JPS58501208A - インシユリン誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン誘導体の製造法 技術分野 本発明は治療用インシュリン調剤の製造に好適な人インシュリン生成物の新規な 製造法に関し、この方法は豚インシュリン生成物をカルボキシペプチダーゼＡま たは相当する酵素で処理してデスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を形成せ しめ、次いでトリプシンまたはそれに関連した酵素および有機溶媒の存在下にＬ −スレオニンアルキルエステルと縮合せしめ、その後形成されたインシュリンエ ステルを加水分解して人インシュリンとすることからなる。

インシュリンは糖尿病の治療に不可欠の医薬である。人起原のインシュリンから 作った治療用調剤で人間を治療するのが自然である。しか′しながら糖尿病の数 およびインシュリンに対する要求量は原材料（人膵臓）の入手しつる量に比例し ない。

従って実際上の理由から、牛および豚インシュリンから作られた治療用調剤を使 用している。しかしながら程度の大小はあれ、これらのインシュリンは人体に抗 体の形成を生ぜしめ、これはそれ以上のインシュリン処置の効果の減少をもたら す。

この欠点は一部牛および豚インシュリン中の不純物に起因し、一部は相客れない 性質に起因している、何故ならば牛インシュリンのアミノ酸順序がＡ８　、ＡＩ ＯおよびＢ５０（２）　特表昭５８　’ａ（１１２（１８（２）位において人イ ンシュリンのアミノ酸順序と異なっているからであり、一方豚インシュリンは人 インシュリンとＢ３０位が異なるだけである。

抗体形成の問題は、クロマトグラフィで精製した牛および豚インシュリンから作 った治療用調剤の導入以来実質的に減少した。しかしながら抗体の形成はなお生 じつる。これは人インシュリンと同じアミノ酸順序のインシュリンから作った治 療用調剤によって克服できると信ぜられている。

インシュリンを化学的に製造することは米国特許第３９０３０６８号およびホッ ペーセイラーのＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅａｐ、第３５７巻第７５９頁〜第７６７頁（１９７６年）から知られてい る。

これらの方法はデスオクタペプチド−（Ｂ２３〜３０）を人インシュリンに詔け るＢ−２３〜３０位に相当する合成オクタペプチドと縮合させることからなる。

しかしながら第一工程でアルカリ性加水分解が行なわれ、これは不都合な副反応 を伴う。第二工程は多くの副反応を生せしめる不特定反応を含み、複雑な精製法 を必要とする。従ってこれらの方法は工業的規模で使用するのには適していない 。

更に米国特許第３２７６９６１号には酵素例えばカルボキシペプチダーゼＡまた はトリプシンのスレオニンの存在下における作用によって他の動物インシュリン から人インシュリンを製造する方法が記載されている。

しかしながらこの既知の方法によれば、評価しつる程度に人インシュリンを製造 することができない。これは多分（３） トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡがリジル−アラニン結合（Ｂ２９− ３０）を加水分解するばかりでなく、作用条件下にインシュリン中の他の位置も 加水分解するという事実による。トリプシンはりジル−アラニン結合（Ｂ２９− ３０）以外にアルギニル−グリシンペプチド結合（Ｂ２２−２３）を選択的に加 水分解する。しかしながらカルボキシペプチダーゼＡはＡ−鎖のＣ−末端でアス パラギンの分解も生ぜしめることなくＢ−鎖のＣ−末端でアラニンを専ら分解す ることはできない。後に特定の条件、即ち重炭酸アンモニウム緩衝溶液中での反 応がアスパラギン放出を阻害するために必要であることが示された（ホッペーセ イ５−　）Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、第３５９巻第７９９頁〜第８ ０２頁１９７８年参照）。更に加水分解反応の速度が作用条件下でペプチド合成 の速度よりも大であることから、かなりのペプチド形成は殆ど生じない。

最後にネイチャー第２８０巻１９７９年８月２日号、第４１２頁〜第４１３頁； 　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　＆　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒｅｓ、　ＣｏｍＩＩＩｕｎ。

１９８０年１月２９日号第９２　＋２１巻第３９６頁〜第４０２頁；およびタン マーク特許出願第１５５６／８０号にはＢ−３０アミノ酸を交換する方法が記載 されており、この方法では重炭酸アンモニウム緩衝剤の存在下に２５℃で８時間 、阻害剤（ジイソプロピルフルオロホスフェート）を加えてカルボキシペプチダ ーゼＡで豚インシュリンを処理して、デスアラニンインシュリンを生ぜしめ、こ れを分離している。その後ＤＭＦおよびエタノールの混合物からなる高濃度（４ ） （約６０％）の有機溶媒混合物を含有する溶媒中のＤＡＩおよびスレオニンブチ ルエステル（’ｒｈｒ−ＯＢｕ’　）の溶液に０．５Ｍの硼酸塩緩衝溶液および トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（テＰＣＫ　）の溶液を加え てカップリング反応を行ない、その後反応を３７℃で２０〜４８時間進行させて （Ｂ　３　Ｑ　−Ｔｈｒ　−０Ｂｕｔ）豚インシュリンを形成させ、これを分離 している。最後にブチルエステルＮ１１基をアニゾールの存在下にトリフルオロ 酢酸で分解している。

しかしながら調査によれば、後者の方法は治療用調剤の製造には不適当な人イン シュリン生成物を生せしめる、何故ならばそれは酵素不純物を含有する、そのた め必要な長い活性の治療調剤の製造に使用するのには適していない。

更に生成物はそれぞれ人および豚起原の膵臓から作った人インシュリンおよび豚 インシュリンとは対照的な「マメステスト」で突然変異である。最後にそれは不 純物を含有し、これは一般に使用される方法では除去することが難しい。

発明の開示 既知の方法で作った人インシュリン生成物の上述した欠点を含まぬ高度に純粋な 人インシュリン生成物を製造しうることをここに見出した。

本発明によれば、デスアラニン−Ｂ３０インシュリン（ＤＡＩ　）とＬ−スレオ ニンアルキルエステルとのカップリングを、緩衝剤を用いずに二つの反応成分、 酵素および反応媒体を混合する特定の順序を用いて実施する。これによってカッ プリング反応が驚く程短時間で完了する。反応媒体（５） として約５．５〜約７．５の範囲でｐＨ値を有する水と低級アルカノールの混合 物を使用する。かくして作られたインシュリンエステルを次いで一部エステルの アルキル部分の適切な選択により、一部８．５〜１０．５の範囲のｐＨ値の水性 媒体中で加水分解を実施することにより、おだやかな方法で人インシュリンに変 える。かくして酵素、トリフルオロ酢酸およびアニゾールの添加が避けられる。

従って本発明方法は、デスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を低級アルカノ ール中に懸濁させ、懸濁液と緩衝剤を加えることなく、約５５〜約７．５のｐＨ 値に規制した水中でＬ−スレオニンアルキルエステルおよびトリプシンまたはそ れに関連した酵素の溶液を混合し、形成された混合物を３０分以下放置すること 、および約８．５〜約１０５の範囲でｐＨ値の水性媒体中でインシュリンエステ ルの加水分解することを特徴とする。

本発明方法を例えば出発インシュリン生成物の５０Ｐ以上を用いる工業的規模の 如き大規模で実施するとき、本発明の好ましい実施態様は、水中のＬ−スレオニ ンアルキルエステルの溶液の一部にトリプシンまたはそれに関連した酵素を別々 に溶解し、水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の残りの部分にデスア ラニン−Ｂ３０インシュリン生成物の懸濁液を加え、形成された混合物の温度お よヒＰＨ値を調整し、次いで水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の一 部の別に作ったトリプシンとそれに関連した酵素の溶液を加えることからなる。

この場合、形成さく　６　）　竹表昭５８−５（１１２０！？（３）れた混合物 の温度およびｐＨ値を１０〜１５℃、および５，８〜６．２に調整するのが好ま しい。更に水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の１０〜２０重量％で 別々にトリプシンまたはそれに関連した酵素を溶解するのが好ましい。

縮合反応は緩衝剤の添加なしに実施することを特に指摘する、各反応成分の緩衝 能力は本発明によって与えられた条件下で、５．５〜７．５の範囲のｐＨを保つ のに充分である。

上記特長は本発明の必須の特徴であり、それは工業的規模での非常に短時間（１ ００倍という係数で短縮される）で反応を実施することを可能にする決定的要因 である。

縮合反応において、反応時間は残りの反応条件によって決まる。約５〜約３０分 、好ましくは約５〜約１５分の反応時間を使用する。

縮合反応の短い反応時間の結果として、認知しうる副反応カ生セス、更にトシル −Ｌ−フェニルアラニンクロ０メチルケトン（ＴＰＣＫ　）で処理した酵素の使 用を必要としない。

本発明方法の特に有利な実施態様において、原料豚インシュリン、例えばインシ ュリン塩ケーキを出発材料として使用する。本発明方法において原料豚インシュ リンを使用するとき、クロマトグラフで精製した豚インシュリンを作るとき得ら れる収率に相当する人インシュリンの高収率を得ることができることを知ること に価値がある（両者の場合、全収率は使用した膵臓の量に基づいて計算する）。

出発材料として原料豚インシュリンの使用が、使用した（　７　） 酵素および未反応デスアラニン−８３０インシユリンから得られた人インシュリ ンエステルのクロマトグラフ分離の困難を生ぜしめないことは驚くべきことであ る。

本発明の方法の縮合に使用する酵素はリジンカルボニルペプチド結合を分解でき なければならない、従ってトリプシンまたはそれに関連した酵素例えばアクロモ バクタ−プロテアーゼ■の使用ができる、これらの製造および性質はマサキ等の Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第４２巻第１４４３頁〜第１４４５頁（１ ９７８年）に記載されている。使用した反応混合物中でのかかる酵素の貧弱な反 応性および前述した短い反応時間のため、キモトリプシン様酵素で可能な汚染物 を除去スるためトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ　 ）で処理した酵素を使用する必要はない。

酵素は溶解した形で使用できる、しかし不溶性マトリフクス例えばアガロースま たはポリアクリルアミドまたは同様の重合体物質に結合させることもできる。

縮合反応は、酵素的接触加水分解が進行すべきペプチド形成反応のため充分に抑 制される条件下で行なう。前述した如＜　ｐＨ値は５．５〜７５としなければな らす、温度は通常０〜５０℃の範囲、好ましくは１０〜３７℃である。

縮合反応において、反応成分、即ちデスーＢ３０インシュリンおよびＬ−スレオ ニンアルキルエステルの濃度は高くすべきである。更に使用するＬ−スレオニン アルキルエステルは２００：１のモル比までの大過剰、好ましくは２０：１〜１ ００　：１の範囲で使用すべきである。

（８） 縮合反応は水混和性低級アルカノールまたはそれらの混合物の存在下に行なう、 これによって加水分解反応を防止し、各反応成分の溶解度を改良する。低級アル カノールの濃度は反応混合物の全容量を基にして計算して２０〜９０％、好まし くは３０〜８０％の範囲で選択すべきである。

縮合反応が完了したとき、インシュリン様蛋白質はゲル沖過により残存成分から 分離し、そこでアニオン交換クロマトグラフイで未反応出発材料から人インシュ リンエステルを分離する。未反応出発材料はこの方法で可能なら再使用してもよ い。

人インシュリンエステルを含有するアニオン交換から集めた画分を脱塩し、その 後集めた溶出液のｐＨ値をＮａＯＨで約９．５に調整する。常温で２４〜４８時 間後に再結晶または他の通常の方法で純粋な人インシュリンを分離する。

インシュリンアルキルエステルの加水分解は水性溶液中で約８５〜約１０．５の ｐＨ値でなめらかに進行する。これは加水分解後、加水分解混合物を通常の方法 で容易に処理でき、分離した人インシュリンを高純度で得ることができる効果を 有する。

かくして本発明方法で作った人インシュリンは蛋白分解不純物を含有しないこと から治療用インシュリン調剤の製造に良く適している、このためそれは長い間活 性を有する調剤の製造に使用できる、それは前述した「アメステスト」での人お よび豚起原と同じ方法で挙動し、一般に使用されているクロマトグラフィによる 不純物の除去の困難がない（９） 更に好ましい実施態様において、生インシュリンを出発材料として使用する場合 、全ての点において同じ量の生インシュリンから得ることのできる高度に精製さ れた豚インシュリンの収率と同等である人インシュリンの収率が得られる。従っ て従来知られていなかった程度まで工業的にのみならす臨床的に満足できる方法 である。

本発明の実施の形態 本発明方法を更に下記実施例で示す。

実施例　１ ２０００■の豚インシュリンに相当する生インシュリン（塩ケーキ）の形の豚イ ンシュリンを０．２Ｍの水性ＮＨ，ＨＣＯ３溶液（ｐＨ値８．４）２００−中に 溶解した。溶液に約５■／−の濃度の水溶液の形で２０■のカルボキシペプチダ ーゼＡを加えた。混合物を注意して５分間撹拌し、その後それを２．５時間２０ ℃で放置した。反応混合物を凍結乾燥した。

アミノ酸測定による放出されたアラニンの測定は９２％の分解収率を示した。

凍結乾燥した粉末を９６％のエタノール２３．４−中に懸濁し、次いで５Ｎ塩酸 で６，５０のｐＨに調整した蒸溜水１４．００−中の４．０　ＯｆのＬ−スレオ ニンメチルエ曵チルおよび２００■のトリプシンの溶液を加えた。注意深く撹拌 後、混合物を３５℃で１５分間放置した。その直後０．ＩＮの塩酸でｐＨを２． ５に先ず調整して反応を停止させ、蒸溜水によって１００ゴの容量にした。

（１０）　特表昭５８−５０１２（１８（４）反応混合物の高圧液体クロマトグ ラフ分析では８０％の人インシュリンエステルの生成を示した。

反応混合物をＩＭの酢酸でセファデックス（５ｅｐｂａｄｅｘ　：登録商票）Ｇ −５０スーパーフアイン（８Ｘ８０個）のカラムでゲル沖過した。人インシュリ ンエステルおよび未反応デスアラニン−Ｂ３０インシュリンを含有する両分を凍 結乾燥した。

収量：１６１２■の生成物混合物。

その後生成物混合物をＤＡＡＥセルロース（ワラマンＤＥ　−５２）（９ｘ２３ α）のカラムで４℃でイオン交換し、塩酸で８−１のｐＨに調整した００２Ｍの トリスおよび７Ｍの尿素からなる緩衝剤の１４０ｒｎ／ｈｒて平衝させた。生成 物の仕込が完了したとき、カラムを上述した緩衝剤溶液を用いて２５時間で溶離 し、次いで１１について０．００４５モルの塩化ナトリウムとの混合物の形で上 述した緩衝剤を用いて２時間溶離し、最後に１１について０．０１１モルの塩化 ナトリウムとの混合物の形の前者の緩衝剤を用いて１２時間溶離した。

溶離液は二つの蛋白質主画分を含有していた。最初に溶離した両分は高圧液体ク ロマトグラフィで人インシュリンエステルであると同定された、その後溶離され た両分はデスアラニルインシュリンであると同定された。

集めた人インシュリンエステル画分を、４℃で０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ ３０）でセファデックスＧ−２５のカラムで脱塩した、その後ｐＨをＩＮのＮａ ＯＨ溶液で９．５に調（１１） 整した。画分を２５℃で２４時間放置した。

９５０ｑの純粋な人インシュリンが得られた、これはアミノ酸分析および高圧ク ロマトグラフィで同定した。

６６．３Ｆの豚インシュリンに相当する生インシュリン（塩ケーキ）の形の豚イ ンシュリンをＰＨ８，４の０．２Ｍの酢酸アンモニウム６００〇−中に溶解した 。この溶液に、約５■／−の濃度の水溶液の形のカルボキシペプチダーゼＡ６０ ０■を加えた。混合物を注意して２０℃で３時間撹拌した。

１５％（ｗ／ｖ　）　ＮａＣ１を加えてデスアラニンインシュリンを沈澱させた 。

分離し、空気乾燥した沈澱を注意して７７０−の９６％エタノール中に注入し、 かくしてエタノール中のデスアラニンインシュリンの懸濁液を形成した（溶液１ ）。

１２０２のＴｈｒ　−０−Ｍｅ　、　ＨＣＩを２７５艷の蒸溜水に溶解し、５Ｍ のＮａＯＨでｐＨを５，８に調整した（溶液２）。

６０−の溶液２に、６００ｔｎｇのトリプシン（豚）を加え、注意して撹拌して 溶液にした（溶液３）。

溶液１および２は撹拌しつつ溶液２に溶液１を徐々に注入して混合した。ｐＨ値 は５ＭのＮａＯＨで５．８に調整した。

混合後混合物を恒温槽中で１０℃に冷却した。

反応はデスアラニンインシュリンとＴｈｒ　−０−Ｍｅ　Ｉ）　上述した混合物 に溶液３を添加後１０分間生起させた。

その直後０．］ＮのＨＣＩでｐＨを２．５に調整し、蒸溜水で（１２） ２４００−の容量にして反応を停止させた。

反応混合物の高圧クロマトグラフ分析では８７％の人インシュリンエステルの生 成を示した。

反応混合物を実施例１に記載した如く処理し、治療用インシュリン調剤の製造に 好適な半合成人インシュリンの高度に精製された生成物（２５，４Ｆ）を生じた 。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、豚インシュリン生成物をカルボキシペプチダーゼＡまたは相当する酵素で処 理してデスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を形成せしめ、次いでトリプシ ンまたはそれに関連した酵素および有機溶媒の存在下にＬ−スレオニンエステル と縮合せしめ、その後かく形成させたインシュリンエステルを加水分解して人イ ンシュリンを形成させる人インシュリンの製造法において、低級アルカノール中 にデスアラニン−８３０インシユリン生成物を懸濁せしめ、緩衝剤の添加をせず に約５．５〜約７．５のｐＨ値に調整した水中のＬ−スレオニンアルキルエステ ルおよびトリプシンまたはそれに関連した酵素の溶液を懸濁液と混合し、形成さ れた混合物を３０分間以内放置し、約８．５〜約１０５の範囲のｐＨ値の水性媒 体中でインシュリンエステルの加水分解を行なうことを特徴とする方法。 ２、水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の一部に別々にトリプシンま たはそれに関連した酵素を溶解し、水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶 液の残部にデスアラニン−Ｂ３．０インシユリン生成物の懸濁液を加え、形成さ れた混合物の温度およびｐＨ値を調整し、次いで水中のＬ−スレオニンアルキル エステルの溶液の一部中のトリプシンまたはそれに関連した酵素の別に作った溶 液を加える請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　使用する豚インシュリンが生の豚インシュリンである請求の範囲第１項ま たは第２項記載の方法。 （１４） ４、形成された混合物の温度およびｐＨを１０〜１５℃および５．８〜６．２に それぞれ調整する請求の範囲第２項記載の方法。 ５、縮合反応を約５〜約１５分間行なう請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　デスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を使用したカルボキシペプチダ ーゼＡまたは相当する酵素の分離せずに分離する請求の範囲第１項記載の方法。 ７、使用するＬ−スレオニンアルキルエステルがＬ−スレオニンメチルエステル である請求の範囲第１項記載の方法。 ８、使用する低級アルカノールがエタノールである請求の範囲第１項記載の方法 。 ９、水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の１０〜２０重量％で別々に トリプシンまたはそれに関連した酵素を溶解する請求の範囲第２項記載の方法。 （１）