DK149457B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller b30-estere deraf - Google Patents

Description

i 149457

Den foreliggende opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af humant insulin eller en B30-ester deraf.

I mange år har forskellige insuliner været anvendt til be-5 handling af insulinafhængig diabetes. Det ville være naturligt at behandle mennesker med humant insulin, men dette er ikke muligt som følge af det eksisterende behov. Af praktiske årsager anvendes derfor okseinsulin og svineinsulin.

Disse insuliner giver imidlertid anledning til dannelse af 10 antistoffer i større eller mindre grad i det menneskelige legeme, og dette medfører bl.a. en nedsat effektivitet af den videre insulinbehandling.

Det menes, at denne ulempe skyldes dels "urenheder" i ok-se/svineinsulinet, dels artsfremmedheden, idet det humane insulinmole-15 kyle afviger fra andre animalske insulinmolekyler på nugle få punkter med hensyn til sammensætning af aminosyrekcmponenteme.

Efter indførelsen af de nyeste rensningsmetoder er det blevet muligt at fremstille insulinpræparater af en højere kvalitet, men der kan dog stadig forekomme dannelse af anti-20 stoffer i det menneskelige legeme. Man mener, at dette kan afhjælpes ved anvendelse af humant insulin i stedet for andre animalske insuliner.

Det er kendt at fremstille humant insulin ad kemisk vej jf. USA-patentskrift nr. 3.903.068 og Hoppe-Seyler's Z. Physiol.

25 Chem. 352, 759-767 (1976).

Disse fremgangsmåder omfatter kondensation af et desocta-peptid-(B23-30)-svineinsulin med et syntetisk octapeptid svarende til stillingerne B23-30 i humant insulin. Ved denne første fremgangsmåde foretages imidlertid basisk hydrolyse, 30 som ledsages af uheldige bireaktioner. Den anden fremgangsmåde omfatter en uspecifik omsætning, som er ledsaget af mange bireaktioner, og som kræver komplicerede rensningsmetoder.

Disse fremgangsmåder er derfor ikke egnede til anvendelse i 149457 2 industriel målestok.

Fra USA-patentskrift nr. 3.276.961 kendes desuden en fremgangsmåde til fremstilling af humant insulin ud fra andre animalske insuliner ved indvirkning af et enzym, f.eks.

5 carboxypeptidase A eller trypsin, i nærværelse af threonin.

Ved denne kendte fremgangsmåde er det imidlertid ikke muligt at fremstille humant insulin i nævneværdig grad. Dette skyldes formentlig, at trypsin og carboxypeptidase A ikke kun hydrolyserer lysyl-alaninpeptidbindingen (B29-B30), men 10 også andre stillinger i insulinmolekylet under de anvendte betingelser. Trypsin hydrolyserer fortrinsvis arginyl-glycin-peptidbindingen (B22-B23) fremfor lysyl-alaninbindingen (B29-B30). Carboxypeptidase A kan ikke frigøre alaninen ved B-kædens C-terminal alene uden at frigøre 15 asparagin ved A-kædens C-terminal. Det er senere blevet påvist, at en særlig betingelse, nemlig omsætning i en ammonium-hydrogencarbonatpufferopløsning, er nødvendig for at forhindre asparaginfrigivelsen, jf. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 359, 799-802 (1978). Endvidere finder peptiddannelse af be-20 tydning næppe sted, da hydrolysereaktionen forløber hurtigere end peptidsyntesen under de anvendte betingelser.

Det har senere vist sig, at der ved tilsætning af et organisk opløsningsmiddel til reaktionsmediet for en enzymatisk katalyseret fremgangsmåde opnås en bemærkelsesværdig forøgel-25 se af hastigheden for peptidbindingssyntesen og formindskelse af hydrolysehastigheden, jf. Ingalls et al. (1975), Bio-techn. Bioeng. 17, 1627, og Homandberg et al., Biochemistry 17, 5220 (1978). Koncentrationen af opløsningsmidlet i reaktionsmediet skal være høj, og'i sidstnævnte litteratursted 30 anføres det, at der ved anvendelse af 1,4-butandiol som opløsningsmiddel opnås de bedste resultater ved en koncentration på 80% af opløsningsmidlet.

På denne baggrund er det lykkedes at koble desoctapeptid-(B23-B30)-insulin (DOI) under anvendelse af trypsin som ka-35 talysator med et syntetisk octapeptid svarende til B23-B30- 149457 3 stillingerne i humant insulin ved anvendelse af sidstnævnte reaktant i overskud (10:1) og ved anvendelse af et organisk opløsningsmiddel (DMF) i en koncentration på over 50%, jf.

J. Am. Chem. Soc. 101, 751-752 (1979). Koblingen giver et 5 rimeligt udbytte, men alt taget i betragtning er denne fremgangsmåde stadig dyr og besværlig, da den kræver trypsin-katalyseret nedbrydning af svineinsulin til dannelse af D0I, og endvidere skal det nødvendige octapeptid fremstilles ved en kompliceret fremgangsmåde.

10 Endvidere kendes fra Nature 280, 412-413 (1979) og Biochem.

Biophys. Res. Com. 92 nr. 2, 396-402 (1980) en fremgangsmåde til semisyntetisk fremstilling af humant insulin, ved hvilken ala-B30 i svineinsulin udskiftes med threonin under anvendelse af trypsin eller achromobacterprotease som kata-15 lysator. Ved denne fremgangsmåde gennemføres først en hydrolyse af svineinsulin med carboxypeptidase eller achromobacterprotease i nærværelse af NH^HCO^ til dannelse af desalanin-B30-insulin (DAI). Den trypsin- eller achromobacterprotease-katalyserede kobling af DAI gennemføres under anvendelse af 20 et stort overskud af et beskyttet threoninderivat, nemlig 4- threonin-butylester (Thr-OBu ) i forholdet 50:1 til 100:1, og i en høj koncentration af organisk opløsningsmiddel, ca. 60% af en blanding af dimethylformamid og ethanol. Under disse betingelser nedsættes spaltningen af Arg(B22)-Gly(B23)-25 bindingen kraftigt.

Det fremgår af det ovenfor anførte, at ulemperne ved den fra USA-patentskrift nr. 3.276.961 kendte fremgangsmåde kan afhjælpes ved at gennemføre omsætningen i høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler, og det har vist 30 sig, at det forøgede udbytte står i relation til det store indhold af organisk opløsningsmiddel. Det er imidlertid stadigt vigtigt, at en åf reaktanterne er til stede i stort overskud. Imidlertid anses mange af de forslåede mest velegnede opløsningsmidler for at være mutagene, og da det kan 35 være vanskeligt at fjerne dem fuldstændigt fra insulinpro- 149457 4 duktet, bør anvendelsen af disse opløsningsmidler så vidt muligt undgås.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til omdannelse af et animalsk insulin/ fortrinsvis svi-5 neinsulin eller dets desalanin-B30-derivat/ til humant insulin i stort udbytte og uden anvendelse af skadelige organiske opløsningsmidler.

Det har overraskende vist sig, at indføringen af threonin i B30-stillingen i et insulin under anvendelse af trypsin el-10 ler et trypsinlignende enzym som katalysator forløber glat i et vandigt medium/ når den molære koncentration af threonin-derivatet i reaktionsblandingen ligger over en vis høj værdi.

I overensstemmelse hermed angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af humant insulin eller en 15 B30-ester deraf, ved hvilken et carboxyl- og eventuelt hydr-oxyl-beskyttet L-threonin-derivat omsættes med et insulin-derivat med formlen (l-r-A-|-21) (l-I_B-l-29)-R (I) hvori R betyder hydroxyl eller en aminosyregruppe, som er 20 forskellig fra threoningruppen. og -A- og -B- betyder A- og B-kæderne med samme aminosyresekvens som i humant insulin, i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym i vand ved en pH-værdi på 5-9 og en tempetatur under 50°C, hvorefter, om ønsket, alle tilstedeværende beskyttelses-25 grupper fjernes, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at L-threoninderivatet foreligger i reaktionsblandingen i en molær koncentration på fra 2 til ca. 6. Den øvre grænse er afhængig af det anvendte threoninderivat.

149457 5

Betydningen af koncentrationen af threoninderivatet i reaktionsblandingen har ikke tidligere været erkendt. Man har hidtil antaget, at den trypsinkatalyserede hydrolyse og den dermed forbundne biproduktdannelse i vandige medier ikke kunne 5 undgås, og at hydrolysen kun kunne undertrykkes. ved at anvende et reaktionsmedium indeholdende 50-90% af et vandblandbart organisk opløsningsmiddel.

Det har tidligere været foreslået at anvende et højt molforhold mellem L-threoninderivatet og insulinforbindelsen, 10 f.eks. fra 5:1 til 500:1, som den drivende kraft ved omsætningen .

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at en høj molær koncentration af et L-threoninderivat i reaktionsblandingen har afgørende betydning ved omsætning ' i vandige me-15 dier, hvorimod et højt molforhold mellem L-threoninderivatet og insulin har mindre betydning, næsten uafhængigt af insulinkoncentrationen.

En molær koncentration af L-threoninderivatet på 2 eller derover resulterer i en specifik reaktion mellem amino-20 syren og insulin i B29-B30-stillingen, medens hydrolysen i B22-B23-stillingen undertrykkes. Endvidere bevirker det en endog meget stor opløselighed af insulinet.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretrækkes det at anvende L-threoninderivatet i reaktionsmediet i en molær 25 koncentration på 3-5. En molær koncentration på mere end 5 resulterer i en kraftig forøgelse af reaktionsblandingens viskositet. En molær koncentration af L-threoninderivatet på væsentligt mindre end 2 resulterer i forøget biproduktdannelse, nedsat opløselighed af insulinet og tilsvarende 30 lavere udbytter.

Insulinreaktanten kan være svineinsulin eller et vilkårligt derivat deraf med den ovenfor anførte formel (I). Des-ala-nin-B(30)-insulin afledt af svineinsulin kan f.eks. anvendes.

149457 6 f L-Threoninreaktanten er et beskyttet L-threoninderivat med formlen

Thr-O^MR2) (II) hvor Thr er L-threoningruppen, R1 betyder hydrogen eller en 2 5 hydroxylbeskyttelsesgruppe, og R betyder en carboxylbeskyt-telsesgruppe. Et foretrukket L-threoninderivat er en alkyl-ester, f.eks. en methyl-, ethyl- eller tert-butyl-ester.

Til eventuel neutralisering af L-threoninderivatet og til regulering af pH-værdien kan der anvendes mineralsyrer eller 10 lavere carboxylsyrer, f.eks. eddikesyre eller propionsyre.

Det proteolytiske enzym skal kunne spalte lysincarbonylbin-dinger i peptider og kan f.eks. være trypsin fra forskellige kilder, forskellige trypsinderivater eller achromobacter-protease.

15 Reaktionstemperaturen kan ligge mellem 0 og 50°C, f.eks. mellem 5 og 20°C.

Da der anvendes et beskyttet L-threonin som reaktant, vil insulinproduktet indeholde en eller flere beskyttelsesgrupper, som kan fjernes på kendt måde.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1.

200 mg svineinsulin opløses i 1 ml 3,7 M vandig opløsning af L-threonin-ethylester-propionat. Til denne blanding sættes 25 en opløsning af 4 mg svinetrypsin i 40 μΐ 0,02 M calcium-acetat, og pH-værdien indstilles på 6,3 med propionsyre.

Opløsningen henstår i 5 timer ved 20°C, hvorefter reaktionen afbrydes ved tilsætning af 9 ml vand og indstilling af blandingens pH-værdi på 3 med 5 N saltsyre.

149457 7 Højtryksvæskekromatografisk analyse af reaktionsblandingen viser en omdannelse på 75%.

A

Reaktionsblandingen gelfiltreres pa en søjle af Sephadex G-50 Superfine (2,6 x 90 cm) i 1 M eddikesyre. Fraktionen 5 indeholdende human insulinester og uomsat svineinsulin frysetørres. Udbytte: 180 mg produktblanding.

Produktblandingen ionbyttes derpå ved 4°C på en søjle af DEAE-cellulose (Whatmann DE-52, 5x2 cm) ækvilibreret med 75 ml/time af en puffer bestående af 0,02 M tris og 7 M urin-10 stof, justeret til pH-værdien 8,1 med saltsyre. Efter påsætning af produktet elueres søjlen i 2,5 timer med ovennævnte pufferopløsning, derefter i 2 timer med ovennævnte pufferopløsning tilsat 0,0045 mol natriumchlorid pr. liter og til sidst i 12 timer med førstenævnte puffer tilsat 0,011 15 mol natriumchlorid pr. liter.

Eluatet indeholder to proteinholdige hovedfraktioner. Ved højtryksvæskekromatografi identificeres den først eluerede fraktion til at være human insulinester og den derpå eluerede fraktion til at være uomsat svineinsulin.

20 Den først eluerede hovedfraktion afsaltes på en søjle af Sephadex G-25 i 0,1 M eddikesyre og frysetørres, hvorved der fås 120 mg human insulinethylester.

Den isolerede humane insulinethylester opløses i 50 ml vand, hvorefter opløsningen indstilles på pH-værdien 9,5 med 0,1 25 N natriumhydroxidopløsning. Opløsningen henstår ved 25UC i 72 timer, idet pH-værdien holdes konstant, hvorefter insulinet krystalliseres på kendt måde. Der fås 110 mg humant insulin, identificeret ved aminosyreanalyse og højtryksvæskekroma-tografi.

U 9457 8

Eksempel 2.

1 g L-threonin-methylester opløses i 1 ml vand, hvorefter der tilsættes 100 mg svineinsulin, og blandingen omrøres, indtil insulinet er opløst. Der opløses 10 mg trypsin, og 5 blandingen henstår ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter afbrydes reaktionen ved indstilling af blandingens pH-værdi på 3 med 1 N saltsyre.

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser et udbytte af human insulinmethylester på 24%.

10 Eksempel 3.

1 g L-threonin-methylester opløses i 1 ml vand. Der tilsættes 100 mg svineinsulin, som opløses under kortvarig omrøring. 10 mg trypsin opløses i blandingen, og efter 5 minutters forløb indstilles opløsningen på pH-værdien 6,3 15 ved tilsætning af 450 yl iseddike. Derefter henstår blandingen ved stuetemperatur, og efter 2 timers forløb afbrydes reaktionen ved indstilling af blandingen på pH-værdien 3 med 1 N saltsyre.

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser et udbytte af 20 human insulinmethylester på 31%.

Eksempel 4.

500 mg svineinsulin opløses i 2,50 ml 4 M L-threonin-methylester-hydrochlorid, pH-værdi = 6,5. Efter indstilling af blandingen på pH-værdien 6,3 med 300 yl 5 N salt-25 syre tilsættes en opløsning af 10 mg trypsin i 100 yl 0,02 M calciumacetat, og reaktionsblandingen henstår ved 8°C i 65 timer. Derefter afbrydes reaktionen ved tilsætning af 25 ml vand og indstilling af blandingen på pH-vær- dien 3 med 5 N saltsyre.

30 Højtryksvæskekromatografisk analyse af reaktionsblandingen viser en omdannelse på 43%.

149457 9

Eksempel 5.

1,5 ml 5 M opløsning af L-threonin-methylester-acetat indeholdende 200 mg svineinsulin fremstilles ved at opløse 200 mg svineinsulin i 750 μΐ 10 M eddikesyre og at tilsætte 5 1 g L-threonin-methylester. Der tilsættes 2 mg svinetrypsin, og den klare reaktionsblanding med en pH-værdi på 6,3 henstilles ved 20°C. Reaktionen afbrydes efter 90 timers forløb ved tilsætning af 15 ml vand og indstilling af blandingens pH-værdi på 3 med 5 N saltsyre.

10 Højtryksvæskekromatografisk analyse af reaktionsblandingen viser en omdannelse på 85%.

Eksempel 6.

2 g zinkfrit svineinsulin opløses i 200 ml 0,2 M ammonium-hydrogencarbonatopløsning, som er indstillet på pH-værdien 15 8,4 med ammoniakvand. 20 mg carboxypeptidase A opløses i 4 ml vand under anvendelse af nogle få korn fast tris, og denne opløsning sættes til insulinopløsningen, hvorefter den resulterende opløsning henstilles ved 20°C i 2,5 timer. Opløsningen spinfryses og frysetørres.

20 Det frysetørrede pulver opløses i 80 ml 1 M eddikesyre og

A

gelfiltreres på en søjle pakket med Sephadex G-50 Superfine (5 x 90 cm) i det samme medium. Den insulinholdige fraktion frysetørres. Der fås 1800 mg des-(B30-alanin)-svineinsulin.

25 En opløsning af 100 mg des-(B30-alanin)-svineinsulin i 475 μΐ 3,2 M L-threonin-methylester-acetat fremstilles ved at opløse 100 mg des- (B30-alanin) -svineinsulin i en blanding af 200 μΐ vand og 75 μΐ iseddike, hvorpå der tilsættes 200 mg L-threoniri-methyl-ester. Efter indstilling af pH-værdien på 6,5 med iseddike 30 tilsættes 1 mg svinetrypsin. Blandingen henstår ved stuetemperatur i 2 timer, hvorefter reaktionen afbrydes ved til- 149457 ίο sætning af 5 ml vand og indstilling af blandingens pH-værdi på 3 med 5 N saltsyre.

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser en omdannelse på 78%.

5 Oparbejning af den rene humane insulinmethylester og omdannelsen deraf til humant insulin kan gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 7 1 g L-threonin-methylester opløses i 1 ml vand, og til denne 10 opløsning sættes 200 mg desalanin-(B30)-svineinsulin fremstillet ifølge eksempel 6. Opløsningen indstilles på pH-værdien 6,3 med 450 μΐ iseddike. Der tilsættes 10 mg trypsin, og opløsningen henstår ved stuetemperatur. Efter 20 minutters forløb afbrydes reaktionen ved indstilling af opløsnin- 15 gen på pH-værdien 3 med 1 N saltsyre.

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser et udbytte af human insulinmethylester på 73%.

Eksempel 8 2 g L-threonin-methylester opløses i 2 ml vand, og til denne 20 opløsning sættes 400 ml desalanin-(B30)-svineinsulin fremstillet ifølge eksempel 6. Opløsningen indstilles på pH-værdien 6,2 med 900 μΐ iseddike. Der tilsættes 20 mg formy-leret trypsin, og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter afbrydes reaktionen ved indstilling af 25 opløsningen på pH-værdien 3 med 1 N saltsyre.

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser et udbytte af human insulinmethylester på 69%.

Eksempel 9

En reaktionsblanding indeholdende 200 mg des-(B30-alanin)-30 svineinsulin i 1400 μΐ 2,5 M L-threonin-methylester-acetat fremstilles ved at opløse 200 mg des-(B30-alanin)-svineinsu- 11 U9457 lin fremstillet ifølge eksempel 6 i en blanding af 400 μΐ vand og 180 μΐ iseddike, hvorefter der tilsættes 460 mg L-threonin-methylester. Til den klare opløsning sættes en opløsning af 2 mg svinetrypsin i 300 μΐ vand. Blandingen, 5 som har en pH-værdi på 6,3, henstår ved 25°C i to timer, , hvorefter reaktionen afbrydes ved tilsætning af 10 ml vand og indstilling af opløsningen på pH-værdien 3 med 5 N saltsyre .

Højtryksvæskekromatografisk analyse viser en omdannelse på 10 64%.