｌ（同５ｍＭ）
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶
解し、エンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌ
を加え、３７℃で３時間反応した。反応停止後、反応液
を蒸留水で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣで
分析した。転移反応生成物がＴＦ−ＳＧＰの場合７．５
％、ＴＦ−ＡＳＧＰの場合１０．６％の収率で得られ
た。転移反応生成物をＨＰＬＣ分取により単離し、質量
分析の結果、ＴＦ−ＳＧＰの転移反応生成物には分子量
２５７４に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］２
５７５）が、またＴＦ−ＡＳＧＰの転移反応生成物には
分子量１９９２に相当するイオンピーク（ｍ／ｚ［Ｍ−
Ｈ］１９９２）が観測され、各々ジシアロ２本鎖複合型
糖鎖がＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移し
た化合物およびアシアロ２本鎖複合型糖鎖がＦｍｏｃ−
Ｄ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）に転移した化合物であるこ
とが確認された。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、ペプチド鎖のアミノ酸配
列の中にＬ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）またはＬ−グ
ルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）があればこれをＤ体のアミノ酸
（Ｄ−ＡｓｎまたはＤ−Ｇｌｎ）に変えて、あるいはＤ
−ＡｓｎまたはＤ−Ｇｌｎがあれば、これらアミノ酸に
ＧｌｃＮＡｃ残基を付加した糖ペプチドを合成した後に
酵素的に糖鎖を転移付加して、天然には無い全く新しい
複合糖ペプチドを合成することが可能になった。付加す
る糖鎖はシアル酸を含む複合型糖鎖あるいは高マンノー
ス型糖鎖いずれでもよく、望み通りの非天然の複合糖ペ
プチドを合成できる。本発明は、医薬への応用とともに
複合糖質の糖鎖の果たしている生理的役割を解明するた
めの研究手法を提供する。
列の中にＬ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）またはＬ−グ
ルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）があればこれをＤ体のアミノ酸
（Ｄ−ＡｓｎまたはＤ−Ｇｌｎ）に変えて、あるいはＤ
−ＡｓｎまたはＤ−Ｇｌｎがあれば、これらアミノ酸に
ＧｌｃＮＡｃ残基を付加した糖ペプチドを合成した後に
酵素的に糖鎖を転移付加して、天然には無い全く新しい
複合糖ペプチドを合成することが可能になった。付加す
る糖鎖はシアル酸を含む複合型糖鎖あるいは高マンノー
ス型糖鎖いずれでもよく、望み通りの非天然の複合糖ペ
プチドを合成できる。本発明は、医薬への応用とともに
複合糖質の糖鎖の果たしている生理的役割を解明するた
めの研究手法を提供する。
【００４０】
【化１】エンドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応に用
いる糖鎖受容体を示す。（式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護
基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαア
ミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボ
キシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミ
ノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。ｎは
１あるいは２である。）ｎが１のときＧｌｃＮＡｃが結
合したＤ−Ａｓｎを含む糖ペプチド、２のときＧｌｃＮ
Ａｃの結合したＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドを示す。
いる糖鎖受容体を示す。（式中、Ｒ1 はＨ、アミノ保護
基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端アミノ酸のαア
ミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2 はＯＨ、カルボ
キシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端アミ
ノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。ｎは
１あるいは２である。）ｎが１のときＧｌｃＮＡｃが結
合したＤ−Ａｓｎを含む糖ペプチド、２のときＧｌｃＮ
Ａｃの結合したＤ−Ｇｌｎを含む糖ペプチドを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成８年９月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】削除
Claims (3)
- 【請求項１】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をＮ−アセチルグルコサミン（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）残基の結合したＤ−アスパラギン（Ｄ−Ａ
ｓｎ）あるいはＤ−グルタミン（Ｄ−Ｇｌｎ）を含む合
成ペプチド（糖鎖受容体）に転移させることにより新規
複合糖ペプチドを製造する方法。 - 【請求項２】エンドグリコシダーゼがエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をＧｌｃＮＡｃ残基の結合したＤ
−ＡｓｎあるいはＤ−Ｇｌｎを含む合成ペプチド（糖鎖
受容体）に転移させることにより製造される新規複合糖
ペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22310696A JPH1042893A (ja) | 1996-08-05 | 1996-08-05 | 新規複合糖質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22310696A JPH1042893A (ja) | 1996-08-05 | 1996-08-05 | 新規複合糖質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042893A true JPH1042893A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=16792927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22310696A Pending JPH1042893A (ja) | 1996-08-05 | 1996-08-05 | 新規複合糖質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1042893A (ja) |
-
1996
- 1996-08-05 JP JP22310696A patent/JPH1042893A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4543329A (en) | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins | |
| US4645740A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| TWI325430B (en) | Aminated complex type sugar chain derivative and its production method | |
| CS254954B2 (en) | Method of peptides production | |
| JPS6229997A (ja) | Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| US4579820A (en) | Process for enzymatic replacement of the B-30 amino acid in insulins | |
| JP5743370B2 (ja) | 改善されたフォールディングの空気ガス処理によってインスリンを抽出する方法 | |
| JPH10306099A (ja) | 新規複合糖ペプチドおよびその製法 | |
| JPH1042893A (ja) | 新規複合糖質の製造法 | |
| EP0324659B1 (en) | Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process | |
| JPH10273500A (ja) | 複合糖ペプチド及びその製造法 | |
| JP3741495B2 (ja) | 新規複合糖ペプチドおよびその製造法 | |
| JP3776952B2 (ja) | 複合糖質の製法 | |
| AU550062B2 (en) | A process for the preparation of an insulin derivative | |
| JP3732871B2 (ja) | 複合糖質の製造方法 | |
| JPH11113593A (ja) | 新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体 | |
| WO2022255289A1 (ja) | 糖ぺプチドを製造する方法 | |
| JP3811527B2 (ja) | 新規複合糖質の製造方法 | |
| EP0458475A2 (en) | Transpeptidation reagent and method | |
| JPH05252948A (ja) | Ａｒｇ−ＰｒｏおよびＡｒｇ−Ｂ含有ペプチドのクロストリパイン触媒連結方法 | |
| JP2003267996A (ja) | Ｎ−アセチルグルコサミン結合型オピオイドペプチド誘導体 | |
| JPH09290A (ja) | 複合糖質の製造法 | |
| JPH10147599A (ja) | 新規生理活性複合糖ペプチド | |
| JP2000319297A (ja) | 酵素的に安定な複合糖ペプチドの調製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20060620 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |