JPH10306099A - 新規複合糖ペプチドおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 神経作用性生理活性ペプチドであるサブスタ
ンスＰに糖鎖を付与した新規複合糖ペプチド誘導体を提
供する。 【構成】 １）下記式（化１）あるいは（化２）で示さ
れる新規複合糖ペプチド。 【化１】 【化２】 （式中、Ｒ¹ はＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏあ
るいはＨからなるペプチド残基を示し、Ｒ² は、複合型
糖鎖、高マンノース型糖鎖あるいは混成型糖鎖を示
す。） ２）下記式（化３）あるいは（化４）で示される新規糖
ペプチド。 【化３】 【化４】 （式中、Ｒ¹ は（化１）と同じ内容を示す。） ３）エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質の糖鎖を
（化３）あるいは（化４）で示されるＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する合成ペプ
チドに転移させることにより（化１）あるいは（化２）
に示す新規複合糖ペプチドを製造する方法。 【効果】 糖鎖を付与することにより溶解性が改善さ
れ、また安定性、薬理作用等の面で改善された、より有
効性の高い生理活性複合糖ペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規生理活性複合
糖ペプチド、およびその製造法に関する。本発明は医薬
に応用される。

【０００２】

【従来の技術】糖質および複合糖質は生物の細胞、体液
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。エリスロポエチンやティシュープラ
スミノーゲンアクチベーター等のタンパク質あるいはヒ
ト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）等のペプチドホル
モンには糖鎖を持つものが知られ、それら糖鎖は基質認
識と共に生体内物質の吸収分解等の代謝の速度に関係し
ている。これら糖タンパク質あるいは糖ペプチドでは糖
鎖が通常Ｎ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のアスパラギ
ン（Ａｓｎ）にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）を介して結合している。

【０００３】タンパク質あるいは生理活性ペプチドの糖
鎖を別の糖鎖に換えたり、あるいは元々糖鎖のないタン
パク質あるいは生理活性ペプチドに糖鎖を付与すること
により、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つこと
が期待される。

【０００４】サブスタンスＰは神経組織や消化管に存在
し、血圧降下作用や回腸収縮作用等を有する生理活性ペ
プチドで、中枢および末梢神経系に働くニューロン伝達
物質と考えられている。

【０００５】サブスタンスＰは［Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂］の構造を有する１１個
のアミノ酸からなるペプチドで活性に必要なのはＣ末側
のヘプタペプチド ＳＰ（５−１１）あるいはヘキサペ
プチド ＳＰ（６−１１）であることが知られる。

【０００６】生理活性ペプチドを医薬として用いようと
する場合、体液中の分解酵素による分解等により、その
有効性が著しく損なわれることが多い。またペプチドに
よっては溶解性が低く溶け難いものがある。

【０００７】サブスタンスＰの場合、Ｃ末側の活性ペプ
チド ＳＰ（５−１１）は疎水性が強く溶解性が悪いた
めにその改善を目的に、例えば、Ｒ．Ｗ．バリ−（R.
W. Bury）ら［ジャーナル オブ メディカル ケミス
トリ−（J. Med. Chem.）、第１９巻、第８５４〜８５
６頁（１９７６）］は５番目のＧｌｎにグルコピラノー
スを付けた［Ｇｌｎ（Ｇｌｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）を
合成した。しかしこのグリコシル化によってもなお溶解
性は低く、分解酵素に対する安定性の改善はみられなか
った。

【０００８】血液中での安定性を高める方法の一つとし
て糖鎖を付与することが有効と考えられる。例えば、山
本ら［日本農芸化学会平成８年度大会講演要旨集、第３
１５頁（１９９６）］は抗ＨＩＶ活性ペプチドであるペ
プチド−Ｔに複合型糖鎖を付加することによりタンパク
質分解酵素に対して安定化することを報告した。

【０００９】糖鎖は親水性が高いためにサブスタンスＰ
のような疎水性が強く溶解性の低いペプチドには溶解性
を改善する効果が期待できる。また糖鎖の認識機能を積
極的に利用して生物学的機能を付与することが期待でき
る。

【００１０】糖鎖を結合させることにより安定性を改善
することや溶解性を改善することが期待されるが、糖鎖
を化学的に合成することは困難であり、エンドグリコシ
ダーゼ等の酵素により天然由来の糖鎖ブロックを転移さ
せる方法が考えられる。

【００１１】エンドグリコシダーゼを用いた糖鎖転移反
応としては、Ｋ．タケガワ（K. Takegawa）ら［ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol.
Chem.）、第２７０巻、第３０９４〜３０９９頁（１９
９５）］がアルスロバクタープロトホルミエ（Arthroba
cter protophormiae）由来のエンド−β−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）による糖質への糖鎖
転移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K. Yamamoto）ら
［バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ コミ
ュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun.）、
第２０３巻、第２４４〜２５２頁（１９９４）］ムコー
ル ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド−Ｍに
よる糖質への糖鎖転移反応を報告した。また、Ｋ．ハネ
ダ（K. Haneda）ら［カ−ボハイドレート リサーチ（C
arbohydr. Res.）、第２９２巻、第６１〜７０頁（１９
９６）］はＧｌｃＮＡｃ残基を有する合成基質への糖鎖
転移反応を報告した。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】生理活性ペプチドは酵
素による分解を受け易くすぐに有効濃度以下になってし
まったり目的臓器に到達しなかったりすることが多く、
また物によっては溶解度が低いために医薬として用いる
場合に大きな問題となる。サブスタンスＰの場合にも溶
解性の改善や血液中で酵素分解を受け難くすることが必
要である。

【００１３】

【課題を解決するための手段】サブスタンスＰに糖鎖を
付与した糖ペプチドにすることにより、溶解性の改善や
安定化の目的を達することが期待できる。

【００１４】Ａｓｎに類縁のＬ−グルタミン（Ｇｌｎ）
にアミド結合したＧｌｃＮＡｃにエンドグリコシダーゼ
により糖鎖を転移させて複合糖ペプチドを合成すること
ができる。［羽田ら、特願平７−２０３９４５（１９９
５）］

【００１５】サブスタンスＰにはペプチドのＮ末端から
５番目と６番目にＧｌｎ残基が存在し、そのいずれかの
Ｇｌｎ残基にＧｌｃＮＡｃを結合した糖ペプチド［Ｇｌ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）］ＳＰを化学的に合成し、エンドグ
リコシダーゼによる糖鎖転移反応を用いる酵素法によ
り、Ｇｌｎに結合したＧｌｃＮＡｃ残基に糖鎖を転移さ
せて新しい複合糖ペプチドを合成できる。即ち、本発明
の目的はこのような方法により合成された（化１）ある
いは（化２）に示すサブスタンスＰの糖鎖誘導体を提供
するものである。

【化１】

【化２】

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明を概説すれば、本発明は、
１）（化３）あるいは（化４）に示すＧｌｃＮＡｃ残基
を結合させたサブスタンスＰ誘導体の合成と、２）（化
３）あるいは（化４）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する
サブスタンスＰ誘導体への酵素エンドグリコシダーゼに
よる糖鎖の転移反応による（化１）あるいは（化２）に
示す複合糖ペプチドの合成の２つの構成からなる。

【００１７】下記式（化３）あるいは（化４）

【化３】

【化４】（式中、Ｒ¹ はＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
ＰｒｏあるいはＨからなるペプチド残基を示す。）に示
すＧｌｃＮＡｃ残基を有するサブスタンスＰ誘導体の合
成は如何なる方法によってもよいが、例えばＴ．イナヅ
（T. Inazu）ら［ペプチド ケミストリー １９９３
（Peptide Chemistry 1993 ）、第１０１〜１０４頁
（１９９４）］あるいはＴ．イナヅ（T. Inazu）ら［ペ
プチド ケミストリー１９９５（Peptide Chemistry 19
95 ）、第６１〜６４頁（１９９６）］の報告した方法
に準じて固相合成法により合成される。

【００１８】Ｎ末端から５番目のＧｌｎにアミド結合し
たＧｌｃＮＡｃ残基を有するサブスタンスＰ［Ｈ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−
ＮＨ₂］即ち［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰの合成を
例にとると、例えば９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）基等によりＮ末端αアミノ基を保護
したグルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ）とＧｌｃ
ＮＡｃのアジドからＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨ誘導体をＴ．イナヅ（T. Inazu）ら［シンレット
（Synlett）、第８６９〜８７０頁（１９９３）］の報
告したαアミノ基をＦｍｏｃ基で保護したアスパラギン
酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ）とＧｌｃＮＡｃのアジド
からのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの合成
法に準じて合成してＮ末端から５番目のＧｌｎを結合さ
せる時にＦｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨの代わりに用い、固定
化樹脂として最終脱保護によりカルボキシル末端がアミ
ド型のペプチドを与えるアミド型樹脂、例えば市販され
ている４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−アミノ
メチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メ
チルベンズヒドリルアミノ樹脂、４−（２’，４’−ジ
メトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシアセト
アミド−ノルロイシル−アミノメチル樹脂、４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−
フェノキシ樹脂あるいはこれらの樹脂にＦｍｏｃ−メチ
オニンを導入したＦｍｏｃ−メチオニン−アミド型樹脂
等を用い、Ｆｍｏｃストラテジーに従って縮合にジメチ
ルホスフィン酸混合酸無水物法を用いるペプチドの固相
合成を展開する。樹脂から切り出し、ＧｌｎにＧｌｃＮ
Ａｃ残基が結合したサブスタンスＰ［Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｎ
Ｈ₂］が合成される。予めピペラジンを用いる常法によ
り保護基を外した後に切り出すとＮ末端αアミノ基が遊
離のＧｌｃＮＡｃ残基を有するサブスタンスＰ、即ち
［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰが得られる。αアミ
ノ基を第３ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、３−
ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基ある
いはベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基で保護したアミ
ノ酸を用いる合成法に依った場合には各々に対応するＮ
末端アミノ基を保護したペプチドが合成され、保護基を
外すと遊離型のペプチドが得られる。ペプチド合成をア
ミノ酸７個つないだ段階で終えるとヘプタペプチド［Ｈ
−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂］、即ち［Ｇｌｎ（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）が合成される。Ｎ末
端から６番目のＧｌｎ結合時にＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）−ＯＨを用いて同様にペプチド合成を展開す
ると、Ｎ末端から６番目のＧｌｎにＧｌｃＮＡｃの結合
したサブスタンスＰ誘導体［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡ
ｃ）⁶］ＳＰが合成される。

【００１９】これらＧｌｃＮＡｃ残基を有するサブスタ
ンスＰ誘導体は、次に示す酵素による糖鎖転移反応の受
容体となり、糖鎖を有するサブスタンスＰ誘導体の合成
中間体として重要である。

【００２０】本発明の第２の構成は、ＧｌｃＮＡｃ残基
を有するペプチドへの糖鎖供与体からのエンドグリコシ
ダーゼによる糖鎖の転移反応による付加である。

【００２１】本発明に用いるエンドグリコシダーゼとし
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、ムコ−ル
ヒエマリス（Mucor hiemalis）由来のエンド−Ｍやアル
スロバクター プロトホルミエ（Arthrobacter protoph
ormiae）由来のエンド−Ａ等が用いられる。該酵素は下
記式（式１）： Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（ペプチドまたはタンパク質）（ 式１） （式中Ｒは複合糖鎖を示す）のアスパラギン（Ａｓｎ）
結合型糖鎖のアセチルキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ
−ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に糖鎖
受容体である（化３）あるいは（化４）に示すＧｌｃＮ
Ａｃ残基を有するペプチドを存在させると、受容体に糖
鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）部分が転移し、（化１）あるい
は（化２）に示す目的物質が合成される。

【００２２】糖鎖供与体としては複合型糖鎖、高マンノ
ース型糖鎖あるいは混成型糖鎖を持つ糖質を用いること
により各々に対応する糖鎖を持った（化１）あるいは
（化２）に示す目的物質を得ることが出来る。転移付加
される糖鎖（Ｒ−ＧｌｃＮＡｃ）としては、例えば（Ｎ
ｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−
（ＧｌｃＮＡｃ）あるいは（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂
−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ）といった複合型糖
鎖、あるいは（Ｍａｎ）₆−（ＧｌｃＮＡｃ）といった
高マンノース型糖鎖である。ここでＮｅｕＡｃはＮ−ア
セチルノイラミン酸、ＧａｌはＤ−ガラクトース、Ｍａ
ｎはＤ−マンノースである。

【００２３】酵素反応系で重要な点は、反応を酵素律速
条件下で行うことおよび糖鎖供与体と受容体の仕込濃度
を高めることで、与酵素量を制限しつつ両基質を高濃度
に仕込むことにより糖鎖転移反応が促進され副反応が抑
えられて反応収率が向上する。

【００２４】ここで留意することは、糖鎖の受容体であ
るサブスタンスＰの糖誘導体の溶解性が低く、高濃度の
塩の存在により析出して反応率が著しく低下することが
あるので、受容体を析出させないようにすることが重要
である。

【００２５】本発明に用いる糖鎖供与体としては、酸性
糖であるシアル酸を含有する複合型糖鎖は、例えばヒト
トランスフェリンや牛フェツインあるいは卵黄等からプ
ロナーゼ等のプロテアーゼ処理とセファデックスＧ−２
５によるゲルろ過を繰り返して調製される。シアリダー
ゼ処理等によりシアル酸を外せばアシアロ複合型糖鎖が
調製される。高マンノース型糖鎖は例えば卵白アルブミ
ン等から同様に処理した後にＤｏｗｅｘ５０イオン交換
樹脂により精製して調製される。酵素的あるいは化学的
に修飾された糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用い
ることができる。

【００２６】本発明の反応は、基質の糖鎖供与体、糖鎖
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。糖鎖供与体の濃度を１
０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受容体の
濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜２０ｍＭに
なるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供与体）
以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与体）程度
に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１０ｍＵ／
ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ５〜８程
度、濃度５〜２００ｍＭ、望ましくは５〜１００ｍＭの
適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの場合、通常ｐ
Ｈ５．５〜６．５、濃度５〜５０ｍＭの酢酸あるいはリ
ン酸緩衝液中で反応が行われる。

【００２７】反応温度は通常、室温〜５０℃程度、好ま
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。

【００２８】酵素反応液中の反応生成物の分析は通常、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われ
る。例えば、Ｃ₁₈の逆相系（ＯＤＳ）カラムを用い、
０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水−アセ
トニトリル系溶媒で展開し、２１４ｎｍの紫外末端吸収
により検出される。

【００２９】生成した複合糖ペプチドは公知の手段に従
って反応終了液から容易に分離精製することが出来る。
例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交
換樹脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）等により反応終了液から反応生成物の複合糖ペプチ
ドを分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよ
い。

【００３０】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００３１】

【実施例１】 サブスタンスＰ部分ペプチド糖誘導体： （１）Ｈ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂、［Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）の合成：４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−
フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンズ
ヒドリルアミノ樹脂にＦｍｏｃ−メチオニンを導入した
Ｆｍｏｃ−メチオニンーアミド型樹脂（Ｍｅｔ含量；
０．３９ｍｍｏｌ／ｇ）２６０ｍｇを固相ペプチド合成
装置の反応容器に取り、次に示すスケジュールに従い、
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆ
ｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍ
ｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨを順次反応させた。ここでＦｍｏｃ−Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨはＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨとＧ
ｌｃＮＡｃのアジドから合成して用いた。なお、各保護
アミノ酸はそれぞれ２当量を使用し、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチ
ルアミン存在下、塩化ジメチルホスフィノチオイルと反
応させ、対応するジメチルチオホスフィン酸混合酸無水
物の溶液として加えた。

【００３２】（２）固相合成スケジュール（ＤＭＦ：４
ｍｌ）は以下の通りであった：１）ＤＭＦ １分 ３
回、２）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液 ３分 ２回、
３）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液 ２０分 １回、
４）ＤＭＦ １分 ６回、５）保護アミノ酸ジメチルチ
オホスフィン酸混合酸無水物及びＮ，Ｎ−ジイソプロピ
ルエチルアミン／ＤＭＦ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ 縮合時には６０分 １
回、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）−ＯＨ 縮合時には６０分 ２回、６）以上
１）〜５）の工程を繰り返す。

【００３３】得られた保護ヘプタ糖ペプチド樹脂に対し
２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液４ｍｌを加え、３分間
２回、さらに２０分間 １回の処理を行う。

【００３４】得られたヘプタ糖ペプチド樹脂を減圧下乾
燥させた後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アニソー
ル、１，４−ブタンジチオール（９０：５：５）からな
る混合溶液５ｍｌを加え、２時間攪拌した。樹脂を濾別
し、トリフルオロ酢酸で洗浄後、濾液と洗液を減圧濃縮
した。残渣にエーテル（３０〜５０ｍｌ）を加え、析出
する白色沈澱を遠心分離した。この操作を繰り返し、粗
糖ペプチド１０６．６ｍｇを得た。得られた粗糖ペプチ
ドを高速液体クロマトグラフィー［Ｉｎｅｒｔｓｉｌ
ＰＲＥＰ−ＯＤＳ φ２０ｘ２５０ｍｍ、０．１％ＴＦ
Ａ／２０％〜６０％（４０分）アセトニトリル水溶液］
で分取した。得られた分画を凍結乾燥すると、目的とす
るＨ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂が８１．８ｍｇ得
られた。構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（［Ｍ＋
Ｈ］⁺１０７２．２、理論分子量１０７２．３）、ＮＭ
Ｒにより確認した。

【００３５】

【実施例２】 サブスタンスＰ糖誘導体［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］
ＳＰ： （１）Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂、［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］
ＳＰの合成：４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−
アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−ノルロイシ
ル−メチルベンズヒドリルアミノ樹脂にＦｍｏｃ−メチ
オニンを導入したＦｍｏｃ−メチオニン−アミド樹脂
（Ｍｅｔ含量；０．３９ｍｍｏｌ／ｇ）２６０ｍｇを固
相ペプチド合成装置の反応容器に取り、次に示すスケジ
ュールに従い、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇ
ｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈ
ｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆ
ｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−
ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを順次反応さ
せた。なお、各保護アミノ酸はそれぞれ２当量を使用
し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルエチルアミン存在下、塩化ジメチルホ
スフィノチオイルと反応させ、対応するジメチルチオホ
スフィン酸混合酸無水物の溶液として加えた。

【００３６】（２）固相合成スケジュール（ＤＭＦ：４
ｍｌ）は以下の通りであった：１）ＤＭＦ １分 ３
回、２）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液 ３分 ２回、
３）２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液 ２０分 １回、
４）ＤＭＦ １分 ６回、５）保護アミノ酸ジメチルチ
オホスフィン酸混合酸無水物及びＮ，Ｎ−ジイソプロピ
ルエチルアミン／ＤＭＦ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ 縮合時には６０分 １
回、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）−ＯＨ 縮合時には６０分 ２回、４位のＦ
ｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ縮合時には６０分 ３回、Ｆｍｏ
ｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ２位のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ
−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ縮合時には
６０分 ２回、６）以上１）〜５）の工程を繰り返す。

【００３７】得られた保護ウンデカ糖ペプチド樹脂に対
し２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液４ｍｌを加え、３分間
２回、さらに２０分間 １回の処理を行う。

【００３８】得られたウンデカ糖ペプチド樹脂を減圧下
乾燥させた後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アニソー
ル、１，４−ブタンジチオール（９０：５：５）からな
る混合溶液５ｍｌを加え、２．５時間攪拌した。樹脂を
濾別し、トリフルオロ酢酸で洗浄後、濾液と洗液を減圧
濃縮した。残渣にエーテル（３０〜５０ｍｌ）を加え、
析出する白色沈澱を遠心分離した。この操作を繰り返
し、粗糖ペプチド１５４ｍｇを得た。得られた粗糖ペプ
チドを高速液体クロマトグラフィー［Ｉｎｅｒｔｓｉｌ
ＰＲＥＰ−ＯＤＳ φ２０ｘ２５０ｍｍ、０．１％Ｔ
ＦＡ／２０％〜６０％（４０分）アセトニトリル水溶
液］で分取した。得られた分画を凍結乾燥すると、目的
とするＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂が５３．５ｍｇ得られた。構造
はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（［Ｍ＋Ｈ］⁺１５５
１．５、理論分子量１５５０．８）、ＮＭＲおよびアミ
ノ酸分析により確認した。

【００３９】

【実施例３】 糖鎖を有するサブスタンスＰ誘導体： （１）ＧｌｃＮＡｃを結合したサブスタンスＰ誘導体
［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰの調製：実施例２に
記載の方法により糖鎖受容体となる［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮ
Ａｃ）⁵］ＳＰを調製した。

【００４０】（２）糖鎖供与体の調製：ヒトトランスフ
ェリン（生化学工業）をプロナーゼ処理、セファデック
スＧ−２５ゲルろ過を繰り返してＡｓｎ残基のみを有す
るシアロ糖ペプチド［ＴＦ−ＳＧＰ，（ＮｅｕＡｃ−Ｇ
ａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡ
ｃ）₂−Ａｓｎ （分子量２３３８）］を調製した。ヒ
トトランスフェリン由来シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を除いてアシアロ
糖ペプチド［ＴＦ−ＡＳＧＰ、（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ）₂−Ａｓｎ
（分子量１７５６）］を調製した。卵白アルブミンをプ
ロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過、更に
Ｄｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製し
て、マンノース６個からなる高マンノース型糖ペプチド
［Ｍ₆ＧＰ；（Ｍａｎ）₆−（ＧｌｃＮＡｃ）₂−Ａｓｎ
（分子量１５１１）］を調製した。

【００４１】（３）糖鎖転移反応：シアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧ
Ｐ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ₆ＧＰ）１
μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）と［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡ
ｃ）⁵］ＳＰ ４００ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）２４μｌに溶解し、エ
ンド−Ｍ １６０μＵを含む酵素溶液１６μｌを加え、
３７℃で６時間反応させた。反応停止後反応液を蒸留水
で１ｍｌに希釈して、反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈ
ｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍｍ、関
東化学）、０．１％ＴＦＡ／２０％〜４０％（３０分）
アセトニトリル水溶液 １．２ｍｌ／分］で２１４ｎｍ
の紫外吸収により分析した。シアロ糖ペプチド（ＴＦ−
ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）ある
いは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ₆ＧＰ）から糖鎖受
容体である［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ誘導体へ
の糖鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析の保持時間、各１
７．６分、１８．１分および１８．８分（糖鎖受容体
［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ２１．７分）のピー
クとして検出され、その収率（対糖鎖受容体、モル比）
は各３．２％、１．８％および１．１％であった。

【００４２】（４）反応生成物の単離と同定：シアロ糖
ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ
−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース型糖ペプチドからの
糖鎖転移反応生成物に相当するＨＰＬＣ分析の溶出区分
を分取し凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にか
けた。ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］^-各３５５１．９、２９７０．
４および２７２６．８に主ピークが認められ、各々、シ
アロ複合型糖鎖の転移したＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ［（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ）₂］−Ｇｌｎ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂（分
子量 ３５５３．７）、アシアロ複合型糖鎖の転移した
Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ［（Ｇａ
ｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ）
₂］−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅ
ｔ−ＮＨ₂（分子量 ２９７１．１）および高マンノー
ス型糖鎖の転移したＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ［（Ｍａｎ）₆−（ＧｌｃＮＡｃ）₂］−Ｇｌ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂
（分子量 ２７２６．９）であることが確認された。

【００４３】

【実施例４】 糖鎖を有するサブスタンスＰ部分ペプチド誘導体： （１）ＧｌｃＮＡｃを結合したサブスタンスＰ部分ペプ
チド誘導体［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１
１）の調製：実施例１に記載の方法により糖鎖受容体と
なる［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）を
調製した。

【００４４】（２）糖鎖転移反応：実施例３と同様に調
製したシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖
ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース型糖
ペプチド（Ｍ₆ＧＰ）１μｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）と
［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１） ４０
０ｎｍｏｌ（同１０ｍＭ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．２５）２４μｌに溶解し、エンド−Ｍ １６０μ
Ｕを含む酵素溶液１６μｌを加え、３７℃で６時間反応
させた。反応停止後反応液を蒸留水で１ｍｌに希釈し
て、反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ
−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１
％ＴＦＡ／２０％〜４０％（３０分）アセトニトリル水
溶液 １．２ｍｌ／分］で２１４ｎｍの紫外吸収により
分析した。シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシア
ロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノース
型糖ペプチド（Ｍ₆ＧＰ）から糖鎖受容体である［Ｇｌ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）誘導体への糖
鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析の保持時間、各１６．
３分、１７．２分および１７．７分（糖鎖受容体［Ｇｌ
ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁵］ＳＰ（５−１１）２２．７分）
のピークとして検出され、その収率（対糖鎖受容体、モ
ル比）は各１．０％、０．５％および０．３％であっ
た。反応生成物を単離し、質量分析により確認した。

【００４５】

【実施例５】 サブスタンスＰ糖誘導体［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁶］
ＳＰ：Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂、［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁶］Ｓ
Ｐの合成は実施例２に述べた方法に準じて行った。４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−
フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンズ
ヒドリルアミノ樹脂にＦｍｏｃ−メチオニンを導入した
Ｆｍｏｃ−メチオニン−アミド樹脂（Ｍｅｔ含量；０．
３９ｍｍｏｌ／ｇ）２９０ｍｇをペプチド自動合成装置
４３３Ａ（アプライドバイオシステム社）の反応容器に
取り、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｏ
Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ
の保護アミノ酸（各４当量）を１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（ＨＯＢｔ）を縮合剤として用いるプロトコ
ールに従い順次縮合させた。次いで、樹脂を自動合成機
から手動ペプチド合成装置に移し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ以降、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−Ｏ
Ｈ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏ
ｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを順次反応させた。各保護アミノ酸
はそれぞれ２当量を使用し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）中Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
存在下、塩化ジメチルホスフィノチオイルと反応させ、
対応するジメチルチオホスフィン酸混合酸無水物の溶液
として加え、実施例２に記載の固相合成スケジュールに
従い反応を行った。

【００４６】実施例２に準じて樹脂からの切り出しと脱
保護を行い、粗糖ペプチド２２１ｍｇを得た。得られた
粗糖ペプチドを高速液体クロマトグラフィー［Ｉｎｅｒ
ｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ φ２０ｘ２５０ｍｍ、０．１％
ＴＦＡ／２０％〜４０％（３０分）アセトニトリル水溶
液］で分取し、目的とするＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂が９１．８ｍ
ｇを得た。構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（［Ｍ＋
Ｈ］⁺１５５１．３、理論分子量１５５０．８）、ＮＭ
Ｒおよびアミノ酸分析により確認した。

【００４７】

【実施例６】 糖鎖を有するサブスタンスＰ誘導体：実施例５で調製し
たＮ末端から６番目のＧｌｎにＧｌｃＮＡｃを結合させ
たサブスタンスＰ誘導体［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁶］
ＳＰを糖鎖受容体として用い、実施例３と同様の反応条
件下で糖鎖転移反応を行った。シアロ糖ペプチド（ＴＦ
−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あ
るいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ₆ＧＰ）から糖鎖
受容体である［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁶］ＳＰ誘導体
への糖鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析の保持時間、各
１７．４分、１７．７分および１８．２分（糖鎖受容体
［Ｇｌｎ（ＧｌｃＮＡｃ）⁶］ＳＰ２１．１分）のピー
クとして検出され、その収率（対糖鎖受容体、モル比）
は各２．３％、２．０％および０．８％であった。

【００４８】シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシ
アロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは高マンノー
ス型糖ペプチドからの各糖鎖転移反応生成物に相当する
ＨＰＬＣ分析の溶出区分を単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
質量分析にかけたところ、ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^-各３５５
３．７、２９７１．１および２７２６．９に主ピークが
認められ、各々、シアロ複合型糖鎖の転移したＨ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ［（Ｎｅ
ｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）₂］−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｍｅｔ−ＮＨ₂（分子量 ３５５３．７）、アシアロ複
合型糖鎖の転移したＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ［（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−
（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ）₂］−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂（分子量 ２９７１．
１）および高マンノース型糖鎖の転移したＨ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ［（Ｍａｎ）
₆−（ＧｌｃＮＡｃ）₂］−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂（分子量 ２７２６．９）である
ことが確認された。

【００４９】

【発明の効果】神経作用性生理活性ペプチドであるサブ
スタンスＰのＧｌｎ残基にＧｌｃＮＡｃを付与し、エン
ドグリコシダーゼによる糖鎖転移反応により合成した糖
鎖を有するサブスタンスＰは溶解性が改善された。また
血液中での酵素分解等に対して安定化や薬理作用の改善
に寄与し、医薬として用いる場合に有効である。この手
法は生理活性ペプチドの溶解性の改善あるいは安定性や
薬理作用の改善に利用される。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖鎖を有するサブスタンスＰ誘導体
2. 【請求項２】下記式（化１）で示される新規複合糖ペプ
   チド 【化１】 （式中、Ｒ¹ はＨ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏあ
   るいはＨからなるペプチド残基を示す。Ｒ² は複合型糖
   鎖、高マンノース型糖鎖あるいは混成型糖鎖を示す。）
3. 【請求項３】下記式（化２）で示される新規複合糖ペプ
   チド 【化２】 ［式中、Ｒ² は（化１）と同じ内容を示す。］
4. 【請求項４】下記式（化３）あるいは（化４）で示され
   る新規糖ペプチド 【化３】 ［式中、Ｒ¹ は（化１）と同じ内容を示す。］ 【化４】
5. 【請求項５】（化１）および（化２）の化合物のＲ² で
   示される糖鎖が、（ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡ
   ｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡｃ） あるいは（Ｇ
   ａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）₂−（Ｍａｎ）₃−（ＧｌｃＮＡ
   ｃ） からなる複合型糖鎖、あるいは（Ｍａｎ）₆−（Ｇ
   ｌｃＮＡｃ）からなる高マンノース型糖鎖である請求項
   ２および請求項３に記載の化合物。但し、ＮｅｕＡｃは
   Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＧａｌはＤ−ガラクトー
   ス、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、
   ＭａｎはＤ−マンノースを示す。
6. 【請求項６】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
   の糖鎖を（化３）および（化４）で示されるＮ−アセチ
   ル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する合
   成ペプチドに転移させることにより（化１）および（化
   ２）に示される新規複合糖ペプチドを製造する方法。
7. 【請求項７】エンドグリコシダーゼがエンド−β−Ｎ−
   アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）
   である請求項６に記載の方法。