JPH02131594A - デ‐ｂ３０‐インシュリンおよびデ‐ｂ３０‐インシュリン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病の治療には相当な量のヒトインシュリンが必要と
される。

ヒトインシュリンは工業的には主としてブタインシュリ
ンから出発する半合成法Ｋよって得られる。ブタインシ
ュリンはインシュリンＢ鎖のＣ末端における単一のアミ
ノ酸だけがヒトインシュリンと異なっている．すなわち
、８５０位はブタインシュリンではアミノ酸アラニン（
Ａｌａ）によって占められそしてヒトインシュリンでは
アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）によって占められている
。そしていずれの場合においてもＬ体としてである。

従ッテ、ブタインシュリンから出発して、Ｂ３０　Ａｌ
ａをＴｈｒで置換することによりヒトインシュリンが得
られる。この置換は本質的に、２つのカテゴリーの方法
によって行われる。すなわち，「ワン管ポット法」（Ｏ
ｎθ−ｐｏｔ　ｐｒＯｃｅｓ８　）と「２工程法Ｊ　（
　ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　）とであ
る。

「ワン一ポット法」では、ブタインシュリンのＢ３０−
Ａｌａ残基は単一の工程でＴｈｒ残基によって置換され
る（ペプチＰ転移（　ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｃｌａｔｉ
ｏｎ））。

「２工程法」では、第一工程でＢ３０−Ａｌａ残基が除
去され（タンパク質分解（　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　
）、そして別の第二工程でＴｈｒ誘導体が連結される（
カップリング反応）。

「ワンーポット」および「２工程」法のいすれＫおいて
もアミノ酸Ｔｈｒ　Ｖｉ（保謹基を有する）誘導体の形
で普通用いられるのでペプチド転移カップリング後にそ
れら保護基を除去する必要がある。

ブタインシュリンからの「２工程法」の第一工程で形成
されるデ（ｄｅ）　−　Ｂ３０−Ａｌａ−ブタインシュ
リンは、その生物活性上ブタインシュリンとほとんど差
異はない。この第一工程は酵素、例えばカル〆キシペプ
チダーゼＡの存在下で通常は行われる。しかしながら，
それらの酵素は、（目的とする）　Ｂ３Ｄ　Ａｌａの除
去のみならず（目的としない）Ａ鎖のＣ末端アスパラギ
ン（Ａ２１Ａｓｎ　）の除去も引き起こしてしまう。こ
うした理由から、Ｅ３０　Ａｌａの除去がなるべく完全
となシ、Ａ２１　Ａｓｎへの攻撃が々るべ〈ゼロに近く
なるように反応条件を選択する必要がある。Ｅ．Ｗ．Ｓ
ｃｈｍ１ｔｔおよびＨ．Ｇ．　Ｇａｔｔｎｅｒ　．　Ｈ
ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．　
Ｃｈｅｍ．　ｖｏｌｔｕｎｅ　３５９、ｐａｇｅｓ　７
９９〜８０２（１９７８）によれば、この目的ＦｉＮＨ
ａ＋イオンの存在によって達せられる。この引用文献Ｋ
含まれた手順に従えば、その方法は、アルカリ性領域（
詳細にはＰＩ−１８．５）Ｋあり、そして基質！１度の
低い（詳細ｋはブタインシュリン５η／Ｍｌ）の水性溶
液中で行われる。

使用酵素はカルボキシペプチダーゼＡであシ、そして酵
素／基質比は１　：１００（重量部）である。

しかしながら、Ｂ３０　Ａｌａ除去と拮抗するＡ２１　
−ＡＳｎ除去＃ｉＮＨ４＋イオンの存在によってさえも
、明らかに児全には、あるいはとにかく望ましい程度に
全面的には抑えられない。このことは、例えばＥＰ−Ａ
α０１７，９３８から明らかである。そこにＦｉＥ．Ｗ
−　Ｓｃｈｍｉｔｔお工びＨ．Ｇ．　Ｇａｔ．ｔｎｅｒ
　（１０ｃ．ｃｉｔ．）の手順を用いた例がいくつか含
１れているが、結果が定かでなかったり、あるいは相当
割合のデ−Ａ２１　−　Ａｓｎ一生成物が依然として得
られた。

実施例１　（　１２／１３頁）では、ブタインシュリン
（５００１Ｎ？）をＰｌ！　８．　３の水性溶液中、１
くテｄ４ＨｃＯ３の存在下、基質濃度を５■／庚１（酵
素：カルがキシベプチダーゼＡ）として転化率が７７％
Ｋなる甘で反応させている。報告された収率は４６０１
９＝９２優であった。しかしながら、仮りに反応が７７
係転化率Ｋ到るまでのみ行われたとして、純理論的に、
わずか約３８５岬という最大量（ブタインシュリン使用
量の７７４）のデ−Ｂ３０−Ａｌａ生成物よりも多量に
生成させることは不可能である。従ってこの実施例は有
効でなく、またＡ２　１−Ａｓｎの抑制が実際ｋ行われ
たという結論を引き出すことはできない。

前記ＥＰ−Ａの第１６頁の第１７ぐラグラフの実施例は
、これＫ対しより有効である。この実施例では２００η
のウシインシュリンを水性ＮＨａＨＣＯ３緩衝液中、５
■／ｄの基質濃度でカル？キシペプチダーゼＡとインキ
ユペートしそして一夜放置している。これにより、７８
俤のデ−Ｂ３０−Ａｌａ−ウシインシュリンと２２憾の
デ−Ｂ３〇一Ａｌａ−デ−Ａ２１　−　Ａｓｎ−ウシイ
ンシュリンとより成る１８０ｑの生成物が得られたと記
載されている。

ウシおよびブタインシュリンとはＡ鎖の８位および１０
位が異なるだけである。従って、Ｂ３Ｑ−Ａｌａおよび
Ａ２１−Ａｓｎの除去ｋ関してはウシおよびブタインシ
ュリンの間Ｋ差はないと考えることができる。

デ一８３０　−　Ａｌａ−ブタインシュリンの製造につ
いてＥ．Ｗ．　Ｓｃｈｍｉｔ，ｔおよびＨ．Ｇ．　（｝
ａｔｔｎｅｒの手順を我々自身で反復したところ、得ら
れたデ−Ｂ３０−Ａｌａ−デ−Ａ２１　−　Ａｓｎ−ブ
タインシュリンの割合は、前記ＥＰ−Ａから予測される
オーダー（１６％）であった。

ブタインシュリンからのＢ３０−Ａｌａの既知の除去方
法を改良すること、そしてまた特Ｋ　Ｂ３０　−Ａｌａ
除去と競合するＡ２１−Ａｓｎ除去を一層抑制すること
を目指していたところ、今般、ＮＨａ＋イオンの非存在
下Ｋ，そして従来よりも高い基質濃度、すなわち５塾値
を超える濃度で実施することＫよりこのことが可能であ
ることを麦出した．更に、本方法はブタインシュリンだ
けでなく、他のインシュリンそしてインシュリン誘導体
に対しても、またＢ２９　ＩＣ続く全ペプチド残基（　
ｒ　Ｅ３０ペプチド残基」）が除去される天然首たは非
天然インシュリン前駆体に対しても機能する。

本方法によれば、完全な基質転化をもって、またＡ２１
−Ａ釘除去な弗小限に抑えつつ、実質的に１００％のＢ
３０−アミノ酸またはＢ３０−ペプチド残基除去率を得
ることができる。このため、そして壕た基質濃度が高い
ことから、９／時収率Ｆｉ既知方法Ｋ比べ相当に増大す
る。最後に加えて、インシュリンの変性知向を高め、そ
して既知方法、％Ｋ　ＮＨａＨＣＯｓの存在下に行われ
る方法の場合によく生じるあの不快な発泡は回避される
。

本方法に成功し発展させたことは極めて驚くべきことで
ある。何故ならば、Ｅ．Ｗ．　Ｓｃｈｎ＋ｉｔｔおよび
Ｈ．Ｇ．　Ｇａｔｔｎｅｒ　（　ｌｏｃ．　ｃｉｔ　）
の引用文献Ｋ基づいて、轟該方法の改良をＮＨａ＋イオ
ンの非存在下に達成し得ることは予測し得なかったから
である．この場合の方法の改良は、明らかにＮＨａ　”
イオンを存在させないと共に従来技術よりも高い基質濃
度としたことによって得られたものである． 本発明は、７を超える（すなわちアルカリ性領域の）Ｐ
Ｈ値の水性溶液中で、インシュリンまたはインシュリン
誘導体から門０アミノ酸をそして天然および非天然イン
シュリン前駆体がらＢ３０ベプチド残基を醇素的に除去
することによるデ一Ｂ３０−インシュリンおよびデ−Ｂ
３０−インシュリン誘導体の製造方法であってその酵素
的除去をＮＨ４＋イオンの非存在下に、そして５―を超
えるインシュリン出発物質濃度で行うことより成る前記
製造方法に関する。

本発明方法のインシュリン出発物質として基本的Ｋ適し
ているのはすべての可能な動物インシュリンおよびヒト
インシュリンであるがこの関連で後者を用いる意味はほ
とんどない。動物インシュリンの例は、ブタ、ウシ、イ
ヌ、マッコウクジラ、ナガスクジラ、ヒツジ、ウマおよ
びウサギ由来のインシュリンである。好ましい動物イン
シュリンは、ヒトインシュリンのＡＩ−Ａ２１およびＢ
１−Ｂ２９配列を有するもの（ブタ、イヌ、マッコウク
ジラ、ナガスクジラおよびウサギ由来のインシュリン）
であり、特に好ましい田発物質はブタインシュリンであ
る。

前記インシュリンはそれらの誘導体の形で用いることも
できる。そのようなものとして適しているのは塩類、コ
ンプレックス、保護基な有するインシュリン、Ｂ＠着た
はＡ＠のＮ末端のアミノ酸が除去されたインシュリン（
例えばデ−　Ｐｈｅ　−　Ｂ１−ブタインシュリン、デ
−ＧＩＹ−ＡＩ−ブタインシュリン）などである。

２個以上のアミノ酸より成る更なるペプチド残基がＢ２
９に接続した天然および非天然インシュリン前駆体をイ
ンシュリン出発物質として用いることもでき、その場合
にもやはりヒトインシュリンのＡＩ−Ａ２１およびＢ１
　−　Ｂ２９配列を有する生成物が好ましい。天然およ
び非天然インシュリン前駆体の例は、ブタプロインシュ
リン、ブタプレプロインシュリン、サルプレプロインシ
ュリン、および遺伝子工学により修飾されたそれらの変
釉、およびＢ３１−Ａｒｇ−インシュリンおよびＢ５１
　−　Ｂ３２−ノーＡｒｇ−インシュリンである。

本方法に用いることのできる酵素は、カルゲキシペゾチ
ダーゼ、およびこのタイプの８３０　−アミノ酸除去に
対して知られるプロテアーゼである。カルゲキシペプチ
ダーゼＡ，リジルエンドペプチダーゼ，アクロモパクタ
ー（　Ａｃｈｒｏｍｏ−ｂａｃｔｅｒ　）プロテアーゼ
が好ましい。

それら酵素は単独で、あるいは相互に混合して、また遊
離状態で、あるいＦｉ川体に固定して用いることができ
る。

使用酵素活性対インシュリン出発物質比は広い範囲にわ
たって変えることができる。約０００１〜１Ｕ（＝単位
）／η、特に約０．００５〜０．２　Ｕ／ｍｇの比が好
ましい。酵素活性は既知の方法Ｋよって測定され、例え
ばカルポキシペプチダーゼＡのそれはＮ−ペンゾイルグ
リシルーＬ−７エニルアラニンを用いて、リジルエンド
２＜プチダーゼのそれはアセチルリジンメチルエステル
を用いて測定される． 反応は７を超える一位の、すなわちアルカリ性領域の水
性媒駕中で行われる。声上限は約１０である。好ましい
一範囲は、約８〜９．５、特に約９〜９．５である。

水性溶液また＃′ｉ懸濁液のＰｌ｛Ｆｉ無機および／１
たは有機塩基、例えばＮａＯＨ　，　ＫＯＨ、（Ｃ２Ｈ
５）３Ｎ、ｎ−ＣａＨ９ＨＨ２、Ｎ−ｚチｋ　｛−　／
Ｌ／ホリンなどの添加Ｋより調節することができる。

インシュリン出発物質の＃度は約５■／ａｄ（反応媒質
）よク高くなければならない。基＊ｍ度の上限は約５０
０η／Ｒｌである。好ｔＬＭ基質濃度は約７０〜２５０
■〜、特に約８０〜１２０キ／ａｔである。高濃度でＦ
ｉ，Ｈをやや高目の値に調節することも必要である。伺
故カらぱ、インシュリン出発物質は一値が低いと溶解し
にくくなるからである。

反応温度に通常約０〜５０℃、好ましくは約２０〜６０
℃であり、反応時間は酵素の量および反応時間に依存す
るが一般に約５〜２４時間である。

本発明方法Ｋおいて、出発インシュリンからの生成物と
して相当するデ−Ｂ３０−インシュリンが高収率で得ら
れ、そして出発インシュリン誘導体からは相当するデ−
Ｂ３０一化合物が得られる。後者＃ｉ所望により、常法
によって特定のデ−Ｂ３０−インシュリンに転化するこ
ともできる。全Ｂ３０ペプチド残基の除去による天然お
よび非天然インシュリン前駆体からの生成物も同じく相
当するデ−Ｂ３０−インシュリンである。

目的生成物は好着しくは等電点で沈殿させることにより
、あるいは亜鉛塩として単離される。

デ−Ｂ３０−インシュリンおよびーインシュリン誘導体
は場合によっては、そのままで抛尿病の治療に用いるこ
とができ、あるいは冒頭で記載した「２工程法」の第二
工程に用いることができる。

以下の比較例は、従来技術と比較することにより本発明
の驚くべき性質および長所を示すためのものである。比
較例の次に多くの本発明の通常の実施例を示す。

比較例 比較例は、Ｅ．Ｗ．　ＳｃｈｍｉｔｔおよびＨ．Ｇ．　
Ｇａｔｔｎｅｒ（　ｌｏｃ．　ｃｉｔ．　）の引用文献
の手順Ｋ従って、着たそれにわずかな修正を加えて行つ
九。結果を次表Ｋまとめて示す。

実験１でｕ　ｇ．Ｗ．　ＳｃｈｍｉｔｔおよびＨ．Ｇ．
　Ｇａｔｔｎｅｒの手順を反復した。

実験２では、ＮＨｎＨＣＯｓ　Ｋ代えて、実験１と同じ
ｐｉ−１（＝８．５）に丁度達するのに十分々ＮａＯＨ
を用いた。相当に高割合のデ−Ａ２１　−　Ａｓｎ一生
成物が得られた。

実験３でもＮａ　ＯＨを用ｂたがーＦｉｂ（分高目とし
た。結果はやはり相邑に好！シ〈ないものであった。

＃適な結果は本発明による実験４において達成された。

本発明の実施例 実施例　１ ５２のブタインシュリンを６０１１７の水に＠濁し、そ
して１Ｎ水酸化ナ｝　ＩＪウム溶液をｐＨ９．２となる
まで添加して溶解する。５５０Ｕのカルがキシペプチダ
ーゼＡを添加後、２３℃で１５時間インキユペーション
する。反応混合物を５℃に冷却し、そして濃酢酸の添加
によりｐＨ　５．　８に調節する。水１２．５１ｊ中の
酢酸亜鉛１ｆを添加後、−５．７で沈殿させる。ＨＰＬ
Ｃ　Ｆ′ｉ、単離生成物が９６．５％のデ−８３０−イ
ンシュリンを含有していることを示す。

実施例　２ １Ｆのブタインシュリンを４ｄの水に懸濁後、３３４１
強度水酸化ナトリウム溶液の添加Ｋより溶解する。ｐＨ
　９．　２で、５ｏμｔのカルｒキシペプチダーゼＡ懸
濁液を添加し、そして２２℃でインキュペーションを行
う。２４時間後のＨＰＬＣは転化が完全であることを示
す。５１の水で希釈後、一を濃酢酸で３．６に調節しそ
して２　０　ｔｈｌのエタノールおよび水５ｍ１／Ｋ溶
解された酢酸亜鉛３８５Ｎを添加する。ｐＨ　６．　０
で２５優強度アンモニア溶液による沈殿、炉過および乾
燥を行５。デ−８３０−インシュリンへの転化率は９８
憾であった。

実施例　３ １ｔのブタインシュリン亜鉛塩を１０１／の水に懸濁し
、そして６３憾強度水酸化ナトリウム溶液で〆ｌ９．３
に調節することによシ溶解する。

その溶液ＦｉｔｏｑのＥＤＴＡ　（　＝−エチレンゾア
ミン四酢酸）の添加後澄明となる。５０μｔの力ルポキ
シペプチダーゼＡ懸濁液を２２℃で攪拌添加することに
より反応を開始する。ＨＰＬＣモニタリングＫよシ、反
応を至適転化率で止め、生成物を実施例２と同様にして
単離する。エタノールに代えてメタノールを用いる。デ
−８３０−インシュリンへの転化率はＨＰＬＣによれば
９９チであった。

実施例　４ １ｆのブタインシュリンを水酸化カ　リウム溶液を用い
て実施例１と同様に反応させる．ＨＰＬＣ　Ｋよるデ−
Ｂ３０−インシュリンへの転化率Ｆｉ９　８．　５俤で
あった。

実施例　５ １ｔのブタインシュリンを４１の水に懸濁しそして濃水
酸化ナトリウム溶液を用いて…９．　０で溶解する。２
　０　Ｕ　（　ＡＬＭ　＝アセチルリジンメチルエステ
ル）のりジルエンドベプチダーゼの添加により反応を２
２℃で開始する。２３時間後のアラニン測定Ｆｉ９４％
除去を示す．５Ｎの水で希釈し、酢酸で酸性化すること
にょりＰ｝１５．４で沈殿させ、単離しそして乾燥する
。

実施例　６ １ｖのブタインシュリンを４　ａｔの水Ｋｌｌ［ｌｔ，
、そしてＮ一エチルモルホリンの添加によりｐ｝１９．
５で溶解する。以後の手順は実施例５Ｋ記載のとおシで
ある。デ−Ｂ３０−インシュリンへの＆化率は９８俤で
あった。

実施例　７ １？のブタインシュリンを１２７の水に懸濁し、そして
３３４強度水酸化ナトリウム溶液の添加により溶解する
。中性押体に固定された２　０　Ｕ　（ＡＬＭ）のりジ
ルエンドペプチダーゼを一９．５で添加し、そしてその
混合物を２３℃に２４ｈ放置する。ＨＰＬＣによる転化
率は９２４である。

実施例　８ １？のブタインシュリン亜鉛塩を１２１Ｒｌの水に懸濁
し、そして５０Ｍ９のＥＤＴＡを添加したトリエチルア
ミンで…９．３に調節することにより溶解−ｔ−ル。１
１０Ｕのカル？キシペゾチダーゼＡの添加により反応を
開始する。１５ｈ後のデ−Ｂ３０一インシュリンへの転
化率は９　４．　６　１であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）７を超えるｐＨ値の水性溶液中で、インシュリンま
   たはインシュリン誘導体からＢ３０アミノ酸を、そして
   天然および非天然インシュリン前駆体からＢ３０ペプチ
   ド残基を酵素的に除去することによるデ−Ｂ３０−イン
   シュリンおよびデ−Ｂ３０−インシュリン誘導体の製造
   方法であつて、その酵素的除去をＮＨ＿４＾＋イオンの
   非存在下にそして５ｍｇ／ｍｌ（反応混合物）を超える
   インシュリン出発物質濃度で行うことより成る前記製造
   方法。 ２）ヒトインシュリンのＡ１−Ａ２１およびＢ１−Ｂ２
   ９配列を有するインシュリンまたはインシュリン誘導体
   および天然または非天然インシュリン前駆体から出発す
   る請求項１記載の方法。 ５）ブタインシュリンから出発する請求項１または２記
   載の方法。 ４）酵素的除去に用いられる酵素がカルボキシペプチダ
   ーゼＡ、リジルエンドペプチダーゼ、アクロモバクター
   プロテアーゼおよび／またはトリプシンである請求項１
   〜３のいずれかに記載の方法。 ５）酵素活性対インシュリン出発物質比が約０．００１
   〜１Ｕ／ｍｇ、好ましくは約０．００５〜０．２Ｕ／ｍ
   ｇに調節される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６）インシュリン出発物質濃度が約７０〜２５０ｍｇ／
   ｍｌ、特に約８０〜１２０ｍｇ／ｍｌ（反応混合物）で
   ある請求項１〜５のいずれかに記載の方法。