JPS58501455A - 人インシユリンまたはそのｂ−３０エステルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人インシュリンまたはその ｍｌ　−３０エステルの製造法 本発明は人インシュリンまたはそのＢ−３０エステルの新規な製造法に関する。

背景技術 長年にわたり、各種のインシュリンがインシュリン依存糖尿病の治療に用いられ て来た。人インシュリンで人間を治療するのが自然である、しかしながら現実の 要求量からみてそれは不可能である。従って実際的な理由から牛および豚インシ ュリンが使用されている。しかしながら程度に大小の差はあれ、これらのインシ ュリンは人体に抗体の形成を生ぜしめる、これは例えばそれ以上のインシュリン 治療の効果の低下をもたらす。

この欠点は一部牛および、／または豚インシュリン中の「不純物」によって、一 部は本来異種のものであることによって生ずるものと考えられる。後者は、アミ ノ酸成分の組成中での幾つかの相違で人インシュリン分子が動物インシュリン分 子と異なることでそれ自体明らかである。

最も新しい精製法の導入後、インシュリン製に関しては大きな改良が得られてい る、しかし人体中での抗体の形成はなお生じつる。これは他の動物インシュリン の代りに大インシュリンを使用することによって克服できると信ぜられる。

（２）　特入昭５８〜５０１４５５　（２）化学的に人インシュリンを製造する ことが知られている、米国特許第３９０３０６８号およびホツペーセイラーの４ Ｐｈｙｇｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、＠　３５７巻＃＄７５９〜７６７頁（１９７６年） 参照。

これらの方法はデスオクタペプチド−（Ｂ２３〜３０）豚インシュリンを大イン シュリン中の位置８２３〜３０に相当する合成オクタペプチドと縮合させること からなる。

しかしながら第一の工程においてアルカリ加水分解を行なっており、これは不都 合な副反応を伴う。第二工程では多くの副反応を生ぜしめる不特定反応を含み、 複雑な精製法を必要としている。従ってこれらの方法は工業的規模での使用に適 していない。

更に米国特許第３２７６９６１号にはスレオニンの存在下に酵素例えばカルボキ シペプチダーゼＡまたはトリプシンの作用によって他の動物インシュリンから人 インシュリンを製造する方法が記載されている。しかしながら、この既知の方法 によって認めうる程度に大インシュリンを作ることは可能であることは証明され ていない。これは多分トリプシン詔よびカルボキシペプチダーゼＡがりジル−ア ラニンペプチド結合（Ｂ２９〜３０）のみならず、作用条件下でインシュリン中 の他の位置も加水分解するという事実に起因している。トリプシンはりジル−ア ラニン結合（Ｂ２９〜３０）よりもアルギニル−グリシンペプチド結合（Ｂ２２ 〜２３）を選択的に加水分解する。しかしながらカルボキシペプチダーゼＡはＡ 鎖のＣ−末端でアスパラギン（３） も分解させることなしにＢ−鎖のＣ−末端でのアラニンを独占的に分解させるこ とができない。後に特定の条件、即ち重炭酸アンモニウムバッファー溶液中での 反応がアスパラギン放出を阻害するために必要であることが示された、ホツベー セイラーのＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　＄　３５９巻第７９９〜８０ ２頁（１９７８年）参照。更にかなりのペプチド形成は、加水分解反応の速度が 作用条件下でペプチド合成の速度より大であることから殆ど生じない。

後に酵素的接触法では反応媒体に有機溶媒を加えることがペプチド結合合成の速 度を増大し、加水分解の速度を減することが知られるようになった、インガルス 等のＢｉｏｔｅｃｂｎ。

Ｂｉｏｅｎｇ、第１７巻第１６２７頁（１９７５年）詔ヨびホマンドバーグ等の Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ第１７巻第５２２０頁（１９７８年）参照。反応媒体 中での溶媒の濃度は高くすべきであり、後の文献中には溶媒として１，４−ブダ ンジオールを用いるとき、最良の結果が８０％の上記溶媒濃度で得られると述べ ている。

これを達成するに当り、５０％より大なる濃度で有機溶媒（ＤＭＦ　）を使用し 、合成オクタペプチド反応成分の過剰（１０：ｌ）を使用して人インシュリンの Ｂ２３〜３０位に相当する合成オクタペプチドでトリプシン接触反応によってデ スオクタペプチド−（Ｂ２３〜３０）インシュリン（ＤＯＩ　）が成功りん結合 された、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　ｇｇｌ　Ｑ　１巻第７５１〜７ ５２頁（１９７９年）参照。結合は有意な（４） な詔高価であり、面どうなものである、何故ならそれはＤｏＩを形成するため豚 インシュリンのトリプシン接触消化を必要とし、更に必要なオクタペプチドは複 雑な合成で製造しなければならないからである。

更にＮａｔｕｒｅ第２８０巻第４１２〜４１３頁（１９７９年）およびＢｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍ、第９２巻第２号第３９６〜４０ ２頁Ｃ１９８０年）には、大インシュリンの半合成製造法が記載されている、こ れによれば豚インシュリンのアラニン−Ｂ３０が触媒としてトリプシンまたはア クロモバクタ−プロテアーゼを使用してスレオニンによって交換される。この方 法においては豚インシュリンを先ずＮ　Ｈ４ＨＣＯ８の存在下にカルボキシペプ チダーゼまたはアクロモバクタ−プロテアーゼで加水分解してデスアラニン−８ ３０インシユリン（ＤＡＩ　）を形成する。ＤＡＩの結合を接触反応させるトリ プシンまたはアクロモバクタ−プロテアーゼは、大過剰の保護されたスレオニン 誘導体、即ち５０：１〜１００：１の比でのスレオニンブチルエステル（Ｔｈｒ −ＯＢｕｔ）　Ｊ６よび高濃度の有機溶媒酌６０％のジメチルホルムアミドとエ タノールの混合物を使用して行っている。かかる条件の下で、アルギニン（Ｂ２ ２）−グリシン（Ｂ２３）結合の分解が大きく減少する。

上述した各記載から米国特許第３２７６９６１号から知られている方法の欠点が 高濃度の有機溶媒中で行なう反応によって克服されることが明らかであり、ひい ては収率の（５） る。しかしながら、反応成分の一つを大過剰に存在させることがなお重要な特長 となっている。多くの提案された最も好適な溶媒は突然変異的な疑いがもたれ、 それらはインシュリン生成物から完全に除去することが困難なことから上記溶媒 の使用はできる限り避けるべきである。

発明の開示 本発明の目的は動物インシュリン、好ましくは豚インシュリンまたはそのデスア ラニン−Ｂ３０誘導体の人インシュリンへの、高収率でかつ有害な有機溶媒を使 用しないでの変換方法を提供することにある。

驚（べきことに、反応媒体中でスレオニン誘導体のモル濃度を一定の高い値以上 に保つとき、触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を用いてインシュリ ン中の８３０位にスレオニンを等することがなめらかに進行することを見出した 。

従って本発明は人インシュリンまたはそのＢ−３０エステルを製造する方法に関 し、この方法では、式（式中Ｒはスレオニン基とは異なるアミノ酸基またはヒド ロキシル基であり、−Ａ−および−Ｂ−は大インシュリンにおけるアミノ酸順序 と同じアミノ酸を有するームー鎖および−Ｂ−鎖を表わす）のインシュリン誘導 体とカルボ牛シおよび場合によってはヒドロキシル保護Ｌ−スレオニン誘導体を 、５０℃以下の温度で、５〜９のｐＨ値で水および（６）　ｎ人間５８−５０１ ４５５　（８）場合によっては有機共溶媒を含有する反応媒体中でトリプシンま たはトリプシン様酵素の存在下に反応させ、続いて所望によっては存在する保護 基を除去することからなり、本発明の方法はＬ−スレオニン誘導体を２〜約６モ ルのモル濃度で反応混合物中に存在させることを特徴とする。上限は個々のスレ オニン誘導体によって決る。

反応媒体中のスレオニン誘導体の濃度の意義は現在まで明らかにされていない。

水性媒体中でのトリプシン接触加水分解およびこれによる副生成物形成は避けら れないことおよび加水分解が水混和性有機溶媒を５０〜９０％含有する媒体によ って抑制されるだけであることが信ぜられていた。

この方法の原動力として、Ｌ−スレオニンとインシュリン化合物の間の高モル比 例えば５：１〜５００　：１を使用することが先に提案されていた。

特に水性反応において、反応混合物中では、Ｌ−スレオニン誘導体およびインシ ュリンの間の大きなモル比は重要性が少なく、インシュリン濃度には殆ど無関係 であるのに、反応混合物中のＬ−スレオニン誘導体の高モル濃度が決定的に重要 であることをここに見出した。

２モル以上のＬ−スレオニン誘導体のモル濃度がＢ２９〜Ｂ３０位でのインシュ リンとアミノ酸の特定反応を生ぜしめ、一方８２２〜Ｂ２３位の加水分解を抑制 する。更にそれはインシュリンの非常に大きい溶解度を生ぜしめる。

Ｌ−スレオニン誘導体が上記高モル濃度で反応媒体中に（７） に添加によって、特に利点は得られない。有機溶媒を加えるとき、添加は反応速 度の低下を避けるため約３０％（Ｖ／Ｖ）以下とすべをである。本発明方法にお いては３〜５のモル濃度で反応媒体中でＬ−スレオニン誘導体を使用することが 好ましい。５より大なるモル濃度は反応混合物の速度の劇的な増を生ぜしめる。

本質的に２モル以下のＬ−スレオニン誘導体のモル濃度は増大した副生成物形成 を生せしめ、インシュリンの低下した溶解度を生ぜしめ、そしてそれに応じて低 い収率を生ぜしめる。

インシュリン反応成分は上記式（Ｉｌの豚インシュリンまたはその誘導体である ことができる。例えば豚インシュリンから誘導されたデスアラニン−Ｂ（３０） インシュリンを使用できる。

Ｌ−スレオニン反応成分は式 ％式％（） （式中〒ｈｒはＬ−スレオニン基であり、Ｒ１は水素またはヒドロキシル保護基 であり　Ｒ２はカルボキシル保護基である）の保護されたＬ−スレオニン誘導体 が好ましい。好ましいＬ−スレオニン誘導体はアルキルエステル例えばメチル、 エチルまたはｔ−ブチルエステルである。

Ｌ−スレオニン誘導体の可能な中和のためおよびｐＨ値を規制するため、鉱酸ま たは低級カルボン酸例えば酢酸またはプロピオン酸を使用できる。蛋白分解酵素 はペプチド中のリジンカルボニル結合を分解する特異性を有すべきであ（８） す、例えば各種起源億からのトリプシン、別のトリプシン誘導体またはアクロモ バクタ−プロテアーゼであることができる。

反応温度は０〜５０℃であることができ、例えば５〜２０℃であることができる 。

反応成分として保護されたＬ−スレオニンを使用するとき、インシュリン生成物 は保護基を含有し、上記基は既知の方法で除去できる。

本発明を下記実施例によって更に示す。

２００１１１１の豚インシュリンをＬ−スレオニンメチルエステル、プロピオネ ートの３．７　Ｍ水溶液１−に溶解した。この混合物に０．０２Ｍの酢酸カルシ ウムの４０μ！中の４岬の豚トリプシンの溶液を加えた、ｐＨ値はプロピオン酸 で６．３に再調整した。その後溶液を２０℃で５時間放置し、その後９−の水を 加え、５Ｎ塩酸でｐＨ値を３に調整して反応を停止させた。

高圧液体クロマトグラフ分析は７５％の変換率を示した。

反応混合物を１Ｍ酢酸でセファデックス（登録商１ｊ）Ｇ−５０スーパーフアイ ンのカラム（２，６Ｘ９０６１１）でゲル濾過した。大インシュリンおよび未反 応豚インシュリンを含有画分を凍結乾燥した。収量：１８０■の生成物混合物。

その後生成物混合物は、塩酸で８．１にｐＨを調整し、０．０２証のトリスおよ び７Ｍの尿素からなるバッファーの７５−（９） ７時間で平衡させたＤＩＡＩ−セルロース（ワットマンＤＩ　−３２）のカラム （５Ｘ２５１）で４℃でイオン交換した。生成物を仕込んだ後カラムを上記バッ ファー溶液で２．５時間溶離し、次いで１１について０．００４５モルの塩化す ）ｔｌｌラムの混合物の形で上記バッファーで２時間、そして最後に１１につい て塩化す）　ＩＪウムの０．０１１モルとの混合物の形で最初に述べたバッファ ーで１２時間溶離した。

溶出液は二つの蛋白質系主画分を含有していた。最初に溶出された画分は高圧液 体クロマトグラフィで大インシュリンエステルとして同定された、その後溶出さ れた両分は未反応豚インシュリンであるとして同定された。

最初に溶出された主画分を０．１Ｍ酢酸でセファデックス（登録商標）Ｇ−２５ のカラムで脱塩し、凍結乾燥して１２０■の人インシュリンエチルエステルを得 た。

分離した大インシュリンエチルエステルを５０−の水に溶解し、ｐＨ値を０，１ Ｍ水酸化す）ＩＪウムで９．５に調整した。

溶液をｐＨ値の制御下７２時間２５℃で放置し、その後インシュリンをそれ自体 知られている方法で結晶化し、アミノ酸分析および高圧液体クロマトグラフィで 同定した。

実施例　２ １　ｆ（ＤＬ−スレオニンメチルエステルを１１１／の水に溶解し、その後１０ ０５ｗの豚インシュリンを加え、混合物をインシュリンが溶解するまで撹拌した 。１０Ｉｌｆのトリプシンをその中に溶解し、混合物を３０分間常温で放置した 。次に反応をＩＮ塩酸でｐＨ値を３に調整して停止した。

（１０）　特人間５８−５１）１４５！１（４）高圧液体クロマトグラフィでの 分析は大インシュリンメチルエステルの２４％の収率を示した。

１ｆのＬ−スレオニンメチルエステルを１ｔＩＩｔの水に溶解した。１００岬の 豚インシュリンを加え、短時間撹拌して溶液にした。この混合物中に１０ｑのト リプシンを溶解し、５分後溶液のｐＨ値を氷酢酸４５０μｌを加えることによっ て６．３に調整した。その後混合物を常温で放置し、２時間後反応をＩＮ塩酸で ｐＨ値３に調整して停止した。

高圧液体クロマトグラフィによる分析は３１％の人インシュリンメチルエステル の収率を示した。

５００■の豚インシュリンを４ＭのＬ−スレオニンメチルエステル、塩酸塩のｐ Ｈ値６．５の２，５０−に溶解した。ｐＨ値を３００μｌの５Ｎ塩酸で６．３に 調整後、Ｉ　Ｑ　Ｏｐｉの００２Ｍ酢酸カルシウム中の１０ｑのトリプシンの溶 液を加え、反応混合物を８℃で６５時間放置した。次に反応を２５−の水を加え 、５Ｎ塩酸でｐＨ値を３に調整して停止した。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は４３％の変換率を示した。

実施例　５ ７５０μｌの１０Ｍ酢酸中に２００■の豚インシュリンを溶解し、それに１２の Ｌ−スレオニンメチルエステルを加えて、２００ｇｑの豚インシュリンを含有す るＬ−スレオニンメチルエステルアセテートの５Ｍ溶液１．５−を作った。

（１１） ２１１１Ｆの豚トリプシンを加え、ｐＨ値６．３を有する透明反応混合物を２０ ℃で放置した。反応は９０時間後、１５ｍの水を加え、５Ｎ塩酸でｐＨ値を３に 調整することによって停止させた。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は８５％の変換率を示した。

実施例　６ ２ｙの亜鉛不含豚インシュリンを２００−の０．２Ｍ重炭酸アンモニウム中に溶 解し、アンモニア水でｐＨ値８４に調整した。固体トリス数粒子によって４−の 水に２０■のカルボキシペプチダーゼＡを溶解し、インシュリン溶液に加え、こ れを次いで２０℃で２．５時間放置した。溶液をスピン凍結し、凍結乾燥した。

凍結乾燥した粉末を８０ｄの１Ｍ酢酸に溶解し、同じ媒体で、セファデックス（ 登録商１１Ａ　）　Ｇ　−５０ｘ−ハーフフィンで充填したカラム（５Ｘ９０Ｑ ＩＩ）でゲル沖過した。インシュリン含有画分を凍結乾燥した。これによって１ ８００■のデス−（Ｂ２Ｏ−アラニン）豚インシュリンを得た。

実施例　７ ３．２ＭのＬ−スレオニンメチルエステルアセテ−）４７５μｌ中に１１００１ １Ｉのデス−（Ｂ２Ｏ−アラニン）豚インシュリンの溶液を、２００　ｔｌｉの 水および７５μｌの氷酢酸の混合物中に実施例６で作った１００岬のデス−（Ｂ ２Ｏ−アラニン）豚インシュリンを溶解し、次いで２００岬のＬ−スレオニンメ チルエステルを加えて作った。氷酢酸でｐＨ（１２） 値を６．５に調整した後、１岬の豚インシュリンを加えた。

混合物を２時間常温で放置し、その後５１１／の水を加え、５Ｎ塩酸を加えてｐ Ｈ値を３に規制して反応を停止させた。

高圧液体クロマトグラフ分析は７８％の変換率を示した。

純粋の大インシュリンメチルエステルの処理およびその人インシュリンへの変換 は実施例１の方法に従って行なうことができた。

実施例　８ １ＰのＬ−スレオニンメチルエステルを１１１Ｉｌの水に溶解し、実施例６によ って作った２００■のデスアラニン（Ｂ−３０）豚インシュリンをこの溶液に加 えた。溶液のｐＨ値を４５０μｌの氷酢酸で６．３に調整した。１０ｔＩｇのト リプシンを加え、溶液を常温で放置した。２０分後反応をＩＮ塩酸でｐＨ値を３ に調整して停止した。

高圧液体クロマトグラフ分析は７３％の人インシュリンメチルエステルの収率を 示した。

実施例　９ ２２のＬ−スレオニンメチルエステルを２１１１１１！の水に溶解し、この溶液 に実施例６て作った４００ｑのデスアラニン（Ｂ−３０）豚インシュリンを加え た。溶液のｐＨ値を９００μｌの氷酢酸で６．２に調整した。２０岬のポルミル 化トリプシンを加え、溶液を２時間常温で放置した。その後反応を１Ｍ塩酸でｐ Ｈ値を３に調整して停止した。

高圧液体クロマトグラフ分析が６９％の人インシュリンメチルエステルの収率を 示した。

（１３） ２．５ＭのＬ−スレオニンメチルエステルアセテート中の２００岬のデス−（Ｂ −３０アラニン）豚インシュリンを含有する反応混合物を、４００μｌの水およ び１８０　ｐｌの氷酢酸の混合物中に実施例６により作った２００岬のデス−（ １−３０アラニン）豚インシュリンを溶解し、次いで４６０岬のＬ−スレオニン メチルエステルを加えて作った。

透明溶液に、３００μｌの水中の２岬の豚トリプシンの溶液を加えた。ｐＨ値６ ，３を有する混合物を２５℃で２時間放置した。その後反応を１０−の水を加え 、５Ｎ塩酸でｐＨ値３に調整して停止した。

高圧液体クロマトグラフ分析は６４％の変換率を示した。

実施例　１１ 実施例で作った１００■のデスーＢ３０−アラニン豚インシュリンを１６０μｌ の水、４０μｌの無水エタノール詔よび７５μｌの氷酢酸の混合物に溶解し、そ の後２００■のＬ−スレオニンメチルエステルを加えた。ｐａｅ、ｓを有する透 明溶液に、５．１■の豚トリプシンを加えた。混合物を常温で２時間放置し、そ の後反応を５−の水を加え、５Ｎ塩酸でｐＨ値３に調整して停止した。

高圧液体クロマトグラフ分析は８０％の収率を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、）リプシン様蛋白質分解酵素の存在下、水および場合によって有機共溶媒を も含有する反応媒体中で、ｐＨ５〜９、温度５０℃以下で式 （式中Ｈはヒドロキシル基またはスレオニンとは異なるアミノ酸基であり、−ム ー怠よび−Ｂ−は大インシュリンと同じアミノ酸順序を有するＡ−鎖およびＢ− 鎖を表わす）のインシュリン誘導体とカルボキシＪＩ４護したそして場合によっ てヒドロキシル保護したＬ−スレオニン誘導体を反応させ、続いて所望によって 存在する保護基を除去することによって人インシュリンまたはそのＢ−３０エス テルを製造する方法において、Ｌ−スレオニン誘導体を反応混合物中に２〜約６ のモル濃度で存在させることを特徴とする方法。 ２、Ｌ−スレオニン誘導体が３〜５のモル濃度で反応混合物中に存在する請求の 範囲８１項記載の方法。 ３、使用するインシュリン誘導体が豚インシュリンより誘導されたデスアラニン −Ｂ３０インシュリン（ＤＡＩ　）であ＼ る請求の範１１１Ｆｊ１項または１ｇ２項記載の方法。 ４、Ｒがアラニンを表わす豚インシュリンを使用する請求の範ｉ！ｌｌｌ１項ま たは第２項記載の方法。 ５、Ｌ−スレオニン誘導体がＬ−スレオニンのメチル、工千ルまたはｔ−ブチル エステルである請求の範囲第１項〜（１５） ４４項記載の方法。 ６、蛋白質分解酵素がトリプシンである請求の範囲第１項〜第５項記載の方法。 ７、反応を０〜２０重量％の有機共溶媒を含有する水性媒体中で行なう請求の範 囲第１項〜第６項記載の方法。 ＆　共溶媒が炭素原子数１〜４を有するアルカノールである請求の範囲第７項記 載の方法。 ９、有機共溶媒を使用しない請求の範８第１項〜第７項記載の方法。 （１）