CN102349868A

CN102349868A - 靶向性的叶酸-疏水抗癌药物水凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN102349868A
Application number: CN2011103150308A
Authority: CN
Inventors: 杨志谋; 王玲; 杨成彪; 王怀民
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明涉及一类基于叶酸-抗癌药物的小分子水凝胶前体分子的制备方法。所得到的化合物通过还原剂(谷胱甘肽和二硫苏糖醇)还原二硫键得到小分子水凝胶。具体是首先通过固相合成的方法合成叶酸连接的短肽，然后将抗癌药物(紫杉醇，喜树碱，羟基喜树碱等)用丁二酸酐或者戊二酸酐衍生化除一个羧基，之后把连接叶酸的短肽与衍生化的抗癌药物连接起来。该前体分子不仅具有靶向的作用、而且有很好的溶解性，且能经过二硫键的还原自组装成小分子水凝胶。本发明所建立的疏水抗癌药物的新型传输体系不仅大大提高了疏水抗癌药物在水中的溶解度，而且能靶向肿瘤组织，降低毒副作用。

Description

靶向性的叶酸-疏水抗癌药物水凝胶的制备方法

技术领域

本发明的技术方案涉及一类基于叶酸和抗癌药物的小分子水凝胶前体分子以及前体分子在还原剂(谷胱甘肽或者二硫苏糖醇)条件下形成稳定的可注射小分子水凝胶的方法

背景技术

1963年美国化学家瓦尼和沃尔发现美国西部紫杉树干的粗体物具有抗肿瘤活性，但直到1971年他们才与杜克大学教授姆克法尔合作确定其活性成分的结构，并命名为紫杉醇。这种药物在1983年进入临床研究并于1994年进入我国市场。它是一种新的抗癌药物，但其十分的疏水，因此在临床上的应用受到一定的限制，即常常需要用一些助溶剂来使其溶解，以便给药。但这些助溶剂，如聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇(1∶1)混合液，会导致一定的毒副作用，如神经毒性，并且在一定程度上阻碍了药物的抑瘤作用。为了解决这些问题我们用多肽来修饰紫杉醇，以解决其水溶性的问题，避免了一些具有毒副作用的助溶剂的实用。

但与此同时还有一个问题，就是紫杉醇这种药物对正常细胞的损害，对病人身体有极大的危害，如过敏反应、骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性、恶心、呕吐、腹泻等等。为了将药物的毒副作用最大化的降低，科学家们一直在探索。其中一种解决的办法就是使药物具有靶向性，特异性的在病变组织周围积累并进入病变细胞。许多科学家的研究表明，叶酸受体在正常的细胞表达量很低或者没有表达，而许多种肿瘤组织则高表达叶酸受体，因此我们在所设计的分子序列上引入了对肿瘤细胞具有靶向性的分子-叶酸，从而避免了药物在非特异性的组织释放，从而降低对正常细胞的杀伤。

除此之外，药物在体内的降解速度快，从而使得药效非常低，因此我们需要一个包载率高、具有靶向性并具有缓释作用的药物传输系统，现在研究的疏水抗癌药物(紫杉醇，喜树碱，羟基喜树碱等)载体主要有脂质体，两亲性共聚物，大分子多聚物和用蛋白质连接或者包裹，水溶性的前体药物等，但是许多载体存在包封率低，无选择性(靶向)，合成困难等缺点，限制了这些载体的进一步应用。小分子自组装形成的水凝胶在近几年得到广泛的关注，尤其是小分子多肽类的自组装，因为其具有生物相容性好，对身体无毒，容易合成等优点。作为一种新型的应用材料-小分子水凝胶，不仅具有良好的生物相容性，并且具有较好的三维形貌，在许多方面如组织工程、药物传输系统等得到国内外科研工作者的广泛的关注。到目前为止，还没有出现用多肽连接疏水抗癌药物然后通过二硫键还原诱导其自组装形成小分子水凝胶的报道。

发明内容

为了解决疏水抗癌药物(紫杉醇，喜树碱，羟基喜树碱等)的水溶性以及靶向性问题，本发明涉及一类靶向性的叶酸-抗癌药物前体分子的制备以及在还原条件(谷胱甘肽或者二硫苏糖醇)下二硫键断裂形成水凝胶的技术，即通过含有二硫键的多肽在二硫键一侧连接疏水性的抗癌药物，并在这一侧连接靶向性的基团叶酸分子。本发明的目的之一是设计与合成能够自组装并且溶解性能良好的前体分子(结构式如下)，该分子具有很好的溶解性(大于5mg/mL)。以丁二酸化的紫杉醇为例：首先通过在紫杉醇的2′羟基位点引入丁二酸，再用FMOC-固相合成方法合成多肽FA-GFKE-ss-EE、FA-GKE-ss-EE、FA-KE-ss-EE、FA-K-ss-EE，并把紫杉醇丁二酸衍生物做成活化酯连接到多肽裸露的氨基上，最终化合物的结构式如下所示：

(1)FA-GFK(Taxol)E-ss-EE

(2)FA-GK(Taxol)E-ss-EE

(3)FA-K(Taxol)E-ss-EE

(4)FA-K(Taxol)-ss-EE

本发明的有益效果是：首先本发明合成简单，可以通过固相合成的方法合成直接带有叶酸的短肽，所用到的原料为人体每天所必需的氨基酸和叶酸分子，紫杉醇在该分子中的含量高，远远大于其它药物载体中的紫杉醇含量；其次前体分子在细胞培养基(DMEM)或PBS缓冲液(pH＝7.4)中有很好的溶解度；最后前体分子在二硫苏糖醇或者谷胱甘肽的作用下能够形成小分子水凝胶。小分子水凝胶能直接注射到体内，因在紫杉醇2′羟基位点引入了酯键，在体内能缓慢地释放出紫杉醇，从而达到缓释紫杉醇并且治疗肿瘤的目的。

附图说明：

附图1：二硫键化合物Fmoc-ss的合成步骤

附图2：丁二酸酐衍生化的紫杉醇结构式

附图3：成胶前体分子FA-GFK(Taxol)E-ss-EE、FA-GK(Taxol)E-ss-EE、FA-K(Taxol)E-ss-EE、FA-K(Taxol)-ss-EE的结构式

附图4：多肽序列FA-GFKE-ss-EE、FA-GKE-ss-EE、FA-KE-ss-EE、FA-K-ss-EE结构式

附图5：成胶前体分子在还原剂(DTT或者GSH)条件下形成水凝胶的宏观图片，A代表FA-K(Taxol)E-ss-EE、B代表FA-K(Taxol)-ss-EE、C代表FA-GK(Taxol)E-ss-EE、D代表FA-GFK(Taxol)E-ss-EE。

具体实施方式：

实施例1：

(1)Fmoc-ss的合成，合成步骤见说明书附图1

第一步：ss的合成

称取10mmol(2.252g)Cystamine dihydrichloride和30mmol(2.52g)碳酸氢钠溶于90ml水和35ml 1，4-二氧六环的混合溶液中使其溶解，然后再称取10mmol (1.007g)1，4-丁二酸酐并溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺，加入到上述混合溶液中，反应过夜。

第二步：Fmoc-ss的合成

称取10mmol(3.377g)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺并溶于50ml丙酮溶液，用恒压漏斗慢慢滴加入上述反应液，室温反应4h，然后抽虑除去白色沉淀，用旋转蒸发的方式浓缩滤液，用1M的盐酸调节滤液PH至酸性，析出白色沉淀，静置一段时间使其充分沉降，抽虑，得到白色沉淀为产物，对产物进行冷冻干燥，得到3.02g即6.32mmol，产率为63.2％。

(2)FA-GFKE-ss-EE、FA-GKE-ss-EE、FA-KE-ss-EE、FA-K-ss-EE的合成

第一步：用Fmoc固相合成的方法合成Fmoc-GFKE-ss-EE、Fmoc-GKE-ss-EE、Fmoc-KE-ss-EE、Fmoc-K-ss-EE，所使用的氨基酸均为氨基端被Fmoc保护的氨基酸，具体合成步骤如下：

①称量0.5mmol树脂，加入固相合成器中，加入适量DCM浸没树脂，在氮气的鼓吹作用下膨胀5min；除去溶剂，加入0.6mmol第一个氨基酸(本实验中为Fmoc保护的赖氨酸)的DCM溶液，加入1.2mmol DIEA，反应2h；

②洗涤：用DCM洗涤，洗5次，每次1min；

③封闭：用体积比DCM∶甲醇∶DIEA为17∶2∶1的溶液反应10min，将树脂上未反应的活性基团封闭；

④洗涤：用DCM洗涤，洗5次，每次1min；洗涤：用DMF洗涤，洗5次，每次1min；脱Fmoc保护基团：加入20％哌啶溶液，反应30min；

⑤洗涤：用DMF洗涤，洗5次，每次1min；加入0.75mmol第二个氨基酸的DMF溶液，加入1.5mmol DIEA，0.75mmol缩合剂HBTU，反应2h；

重复操作步骤④，⑤，将氨基酸依次连接在树脂上；得到多肽Fmoc-GFKE-ss-EE、Fmoc-GKE-ss-EE、Fmoc-KE-ss-EE、Fmoc-K-ss-EE。

第二步：加入叶酸分子

⑥用DMF洗涤，洗5次，每次1min；脱Fmoc保护基团：加入20％哌啶溶液，反应30min；

⑦洗涤：用DMF洗涤，洗5次，每次1min；取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU溶于15ml DMSO中并加入0.8mmol DIEA，再取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU并溶于15ml加有0.8mmol的DMSO中，将两溶液加入反应器中避光反应过夜。

⑧排出反应液，取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU溶于15ml DMSO中，避光反应4h。

⑨用DMF洗涤，直至洗涤液没有颜色。

⑩切割：加入95％TFA的溶液(三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5)，避光反应30min，收集液体，旋转蒸干，用反相高效液相分离，得到化合物FA-GFKE-ss-EE、FA-GKE-ss-EE、FA-KE-ss-EE、FA-K-ss-EE。

(3)FA-GFK(Taxol)E-ss-EE、FA-GK(Taxol)E-ss-EE、FA-K(Taxol)E-ss-EE、FA-K(Taxol)-ss-EE的合成

第一步：紫杉醇衍生物Taxol-succ的合成(参照文献J.Med.Chem.，1989，32(4)，pp 788-792)

第二步：首先把紫杉醇的衍生物(见说明书附图2)溶解在二氯甲烷中，然后加入1.1当量的N-羟基丁二酰亚胺，1.2当量的二环己基碳二亚胺室温避光搅拌3h，过滤并用旋转蒸发的方法除去二氯甲烷，得到紫杉醇衍生物的活化酯的白色粉末。

第三步：将得到的紫杉醇衍生物的活化酯的白色粉末溶于二甲基甲酰胺，将1.5当量的多肽加入其中，同时加入7.5当量的N，N-二异丙基乙胺，室温避光搅拌过夜，高效液相分离。得到产物88.9mg左右，产率为34％-44％。

(4)小分子水凝胶的形成

称取2.0mg得到的化合物1，加入300ul的PBS(pH＝7.4)缓冲液，用碳酸钠小心调节pH至7.4，然后将溶液体积用PBS定容在400ul，取出200ul，加入2当量的还原剂谷胱甘肽或二硫苏糖醇，静置5min后，倒置小瓶可以看到类似果冻状的胶体。

Claims

1.基于叶酸(FA)和疏水性抗癌药物的小分子水凝胶药物传输体系其特征在于：该系列分子具有如下结构：首先通过叶酸修饰的短肽FA-XKYssEE，其中X，Y为除赖氨酸之外的任一种氨基酸或者不含赖氨酸的短肽，其中利用赖氨酸γ位氨基与衍生化的疏水抗癌药物(紫杉醇，喜树碱，羟基喜树碱等)结合；形成的最终分子可以在还原剂如谷胱甘肽，二硫酸糖醇，TCEP等条件下形成可注射的小分子水凝胶。

2.根据权利要求书1所述叶酸修饰的短肽可以为FA-GFKE-ss-EE、FAGKE-ss-EE、FAKE-ss-EE、FAK-ss-EE等。

3.根据权利要求书1所述，疏水性的抗癌药物可以为紫杉醇，喜树碱，羟基喜树碱等有衍生化位点的抗癌药物

4.根据权利要求数1所述，抗癌药物的衍生化可以用丁二酸酐或者戊二酸酐等修饰紫杉醇2’位羟基，或者喜树碱20位羟基以及羟基喜树碱的10位羟基

5.根据权利要求书所述本发明最后所使用的成胶方法为加入0.5-5倍的谷胱甘肽，二硫苏糖醇，TCEP等

6.根据权利要求书1所述，其中可以被还原剂作用的分子为Fmoc-ss，其制备方法如下：

(1)化合物Fmoc-ss的制备(结构式及制备见说明书附图1)

称取10mmol(2.252g)Cystamine dihydrichloride和30mmol(2.52g)碳酸氢钠溶于90ml水和35ml 1，4-二氧六环的混合溶液中使其溶解，然后再称取10mmol(1.007g)1，4-丁二酸酐并溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺，加入到上述混合溶液中，反应过夜。称取10mmol(3.377g)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺并溶于50ml丙酮溶液，用恒压漏斗慢慢滴加入上述反应液，室温反应4h，然后抽虑除去白色沉淀，用旋转蒸发的方式浓缩滤液，用1M的盐酸调节滤液PH至酸性，析出白色沉淀，静置一段时间使其充分沉降，抽虑，得到白色沉淀为产物，对产物进行冷冻干燥，得到3.02g即6.32mmol，产率为63.2％。

7.根据权利要求书1所述，叶酸连接的多肽中所引入的叶酸分子其步骤如下：

按照Fmoc固相合成的方法首先合到最后一个氨基酸，并且最后一个氨基酸的氨基保护基已经切除，再取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU溶于15ml DMSO中并加入0.8mmol DIEA，再取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU并溶于15ml加有0.8mmol的DMSO中，将两溶液加入反应器中避光反应过夜。排出反应液，取0.5mmol叶酸，0.3mmol HBTU溶于15ml DMSO中，避光反应4h。用DMF洗涤，直至洗涤液没有颜色。加入95％TFA的溶液(三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5)切割，避光反应30min，收集液体，旋转蒸干，用反相高效液相分离，得到化合物。