CN103467594A - 胰岛素修饰物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胰岛素修饰物，包括胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链；所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素，所述胰岛素B链第30位的丙氨酸被切除，胰岛素与脂肪酸链之间以酰胺键连接。这种胰岛素修饰物在进入体内之后，能因脂肪酸长链的疏水作用而形成疏水团，促进胰岛素蛋白的纵向排序，构成由分子间作用力主导的链状聚多聚体。这种聚多聚体比起单体胰岛素，半衰期大大提高，具有良好的缓释效果；同时这种胰岛素修饰物中不含有具有免疫原性的其他蛋白质，安全性能较高。本发明还公开了上述胰岛素修饰物的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种胰岛素修饰物及其制备方法和应用。
背景技术
1999年的一项统计（数据来自Veterinary Medical Database VMDB）表明犬猫糖尿病发病率在1970到1998这28年间从0.2％上升到1％，且上升趋势越见明显。几乎100％的犬和50％的猫，都是I型(胰岛素依赖性)糖尿病。患猫的另50％是Ⅱ型(非胰岛素依赖性)糖尿病。在众多治疗糖尿病的方法中，胰岛素注射是最主要和最直接的方法。自1922年成功应用于临床之后，胰岛素历经了80年的发展。最初的第一代胰岛素是从动物（猪/牛）体内提取，到1942年第二代胰岛素是通过大肠杆菌等系统生物合成人序列的胰岛素，而现在的第三代重组胰岛素类似物，通过对胰岛素序列进行氨基酸替换，或特定位点进行化学修饰而赋予了药物特殊的优化功能。它治疗了众多糖尿病患者，同时也为医药行业带来了极为丰厚的经济效益。
胰岛素衍生物因其能通过各种化学修饰实现缓控释等功能，一直被研究较多，但是胰岛素衍生物用于动物糖尿病的治疗一直未见报道。
目前应用于宠物糖尿病常用的胰岛素药物除人用胰岛素制剂（NPH低精蛋白锌混悬液,PZI鱼精蛋白胰岛素,Lente锌胰岛素混悬液,Glargine甘精胰岛素类似物等）外，主要有两种专为动物设计的胰岛素制剂。一种是美国默克医药集团的猪锌胰岛素混悬液（商品名为Vetsulin），该胰岛素制剂为35%无定型性和65%结晶性猪胰岛素组成的混悬液。另一种是德国勃林格翰医药公司的鱼精蛋白重组人胰岛素悬浮液（商品名为Prozinc）。这两种动物专用胰岛素药物均已获FDA美国药监局获批上市。
这两种胰岛素药物的主要局限性在于，它们的缓释效果非常有限。Vetsulin通过控制胰岛素晶型配比实现一定程度的缓释，因为胰岛素结晶态比无定型态溶解速度慢，因此药物在进入体内之后能实现两次释放过程，从而延长药效；Prozinc通过加入鱼精蛋白实现缓释，因为鱼精蛋白是碱性蛋白，能保持胰岛素进入体内后的电中性，延缓其作用过程。但是上述两种缓释机制的效果有限，其起效时间在14-24小时之间，作为宠物用产品便利性不够。另外Vetsulin结晶状态的不稳定，Prozinc鱼精蛋白的免疫原性都可能影响药物的安全使用。
因此，目前尚未有一种用于动物糖尿病的治疗的具有良好的缓释效果和较高安全性能的胰岛素修饰物。
发明内容
基于此，有必要提供一种用于动物糖尿病的治疗的具有良好的缓释效果和较高安全性能的胰岛素修饰物，及其制备方法和应用。
一种胰岛素修饰物，包括胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链；
所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素，所述胰岛素B链第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：
Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端，m为6～32的整数。
一种胰岛素修饰物的制备方法，包括如下步骤：
提供胰岛素，并使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素，所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素；
将结构式为(CH2)m(COOH)2的化合物A溶解在甲醇中，在碱存在的条件下进行皂化反应，接着将产物溶于HCl酸化的庚烷中，重结晶后得到结构式为CH3OOC(CH2)mCOOH的化合物B，其中，m为6～32的整数；
将所述化合物B和足量的具有如下结构式的化合物C溶解在THF中，在催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发除去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为具有如下结构式的化合物D，
将所述化合物D与足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在所述催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到的固体残余为具有如下结构式的化合物E，
谷氨酸-1-甲酯
将所述化合物E、足量的具有如下结构式的化合物F和足量的具有如下结构式的化合物G溶解在二氯甲烷中，冰浴冷却条件下搅拌20h，过滤保留液相并真空干燥，得到具有如下结构式的化合物H，
将所述修饰过的胰岛素溶于碳酸钠的水溶液中得到第一溶液，同时将所述化合物H溶于乙腈中得到第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合，30min后用乙醇胺终止反应，向反应体系中加水并调节pH为5.5产生沉淀，保留沉淀并将该沉淀重新溶解后与等体积的0.2mol/L的NaOH溶液混匀进行皂化反应，反应完成后调节pH为5.5，保留沉淀，分离纯化后得到所述胰岛素修饰物，所述胰岛素修饰物包括所述胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端。
在一个实施例中，使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素的操作为：
将胰岛素锌盐溶解在水中并用质量浓度为33%的NaOH调节pH为9.3，接着按照所述胰岛素锌盐与EDTA的质量比为100：1加入EDTA，混匀后在室温、搅拌的条件下，按照羧基肽酶A和所述胰岛素锌盐质量比为0.5:100，加入所述羧基肽酶A的悬浮液，15h后加水稀释并用浓醋酸调节pH为3.6，接着加入甲醇和醋酸锌的水溶液，最后用浓氨水调节pH为6.0，过滤后保留沉淀，即为所述修饰过的胰岛素。
在一个实施例中，所述得到固体残余为具有如下结构式的化合物D的操作中，所述化合物B和所述化合物C的摩尔比为0.91：1.1，所述催化剂为N,N-二异丙基乙胺，所述催化剂与所述化合物C的摩尔比为1：1；
所述化合物D与所述谷氨酸-1-甲酯的摩尔比为1：1，所述催化剂与所述化合物D的摩尔比为1：1。
在一个实施例中，所述得到具有如下结构式的化合物H的操作中，所述化合物E、所述化合物F和所述化合物G的摩尔比为1：1：1。
在一个实施例中，所述分离纯化后得到所述胰岛素修饰物的操作中，所述修饰过的胰岛素和所述化合物H的质量比为200：37.9。
一种胰岛素修饰物的二价金属离子复合物，包括上述的胰岛素修饰物形成的六聚体，所述六聚体结合了二价金属离子。
在一个实施例中，每个所述六聚体结合2个锌离子、3个锌离子或4个锌离子。
一种用于糖尿病的治疗的药物组合物，包括上述的胰岛素修饰物以及药学上可接受的载体。
在一个实施例中，所述药物组合物用于治疗猫犬糖尿病。
这种胰岛素修饰物在进入体内之后，能因脂肪酸长链的疏水作用而形成疏水团，促进胰岛素蛋白的纵向排序，构成由分子间作用力主导的链状聚多聚体。这种聚多聚体比起单体胰岛素，半衰期大大提高，具有良好的缓释效果；同时这种胰岛素修饰物中不含有具有免疫原性的其他蛋白质，安全性能较高。
附图说明
图1为一实施方式的胰岛素修饰物的二聚体的示意图；
图2为一实施方式的胰岛素修饰物的六聚体的示意图；
图3一实施方式的胰岛素修饰物的在中性条件下长链六聚体多聚物的示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种胰岛素修饰物，包括胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链。
胰岛素选择猪胰岛素或犬胰岛素。之所以选择猪胰岛素或犬胰岛素，一方面考虑到本发明的设计初衷是提供一种动物用药，采用动物源胰岛素具有较高的亲缘性。此外，猪胰岛素和犬胰岛素结构上较为接近，尤其是二者B链末端结构几乎一致，便于后续修饰处理。
胰岛素B链第30位的丙氨酸被切除，脂肪酸链与胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：
Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH。
其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端，m为6～32的整数。
将猪/犬胰岛素B链末端去除30位丙氨酸后，对该末端进行化学修饰，以酰胺键与带有羧酸基团的脂肪酸长链相连。
如图1～图3所示的胰岛素修饰物，其中长线条代表脂肪酸长链，椭圆球代表胰岛素。这种胰岛素修饰物会因为脂肪酸长链的疏水作用而发生聚合，并且在不同条件下形成不同类型的聚合物，从而大大提高其半衰期。在中性条件（pH为7.4）下，可以形成长链六聚体多聚物。
这种胰岛素修饰物在进入体内之后，能因脂肪酸长链的疏水作用而形成疏水团，促进胰岛素蛋白的纵向排序，构成由分子间作用力主导的链状聚多聚体。这种聚多聚体比起单体胰岛素，半衰期大大提高，可使药物的起效时间延长到36小时以上。
此外，这种胰岛素修饰物中不含有具有免疫原性的其他蛋白质，安全性能较高。
结合体图2和图3，本发明还提供一种胰岛素修饰物的二价金属离子复合物，包括上述的胰岛素修饰物形成的六聚体，该六聚体结合了二价金属离子。
在一个较优的实施例中，上述胰岛素修饰物的二价金属离子复合物中的每个六聚体结合2个锌离子、3个锌离子或4个锌离子。
此外，还提供一种用于治疗糖尿病的药物组合物，包括上述的胰岛素修饰物以及药学上可接受的载体。
特别而言，上述药物组合物用于治疗犬猫糖尿病。
本发明还提供一种上述胰岛素修饰物的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供胰岛素，并使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素。
胰岛素选择猪胰岛素或犬胰岛素。之所以选择猪胰岛素或犬胰岛素，一方面考虑到本发明的设计初衷是提供一种动物用药，采用动物源胰岛素具有较高的亲缘性。此外，猪胰岛素和犬胰岛素结构上较为接近，尤其是二者B链末端结构几乎一致，便于后续修饰处理。
使用羧基肽酶A将胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素的具体操作为：将胰岛素锌盐溶解在水中并用质量浓度为33%的NaOH调节pH为9.3，接着按照胰岛素锌盐与EDTA的质量比为100：1加入EDTA，混匀后在室温、搅拌的条件下，按照羧基肽酶A和胰岛素锌盐质量比为0.5:100，加入羧基肽酶A的悬浮液，15h后加水稀释并用浓醋酸调节pH为3.6，接着加入甲醇和醋酸锌的水溶液，最后用浓氨水调节pH为6.0，过滤后保留沉淀，即为修饰过的胰岛素。
其中，醋酸锌与胰岛素锌盐的质量比为0.39：1。
S20、将结构式为(CH2)m(COOH)2的化合物A溶解在甲醇中，在碱存在的条件下进行皂化反应，接着将产物溶于HCl酸化的庚烷中，重结晶后得到结构式为CH3OOC(CH2)mCOOH的化合物B，其中，m为6～32的整数。
碱为NaOH，反应体系中碱的浓度为1mol/L。
S30、将S20得到的化合物B和足量的化合物C溶解在THF中，在催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为化合物D。
化合物B和化合物C的摩尔比为0.91：1.1，催化剂为N,N-二异丙基乙胺，催化剂与化合物C的摩尔比为1：1。
N,N-二异丙基乙胺：
S40、将S30得到的化合物D与足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在上述催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到的固体残余为化合物E。
谷氨酸-1-甲酯
化合物D与谷氨酸-1-甲酯的摩尔比为1：1，催化剂与化合物D的摩尔比为1：1。催化剂仍然采用N,N-二异丙基乙胺。
S50、将S40得到的化合物E、足量的化合物F和足量的化合物G溶解在二氯甲烷中，冰浴冷却后搅拌20h，过滤保留液相并真空干燥，得到化合物H。
化合物E、化合物F和化合物G的摩尔比为1：1：1。
S60、将S10得到的修饰过的胰岛素溶于碳酸钠的水溶液中得到第一溶液，同时将S50得到的化合物H溶于乙腈中得到第二溶液，将第一溶液和第二溶液混合，30min后用乙醇胺终止反应，向反应体系中加水并调节pH为5.5，保留沉淀并将该沉淀重新溶解后与等体积的0.2mol/L的NaOH溶液混匀进行皂化反应，反应完成后调节pH为5.5，保留沉淀，分离纯化后得到胰岛素修饰物。
得到的胰岛素修饰物包括胰岛素以及连接在胰岛素B链末端的脂肪酸链，脂肪酸链与胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：
Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端。
反应方程式如下（modified insulin表示S10得到的修饰过的胰岛素，insulin表示切除了B链第30位的丙氨酸的胰岛素）：
步骤S60中，采用盐酸或者氨水调节pH为5.5。
修饰过的胰岛素和化合物H的质量比为200：37.9。
第一溶液中，碳酸钠的浓度为5mmol/L。
这种胰岛素修饰物的制备方法简单实用，可操作性强。
以下具体实施例。
实施例1
本实施例中，结构式为(CH2)m(COOH)2的化合物A为十六烷二酸，即m=14的情况。
修饰过的胰岛素的制备：将1g猪胰岛素锌盐加入10ml水中，用33%浓度的氢氧化钠溶液调节PH至9.3。加10mg EDTA（乙二胺四乙酸），使溶解。室温搅拌加入50ml羧基肽酶A悬浮液。约15小时后用5ml水稀释，加浓醋酸调节PH至3.6，再加20ml甲醇和3ml醋酸锌水溶液（130mg/ml）。用25%浓氨水调至PH6.0沉淀。过滤，干燥，得到修饰过的胰岛素。
化合物H的制备：将化合物A溶解在甲醇中，加入1mol/L的NAOH进行皂化反应，接着将产物溶于HCl酸化的庚烷中，重结晶后得到化合物B。将化合物B、化合物C和N,N-二异丙基乙胺按照摩尔数为0.91mmol：1.1mmol：1.1mmol溶解在THF中，搅拌20个小时后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并盐酸洗涤两次再用水洗涤一次，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为具有如下结构式的化合物D。将化合物D、谷氨酸-1-甲酯和N,N-二异丙基乙胺按照摩尔数为0.58mmol：0.58mmol：0.58mmol溶解在二甲基甲酰胺中，搅拌20个小时后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并盐酸洗涤两次再用水洗涤一次，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为具有如下结构式的化合物E。将化合物E、化合物F和化合物G按照摩尔数为0.45mmol：0.45mmol：0.45mmol溶解在二氯乙烷中，冰浴冷却后搅拌20h，过滤保留液相并真空干燥，得到具有如下结构式的化合物H。
制备胰岛素修饰物：将200mg制得的修饰过的胰岛素溶于10mlNa2CO3(15℃水浴，pH10.2)。将40mg制得的化合物H溶于10ml乙腈，随后加入修饰过的胰岛素的溶液中。30分钟后，加3.8ml的0.2M乙醇胺（pH9.0）终止反应。添加2.5体积的水并将pH调节至5.5，得沉淀。后将其溶于pH8下的10ml冰水，加10ml的0.2M NaOH皂化，冰冷却40分钟，调节pH到5.5得沉淀产物。沉淀产物分离、纯化、干燥后，得到胰岛素修饰物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种胰岛素修饰物，其特征在于，包括胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链；
所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素，所述胰岛素B链第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：
Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端，m为6～32的整数。
2.一种胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供胰岛素，并使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素，所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素；
将结构式为(CH2)m(COOH)2的化合物A溶解在甲醇中，在碱存在的条件下进行皂化反应，接着将产物溶于HCl酸化的庚烷中，重结晶后得到结构式为CH3OOC(CH2)mCOOH的化合物B，其中，m为6～32的整数；
将所述化合物B和足量的具有如下结构式的化合物C溶解在THF中，在催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发除去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为具有如下结构式的化合物D，
将所述化合物D与足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在所述催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到的固体残余为具有如下结构式的化合物E，
谷氨酸-1-甲酯
将所述化合物E、足量的具有如下结构式的化合物F和足量的具有如下结构式的化合物G溶解在二氯甲烷中，冰浴冷却条件下搅拌20h，过滤保留液相并真空干燥，得到具有如下结构式的化合物H，
将所述修饰过的胰岛素溶于碳酸钠的水溶液中得到第一溶液，同时将所述化合物H溶于乙腈中得到第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合，30min后用乙醇胺终止反应，向反应体系中加水并调节pH为5.5产生沉淀，保留沉淀并将该沉淀重新溶解后与等体积的0.2mol/L的NaOH溶液混匀进行皂化反应，反应完成后调节pH为5.5，保留沉淀，分离纯化后得到所述胰岛素修饰物，所述胰岛素修饰物包括所述胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端。
3.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素的操作为：
将胰岛素锌盐溶解在水中并用质量浓度为33%的NaOH调节pH为9.3，接着按照所述胰岛素锌盐与EDTA的质量比为100：1加入EDTA，混匀后在室温、搅拌的条件下，按照羧基肽酶A和所述胰岛素锌盐质量比为0.5:100，加入所述羧基肽酶A的悬浮液，15h后加水稀释并用浓醋酸调节pH为3.6，接着加入甲醇和醋酸锌的水溶液，最后用浓氨水调节pH为6.0，过滤后保留沉淀，即为所述修饰过的胰岛素。
4.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，所述得到固体残余为具有如下结构式的化合物D的操作中，所述化合物B和所述化合物C的摩尔比为0.91：1.1，所述催化剂为N,N-二异丙基乙胺，所述催化剂与所述化合物C的摩尔比为1：1；
所述化合物D与所述谷氨酸-1-甲酯的摩尔比为1：1，所述催化剂与所述化合物D的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，所述得到具有如下结构式的化合物H的操作中，所述化合物E、所述化合物F和所述化合物G的摩尔比为1：1：1。
6.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，所述分离纯化后得到所述胰岛素修饰物的操作中，所述修饰过的胰岛素和所述化合物H的质量比为200：37.9。
7.一种胰岛素修饰物的二价金属离子复合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的胰岛素修饰物形成的六聚体，所述六聚体结合了二价金属离子。
8.根据权利要求7所述的胰岛素修饰物的二价金属离子复合物，其特征在于，每个所述六聚体结合2个锌离子、3个锌离子或4个锌离子。
9.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的胰岛素修饰物以及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗猫犬糖尿病。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131225 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |