JPH11113593A - 新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体 - Google Patents
新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体Info
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- JPH11113593A JPH11113593A JP9270443A JP27044397A JPH11113593A JP H11113593 A JPH11113593 A JP H11113593A JP 9270443 A JP9270443 A JP 9270443A JP 27044397 A JP27044397 A JP 27044397A JP H11113593 A JPH11113593 A JP H11113593A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】酵素による糖鎖の転移反応を利用して天然には
糖鎖の付け得ないアミノ酸残基に糖鎖の付いた複合糖ペ
プチドを製造する方法、およびこの方法により合成され
る新規複合糖ペプチド誘導体とその合成中間体を提供す
る。 【解決手段】１）エンドグリコシダーゼの存在下、複合
糖質（糖鎖供与体）の糖鎖を合成糖ペプチド中のＬ−セ
リン（Ｓｅｒ）あるいはＬ−トレオニン（Ｔｈｒ）等の
側鎖に水酸基を有するアミノ酸残基の水酸基とＯ−グリ
コシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）残基、またはＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）
のβ−カルボキシル基あるいはＬ−グルタミン酸（Ｇｌ
ｕ）のγ−カルボキシル基等の酸性アミノ酸の側鎖カル
ボキシル基とエステル結合したＧｌｃＮＡｃ残基（糖鎖
受容体）に転移させることにより新規複合糖ペプチドを
製造する方法。
糖鎖の付け得ないアミノ酸残基に糖鎖の付いた複合糖ペ
プチドを製造する方法、およびこの方法により合成され
る新規複合糖ペプチド誘導体とその合成中間体を提供す
る。 【解決手段】１）エンドグリコシダーゼの存在下、複合
糖質（糖鎖供与体）の糖鎖を合成糖ペプチド中のＬ−セ
リン（Ｓｅｒ）あるいはＬ−トレオニン（Ｔｈｒ）等の
側鎖に水酸基を有するアミノ酸残基の水酸基とＯ−グリ
コシド結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）残基、またはＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）
のβ−カルボキシル基あるいはＬ−グルタミン酸（Ｇｌ
ｕ）のγ−カルボキシル基等の酸性アミノ酸の側鎖カル
ボキシル基とエステル結合したＧｌｃＮＡｃ残基（糖鎖
受容体）に転移させることにより新規複合糖ペプチドを
製造する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペプチドの合成反
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた新規複合糖
ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に応用
される。
応と酵素による糖鎖転移反応を組み合わせた新規複合糖
ペプチドの製造方法に関する。本発明は医薬分野に応用
される。
【０００２】
【従来の技術】糖質および複合糖質は生物の細胞、体液
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収、分解
等の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を
持つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュ
ープラスミノーゲンアクチベーターがあり、医薬として
利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖鎖を
持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のＬ
−アスパラギン（Ａｓｎ）にＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して結合している。
等に存在し、細胞の基質認識や細胞−細胞間の認識等に
深く関わっている。また糖質は生体内物質の吸収、分解
等の代謝の速度に関係している。タンパク質には糖鎖を
持つものが知られ、例えばエリスロポエチンやティシュ
ープラスミノーゲンアクチベーターがあり、医薬として
利用されている。またペプチドホルモンの中にも糖鎖を
持つものが知られ、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）等がある。これら糖タンパク質あるいは糖ペ
プチドでは糖鎖がＮ結合型糖鎖として、ペプチド鎖のＬ
−アスパラギン（Ａｓｎ）にＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して結合している。
【０００３】タンパク質あるいは生理活性ペプチド等に
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。
糖鎖を付けたり、あるいは今ある糖鎖を別の糖鎖に換え
ることにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立
つことが期待される。
【０００４】糖鎖を酵素的に改変する方法としては、エ
ンドグリコシダーゼによる方法が考えられる。エンドグ
リコシダーゼを用いた糖転移反応としては、Ｒ．Ｂ．ト
リムブル（R. B. Trimble）ら［ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２
６１巻、第１２０００〜１２００５頁（１９８６）］の
フラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavobacte
rium meningosepticum）由来のエンド−β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ（エンド−Ｆ）に関するもの、
Ｒ．Ｍ．バーデールス（R. M. Bardales）ら［ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. C
hem.）、第２６４巻、第１９８９３〜１９８９７頁（１
９８９）］のディプロコッカス ニューモニエ（Diproc
occus pneumoniae）由来のエンド−α−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼに関するものがあり、前者はグリセ
ロールが受容体に、また後者はグリセロール、ｐ−ニト
ロフェノール、セリン、トレオニン等が受容体になると
いう報告である。その後、Ｋ．タケガワ（K. Takegaw
a）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第３０９４〜３
０９９頁（１９９５）］がアルスロバクター プロトホ
ルミエ（Arthrobacter protophormiae）由来のエンド−
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）に
よる糖質への糖鎖転移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K.
Yamamoto）ら［バイオケミカル バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.）、第２０３巻、第２４４〜２５２頁（１９
９４）］はムコール ヒエマリス（Mucor hiemalis）由
来のエンド−Ｍによる糖質への糖鎖転移反応を報告し
た。また、Ｋ．ハネダ(K. Haneda)ら［カーボハイドレ
−ト リサーチ(Carbohydr. Res.)、第２９２巻、第６
１〜７０頁（１９９６）］はＡｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃ
を結合させた合成ペプチドに酵素エンド−Ｍにより天然
のＮ結合型糖鎖を転移付加させて複合糖ペプチドを合成
出来ることを報告した。
ンドグリコシダーゼによる方法が考えられる。エンドグ
リコシダーゼを用いた糖転移反応としては、Ｒ．Ｂ．ト
リムブル（R. B. Trimble）ら［ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第２
６１巻、第１２０００〜１２００５頁（１９８６）］の
フラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavobacte
rium meningosepticum）由来のエンド−β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ（エンド−Ｆ）に関するもの、
Ｒ．Ｍ．バーデールス（R. M. Bardales）ら［ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. C
hem.）、第２６４巻、第１９８９３〜１９８９７頁（１
９８９）］のディプロコッカス ニューモニエ（Diproc
occus pneumoniae）由来のエンド−α−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼに関するものがあり、前者はグリセ
ロールが受容体に、また後者はグリセロール、ｐ−ニト
ロフェノール、セリン、トレオニン等が受容体になると
いう報告である。その後、Ｋ．タケガワ（K. Takegaw
a）ら［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（J. Biol. Chem.）、第２７０巻、第３０９４〜３
０９９頁（１９９５）］がアルスロバクター プロトホ
ルミエ（Arthrobacter protophormiae）由来のエンド−
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）に
よる糖質への糖鎖転移反応を、また、Ｋ．ヤマモト（K.
Yamamoto）ら［バイオケミカル バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.）、第２０３巻、第２４４〜２５２頁（１９
９４）］はムコール ヒエマリス（Mucor hiemalis）由
来のエンド−Ｍによる糖質への糖鎖転移反応を報告し
た。また、Ｋ．ハネダ(K. Haneda)ら［カーボハイドレ
−ト リサーチ(Carbohydr. Res.)、第２９２巻、第６
１〜７０頁（１９９６）］はＡｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃ
を結合させた合成ペプチドに酵素エンド−Ｍにより天然
のＮ結合型糖鎖を転移付加させて複合糖ペプチドを合成
出来ることを報告した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】複合糖質は糖鎖部分と
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり、あるいは天然にない生物機能が付加されれば医
薬品に応用した場合に有用である。また、複合糖質にお
ける糖鎖のもつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手
段がなかったために、十分には解明されていないが、そ
の役割の解析のための重要な手段を提供する。
糖鎖が付加する側のタンパク質、ペプチドあるいはセラ
ミド部分等から構成されている。糖質に糖鎖を新たに付
与したりあるいは他の糖鎖と入れ換えたりする、いわゆ
る糖鎖の改変（リモデリング）により複合糖質の生体内
での安定性や生物活性が天然の複合糖質に比べて増強さ
れたり、あるいは天然にない生物機能が付加されれば医
薬品に応用した場合に有用である。また、複合糖質にお
ける糖鎖のもつ生理的機能は今まで糖鎖改変の有効な手
段がなかったために、十分には解明されていないが、そ
の役割の解析のための重要な手段を提供する。
【０００６】天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドの
糖鎖は、通常アスパラギン（Ｎ）結合型糖鎖として、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｓ
ｅｒ（Ｔｈｒ）はＬ−セリンまたはＬ−トレオニンを示
す］のアミノ酸配列のペプチド鎖のＡｓｎのアミド基に
結合したＧｌｃＮＡｃを介して結合している。即ちこの
アミノ酸配列のＡｓｎ残基に、還元末端にＧｌｃＮＡｃ
残基を有する糖鎖が転移し更に修飾を受けてＮ結合型糖
鎖が生合成される。従って、天然にはこのアミノ酸配列
のＡｓｎ以外の他のアミノ酸に結合したＮ結合型糖鎖は
見出されていない。
糖鎖は、通常アスパラギン（Ｎ）結合型糖鎖として、Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）［Ｘは任意のアミノ酸、Ｓ
ｅｒ（Ｔｈｒ）はＬ−セリンまたはＬ−トレオニンを示
す］のアミノ酸配列のペプチド鎖のＡｓｎのアミド基に
結合したＧｌｃＮＡｃを介して結合している。即ちこの
アミノ酸配列のＡｓｎ残基に、還元末端にＧｌｃＮＡｃ
残基を有する糖鎖が転移し更に修飾を受けてＮ結合型糖
鎖が生合成される。従って、天然にはこのアミノ酸配列
のＡｓｎ以外の他のアミノ酸に結合したＮ結合型糖鎖は
見出されていない。
【０００７】天然の糖タンパク質あるいは糖ペプチドに
はＮ結合型糖鎖の他にムチン型糖鎖（Ｏ結合型糖鎖）が
ある。この場合、糖の結合するアミノ酸はＳｅｒあるい
はＴｈｒであり、糖としてＧｌｃＡＮｃではなくＮ−ア
セチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）あるいはキシロ
ース（Ｘｙｌ）がアミノ酸の水酸基とＯ−グリコシド結
合し、更に順次糖が転移付加されて種々のムチン型糖鎖
が生合成される。
はＮ結合型糖鎖の他にムチン型糖鎖（Ｏ結合型糖鎖）が
ある。この場合、糖の結合するアミノ酸はＳｅｒあるい
はＴｈｒであり、糖としてＧｌｃＡＮｃではなくＮ−ア
セチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）あるいはキシロ
ース（Ｘｙｌ）がアミノ酸の水酸基とＯ−グリコシド結
合し、更に順次糖が転移付加されて種々のムチン型糖鎖
が生合成される。
【０００８】また最近、タウ（Ｔａｕ）等の特殊なタン
パク質のＳｅｒやＴｈｒにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシ
ド結合した例が報告されているが、ＧｌｃＮＡｃ単独で
糖鎖は伸びていない。
パク質のＳｅｒやＴｈｒにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシ
ド結合した例が報告されているが、ＧｌｃＮＡｃ単独で
糖鎖は伸びていない。
【０００９】一方、Ａｓｎに結合した糖鎖（Ｎ結合型糖
鎖）を有する複合糖質は普遍的であるが、Ｌ−アスパラ
ギン酸（Ａｓｐ）のβ−カルボキシル基やＬ−グルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）のγ−カルボキシル基にエステル結合し
た糖鎖を有する複合糖質は知られていない。
鎖）を有する複合糖質は普遍的であるが、Ｌ−アスパラ
ギン酸（Ａｓｐ）のβ−カルボキシル基やＬ−グルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）のγ−カルボキシル基にエステル結合し
た糖鎖を有する複合糖質は知られていない。
【００１０】糖質あるいは複合糖質に糖鎖を新たに付加
あるいは改変する方法としては、エンド−Ｍやエンド−
Ａ等のエンドグリコシダーゼによる方法があり、複合糖
鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転移させる、より
効率的な方法を提供する。
あるいは改変する方法としては、エンド−Ｍやエンド−
Ａ等のエンドグリコシダーゼによる方法があり、複合糖
鎖をブロックとして糖質や複合糖質に転移させる、より
効率的な方法を提供する。
【００１１】上述のエンドグリコシダーゼによる糖鎖の
転移付加反応の糖鎖受容体になるのはタンパク質あるい
はペプチド中のＡｓｎ残基にアミド結合したＧｌｃＮＡ
ｃ残基であり、Ａｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃの結合した糖
ペプチド［Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ペプチド］を化学
的に合成し、上述の酵素法により天然糖タンパク質由来
のＮ結合型糖鎖を合成糖ペプチドのＧｌｃＮＡｃ残基に
転移付加させて新しい複合糖ペプチドを合成できる。ま
た、Ａｓｎに類縁のアミノ酸であるＬ−グルタミン（Ｇ
ｌｎ）にアミド結合したＧｌｃＮＡｃ残基を付けた糖ペ
プチドを合成すれば、同様の複合糖ペプチドが合成でき
る［羽田ら、特開平９−３１０９５号（１９９７）］。
転移付加反応の糖鎖受容体になるのはタンパク質あるい
はペプチド中のＡｓｎ残基にアミド結合したＧｌｃＮＡ
ｃ残基であり、Ａｓｎ残基にＧｌｃＮＡｃの結合した糖
ペプチド［Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）−ペプチド］を化学
的に合成し、上述の酵素法により天然糖タンパク質由来
のＮ結合型糖鎖を合成糖ペプチドのＧｌｃＮＡｃ残基に
転移付加させて新しい複合糖ペプチドを合成できる。ま
た、Ａｓｎに類縁のアミノ酸であるＬ−グルタミン（Ｇ
ｌｎ）にアミド結合したＧｌｃＮＡｃ残基を付けた糖ペ
プチドを合成すれば、同様の複合糖ペプチドが合成でき
る［羽田ら、特開平９−３１０９５号（１９９７）］。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＳｅｒある
いはＴｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸の水酸基
にＯ−グリコシド結合したＧｌｃＮＡｃ残基にもエンド
グリコシダーゼの作用によりＮ結合型糖鎖が転移し得る
ことを見出した。更に驚くべきことに、Ａｓｐあるいは
Ｇｌｕ等の酸性アミノ酸のβ−あるいはγ−カルボキシ
ル基とエステル結合したＧｌｃＮＡｃ残基にもエンドグ
リコシダーゼによりＮ結合型糖鎖が転移し得ることを見
出し、本発明を完成した。
いはＴｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸の水酸基
にＯ−グリコシド結合したＧｌｃＮＡｃ残基にもエンド
グリコシダーゼの作用によりＮ結合型糖鎖が転移し得る
ことを見出した。更に驚くべきことに、Ａｓｐあるいは
Ｇｌｕ等の酸性アミノ酸のβ−あるいはγ−カルボキシ
ル基とエステル結合したＧｌｃＮＡｃ残基にもエンドグ
リコシダーゼによりＮ結合型糖鎖が転移し得ることを見
出し、本発明を完成した。
【００１３】即ち本発明は、ペプチド中のＳｅｒあるい
はＴｈｒ残基の水酸基にムチン型糖鎖でなくＮ結合型糖
鎖を付加することを可能にし、また本来糖鎖のないＡｓ
ｐのβ−あるいはＧｌｕのγ−カルボキシル基にＮ結合
型糖鎖を付加することを可能にする。本発明により、ペ
プチドホルモン等の生理活性ペプチドのＡｓｎやＧｌｎ
残基のみならずＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｐあるいはＧｌｕ
残基等に糖鎖を付けることが出来、ほとんど全ての生理
活性ペプチドに糖鎖を付けることを可能にする。
はＴｈｒ残基の水酸基にムチン型糖鎖でなくＮ結合型糖
鎖を付加することを可能にし、また本来糖鎖のないＡｓ
ｐのβ−あるいはＧｌｕのγ−カルボキシル基にＮ結合
型糖鎖を付加することを可能にする。本発明により、ペ
プチドホルモン等の生理活性ペプチドのＡｓｎやＧｌｎ
残基のみならずＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｐあるいはＧｌｕ
残基等に糖鎖を付けることが出来、ほとんど全ての生理
活性ペプチドに糖鎖を付けることを可能にする。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明を概説すれば、本発明は
１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基がＯ−グリコシ
ド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の側鎖に水酸基を有
するアミノ酸残基またはＧｌｃＮＡｃ残基がエステル結
合したＡｓｐあるいはＧｌｕ等の酸性アミノ酸残基を含
む糖ペプチドの合成と、２）このＧｌｃＮＡｃ残基を有
する糖ペプチド（糖鎖受容体）への酵素エンドグリコシ
ダーゼによる糖鎖の転移反応の２つの構成からなる。
１）糖鎖受容体となるＧｌｃＮＡｃ残基がＯ−グリコシ
ド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の側鎖に水酸基を有
するアミノ酸残基またはＧｌｃＮＡｃ残基がエステル結
合したＡｓｐあるいはＧｌｕ等の酸性アミノ酸残基を含
む糖ペプチドの合成と、２）このＧｌｃＮＡｃ残基を有
する糖ペプチド（糖鎖受容体）への酵素エンドグリコシ
ダーゼによる糖鎖の転移反応の２つの構成からなる。
【００１５】本発明の第１の構成であるＧｌｃＮＡｃ残
基がＯ−グリコシド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の
側鎖に水酸基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチド、
またはＧｌｃＮＡｃ残基がエステル結合したＡｓｐある
いはＧｌｕ等の酸性アミノ酸残基を含む糖ペプチドと
は、下記式（化１）
基がＯ−グリコシド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の
側鎖に水酸基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチド、
またはＧｌｃＮＡｃ残基がエステル結合したＡｓｐある
いはＧｌｕ等の酸性アミノ酸残基を含む糖ペプチドと
は、下記式（化１）
【００１６】
【化１】 ［式中、ＹはＣＨ2、ＣＨ（ＣＨ3）、ＣＨ2−ＣＯ、あ
るいはＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ等を示す。各Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、ＡｓｐあるいはＧｌｕ等に対応する。Ｒ1はＨ、ア
ミノ保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端のα−
アミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2はＯＨ、カル
ボキシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端ア
ミノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。］
で示される化合物である。
るいはＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ等を示す。各Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、ＡｓｐあるいはＧｌｕ等に対応する。Ｒ1はＨ、ア
ミノ保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＮ末端のα−
アミノ基を保護したペプチドを示す。Ｒ2はＯＨ、カル
ボキシル保護基、アミノ酸、ペプチドあるいはＣ末端ア
ミノ酸のカルボキシル基を保護したペプチドを示す。］
で示される化合物である。
【００１７】第２の構成では式（化１）に示すＧｌｃＮ
Ａｃ残基を有する糖ペプチドを糖鎖受容体としてエンド
グリコシダーゼによる糖鎖転移反応により式（化２）に
示す目的の糖鎖を有するペプチドが合成される。
Ａｃ残基を有する糖ペプチドを糖鎖受容体としてエンド
グリコシダーゼによる糖鎖転移反応により式（化２）に
示す目的の糖鎖を有するペプチドが合成される。
【００１８】
【化２】 ［式中、Ｒは複合型、高マンノース型あるいは混成型の
Ｎ結合型糖鎖を示す。Ｙ、Ｒ1およびＲ2は式（化１）と
同じ内容を示す。］
Ｎ結合型糖鎖を示す。Ｙ、Ｒ1およびＲ2は式（化１）と
同じ内容を示す。］
【００１９】式（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基のＯ−
グリコシド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の誘導体を
含む糖ペプチド誘導体の合成、およびＧｌｃＮＡｃ残基
のエステル結合したＡｓｐあるいはＧｌｕ等の誘導体を
含む糖ペプチドの合成は如何なる方法によってもよい。
グリコシド結合したＳｅｒあるいはＴｈｒ等の誘導体を
含む糖ペプチド誘導体の合成、およびＧｌｃＮＡｃ残基
のエステル結合したＡｓｐあるいはＧｌｕ等の誘導体を
含む糖ペプチドの合成は如何なる方法によってもよい。
【００２０】ＧｌｃＮＡｃのＯ−グリコシド結合したＳ
ｅｒあるいはＴｈｒ誘導体は、例えばＧｌｃＮＡｃの
３、４、６位水酸基をベンジル（Ｂｎ）基で保護した
後、１位水酸基のジメチルホスフィノチオエート体と
し、α−アミノ基をベンジルオキシカルボニル（Ｚ）
基、カルボキシル基をＢｎ基で保護したセリンと反応さ
せて、Ｏ−グリコシドを合成し、パラジウムカーボンを
触媒とする接触還元によりＺ基およびＢｎ基の脱保護を
行いセリンにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したＨ
−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製した。次いでセ
リンのα-アミノ基を常法により９−フルオレニルメチ
ルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化してＦｍｏｃ−Ｓｅ
ｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを得た。同様の手法によりＦ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製した。こ
れらをペプチドの固相合成の段階でＳｅｒあるいはＴｈ
ｒの代わりに用いてペプチド合成を行うと、Ｓｅｒある
いはＴｈｒにＧｌｃＮＡｃ残基がＯ−グリコシド結合し
た糖ペプチド誘導体が合成される。
ｅｒあるいはＴｈｒ誘導体は、例えばＧｌｃＮＡｃの
３、４、６位水酸基をベンジル（Ｂｎ）基で保護した
後、１位水酸基のジメチルホスフィノチオエート体と
し、α−アミノ基をベンジルオキシカルボニル（Ｚ）
基、カルボキシル基をＢｎ基で保護したセリンと反応さ
せて、Ｏ−グリコシドを合成し、パラジウムカーボンを
触媒とする接触還元によりＺ基およびＢｎ基の脱保護を
行いセリンにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したＨ
−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製した。次いでセ
リンのα-アミノ基を常法により９−フルオレニルメチ
ルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化してＦｍｏｃ−Ｓｅ
ｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを得た。同様の手法によりＦ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製した。こ
れらをペプチドの固相合成の段階でＳｅｒあるいはＴｈ
ｒの代わりに用いてペプチド合成を行うと、Ｓｅｒある
いはＴｈｒにＧｌｃＮＡｃ残基がＯ−グリコシド結合し
た糖ペプチド誘導体が合成される。
【００２１】一方、ＧｌｃＮＡｃのエステル結合したＡ
ｓｐあるいはＧｌｕ誘導体は、例えばα−アミノ基をブ
チルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護したアスパラ
ギン酸のβ−カルボキシル基とＧｌｃＮＡｃの１位水酸
基がエステル結合したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨを以下の如く調製した。α−アミノ基をＢｏ
ｃ基、α−カルボキシル基をＢｎ基で保護したアスパラ
ギン酸と３、４、６位水酸基をＢｎ基で保護したＧｌｃ
ＮＡｃをジクロロメタン中、水溶性カルボジイミドと
０．１当量の４−ジメチルアミノピリジン存在下に縮合
させ、次いでパラジウムカーボンによる接触還元により
脱保護して目的の化合物Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮ
Ａｃ）−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。
同様の手法によりＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製した。これらをペプチドの固相合成の段階
でＡｓｐあるいはＧｌｕの代わりに用いてペプチド合成
を行うと、ＡｓｐあるいはＧｌｕにＧｌｃＮＡｃ残基が
エステル結合した糖ペプチド誘導体が合成される。
ｓｐあるいはＧｌｕ誘導体は、例えばα−アミノ基をブ
チルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護したアスパラ
ギン酸のβ−カルボキシル基とＧｌｃＮＡｃの１位水酸
基がエステル結合したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨを以下の如く調製した。α−アミノ基をＢｏ
ｃ基、α−カルボキシル基をＢｎ基で保護したアスパラ
ギン酸と３、４、６位水酸基をＢｎ基で保護したＧｌｃ
ＮＡｃをジクロロメタン中、水溶性カルボジイミドと
０．１当量の４−ジメチルアミノピリジン存在下に縮合
させ、次いでパラジウムカーボンによる接触還元により
脱保護して目的の化合物Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮ
Ａｃ）−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。
同様の手法によりＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製した。これらをペプチドの固相合成の段階
でＡｓｐあるいはＧｌｕの代わりに用いてペプチド合成
を行うと、ＡｓｐあるいはＧｌｕにＧｌｃＮＡｃ残基が
エステル結合した糖ペプチド誘導体が合成される。
【００２２】（化１）あるいは（化２）の化合物のＲ1
に示す末端アミノ酸のα−アミノ基の保護基としては、
例えば、Ｆｍｏｃ基やＢｏｃ基の他、３−ニトロ−２−
ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、Ｚ基あるいはダ
ンシル（Ｄｎｓ）基等が用いられる。Ｎ末端アミノ酸の
保護基は予め常法により脱保護した後に酵素による糖鎖
転移反応に供するが、糖鎖転移反応後に外してもよい。
に示す末端アミノ酸のα−アミノ基の保護基としては、
例えば、Ｆｍｏｃ基やＢｏｃ基の他、３−ニトロ−２−
ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）基、Ｚ基あるいはダ
ンシル（Ｄｎｓ）基等が用いられる。Ｎ末端アミノ酸の
保護基は予め常法により脱保護した後に酵素による糖鎖
転移反応に供するが、糖鎖転移反応後に外してもよい。
【００２３】（化１）あるいは（化２）の化合物のＲ2
に示すカルボキシル基の保護基としては、第３ブチル（
tＢｕ）基、ベンジル（Ｂｎ）基あるいはメチル（Ｍ
ｅ）基、エチル（Ｅｔ）基、フェナシル（Ｐａｃ）基、
トリクロロエチル（Ｔｃｅ）基等であるが、水への溶解
性を上げるために保護基を外し、遊離型で酵素反応に用
いることが多い。
に示すカルボキシル基の保護基としては、第３ブチル（
tＢｕ）基、ベンジル（Ｂｎ）基あるいはメチル（Ｍ
ｅ）基、エチル（Ｅｔ）基、フェナシル（Ｐａｃ）基、
トリクロロエチル（Ｔｃｅ）基等であるが、水への溶解
性を上げるために保護基を外し、遊離型で酵素反応に用
いることが多い。
【００２４】本発明の第２の構成は、（化１）に示す糖
鎖受容体である合成基質への糖鎖供与体からの酵素エン
ドグリコシダーゼによる糖鎖の転移反応による付加であ
る。
鎖受容体である合成基質への糖鎖供与体からの酵素エン
ドグリコシダーゼによる糖鎖の転移反応による付加であ
る。
【００２５】本発明に用いるエンドグリコシダーゼとし
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ｍ
やエンド−Ａ等が用いられる。該酵素は下記式（式
１）： Ｒ3−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（ペプチドまたはタンパク質） （式１） （式中Ｒ3は糖鎖を示す）のＡｓｎ（Ｎ）結合型糖鎖の
Ｎ、Ｎ´−ジアセチルキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ
−ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に適当
な糖鎖受容体を存在させると、受容体に糖鎖（Ｒ3−Ｇ
ｌｃＮＡｃ）部分が転移する。
ては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
（ＥＣ３．２．１．９６）であり、例えば、エンド−Ｍ
やエンド−Ａ等が用いられる。該酵素は下記式（式
１）： Ｒ3−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−（ペプチドまたはタンパク質） （式１） （式中Ｒ3は糖鎖を示す）のＡｓｎ（Ｎ）結合型糖鎖の
Ｎ、Ｎ´−ジアセチルキトビオース部分（ＧｌｃＮＡｃ
−ＧｌｃＮＡｃ）の間を加水分解するが、この時に適当
な糖鎖受容体を存在させると、受容体に糖鎖（Ｒ3−Ｇ
ｌｃＮＡｃ）部分が転移する。
【００２６】エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼによる糖鎖転移反応の糖鎖受容体となるのは、通
常、ペプチドのＡｓｎとＮ−グリコシド結合したＧｌｃ
ＮＡｃ残基であるが、驚くべきことに、天然には存在し
ないＳｅｒあるいはＴｈｒにＯ−グリコシド結合したＧ
ｌｃＮＡｃ残基、またはＡｓｐあるいはＧｌｕにエステ
ル結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含む糖ペプチドのＧｌｃ
ＮＡｃ残基にもＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃの場合と
同様に糖鎖の転移反応が起きることが分かった。
ーゼによる糖鎖転移反応の糖鎖受容体となるのは、通
常、ペプチドのＡｓｎとＮ−グリコシド結合したＧｌｃ
ＮＡｃ残基であるが、驚くべきことに、天然には存在し
ないＳｅｒあるいはＴｈｒにＯ−グリコシド結合したＧ
ｌｃＮＡｃ残基、またはＡｓｐあるいはＧｌｕにエステ
ル結合したＧｌｃＮＡｃ残基を含む糖ペプチドのＧｌｃ
ＮＡｃ残基にもＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃの場合と
同様に糖鎖の転移反応が起きることが分かった。
【００２７】（化１）に示すＧｌｃＮＡｃ残基を有する
合成基質は、かかる知見に基づき調製されたものであ
り、この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応により
式（化２）に示す天然にはない糖鎖を有するペプチドを
合成する本発明を完成させた。
合成基質は、かかる知見に基づき調製されたものであ
り、この合成基質への酵素による糖鎖の転移反応により
式（化２）に示す天然にはない糖鎖を有するペプチドを
合成する本発明を完成させた。
【００２８】酵素の糖鎖供与体の基質特異性について
は、エンド−Ｍは複合型、混成型あるいは高マンノース
型糖鎖のいずれにも作用するが、エンド−Ａは高マンノ
ース型糖鎖のみに作用する。
は、エンド−Ｍは複合型、混成型あるいは高マンノース
型糖鎖のいずれにも作用するが、エンド−Ａは高マンノ
ース型糖鎖のみに作用する。
【００２９】これらの酵素の本来の機能である糖鎖の加
水分解反応を抑えての糖鎖転移反応を優先的に行わせる
ことが必要である。与酵素量を減らし、基質である糖鎖
供与体と糖鎖受容体の仕込濃度を、そのモル比を１以上
にしつつ高濃度にすることにより反応の場（酵素の活性
中心）における水の影響を排して転移反応を効率よく進
行させることができる。
水分解反応を抑えての糖鎖転移反応を優先的に行わせる
ことが必要である。与酵素量を減らし、基質である糖鎖
供与体と糖鎖受容体の仕込濃度を、そのモル比を１以上
にしつつ高濃度にすることにより反応の場（酵素の活性
中心）における水の影響を排して転移反応を効率よく進
行させることができる。
【００３０】本発明に用いる糖鎖供与体としては、複合
型、高マンノース型あるいは混成型のいずれのＮ結合型
糖鎖も用いられ、天然の糖タンパク質等から調製され
る。シアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトトラン
スフェリン、牛フェツインあるいは卵黄等から調製さ
れ、シアリダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシア
ロ複合型糖鎖が調製される。また高マンノース型糖鎖は
例えば卵白アルブミン等から調製される。これらのタン
パク質部分は通常プロテアーゼ処理によりＡｓｎのみに
まで小さくして用いる。酵素的あるいは化学的に修飾さ
れた糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることが
できる。
型、高マンノース型あるいは混成型のいずれのＮ結合型
糖鎖も用いられ、天然の糖タンパク質等から調製され
る。シアル酸を含有する複合型糖鎖は例えばヒトトラン
スフェリン、牛フェツインあるいは卵黄等から調製さ
れ、シアリダーゼ処理等によりシアル酸を外せばアシア
ロ複合型糖鎖が調製される。また高マンノース型糖鎖は
例えば卵白アルブミン等から調製される。これらのタン
パク質部分は通常プロテアーゼ処理によりＡｓｎのみに
まで小さくして用いる。酵素的あるいは化学的に修飾さ
れた糖鎖、あるいは化学合成された糖鎖も用いることが
できる。
【００３１】本発明の反応は、基質の糖鎖供与体、糖鎖
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。通常、糖鎖供与体の濃
度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受
容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜３５
ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供
与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与
体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１
０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ
５〜８程度、濃度１０〜２００ｍＭ、望ましくは２０〜
１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの
場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度２０〜１００ｍＭ
の酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。基本
的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍＭ、糖鎖受
容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよび６０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。時に混在するプ
ロテアーゼによる分解を抑えるためにＥＤＴＡが加えら
れる。
受容体および酵素のエンドグリコシダーゼを緩衝溶液中
で混合することにより行われる。通常、糖鎖供与体の濃
度を１０ｍＭ以上、望ましくは１５〜７５ｍＭ、糖鎖受
容体の濃度を２．５ｍＭ以上、望ましくは７．５〜３５
ｍＭになるように加える。酵素量は５００Ｕ／モル（供
与体）以下、望ましくは８０〜４００Ｕ／モル（供与
体）程度に制限し、例えば、エンド−Ｍの場合、２〜１
０ｍＵ／ｍｌ程度の量で用いる。緩衝液としては、ｐＨ
５〜８程度、濃度１０〜２００ｍＭ、望ましくは２０〜
１００ｍＭの適当な緩衝液が用いられる。エンド−Ｍの
場合、通常ｐＨ５．５〜６．５、濃度２０〜１００ｍＭ
の酢酸あるいはリン酸緩衝液中で反応が行われる。基本
的な反応液組成の一例は、糖鎖供与体２５ｍＭ、糖鎖受
容体１０ｍＭ、エンド−Ｍ４ｍＵ／ｍｌおよび６０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）である。時に混在するプ
ロテアーゼによる分解を抑えるためにＥＤＴＡが加えら
れる。
【００３２】反応温度は通常、室温〜５０℃程度、好ま
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
しくは３０〜４０℃で行われ、反応時間は１〜２４時間
である。例えば、エンド−Ｍ酵素の場合、通常、３７℃
で３〜１８時間程度反応が行われる。
【００３３】生成した複合糖質は公知の手段に従って反
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
応終了液から容易に分離精製することが出来る。例え
ば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹
脂カラムクロマトグラフィー、レクチンカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
等により反応終了液から反応生成物の複合糖質を分離
し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行えばよい。
【００３４】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００３５】
【実施例１】 Ｄｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転移反
応： （１）ＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したセリンの
Ｄｎｓ化誘導体［Ｄｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｏ
Ｈ］の調製：ＧｌｃＮＡｃの３、４、６位水酸基をベン
ジル（Ｂｎ）基で保護した後、１位水酸基のジメチルホ
スフィノチオエート体とし、α−アミノ基をＺ、カルボ
キシル基をＢｎ基で保護したセリンと反応させて、Ｏ−
グリコシドを合成し、パラジウムカーボンによる接触還
元により脱保護してセリンにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコ
シド結合したＨ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製
した。次いでセリンのα-アミノ基を常法によりダンシ
ル化してＤｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを得、
ＮＭＲにより構造を確認した。
応： （１）ＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したセリンの
Ｄｎｓ化誘導体［Ｄｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｏ
Ｈ］の調製：ＧｌｃＮＡｃの３、４、６位水酸基をベン
ジル（Ｂｎ）基で保護した後、１位水酸基のジメチルホ
スフィノチオエート体とし、α−アミノ基をＺ、カルボ
キシル基をＢｎ基で保護したセリンと反応させて、Ｏ−
グリコシドを合成し、パラジウムカーボンによる接触還
元により脱保護してセリンにＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコ
シド結合したＨ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製
した。次いでセリンのα-アミノ基を常法によりダンシ
ル化してＤｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを得、
ＮＭＲにより構造を確認した。
【００３６】（２）糖鎖供与体の調製：ヒトトランスフ
ェリン（生化学工業）をプロナーゼ処理、セファデック
スＧ−２５ゲルろ過を繰り返してＡｓｎ残基のみを有す
るシアロ糖ペプチド［ＴＦ−ＳＧＰ，（ＮｅｕＡｃ−Ｇ
ａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−Ａｓｎ （分子量２３３８）］を調製した。ヒ
トトランスフェリン由来シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を除いてアシアロ
糖ペプチド［ＴＦ−ＡＳＧＰ、（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ
（分子量１７５６）］を調製した。卵白アルブミンをプ
ロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過、更に
Ｄｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製し
て、マンノース６個からなる高マンノース型糖ペプチド
［Ｍ6−ＧＰ；（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓ
ｎ（分子量１５１１）］を調製した。
ェリン（生化学工業）をプロナーゼ処理、セファデック
スＧ−２５ゲルろ過を繰り返してＡｓｎ残基のみを有す
るシアロ糖ペプチド［ＴＦ−ＳＧＰ，（ＮｅｕＡｃ−Ｇ
ａｌ−ＧｌｃＮＡｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−Ａｓｎ （分子量２３３８）］を調製した。ヒ
トトランスフェリン由来シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ）をシアリダーゼ処理してシアル酸を除いてアシアロ
糖ペプチド［ＴＦ−ＡＳＧＰ、（Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）2−（Ｍａｎ）3−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓｎ
（分子量１７５６）］を調製した。卵白アルブミンをプ
ロナーゼ処理、セファデックスＧ−２５ゲルろ過、更に
Ｄｏｗｅｘ５０イオン交換クロマトにより分離精製し
て、マンノース６個からなる高マンノース型糖ペプチド
［Ｍ6−ＧＰ；（Ｍａｎ）6−（ＧｌｃＮＡｃ）2−Ａｓ
ｎ（分子量１５１１）］を調製した。
【００３７】（３）糖鎖転移反応：シアロ糖ペプチド
（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧ
Ｐ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6−ＧＰ）
５００ｎｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＤｎｓ−Ｓｅｒ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ ２００ｎｍｏｌ（同１０ｍ
Ｍ）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）１２μ
ｌに溶解し、エンド−Ｍ ８０μＵを含む酵素溶液８μ
ｌを加え、３７℃で６時間反応させた。反応停止後反応
液を蒸留水で５００μｌに希釈して、反応生成物をＨＰ
ＬＣ［マイクロボンダスフェアＣ１８カラム（φ３．９
ｘ１５０ｍｍ、ウォータース）、１０％〜１７．５％
（４０分）アセトニトリル２５ｍＭ硼酸緩衝溶液０．５
ｍｌ／分］で励起３２０ｎｍ、吸収５４０ｎｍの蛍光吸
収により分析した。シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは
高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6−ＧＰ）から糖鎖受容
体であるＤｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ誘導体
への糖鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析により検出さ
れ、その収率（対糖鎖受容体、モル比）は各１８．７
％、１７．６％および９．０％であった。各糖鎖転移反
応生成物に相当する区分をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉ
ｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化
学）、０．１％ＴＦＡ／１０％〜２５％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍ］に
より分取し凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に
かけた。各ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５４９．６、１９６
３．０および１７１８．７に主イオンピークが認めら
れ、各々、Ｄｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシ
アロ複合型糖鎖の転移した物質（分子量 ２５４４．
４）、アシアロ複合型糖鎖の転移した物質（分子量 １
９６１．６）および高マンノース型糖鎖の転移した物質
（分子量 １７１７．６）であることが確認された。
（ＴＦ−ＳＧＰ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧ
Ｐ）あるいは高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6−ＧＰ）
５００ｎｍｏｌ（終濃度２５ｍＭ）とＤｎｓ−Ｓｅｒ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ ２００ｎｍｏｌ（同１０ｍ
Ｍ）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．２５）１２μ
ｌに溶解し、エンド−Ｍ ８０μＵを含む酵素溶液８μ
ｌを加え、３７℃で６時間反応させた。反応停止後反応
液を蒸留水で５００μｌに希釈して、反応生成物をＨＰ
ＬＣ［マイクロボンダスフェアＣ１８カラム（φ３．９
ｘ１５０ｍｍ、ウォータース）、１０％〜１７．５％
（４０分）アセトニトリル２５ｍＭ硼酸緩衝溶液０．５
ｍｌ／分］で励起３２０ｎｍ、吸収５４０ｎｍの蛍光吸
収により分析した。シアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＳＧ
Ｐ）、アシアロ糖ペプチド（ＴＦ−ＡＳＧＰ）あるいは
高マンノース型糖ペプチド（Ｍ6−ＧＰ）から糖鎖受容
体であるＤｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ誘導体
への糖鎖転移反応生成物がＨＰＬＣ分析により検出さ
れ、その収率（対糖鎖受容体、モル比）は各１８．７
％、１７．６％および９．０％であった。各糖鎖転移反
応生成物に相当する区分をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉ
ｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化
学）、０．１％ＴＦＡ／１０％〜２５％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２５４ｎｍ］に
より分取し凍結乾燥後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に
かけた。各ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５４９．６、１９６
３．０および１７１８．７に主イオンピークが認めら
れ、各々、Ｄｎｓ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシ
アロ複合型糖鎖の転移した物質（分子量 ２５４４．
４）、アシアロ複合型糖鎖の転移した物質（分子量 １
９６１．６）および高マンノース型糖鎖の転移した物質
（分子量 １７１７．６）であることが確認された。
【００３８】
【実施例２】 Ｄｎｓ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転移反
応：ＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したトレオニン
のＤｎｓ化誘導体［Ｄｎｓ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨ］は実施例１と同様に調製し、ＮＭＲにより構造を
確認した。Ｄｎｓ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖
鎖受容体とし、各種糖鎖供与体を用いて実施例１と同様
に反応させ、実施例１の如くＨＰＬＣ分析した。各ＴＦ
−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖鎖
転移生成物が検出され、その収率は各２３．６％、１
４．７％および６．６％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］-２５６２．８、１９７６．９および１７
３３．３に主イオンピークが認められ、各々、Ｄｎｓ−
Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）へシアロ複合型糖鎖の転移した
物質（分子量 ２５５８．４）、アシアロ複合型糖鎖の
転移した物質（分子量 １９７５．９）および高マンノ
ース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７３１．７）で
あることが確認された。
応：ＧｌｃＮＡｃがＯ−グリコシド結合したトレオニン
のＤｎｓ化誘導体［Ｄｎｓ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨ］は実施例１と同様に調製し、ＮＭＲにより構造を
確認した。Ｄｎｓ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖
鎖受容体とし、各種糖鎖供与体を用いて実施例１と同様
に反応させ、実施例１の如くＨＰＬＣ分析した。各ＴＦ
−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖鎖
転移生成物が検出され、その収率は各２３．６％、１
４．７％および６．６％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］-２５６２．８、１９７６．９および１７
３３．３に主イオンピークが認められ、各々、Ｄｎｓ−
Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）へシアロ複合型糖鎖の転移した
物質（分子量 ２５５８．４）、アシアロ複合型糖鎖の
転移した物質（分子量 １９７５．９）および高マンノ
ース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７３１．７）で
あることが確認された。
【００３９】
【実施例３】 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転移
反応： （１）Ｆｍｏｃ保護基を有するセリンにＧｌｃＮＡｃが
Ｏ−グリコシド結合した誘導体［Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）−ＯＨ］の調製：実施例１と同様に調製し
たＨ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨのＮ末端α−アミ
ノ基をＦｍｏｃのＯ−サクシニル体と反応させてＦｍｏ
ｃ基で保護したＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｏ
Ｈを調製した。ＮＭＲにより構造を確認した。δTMS(DM
SO-d6):1.77(s, 3H, N-Ac).
反応： （１）Ｆｍｏｃ保護基を有するセリンにＧｌｃＮＡｃが
Ｏ−グリコシド結合した誘導体［Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）−ＯＨ］の調製：実施例１と同様に調製し
たＨ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨのＮ末端α−アミ
ノ基をＦｍｏｃのＯ−サクシニル体と反応させてＦｍｏ
ｃ基で保護したＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−Ｏ
Ｈを調製した。ＮＭＲにより構造を確認した。δTMS(DM
SO-d6):1.77(s, 3H, N-Ac).
【００４０】（２）糖鎖転移反応：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ
（ＧｌｃＡＮｃ）−ＯＨを糖鎖受容体とし、各種糖鎖供
与体を用いて実施例１と同様に反応させた。反応生成物
をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム
（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２
０％〜４４％（３６分）アセトニトリル溶液 １．２ｍ
ｌ／分］で２５４ｎｍの紫外吸収により分析した。各Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖
鎖転移生成物が検出され、その収率は各１２．５％、１
３．５％および８．９％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］- ２５３７．１、１９５０．１および１
７０６．４に主イオンピークが認められ、各々、Ｆｍｏ
ｃ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシアロ複合型糖鎖
の転移した物質（分子量 ２５３３．３）、アシアロ複
合型糖鎖の転移した物質（分子量 １９５０．８）およ
び高マンノース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７０
６．６）であることが確認された。
（ＧｌｃＡＮｃ）−ＯＨを糖鎖受容体とし、各種糖鎖供
与体を用いて実施例１と同様に反応させた。反応生成物
をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム
（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２
０％〜４４％（３６分）アセトニトリル溶液 １．２ｍ
ｌ／分］で２５４ｎｍの紫外吸収により分析した。各Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖
鎖転移生成物が検出され、その収率は各１２．５％、１
３．５％および８．９％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］- ２５３７．１、１９５０．１および１
７０６．４に主イオンピークが認められ、各々、Ｆｍｏ
ｃ−Ｓｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシアロ複合型糖鎖
の転移した物質（分子量 ２５３３．３）、アシアロ複
合型糖鎖の転移した物質（分子量 １９５０．８）およ
び高マンノース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７０
６．６）であることが確認された。
【００４１】
【実施例４】 Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転移
反応： （１）Ｆｍｏｃ保護基を有するトレオニンにＧｌｃＮＡ
ｃがＯ−グリコシド結合した誘導体［Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ］の調製：実施例１と同様に調
製したＨ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨのＮ末端α−
アミノ基をＦｍｏｃのＯ−サクシニル体と反応させてＦ
ｍｏｃ基で保護したＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δ
TMS(DMSO-d6):1.27(d, 3H, Thr-Me), 2.09(s, 3H, N-A
c).
反応： （１）Ｆｍｏｃ保護基を有するトレオニンにＧｌｃＮＡ
ｃがＯ−グリコシド結合した誘導体［Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ
（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ］の調製：実施例１と同様に調
製したＨ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨのＮ末端α−
アミノ基をＦｍｏｃのＯ−サクシニル体と反応させてＦ
ｍｏｃ基で保護したＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δ
TMS(DMSO-d6):1.27(d, 3H, Thr-Me), 2.09(s, 3H, N-A
c).
【００４２】（２）糖鎖転移反応：Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ
（ＧｌｃＡＮｃ）−ＯＨを糖鎖受容体とし、各種糖鎖供
与体を用いて実施例１と同様に反応させた。反応生成物
をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム
（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２
０％〜４４％（３６分）アセトニトリル溶液 １．２ｍ
ｌ／分］で２５４ｎｍの紫外吸収により分析した。各Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖
鎖転移生成物が検出され、その収率は各１４．８％、１
５．１％および７．８％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］- ２５４５．０、１９６３．９および１
７１９．１に主イオンピークが認められ、各々、Ｆｍｏ
ｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシアロ複合型糖鎖
の転移した物質（分子量 ２５４７．４）、アシアロ複
合型糖鎖の転移した物質（分子量 １９６４．９）およ
び高マンノース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７２
０．６）であることが確認された。
（ＧｌｃＡＮｃ）−ＯＨを糖鎖受容体とし、各種糖鎖供
与体を用いて実施例１と同様に反応させた。反応生成物
をＨＰＬＣ［Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム
（φ６ｘ２５０ｍｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２
０％〜４４％（３６分）アセトニトリル溶液 １．２ｍ
ｌ／分］で２５４ｎｍの紫外吸収により分析した。各Ｔ
Ｆ−ＳＧＰ、ＴＦ−ＡＳＧＰおよびＭ6−ＧＰからの糖
鎖転移生成物が検出され、その収率は各１４．８％、１
５．１％および７．８％であった。各々の転移生成物を
実施例１と同様にＨＰＬＣ分取し質量分析したところ、
各［Ｍ−Ｈ］- ２５４５．０、１９６３．９および１
７１９．１に主イオンピークが認められ、各々、Ｆｍｏ
ｃ−Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへシアロ複合型糖鎖
の転移した物質（分子量 ２５４７．４）、アシアロ複
合型糖鎖の転移した物質（分子量 １９６４．９）およ
び高マンノース型糖鎖の転移した物質（分子量 １７２
０．６）であることが確認された。
【００４３】
【実施例５】 Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転
移反応： （１）Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの調
製：α−アミノ基をＢｏｃ基で保護したアスパラギン酸
とβ−カルボキシル基とＧｌｃＮＡｃの１位水酸基がエ
ステル結合したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨを以下の如く調製した。α−アミノ基をＢｏｃ基、
α−カルボキシル基をＢｎ基で保護したアスパラギン酸
と３、４、６位水酸基をＢｎ基で保護したＧｌｃＮＡｃ
をジクロロメタン中、水溶性カルボジイミドと０．１当
量の４−ジメチルアミノピリジン存在下に縮合させ、次
いでパラジウムカーボンによる接触還元により脱保護し
て目的の化合物Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δTMS(DM
SO-d6):1.81(s, 3H, N-Ac).
移反応： （１）Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの調
製：α−アミノ基をＢｏｃ基で保護したアスパラギン酸
とβ−カルボキシル基とＧｌｃＮＡｃの１位水酸基がエ
ステル結合したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨを以下の如く調製した。α−アミノ基をＢｏｃ基、
α−カルボキシル基をＢｎ基で保護したアスパラギン酸
と３、４、６位水酸基をＢｎ基で保護したＧｌｃＮＡｃ
をジクロロメタン中、水溶性カルボジイミドと０．１当
量の４−ジメチルアミノピリジン存在下に縮合させ、次
いでパラジウムカーボンによる接触還元により脱保護し
て目的の化合物Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−
ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δTMS(DM
SO-d6):1.81(s, 3H, N-Ac).
【００４４】（２）Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｂｏｃ−Ａｓｐ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｉｎ
ｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２ カラム（φ４．６ｘ１５０
ｍｍ）、０．１％ＴＦＡ／６％〜１６％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２１０ｎｍ］で
分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移生成物と推
定されるピークが認められ、シアロ複合型糖鎖、アシア
ロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖からの転移反応
収率は各々８．０％、１１．３％および６．０％であっ
た。各々の糖鎖に対応する転移反応生成物をＨＰＬＣ分
取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シアロ複合型糖鎖の
転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ＋Ｋ］+２４７５．３、アシア
ロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+１８８２．
１、高マンノース型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+
１６３７．１に主イオンピークが認められ、各々Ｂｏｃ
−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへのシアロ複合型
糖鎖の転移生成物（分子量 ２４３９．２）、アシアロ
複合型糖鎖の転移生成物（分子量 １８５６．７）およ
び高マンノース型糖鎖の転移生成物（分子量 １６１
２．５）であることが確認された。
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｂｏｃ−Ａｓｐ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｉｎ
ｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２ カラム（φ４．６ｘ１５０
ｍｍ）、０．１％ＴＦＡ／６％〜１６％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２１０ｎｍ］で
分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移生成物と推
定されるピークが認められ、シアロ複合型糖鎖、アシア
ロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖からの転移反応
収率は各々８．０％、１１．３％および６．０％であっ
た。各々の糖鎖に対応する転移反応生成物をＨＰＬＣ分
取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シアロ複合型糖鎖の
転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ＋Ｋ］+２４７５．３、アシア
ロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+１８８２．
１、高マンノース型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+
１６３７．１に主イオンピークが認められ、各々Ｂｏｃ
−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへのシアロ複合型
糖鎖の転移生成物（分子量 ２４３９．２）、アシアロ
複合型糖鎖の転移生成物（分子量 １８５６．７）およ
び高マンノース型糖鎖の転移生成物（分子量 １６１
２．５）であることが確認された。
【００４５】
【実施例６】 Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖転
移反応： （１）Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの調
製：α−アミノ基をＢｏｃ基で保護したグルタミン酸を
用い実施例５と同様の手法で目的の化合物Ｂｏｃ−Ｇｌ
ｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより
構造を確認した。
移反応： （１）Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの調
製：α−アミノ基をＢｏｃ基で保護したグルタミン酸を
用い実施例５と同様の手法で目的の化合物Ｂｏｃ−Ｇｌ
ｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより
構造を確認した。
【００４６】（２）Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｂｏｃ−Ｇｌｕ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｉｎ
ｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２ カラム（φ４．６ｘ１５０
ｍｍ）、０．１％ＴＦＡ／６％〜１６％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２１０ｎｍ］で
分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移生成物と推
定されるピークが認められ、シアロ複合型糖鎖、アシア
ロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖からの転移反応
収率は各々９．５％、９．１％および６．８％であっ
た。各々の糖鎖に対応する転移反応生成物をＨＰＬＣ分
取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シアロ複合型糖鎖の
転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ＋Ｋ］+２４８６．５、アシア
ロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+１８９５．
６、高マンノース型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+
１６５０．９に主イオンピークが認められ、各々Ｂｏｃ
−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへのシアロ複合型
糖鎖の転移生成物（分子量 ２４５３．３）、アシアロ
複合型糖鎖の転移生成物（分子量 １８７０．７）およ
び高マンノース型糖鎖の転移生成物（分子量 １６２
６．５）であることが確認された。
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｂｏｃ−Ｇｌｕ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｉｎ
ｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２ カラム（φ４．６ｘ１５０
ｍｍ）、０．１％ＴＦＡ／６％〜１６％（３０分）アセ
トニトリル溶液 １．０ｍｌ／分、検出２１０ｎｍ］で
分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移生成物と推
定されるピークが認められ、シアロ複合型糖鎖、アシア
ロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖からの転移反応
収率は各々９．５％、９．１％および６．８％であっ
た。各々の糖鎖に対応する転移反応生成物をＨＰＬＣ分
取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シアロ複合型糖鎖の
転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ＋Ｋ］+２４８６．５、アシア
ロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+１８９５．
６、高マンノース型糖鎖の転移生成物は［Ｍ＋Ｎａ］+
１６５０．９に主イオンピークが認められ、各々Ｂｏｃ
−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへのシアロ複合型
糖鎖の転移生成物（分子量 ２４５３．３）、アシアロ
複合型糖鎖の転移生成物（分子量 １８７０．７）およ
び高マンノース型糖鎖の転移生成物（分子量 １６２
６．５）であることが確認された。
【００４７】
【実施例７】 Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖
転移反応： （１）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの
調製：実施例５で調製したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）−ＯＨのＢｏｃ基をトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）により脱保護した後、ＦｍｏｃのＯ−サクシニル体
と反応させてα−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したＦｍ
ｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製し、Ｎ
ＭＲにより構造を確認した。δTMS(DMSO-d6):1.78(s, 3
H, N-Ac), 5.95(d, 1H, H-1, 12.85(br, 1H, COOH).
転移反応： （１）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの
調製：実施例５で調製したＢｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）−ＯＨのＢｏｃ基をトリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）により脱保護した後、ＦｍｏｃのＯ−サクシニル体
と反応させてα−アミノ基をＦｍｏｃ基で保護したＦｍ
ｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを調製し、Ｎ
ＭＲにより構造を確認した。δTMS(DMSO-d6):1.78(s, 3
H, N-Ac), 5.95(d, 1H, H-1, 12.85(br, 1H, COOH).
【００４８】（２）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉ
ｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍ
ｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２５％〜４５％（４
０分）アセトニトリル溶液 １．２ｍｌ／分、検出２５
４ｎｍ］で分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移
生成物と推定されるピークが認められ、シアロ複合型糖
鎖、アシアロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖から
の転移反応収率は各々２１．２％、２３．５％および
８．０％であった。各々の糖鎖に対応する転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シア
ロ複合型糖鎖の転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５６
２．８、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ−Ｈ］
-１９７９．３、高マンノース型糖鎖の転移生成物は
［Ｍ−Ｈ］-１７３３．２に主イオンピークが認めら
れ、各々Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ
へのシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量 ２５６
１．４）、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量
１９７８．８）および高マンノース型糖鎖の転移生成物
（分子量 １７３４．６）であることが確認された。
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉ
ｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍ
ｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２５％〜４５％（４
０分）アセトニトリル溶液 １．２ｍｌ／分、検出２５
４ｎｍ］で分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移
生成物と推定されるピークが認められ、シアロ複合型糖
鎖、アシアロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖から
の転移反応収率は各々２１．２％、２３．５％および
８．０％であった。各々の糖鎖に対応する転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シア
ロ複合型糖鎖の転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５６
２．８、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ−Ｈ］
-１９７９．３、高マンノース型糖鎖の転移生成物は
［Ｍ−Ｈ］-１７３３．２に主イオンピークが認めら
れ、各々Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ
へのシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量 ２５６
１．４）、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量
１９７８．８）および高マンノース型糖鎖の転移生成物
（分子量 １７３４．６）であることが確認された。
【００４９】
【実施例８】 Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨへの糖鎖
転移反応： （１）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの
調製：実施例６で調製したＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）−ＯＨから実施例７と同様の手法でグルタミン
のγ−カルボキシル基にＧｌｃＮＡｃがエステル結合し
た目的の化合物Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δ
TMS(DMSO-d6):1.80(s, 3H, N-Ac), 5.94(d, 1H, H-1, 1
2.68(br, 1H, COOH).
転移反応： （１）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨの
調製：実施例６で調製したＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−Ｇｌｃ
ＮＡｃ）−ＯＨから実施例７と同様の手法でグルタミン
のγ−カルボキシル基にＧｌｃＮＡｃがエステル結合し
た目的の化合物Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）
−ＯＨを調製し、ＮＭＲにより構造を確認した。δ
TMS(DMSO-d6):1.80(s, 3H, N-Ac), 5.94(d, 1H, H-1, 1
2.68(br, 1H, COOH).
【００５０】（２）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡ
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉ
ｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍ
ｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２５％〜４５％（４
０分）アセトニトリル溶液 １．２ｍｌ／分、検出２５
４ｎｍ］で分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移
生成物と推定されるピークが認められ、シアロ複合型糖
鎖、アシアロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖から
の転移反応収率は各々２４．１％、２７．４％および
９．４％であった。各々の糖鎖に対応する転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シア
ロ複合型糖鎖の転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５７
６．４、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ−Ｈ］
-１９９１．０、高マンノース型糖鎖の転移生成物は
［Ｍ−Ｈ］-１７４７．６に主イオンピークが認めら
れ、各々Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ
へのシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量 ２５７
５．４）、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量
１９９２．９）および高マンノース型糖鎖の転移生成物
（分子量 １７４８．６）であることが確認された。
ｃ）−ＯＨへの各種糖鎖の転移反応：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを糖鎖受容体として、実施
例１と同様に反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ［Ｍｉ
ｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８カラム（φ６ｘ２５０ｍ
ｍ、関東化学）、０．１％ＴＦＡ／２５％〜４５％（４
０分）アセトニトリル溶液 １．２ｍｌ／分、検出２５
４ｎｍ］で分析した。各々の糖鎖に対応して１つの転移
生成物と推定されるピークが認められ、シアロ複合型糖
鎖、アシアロ複合型糖鎖および高マンノース型糖鎖から
の転移反応収率は各々２４．１％、２７．４％および
９．４％であった。各々の糖鎖に対応する転移反応生成
物をＨＰＬＣ分取し凍結乾燥後質量分析にかけた。シア
ロ複合型糖鎖の転移生成物はｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］-２５７
６．４、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物は［Ｍ−Ｈ］
-１９９１．０、高マンノース型糖鎖の転移生成物は
［Ｍ−Ｈ］-１７４７．６に主イオンピークが認めら
れ、各々Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ
へのシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量 ２５７
５．４）、アシアロ複合型糖鎖の転移生成物（分子量
１９９２．９）および高マンノース型糖鎖の転移生成物
（分子量 １７４８．６）であることが確認された。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、ペプチド鎖のアミノ酸配
列の中にＡｓｎのみならずＳｅｒ，Ｔｈｒ等の側鎖に水
酸基を有するアミノ酸あるいはＡｓｐ，Ｇｌｕ等の酸性
アミノ酸があれば、これらアミノ酸にＧｌｃＮＡｃ残基
を付加した糖ペプチドを合成し、次いで酵素的に糖鎖を
転移付加して、天然には無い全く新しい複合糖ペプチド
を合成することが可能になった。付加する糖鎖はシアル
酸を含む複合型糖鎖あるいは高マンノース型糖鎖等いず
れでもよく、望み通りの非天然の複合糖ペプチドを合成
できる。本発明は、医薬への応用とともに複合糖質の糖
鎖の果たしている生理的役割を解明するための研究手法
を提供する。
列の中にＡｓｎのみならずＳｅｒ，Ｔｈｒ等の側鎖に水
酸基を有するアミノ酸あるいはＡｓｐ，Ｇｌｕ等の酸性
アミノ酸があれば、これらアミノ酸にＧｌｃＮＡｃ残基
を付加した糖ペプチドを合成し、次いで酵素的に糖鎖を
転移付加して、天然には無い全く新しい複合糖ペプチド
を合成することが可能になった。付加する糖鎖はシアル
酸を含む複合型糖鎖あるいは高マンノース型糖鎖等いず
れでもよく、望み通りの非天然の複合糖ペプチドを合成
できる。本発明は、医薬への応用とともに複合糖質の糖
鎖の果たしている生理的役割を解明するための研究手法
を提供する。
Claims (10)
- 【請求項１】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をアミノ酸、あるいはペプチド中
の側鎖と結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇ
ｌｃＮＡｃ）残基（糖鎖受容体）に転移させることによ
り新規複合糖ペプチドを製造する方法。 - 【請求項２】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をアミノ酸、あるいはペプチド中
の側鎖水酸基とＯ−グリコシド結合したＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基（糖鎖受容体）
に転移させることにより新規複合糖ペプチドを製造する
方法。 - 【請求項３】アミノ酸がＬ−セリン（Ｓｅｒ）あるいは
Ｌ−トレオニン（Ｔｈｒ）である請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をペプチド中の酸性アミノ酸のカ
ルボキシル基とエステル結合したＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基（糖鎖受容体）に転移
させることにより新規複合糖ペプチドを製造する方法。 - 【請求項５】アミノ酸がＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）
あるいはＬ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）である請求項３に
記載の方法。 - 【請求項６】エンドグリコシダーゼがエンド−β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６）
である請求項１項に記載の方法。 - 【請求項７】エンドグリコシダーゼの存在下、複合糖質
（糖鎖供与体）の糖鎖をペプチド中のＳｅｒあるいはＴ
ｈｒ残基の水酸基とＯ−グリコシド結合したＧｌｃＮＡ
ｃ残基、またはＡｓｐ残基のβ−カルボキシル基あるい
はＧｌｕ残基のγ−カルボキシル基とエステル結合した
ＧｌｃＮＡｃ残基（糖鎖受容体）に転移させることによ
り製造される新規複合糖ペプチド。 - 【請求項８】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇｌｃ
ＮＡｃ）残基を側鎖に有し、αアミノ基を９−フルオレ
ニルオキシカルボニル基または第三ブチルオキシカルボ
ニル基で保護した糖アミノ酸誘導体。 - 【請求項９】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇｌｃ
ＮＡｃ）残基が側鎖水酸基にＯ−グリコシド結合し、α
アミノ基を９−フルオレニルオキシカルボニル基または
第三ブチルオキシカルボニル基で保護したセリンまたは
トレオニン誘導体。 - 【請求項１０】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）残基が側鎖カルボキシル基にエステル結合
し、αアミノ基を９−フルオレニルオキシカルボニル基
または第三ブチルオキシカルボニル基で保護したアスパ
ラギン酸またはグルタミン酸誘導体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9270443A JPH11113593A (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9270443A JPH11113593A (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11113593A true JPH11113593A (ja) | 1999-04-27 |
Family
ID=17486365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9270443A Pending JPH11113593A (ja) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | 新規複合糖ペプチドとその製法及び中間体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11113593A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002176998A (ja) * | 2000-12-15 | 2002-06-25 | Meiji Milk Prod Co Ltd | ムチン型糖ペプチドおよび糖タンパク質製造法 |
| WO2005019465A1 (ja) * | 2003-08-26 | 2005-03-03 | Seikagaku Corporation | 糖鎖切断剤 |
| US7157554B2 (en) * | 2000-06-22 | 2007-01-02 | Theravance, Inc. | Glycopeptide carboxy-saccharide derivatives |
| CN114591391A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-07 | 湖北强耀生物科技有限公司 | 一种o-糖肽键多肽的合成工艺 |
-
1997
- 1997-09-17 JP JP9270443A patent/JPH11113593A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7157554B2 (en) * | 2000-06-22 | 2007-01-02 | Theravance, Inc. | Glycopeptide carboxy-saccharide derivatives |
| US7265086B2 (en) | 2000-06-22 | 2007-09-04 | Theravance, Inc. | Glycopeptide carboxy-saccharide derivatives |
| JP2002176998A (ja) * | 2000-12-15 | 2002-06-25 | Meiji Milk Prod Co Ltd | ムチン型糖ペプチドおよび糖タンパク質製造法 |
| WO2005019465A1 (ja) * | 2003-08-26 | 2005-03-03 | Seikagaku Corporation | 糖鎖切断剤 |
| JPWO2005019465A1 (ja) * | 2003-08-26 | 2006-10-19 | 生化学工業株式会社 | 糖鎖切断剤 |
| CN114591391A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-07 | 湖北强耀生物科技有限公司 | 一种o-糖肽键多肽的合成工艺 |
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