JPS60500401A - ヒトインシユリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインシュリンの製造法 技術分野 本発明は治療用インシュリン製剤の製造に好適であるヒトインシュリン生成物の 製造法ぷこ関し、この方法においてはブタインシュリン生成物をカルボキシペプ チダーゼＡまたは相当する酵素で処理してデスアラニン−Ｂ３０インシュリン生 成物を形成し、これを次いで有機溶媒およびトリプシンまたはそれ（こ関連した 酵素の存在下にＬ−スレオニンアルキルエステルと−合し、その後形成されたイ ンシュリンエステルを加水分解してヒトインシュリンとする。

背景技術 インシュリンは糖尿病の治療醗こ不可欠の医薬である。ヒト起源のインシュリン から作った治療用調剤で人を治療することが自然であろう。しかしながら、糖尿 病患者の数およびインシュリンに対する個々の要求量は原材料（人のスイｆｇ１ ）の入手しうる量に比例しない。

インシュリンを化学的１こ製造することは例えば米ｌ特許第３９０３０６８号お よびホップーセイラーのＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｎ、第３５７巻第７５９頁〜第７６７頁（１９７６年）から知られてい る。

これらの方法は、デスオクタペプチド−（Ｂ２３−３０）ブタインシュリンを、 ヒトインシュリン（こおける位置Ｂ２３−３０Ｇこ相当する合成オクタペプチド と縮合することからなる。しかしながら第一の方法ではアルカリ性加水（２）　 竹製ｑ６ｏ−５ｏｃ＋４ｏｔ　（２）分解を行なっており、これは不都合な副反 応を伴う。第二の方法では多くの副反応を生せしめる非特定反応からなり、複雑 な精製を必要とする。その結果これらの方法は工業的規模で使用するのには好適 でない。

更に米国特許第３２７６９６１号には、スレオニンの存在下、酵素、例えばカル ボキシペプチダーゼＡまたはトリプシンの作用によって他の動物のインシュリン からヒトインシュリンを製造する方法が記載されている。

しかしながらこの既知の方法では、ヒトインシュリンを認めうる程度に作ること はできない。これは多分トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡがリジル− アラニンペプチド結合（Ｂ２９−Ｂ３０　）を加水分解するばかりでなく、作用 条件下でインシュリン中の他の位置も加水分解するという事実に原因がある。ト リプシンはりジル−アラニン結合（Ｂ２９−Ｂ３０　）以外にアルギニル−グリ シンペプチド結合（Ｂ２２−８２３）を選択的シこ加水分解する。

しかしながらカルボキシペプチダーゼＡは、Ａ、−鎖のＣ−末端でアスパラギン をも開裂することなく、Ｂ　−Ｍｌニア）Ｃ−末端でアラニンを独占的に開裂す ることはできない。後に特別の条件、即ち重炭酸アンモニウムバッファー溶液中 での反応が、アスパラギン放出を妨害するために必要であることが示された（ホ ツプーセイラーのＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第３５９巻、第７９９頁 〜第８０２頁、１９７８年参照）。

更にかなりのペプチド形成は殆ど生ぜず、これは加水分解反応の速度が作用条件 下でペプチド合成の速度より大であ（３） るからである。

最後にネイチャー第２８０巻、１９７９年８月２日号、第４１２〜第４１３頁、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＋ｍｕｎ。

１９８０年１月２９日号、第９２巻第２号、第３９６頁〜第４０２頁、およびヨ ーロッパ特許第００１７９３８号（全てモリハラ等による）にはＢ−３０アミノ 酸を交換する方法が記載されており、この方法では重炭酸アンモニウムバッファ ーの存在下に８時間で２５°Ｃで阻害剤（ジイソプロピルフルオロホスフェート ）を加えて、ブタインシュリンをカルボキシペプチダーゼＡで処理しデスアラニ ンインシュリン（ＤＡＩ　）を生成させ、これを分離している。その後０５Ｍ硼 酸塩バッファー溶液中のトリプシンの溶液およびアラニンクロロメチルケトン（ ＴＰＣＫ　）を、ＤＭＦ　Ｅよびエタノールの混合物からなる高濃度（約６０％ ）の有機溶媒混合物を含有する溶媒中のＤＡＩ：３よびスレオニンブチルエステ ル（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ）の溶液に加えてカップリング反応を行ないその後反応を ３７℃で２０〜４８時間進行させて（Ｂ　３　Ｑ　−Ｔｈｒ　−０Ｂｕｔ）ブタ インシュリンを形成させて、これを分離している。最後にブチルエステル保護基 をアニソールの存在下にトリフルオロ酢酸で開裂させている。

この既知の方法は工業的規模で使用できるが、しかしこれは大過剰に存在させな ければならないスレオニンアルキルエステルを作ることが難しく、従って高価で あり、更に回収することが困難であるので著しい欠点を含んでいる。

それ以外に、三級ブチルエステル基の除去に必要な大量の（４） トリフルオロ酢酸の使用は工業的規模で操作するとき種々の困難を生せしめる。

従ってＢ３０位に三級ブチルエステル基を含み、これｌこよる中間物（Ｂ３０− Ｔｈｒ−Ｑ１３１１ｔ）インシュリンを含むこの方法は工業的目的のためには適 切性既知の方法で作ったヒトインシュリンの上述した欠点のない高度ｌこ純粋な ヒトインシュリン生成物を作ることができることをここｌこ見出し１こ。

本発明ｔこよれば、デスアラニン−Ｂ３０インシュリン（ＤＡＩ　）とＬ−スレ オニンアルキルエステルとのカップリングを０℃〜−３０℃の温度で行ない、認 めうる副生酸物形成なしに高収率でインシュリンエステルを形成する。反応媒体 として約５５〜約７５の範囲のｐＨ値の水および低級アルカノールの混合物を使 用する。かくして作られたインシュリンエステルは、−ｉエステルのアルキル部 分の適切な選択、一部８．５〜１０．５の範囲のｐＨ値の水性媒体中で加水分解 を行なうことにより、おだやかな方法でヒトインシュリンに変える。かくして酵 素、トリフルオロ酢酸およびアニソールの添加が避けられる。

従って本発明の方法は、低級アルカノール中にデスアラニン−Ｂ３０インシュリ ン生成物を懸濁させ、懸濁液とバッファーの添加なしに約５５〜約７．５のｐＥ ｌ値薔こ規制した水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの少なくとも一部の溶 液を混合し、混合物をＯ′Ｃ〜−３０℃の温度に冷却し、（５） 混合物にトリプシン、トリプシン誘導体またはそれに関連した酵素を（所望によ って水中にＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の一部１こ溶解して）加え、 形成された混合物をＯ℃〜−３０℃の温度で５日間以下放置することを特徴とす る。

本発明方法を、例えば５０ｙ以上の出発インシュリン生成物を用いて工業的規模 の如き大規模で実施するとき、本発明の好ましい実施態様では、水中のＬ−スレ オニンアルキルエステルの溶液の一部にトリプシンまたはそれに関連した酵素を 別に溶解し、水中のＬ−スレオニンアルキルエステル ユリン生成物の懸濁液を那え、形成された混合物の温度およびｐＨ値を調整し、 次いで水中のＬ−スレオニンアルキルエステル 酵素の別に作った溶液を加えることからなる。この場合、形成される混合物の温 度およびｐＨ値は一２℃〜−１５℃および５．８〜６．２に調整するのが好まし い。更に水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の１０〜２０重量％で別 にトリプシンまたはそれに関連した酵素を溶解することが好ましい。

本発明方法（こおいては、組合反応は、）く・ンファ−の添加ないこ行なう、反 応成分の緩衝能力は、本発明により与えられた条件下で、ｐＨを５，５〜７．５ の範囲で保つのに充分である。

上記特長は本発明の方法の必須不可欠の特長であり、それらは、この方法を工業 的規模で実施するとき、認めうる副生酸物形成なしに高収率で目的生成物を得る ことを決定的にする。

一合反応において、反応時間は、残余の反応条件、特に温度によって決る。約３ ０〜約１２０時間の反応時間を使用する。

補合反応における低温の糖果として、認めうる副反応は生じない、更にトシル− Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（　ＴＰＣＫ　）で処理した酵素を使 用下ることは必要としない。

本発明方法の特に耳利な実施態様においては、出発材料として生のブタインシュ リン例えばインシュリン塩ケーキを使用する。不発明方法に２いて生のブタイン シュリンを使用するとき、クロマトグラフで精製したブタインシュリンを作った とき得られる収率に相当する高収率のヒトインシュリンを得ることができること が判ったこと価値がある。

これら両方の場合、全体的収率は使用したスイ臓の量に基ついて計算する。

出発材料として生のブタインシュリンの使用が、使用シた酵素および未反応デス アラニン−Ｂ３０インシュリンから得られたヒトインシュリンのクロマトグラフ 分離するのに困難を生ぜしめないことは驚くべきことである。

本発明方法の一合において使用する酵素は、リジンカルボニルペプチド結合を開 裂できなければならない、従ってトリフシン、トリプシン誘導体（例えばアセチ ル化トリプ（　７　） シン）またはこれに関連した酵素、例えばアクロモバクタ−プロテアーゼ］：　 （　ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉ　）を使用できる、これ らの製造および性質はアラキ等のＡｇｒｉｃ，　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ．　％　４　２巻＠１　４　４３頁〜第１４４５頁（１９７８年）（こ 記載されている。トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（　ＴＰＣ Ｋ　）で処理した酵素の使用は、使用した反応混合物中でのかかる酵素の反応性 の劣ること、および上述した低温によりキモｌ−　ＩＪプシン様酵素での可能な 汚染を除くためには必要としないっ 酵素は溶解した形で使用て°きる、しかし不溶ヰマトリックス例えはアガロース またはポリアクリルアミドまたは同様の屯合体吻責，こ結合させることもてきる 。

輪台反応は、酵素同接触反応か進行するペプチド形成反恥を充分に抑制される集 注下で行なう。＠述した如く、ｐＨ値は５５〜７５の間になければならない。温 度は通常０℃〜−３０°Ｃ、好ましくはＱ　’Ｃ〜−２０℃の範囲である。

補合反応中、反応成分、即ちデスアラニン−Ｅ３０インシュリンおよびＬ−スレ オニンアルキルエステルの濃度は高くあるべきである、史１こ使用するＬ−スレ オニンアルキルエステルは大過剰で、２００　二１のモル比、好ましくは２０： １〜１００：１の範囲のモル比で使用すべきである。

組合反応は水混和性低級アルカメールまたはそれらの混合物の存在丁に行なう、 これによって加水分解反応は阻害され、反応成分の溶解度は改良される。低級ア ルカノールの濃度は反応混合物の全容積を基にして計算して２０〜９０（　８　 ） ％、好ましくは３０〜８０％の範囲で選択すべきである。

−合反応が完ｒしたとき、インシュリン様蛋白質はゲルｐ過（こより残存成分か ら分離する、そこでヒトインシュリンエステルはアニオン交換クロマトグラフィ で未反応出発材料から分離される。未反応出発材料はこの方法で再使用すること かできる。

ヒトインシュリンエステルを含有するアニオン交換からの集めた画分は脱塩し、 次いで集めた溶出液のｐＨ値をＮａＯＨで約９５に調整する。常温で２４〜４８ 時間後、純粋なヒトインシュリンを結晶化または他の通常の方法で分離する。

インシュリンアルキルエステルの加水分解は水性溶液中で約８．５〜約９５のｐ Ｈ値で滑らかに進行する。これは加水分解後加水分解混合物を通常の方法で容易 （こ処理できることおよび分岨したヒトインシュリンを高純度で含有する効果を 宵する。

本発明方法で作ったヒトインシュリンは治療用インシュリン調剤の製造に非常に 好適である。何故ならばそれは蛋白分解不純物を含有しないからである、このた め延長された活性を有する調剤の製造に使用できる、何故ならそれは前述した［ Ａ＋ｎｅｓ　Ｔｅｓｔ　Ｊ　ｉこおけるヒトおよびブタ起源のスイ臓から作った ヒトインシュリンおよびブタインシュリンと同じ方法で挙動し、それは一般に使 用されるクロマトグラフ法によって除去するのが困難である不純物を含有しない からである。

更１こ本発明の好ましい実施態様において、出発材料とし（９） て生のインシュリンを使用する場合、同じ量の生インシュリンから得られる高度 をこ精製したブタインシュリンの収率に全く本質的に等しいヒトインシュリンの 収率か得られる。

従って従来知られていなかった程度に工業約１このみならす臨床的（こ満足でき る懸案の方法である。

発明を実施するための形態 本発明を更に下記実施例によって説明する。

実施例　１ １０００ｆｎｑのブタインシュリンに相当する生インシュリンを１００＋ｎ！、 の０．ＩＭ水性ＮＨ４ＨＣＯ３溶Ｍ（ｐＨ８，４）に溶解した。この溶液に約５ ｒｎｑ／−の濃度の水溶液の形で１０ワのカルボキシペプチダーゼＡを加えた。

混合物をゆるやかに撹拌しつつ２０℃で３時間放置した。その直後反応混合物を 凍結乾燥した。

放出されたアラニンの測定は、９３％の分屏収率を示した（アミノ酸分析）。

凍結乾燥した粉末を９６％エタノール（１２，７ｍＡ）中に懸濁し、２０００ｔ ｎｇのＴｈｒ　−０−Ｍｅ　、　ＨＣＩを１ｍＭの酢酸カルシウム中４こ溶解し 、ｐＨを５ＭのＮａＱＨでＰ）１６．ｏｏｉこ調整した。

１０哩のブタトリプシンを５００μｌのＴｈｒ−０−Ｍθ温溶液溶解した。

次にエタノール懸濁液を撹拌しつつＴｈｒ　−０−Ｍｅ温溶液徐々に加えた。混 合物を−１０℃に冷却し、トリプシン溶液を撹拌しつつ加えた。反応混合物を一 １０℃で２２時間（１ｏ）　符表昭ＧＯ−５００４０１（４）放置した。反応を 先ず０．１ＭのＨＣｌてｐＨを２．５に調整し、次いで蒸溜水で容積を５０ｄｉ こして停止させた。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析では７６％のヒトインシュリンエステ ルの生成を示した。

反応混合物を１Ｍ酢酸でセファデックスＧ−５０スーパーフアインのカラム（８ Ｘ８０りでゲル押通した。ヒトインシュリンエステルおよび未反応デスアラニア −Ｂ３０インシュリンを含有する両分を凍結乾燥した。

収量：　８１　ｏｒｎｑの混合生成物 ・その後生成混合物を、塚酸てｐＨ８，１１こ調整した０、０２Ｍのトリスおよ び７Ｍの尿素からなる緩衝液１４０　ｍｊ’／ｈｒで平衡化シタＤＥＡＥセルロ ース（ワット−ｖ　ンＤＥ　５２，５　Ｘ　２３Ｌ：ｒｎ）のカラムで４℃でイ オン交換した。生成物の仕込み完ゴしたとき、カラムを上記緩衝液を用いて２５ 時間溶離し、次いてＩＡ’ｌこついて０．００４５モルの塩化す）　ＩＪウムと 混合した形で上記緩衝液を用いて２時間溶離し、最後に１１について００１１モ ルの塩化ナトリウムと混合した形で上記緩衝液を用い１２時間溶離した。

溶出液は二つの蛋白質主画分を含有していた。最初に溶離した両分は高圧液体ク ロマトグラフィでヒトインシュリンエステルであると同定された、その後溶離し た両分はデスアラニルインシュリンであると同定された。

集めたヒトインシュリンエステル画分を４℃で、０１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ ８，０）でセファデックスＧ２５のカラムで脱塩した、その後ＩＭのＮａ０Ｆｌ 溶液でｐＨを９．５に調整（１１） した。この画分を２４時間で２５℃で放置した。

４８０１ｎｇの純粋なヒトインシュリンを得た、これはアミノ酸分析および高圧 クロマトグラフィで同定した。

実施例　２ １００ｒｎｇのデスアラニン−Ｂ３０インシュリン（蛋白質で計算）を１８８０ μｇの９６％エタノール中をこスラリー化した。２００＋ｎ９のＴｈｒ−０−Ｍ ｅ　、ＨＣＩをｌ　ｍＭの酢酸カルシウムの５００　ｐｌｔこ溶解し、ｐＨ値を ５ＭおよびＩＭのＮａＯＨて６．０に調整した。

１巧のブタトリプシンを１００μｌのＴｈｒ　−０−Ｍｅ−エステル溶液ｆこ溶 解した。

撹拌しながらエステル溶液の残部にデスアラニン−Ｂ３０インシュリン懸蜀液を 那えた。混合物を一１０℃に冷却した。トリプシン溶液を加え、その後混合物を ２２時間−５℃で放置した。

組合の収率は、ピペットにより０５１Ａの酢酸２９２５μｌに上記混合物７５μ ｊを加えて作った混合物を用い、高圧液体クロマトグラフ分析で測定し１こ。

組合の収率：８３％。

国際調査報告 Ｉｎ電＠＋ｎａ＋１ｏｎｓｌＡｏｐＨｅａ＋１ｅｎＮ６．ｐ（７／ＤＫＢ４／Ｑ ＱＱｌ′。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、テスアラニンーＢ３０インシュリン生成物を低級アルカノール中に懸濁し、 バッファーの添加をせずに約５．５〜約７．５のｐＨ値に調整した水中のし一ス レオニンアルキルエステルの少なくとも一部溶液を懸濁液と混合し、混合物を０ 〜−３０℃の温度に冷却し、混合物にトリプシン、トリプシン誘導体またはそれ に関連する酵素を、所望によって水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液 の一部に溶解して加え、形成された混合物をＯ〜−３０゛Ｃの温度で５日以下放 置することを特徴とするブタインシュリン生成物をカルボキシペプチダーゼＡま たは相当する酵素で処理してデスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を形成し 、これを次いてトリプシン、トリプシン誘導体またはそれに関連した酵素および 共有機浴媒の存在下にＬ−スレオニンアルキルエステルと組合し、その後かく形 成されたインシュリンエステルを約８５〜約１０．５の＠囲のｐＨ値の水性媒体 中で加水分解しヒトインシュリンを形成するヒトインシュリンの製造法。 ２、使用するブタインシュリン生成物が生のブタインシュリンである請求の範囲 第１項記載の製造法。 ３、形成された混合物の温度およびｐＨをＯ℃〜−２０℃および５．８〜６．２ にそれぞれ調整する請求の範囲第１項記載の製造法。 ４、縮合反応を約３０分〜約４８時間行なう請求の範囲第１　悟　会コ　１リ　 ｎ）匍１　ン卦　ン辷（１３） ５、　デスアラニン−Ｂ３０インシュリン生成物を使用したカルボキシペプチダ ーゼＡまたは相当する酵素の分離をせずに分離する請求の範囲第１項記載の製造 法。 ６、使用するＬ−スレオニンアルキルエステルかＬ−スレオニンメチルエステル である請求の範囲第１項記載の製造法。 ７、使用する低級アルカノールかエタノールである請求の範囲第１項記載の製造 法。 ８、水中のＬ−スレオニンアルキルエステルの溶液の１０〜２０重量％でトリプ シン、トリプシン誘導体またはそれに関連した酵素を特徴とする請求の範囲第１ 項記載の製造法。 （ｌ　）