CN103509775A - 无色杆菌蛋白酶ⅰ变体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明公开了无色杆菌蛋白酶I变体。本发明公开的无色杆菌蛋白酶I变体具有活性显著优于野生型无色杆菌蛋白酶I的优点。

Description

无色杆菌蛋白酶Ⅰ变体
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种酶变体、其制备方法及其应用。
背景技术
无色杆菌蛋白酶I(Achromobacter protease I，API，EC 3.4.21.50)是从无色杆菌M497-1的培养液中分离出来的碱性蛋白酶，可裂解大多数革兰氏阳性菌或阴性菌，属哺乳动物型丝氨酸蛋白酶。它高度专一性水解赖氨酰键，包括赖氨酰-脯氨酰键，这与胰蛋白酶和其他丝氨酸蛋白酶不同。该酶在蛋白质的氨基酸测序、肽图谱分析和肽合成中具有重要的作用。作为内切酶，它还具有另外几个显著特点：1.比牛胰蛋白酶活力高一个数量级；2.具有广泛的pH范围(pH8.5-10.5)；3.在含4mol/L尿素或0.1％SDS的溶液中保持全酶活性。该酶的基因已被克隆，并获得其一级结构，其为胰蛋白酶家族成员之一。His57、Asp113和Ser194构成其催化三联体。在生物体内，这个酶首先以酶原的形式被合成，它的成熟体是由268个氨基酸残基组成，含三个二硫键，分别在Cys6-Cys216、Cys12-Cys80和Cys36-Cys58之间。除成熟酶外，酶原在N端和C端还具有较长的肽段。N端肽段由先导肽和前肽组成，前肽的功能不详。C端肽段含180个氨基酸残基，无论其是否被切除均不影响该酶的折叠和活性。
利用这个酶，Morihara等把猪胰岛素B链丙氨酸残基换成苏氨酸，成功的完成了人胰岛素的半合成；Masaki等在水相向大豆蛋白质中引入了蛋氨酸，使其含量从原来的1.19％提高到5.93％，这预示出该酶在改善食品营养结构方面的应用前景。
API(以下如无特别说明，API均指无色杆菌蛋白酶I)所具有的高酶活性、高度底物专一性和高稳定性在丝氨酸蛋白酶家族中是罕见的，因此其在生物工程领域的获得广泛应用。
虽然API已经在生物工程领域获得了广泛的应用，但进一步提高API与底物蛋白中赖氨酸的亲和力从而改善酶切的效率一直是本领域技术人员着力解决的问题。
发明内容
本发明的申请人通过PCR的方法，获得野生型API的全序列，并在5’端和3’端分别加上MscI和HindIII的酶切位点，通过双酶切的方法，定向克隆入相同双酶切的pET32载体，利用载体中Trx进行融合表达。构建的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，在LB培养基中于37℃培养过夜，提取外周胞质蛋白，纯化获得成熟的野生型API。然后在野生型API序列基础上，参考已经获得的野生型API的X线衍射晶体结构，对API活性中心附近的氨基酸通过overlap PCR的方法，进行定点突变，分别构建八种突变体，按照同样的方法装入pET32表达载体，Trx融合表达，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在LB培养基中于37℃培养过夜，提取外周胞质蛋白，纯化分别获得成熟的API各种突变体如下：
突变体1：K49R
突变体2：K106R
突变体3：K49R，K106R
突变体4：K49R，K106R，H56A
突变体5：K49R，K106R，T111G
突变体6：K49R，K106R，L209A
突变体7：K49R，K106R，D225E
突变体8：K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E
上述“K49R”、“K106R”、“H56A”、“T111G”、“L209A”、“D225E”中，两字母之间数字代表突变位点，左边字母代表野生型API氨基酸序列(SEQ.IDNO.1)中突变位点突变前的单字符氨基酸，右边字母代表突变位点突变后的单字符氨基酸。例如“K49R”表示：野生型API氨基酸序列(SEQ.ID NO.1)的第49位氨基酸由赖氨酸(赖氨酸的单字符号为K)突变为精氨酸(精氨酸的单字符号为R)。
后通过活性实验和酶切效率实验，结果表明，本发明公开的API突变体其活性均高于野生型API，且可成功地将胰岛素C肽切除，达到了本发明的目的。
具体地，本发明中，将野生型API序列中关键位置的赖氨酸突变为精氨酸，有效的减少了API的不当自身酶解，大大提高了酶的得率。将活性中心附近的天冬氨酸突变为谷氨酸，可以使API更有效的与底物蛋白中的赖氨酸结合，显著改善酶切效果。活性中心附近的组氨酸、苏氨酸与亮氨酸经过突变，也可提高API与底物中赖氨酸的亲和力，进一步提高酶切的效果。API成熟蛋白具有三对链内二硫键，结构复杂，如果采用包涵体表达的方式，虽然可以获得更高的表达量，然而蛋白复性的难度很大，反而不利于获得高活性的成熟酶蛋白。因此采用大肠杆菌胞质腔表达，直接纯化胞质腔中的API，可获得高活性的API成熟蛋白。
利用本发明获得的野生型的API(其氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ.IDNO.1和SEQ.ID NO.2所示)和各种不同的突变体进行酶活性实验，结果显示，本发明构建的突变体，活性显著优于野生型API，可在大肠杆菌胞质腔获得高表达，有利于该酶的工业化应用。利用本发明的API突变体，可以成功将胰岛素C肽切除，获得B链(-T)与A链的正确结构，并实现生产规模的使用。
附图说明
图1：API突变体活性测定结果；其中wild type：野生型；mutant1：K49R；mutant2：K106R；mutant 3：K49R，K106R；mutant 4：K49R，K106R，H56A；mutant 5：K49R，K106R，T111G；mutant 6：K49R，K106R，L209A；mutant 7：K49R，K106R，D225E；mutant 8：K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E；
图2：突变体8酶切效率，其中保留时间为14.670分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；
图3：突变体6酶切效率，其中保留时间为15.126分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；
图4：突变体5酶切效率，其中保留时间为15.137分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；
图5：突变体4酶切效率，其中保留时间为13.903分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为10.663分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物；
图6：突变体7酶切效率，其中保留时间为15.037分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为12.041分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物；
图7：突变体3酶切效率，其中保留时间为14.976分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为11.972分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物；
图8：突变体2酶切效率；其中保留时间为15.539分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为12.101分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物；
图9：突变体1酶切效率；其中保留时间为14.849分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为11.805分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物；
图10：野生型酶切效率；其中保留时间为14.827分钟的主峰为胰岛素原完全酶切后的正确结构；保留时间为11.826分钟的峰为未酶切的胰岛素原；前二者间为胰岛素原不完全酶切的产物。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应构成对本发明的限制。
下述实施例、实验例中的原材料如果没有特别说明，均为市售。
实施例1：野生型API的构建
引物1：5’-tggccaatgaaacgcatctgcggtt
引物2：5’-aagcttctaatgatgatgatgatggtgcggagtaccg
以无色杆菌M497-1基因组DNA(采用Qiagen细菌基因组DNA纯化试剂盒纯化获得)为底物，使用引物1和引物2，采用PCR方法扩增获得API基因，并在其5’端和3’端分别加入MscI和HindIII的酶切位点，在3’端加上His标签。扩增获得的序列连接入T easy载体(Promega)，经基因序列测定确认无误后，采用MscI和HindIII双酶切，回收酶切片段，与相同双酶切的pET32a(Novagen)连接，获得API的pET32a表达载体。表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性转化克隆，LB培养基中于37℃培养过夜进行培养扩增。采用渗压震扰法(Norioka S，et al.J Biol Chem，1994，269：1-5)提取外周胞质蛋白，通过His标签亲和层析纯化获得API蛋白(其氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示)。
实施例2：突变体1的构建(K49R)
引物3：5’-acaccgctaacgaccgcagaatgta
引物4：5’-gcggtcaggaagtacattctgcggt
以野生型API基因为模板，分别用引物1与引物4、引物3与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体1基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例3：突变体2的构建(K106R)
引物5：5’-agtccggttccactgttagggcgac
引物6：5’-gaggtagcgtaagtcgccctaacag
以野生型API基因为模板，分别用引物1与引物6、引物5与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体2基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例4：突变体3的构建(K49R，K106R)
以API突变体1基因为模板，分别用引物1与引物6、引物5与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体3基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例5：突变体4的构建(K49R，K106R，H56A)
引物7：5’-tgtacttcctgaccgcggcacactg
引物8：5’-gtgcccataccgcagtgtgccgcgg
以API突变体3基因为模板，分别用引物1与引物8、引物7与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体4基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例6：突变体5的构建(K49R，K106R，T111G)
引物9：5’-ttagggcgacttacgctggctccga
引物10：5’-agcagggtaaagtcggagccagcgt
以API突变体3基因为模板，分别用引物1与引物10、引物9与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体5基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例7：突变体6的构建(K49R，K106R，L209A)
引物11：5’-aacgcgtgctcggtcaggcgcacgg
引物12：5’-ctagacggaccgccgtgcgcctgac
以API突变体3基因为模板，分别用引物1与引物12、引物11与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体6基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例8：突变体7的构建(K49R，K106R，D225E)
引物13：5’-ccggcaccaaccgcagcgaacagta
引物14：5’-aatacgcgaccgtactgttcgctgc
以API突变体3基因为模板，分别用引物1与引物14、引物13与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体6基因序列。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实施例9：突变体8的构建(K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E)
以API突变体4基因为模板，分别用引物1与引物10、引物9与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得中间突变体A基因序列(K49R，K106R，H56A，T111G)。
以中间突变体A基因为模板，分别用引物1与引物12、引物11与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得中间突变体B基因序列(K49R，K106R，H56A，T111G，L209A)。
以中间突变体B基因为模板，分别用引物1与引物14、引物13与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物1与引物2扩增，获得突变体8基因序列(K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E)。转化、表达及纯化方法与野生型API相同。
实验例1：API突变体活性测定
试剂：
A：0.2M 2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMP，2-Amino-2-methyl-1，3-propanediol)pH9.5
B：2.5mM底物溶液(N-Benzoyl-DL-lysine-p-nitroanilide Hydrobromide)
C：2mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH8.0
D：API阳性对照(Wako)
E：终止液45％乙酸
反应方法：
2.6mlA液加入0.3mlB液30℃孵育5min，然后阳性对照加入D液0.1ml，空白对照加入C液0.1ml，测试样品(野生型API及各种不同的突变体)加入同样的量，混匀后30℃孵育25分钟，然后加入1mlE液进行终止反应。
通过测量OD405的吸光度来判定酶的活性：
AU/ml＝(a-b)*C/6
其中a为测试样品的405nm吸光度b为空白对照的吸光度，c为样品的稀释倍数。
以野生型API的活性为100％，计算各种突变体的相对活性(％)。
结果如表1和图1所示：
Figure BSA00000735078200091
实验例2：API突变体切割胰岛素原
按照专利US4916212描述的方法获得胰岛素原，按照下述方法利用API(野生型及各种突变体)酶切胰岛素原，反相HPLC(C4柱)检测酶切效果。
酶切条件：
酶切缓冲液：100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH9-10；
酶切温度：4-25℃
酶切时间：12-24小时
酶与底物质量比：1∶2000～1∶3000
酶切效率检测：
检测方法：反相HPLC，C4柱检测
流动相：A.pH3.0磷酸钠缓冲液；B.乙腈
温度：室温
梯度：25分钟，B相20％～40％
结果见附图2～10，结果表明：突变体8的酶切效率最高，其次为突变体5和突变体6，均优于其他专利或文献中报道的结果。
Figure ISA00000735078400011
Figure ISA00000735078400021
Figure ISA00000735078400031
Figure ISA00000735078400041

Claims (2)

1.一种无色杆菌蛋白酶I变体，其特征在于SEQ.I.D.NO.1氨基酸序列K49R，K106R，T111G或K49R，K106R，L209A或K49R，K106R，D225E。
2.一种无色杆菌蛋白酶I变体，其特征在于SEQ.I.D.NO.1氨基酸序列K49R，K106R，H56A，T111G，L209A，D225E。
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