JPH02108698A - 炭水化物代謝に対して低下した作用を示す成長ホルモン同化特性を有するタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、１９１個のアミノ酸お
よび２個のジスルフィド結合を有する１本鎖ポリペプチ
ドホルモンである。ｈＧＨは、下垂体前葉のソマトトロ
ピン細胞によって製造され、タンパク質、炭水化物およ
び脂質の代謝に対するその作用によって、身体の成長に
重要な役割を果たしている。少なくとも４種類の別個の
生物学的活性、即ち（１）成長促進、（２）乳腺刺激活
性、（３）糖尿病誘発活性および（４）インシュリン様
活性は、哺乳類の成長ホルモン分子に起因している。

このホルモンは、下垂体性小人症の治療のための補充療
法において成功裡に使用されている。ｈＧＨは、同化促
進特性を有するが故に、その他の種々の医学的症状の治
療用候補物質であると考えられている。しかしながら、
炭水化物代謝に対するその効果は、ある種の状況下では
、その利用の制限となると思われる。記述した様に、ｈ
ＧＨは、実験動物において血清中グルコースの低下およ
び血清中遊離脂肪酸の低下を生じる、初期インシュリン
様活性を有することが報告されている。更に、ｈＧＨは
、試験動物にこのホルモンを投与した数時間後に観察さ
れる糖尿病誘発活性を有している。

経口によるグルコースチャレンジに応答し、血清中グル
コースおよびインシュリンの画濃度は、インシュリン耐
性グルコース過敏症を伴なって上昇する。このデータは
ｈＧＨで処置されたヒト！成人小者に限定されるが、同
じ代謝の乱れが起こる可能性がある。このため、その同
化促進特性を保持しているｈＧＨの糖尿病非誘発性形態
は、ヒト成人の治療用に非常に望ましい。

本発明者らは、成長ホルモンの構造を、成長ホルモン同
化特性の全てまたは一部分を保持しながら、インシュリ
ン様および糖尿病誘発効果の両者を排除するかまたは実
質上低下するように修飾し得ることを見い出した。本発
明は、この様な種類の化合物に関するものである。

これらの活性を分離し、同化活性のみまたは同化活性を
主に有する成長ホルモン“活性コアパを単離することが
、長い間の研究の目標であった。

文献にはヒト成長ホルモン（ｈＧ　Ｈ）の種々の修飾を
記載した多数の報告があるが、成長ホルモン“活性コア
”単離の目標は、まだ達成されていない。

天然の、タンパク分解的に切断された、３種類の２本鎖
形態のヒト成長ホルモンが特性化され、２４に１α、お
よびα３と呼称されている。これらの誘導体は、ルイス
等のレビュー（総説）論文（Ｌｅｗｉｓ　ｅｔ　ａｌ、
＋　艮明り刈肛、比ｏｒｍ、　Ｒ照、３６，４７７−５
０８（１９８０））に記載されている。下垂体から単離
された２４に形態は、ＰｈｅＩ３ｓ位の１個の切断に由
来する。α、形態は残基１３５〜１４０を除去するよう
に切断され、α３形態は残基１３５〜１４６を欠如して
いる。これらの誘導体は通常、成長刺激活性能並びに乳
腺刺激活性の上昇を示す 天然の誘導体以外に、酵素を使ったヒト成長ホルモンの
タンパク分解的修飾について多くの文献がある。使用さ
れた酵素には、トリプシン、キモトリプシン、プラスミ
ン、トロンビン、ズブチリシン、プロメライン、フィブ
リノリシンおよびペプシンが包含される。

ヒト成長ホルモンを修飾するためのトリブシンノ使用は
、すおよびサミュエルソン（Ｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｍｕａ
ｌｓｓｏｎ、　Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　ｌ、
　４７−５２（１９６５）によって、１９６５年にはじ
めて報告された。これらの著者は、ヒト成長ホルモンを
トリプシンで種々の時間処理し、次いで、消化物の生物
学的活性を試験した。彼らは、３０分までの時間消化す
ると、う。

ト脛骨検定によって測定されるように成長促進活性をあ
まり失わないか、またはハトそ嚢検定によって測定され
るように乳腺刺激活性をあまり失わないことを見い出し
た。より長い時間消化すると、成長促進活性は徐々に失
われ、乳腺刺激活性は急に消失した。より最近、グラフ
ら（Ｇｒａｆ　ｅｔ　ｅｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７．２３６５−２
３６９（１９８２））は、ヒト成長ホルモンのトリプシ
ン分解の生成物を、残基１３５から１４５が欠失してい
る誘導体であると特徴つけた。この誘導体は、２種類の
受容体結合検定、放射免疫検定およびラット脛骨検定に
おいて、完全なホルモンと同様の特性を有している。

酵素、プラスミンは、ヒト成長ホルモンを修飾するため
に広範に使用されている。ミルズら（Ｍｉ（１）残基１
−１３４からなるＳ−カルバミドメチル化フラグメント
、（２）フラグメント２０４１、（３）フラグメント９
５−１３４、（４）カルバミドメチル化フラグメント１
４１−１９１と非共有結合コンプレックスの形で結合し
たカルバミドメチル化フラグメント１−１３４、（５）
カルバミドメチル化フラグメントｌ−１３４とカルバミ
ドメチル化フラグメント１４１−１９１の脱アミド化非
共有結合フンブレックス、（６）カルバミドメチル化フ
ラグメント１−１３４．４２１３４および１４＋、ｉ９
１の１；１脱アミド化非共有結合コンプレックス、（７
）Ｄａ、即ちプラスミン消化物の陰イオン交換分離によ
り分離されたフラクション、（８）Ｄｂ、即ち同じ陰イ
オン交換カラムから分離された第２の、より酸性のフラ
クション、および（９）Ｄｃ、即ち同じ陰イオン交換カ
ラムから分離された第３の、より酸性のフラクション、
を包含する、数種のフラクションおよび誘導体の単離と
共に、還元され、Ｓ−カルバミドメチル化されたヒト成
長ホルモンの消化を報告している。ＤａおよびＤｂは、
成長促進活性についてのラットの体重増加検定において
、ヒト成長ホルモンと同等の活性を有すると報告されて
いる。同じグループからの第２報で、リーガンら（Ｒｅ
ａｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
　１０２．１３７７−１３８６（１９７８））は、これ
らの誘導体を、生物学的により詳細に特性化している。

誘導体（４）および（５）は、ラット体重増加検定にお
いてその成長促進活性のほとんどを保持し、乳腺刺激検
定において優れていることが見い出された。逆に、誘導
体（６）は、完全なヒト成長ホルモンに比較して約１／
３の成長促進活性を有したのみであったか、乳腺刺激検
定において同等活性であった。フラクション（７）は、
成長促進活性およびラット精巣上体脂肪組織におけるグ
ルコース酸化によって測定されるインシュリン様活性を
保持し、少し高い乳腺刺激活性を示した。フラクション
（８）は、成長促ノ「活性を保持していたが、約１／２
のインシュリン様活性を失った。フラクション（９）は
、約４４％の成長促進活性を保持していたが、その他の
生物学的活性は試験されなかった。非分画プラスミン消
化物は、完全なヒト成長ホルモンの約１／２の成長促進
活性およびｌ／２のインシュリン様活性、および約３／
４の乳腺刺激活性を有していることが見い出された。こ
れらの誘導体の幾つかの糖尿病誘発活性は、肥満した。

ｂ１０ｂマウスで試験された［リーガン（Ｒｅａｇａｎ
、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　２７．８８３−８８８（１９７
８））］。非分画プラスミン消化物は、Ｓ−カルバミド
メチル化誘導体と同様、完全なヒト成長ホルモンの糖尿
病誘発活性の１００％を保持していることが見いだされ
た。誘導体（４）および（６）も同様に糖尿病誘発性で
あることが見いだされたが、誘導体（２）は糖尿病誘発
活性を有さなかった。

トロンビンは、ヒト成長ホルモン分子内の１カ所、即ち
Ａｒｇｒｓ４で切断し、ジスルフィド結合で結合した２
本の鎖を有する２本鎖分子を生じる。

ジスルフィド結合を還元およびアルキル化すると、２本
の鎖の非共有結合コンプレックスを生じる。

この種の数個の誘導体が、ヒト成長ホルモンのトロンビ
ン消化物から単離されている［ミルズ等（Ｍｉ１６６３
−１６７１（１９８１））］。これには、（１）Ａ　ｒ
　ｇ　１３４に１個のクリップ（切断点）を有する誘導
体、（２）Ｓ−カルバミドメチル化非共有結合コン７’
Ｌ／ツクス、（３）Ｓ−アミノエチル化非共有結合コン
プレックス、（４）Ｓ−カルボキシメチル非共有結合コ
ンプレックス、（５）カルバミドメチル化フラグメント
１１３４、および（６）カルバミドメチル化フラグメン
ト１３５１９１が包含される。これらの誘導体に対して
行われた生物学的検定には、成長促進についてのラット
体重増加検定、インシュリン様活性の指標としてのグル
コースの酸化、糖尿病誘発活性についての肥満ｏ　ｂ　
／　ｏ　ｂマウス検定および乳腺刺激活性についてのＮ
−アセチルラクトサミン合成検定が含まれる。誘導体（
１）は、試験されなかった糖尿病誘発検定以外の全ての
検定において全く活性であった。誘導体（２）および（
３）は、体重増加検定において５Ｏ％活性およびインシ
ュリン様検定において２０％活性であっただけであった
が、乳腺刺激検定において７５−８０％活性であった。

また、これらの２種の誘導体は、糖尿病誘発検定で試験
されなかった。誘導体（４）は、１０％の成長促進活性
および５％のインシュリン様活性のみを有することが見
いだされたが、乳腺刺激検定において全く活性であった
。フラグメント（５）および（６）は、体重増加検定に
おいてごくわずかな活性を有することがわかったが、イ
ンシュリン様活性は非常に低かった。しかしながら、フ
ラグメント（５）は完全なヒト成長ホルモンの２５−５
０％の糖尿病誘発活性を有したが、フラグメント（６）
は検出し得る活性を有さなかった。

υ等（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、２１８．４ｌ−５２（１９５６））は、ヒト成長ホ
ルモンのキモトリプシン消化生成物の生物学的特性を調
べた。彼らは、インキュベーションの時間を長くすると
、ラット脛骨検定によって測定される成長促進活性を徐
々に失うことを見いだした。しかしながら、３００分の
インキュベーション後でも、消化物はなお完全なヒト成
長ホルモンの７５％の活性を保持していた。

“活性コア”は、キモトリプシン消化物の透析によって
得られ、完全な活性を保持することか見いだされた。

フィブリノリシンは、残基１３８から１４７からなるペ
プチドの除去によってヒト成長ホルモンを修飾するため
に使用された［ルイス等（Ｌｅｗｉｓ　ｅｔａｌ、　、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍ、　６７、６１７−６２４（１９７５））。この
誘導体は、非常に高められた成長促進活性および乳腺刺
激活性を有することが見いだされた。

ヒト成長ホルモンをプロメラインで消化すると、３種類
の成分の混合物を生じ、これら３種類は全て残基１−１
３４からなる大きなフラグメント、および残基１４３−
１９１．１４５−１９１または１４６−１９１のいずれ
かからなるより小さいフラグメントを有する。この混合
物は、完全なヒト成長ホルモンの７０−８０％の成長促
進活性および１００％のインシュリン様活性を保持して
いた［ミルズ等（Ｍｉｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　７４２．１６９
−１７４（１９８３））］。この混合物を還元し、Ｓ−
カルバミドメチル化すると、アルキル化された小さいほ
うのフラグメント３種類全てを単離することができる。

次に、これらのフラグメントにトロンビン消化から得た
Ｓ−カルバミドメチル化フラグメントｌ−１３４を補足
すると、この３種の誘導体のアルキル化同属体からなる
非共有結合コンプレックスの混合物を得ることができる
。これらは、成長促進およびインシュリン様活性検定の
両者において、実質上、より小さい活性であることがわ
かった。

ペプシンを使用し、ヒト成長ホルモンが消化された［１
バＬｉ、　Ｌ、　Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４５．１
６９−１７８（１９６２））］。

成長促進活性は、消化時間を長くするに伴って低下する
ことがわかったが、１２０分後でも、元の活性の約６６
％が保持されていた。乳腺刺激活性は６０分の消化では
完全に保持されたが、更に消化すると、活性が完全に消
失した。゛°活性コア”は、透析によって消化物から単
離され、１００％の成長促進活性を保持していた。

ヒト成長ホルモンをズブチリシンで制限的に加水分解す
ると、３種類の２本鎖誘導体、Ｓｌ、Ｓ。

およびＳ３を生じる［ルイス等（Ｌｃｖｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１０１．１５８７−
１６０３（１９７７））］。Ｓ１は、残基１５０−１９
１からなるフラグメントにジスルフィド結合によって結
合した残基１−１３９からなる。

Ｓ、は、残基１４７−１９１からなるフラグメントにジ
スルフィド結合によって結合した残基１１３９からなる
。Ｓ３は、Ｓ２の脱アミド誘導体である。これらの３種
類の誘導体は、ラット脛骨検定で試験され、優れた成長
促進活性を有することが見いだされた。これらは更に、
経口グルコース許容試験を使用し、イヌにおいて糖尿病
誘発活性について試験された。Ｓｌは、高血糖およびイ
ンシュリン過剰を生じるという点で最も高い活性体であ
ることがわかった。Ｓ、およびＳ、も糖尿病誘発性であ
ったがＳｌより低かった。

アミノ末端の最初の１３残基を欠失している、組換えＤ
ＮＡ技術によって製造された、ヒト成長ホルモンの頭部
欠失類似体については、文献に２つの報告がある。［ガ
ートラー等（ＧｅｒＬｌｅｒ　ｅＬ　ａｔ、。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１１８．７２０−７２６（１
９８６）およびアシュケナジ等（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１２１．４１
４４＋９（１９８７）］。この類似体は、ヒト成長ホル
モン、およびＮｂ２細胞およびウシ泌乳期乳腺からの外
植体（体外移植組織）におけるヒツジプロラクチンの両
者の乳腺刺激活性を阻害することが見いだされた。しか
しながら、これは、Ｎｂ、セルラインにおいて成長促進
活性を有していなかっただけでなく、これは、乳腺外植
体によるグルコース取り込みに影響しなかった。これは
、Ｎｂ、細胞、ＩＭ−９細胞、泌乳期ウシ乳腺からの顆
粒体フラクションおよびラット肝臓からの顆粒体フラク
ションへの結合について放射標識されたヒト成長ホルモ
ンと競合したが、非常に低い親和性を有した。

その他の成長ホルモン、主にウシ、ヒツジおよびラット
の成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンに使用したものと
同一の多数の酵素を使用してタンパク分解的に修飾され
、その生物学的特性が研究された。結果は、一般的に言
って、ヒト成長ホルモンで得られた結果と同じ、即ち、
ホルモンのり；／バク分解的修飾は、生物学的特性を変
化させた。

本明細書では２例のみを挙げる。−例はラット成長ホル
モンおよびトリプシンによるタンパク分解を使用し、他
側はウシおよびヒツジ成長ホルモンおよびトリプシンに
よるタンパク分解を使用するものである。メイシアグ等
（Ｍａｃｉａｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　２５５．６０６４−６０７０（１９８０））
は、ラット成長ホルモンを制限的にトリプシン加水分解
すると、２種類の７ラグメント、即ちジスルフィド結合
によって連結された残基１−９５と残基１３４−１９１
からなる一方のフラグメント、および残基９６１３３か
らなる他方のフラグメントを生じた。これらの２種類の
誘導体は、単離された肝細胞との相互作用およびラット
脛骨検定における成長刺激活性について試験された。大
きい方のフラグメントは、完全な成長ホルモンと同様の
結合特性を示したが、成長促進活性をわずか、または全
く有さなかった。小さい方のフラグメントは成長ホルモ
ン受容部位と弱く相互作用したが、有意な成長促進活性
を有した。

グラフおよびり（Ｇｒａｆ　ａｎｄ　Ｌｉ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　１３，５４０８−５４１５（１９７４））は
、ウシおよびヒツジの両成長ホルモンをトリプシンで消
化し、残基９６−１３３に相当する各々の消化物からの
フラグメントおよび残基１５１−１９１に相当するウシ
成長ホルモン消化物からのフラグメントを単離した。こ
れらの誘導体は、成長促進活性についてラット脛骨検定
で試験され、３種類全てが測定可能な活性を有すること
がわかった。

このように、ヒト成長ホルモンの多数の誘導体は、分子
の生物学的特性に変化が生じることが記載されてきた。

しかしながら、これらの誘導体はいずれも、Ｎ−末端に
おける頭部切断と大きなループにおける切断または欠失
の両者を含むものではない。更に、これらの誘導体はい
ずれも、実質上全ての同化促進活性を保持しておらず、
インシュリン様および糖尿病誘発活性が実質上低下した
ものではなかった。

従って、本発明は、天然のホルモンに比較すると実質上
低下したインシュリン様および糖尿病誘発活性を有し、
天然のホルモンの実質」１全での同化促進活性を有する
修飾成長ホルモンに関するものである。

より詳細には、本発明は、対応する天然の成長ホルモン
に比較して同化特性および実質上低下したインシュリン
様および糖尿病誘発効果を有し、ａ）ヒト成長ホルモン
の構造のアミノ末端から、少なくともアミノ酸残基ｌ−
５であって、アミノ酸残プλ１−１９を越えない残基配
列が除去されているか、または非ヒト成長ホルモンであ
る場合、同等の配列が除去されており； ｂ）ヒト成長ホルモンの構造の残基１２７のカルボキン
部分から残基１５３のアミノ部分までのいずれかの点で
ペプチド結合が切断されているか、または非ヒト成長ホ
ルモンである場合、同等の残基においてペプチド結合か
切断されており；Ｃ）所望により、ヒト成長ホルモンの
構造のアミノ酸残基１２８１５２の１またはそれ以上の
残基が除去されているか、または非ヒト成長ホルモンで
ある場合、ｌまたはそれ以上の同等のアミノ酸残基が除
去されている、 点で構造を異にする修飾成長ホルモンに関するものであ
る。

既述した様に、本発明は、成長ホルモン分子を、同化活
性を維持しながらそのインシュリン様および糖尿病誘発
効果を実質上低下するように構造的に修飾し得るという
知見に関するものである。

“実質上低下した°°という語句または本明細書で使用
されるこの語句と類似した用語は、天然のホルモンのイ
ンシュリン様および糖尿病誘発活性の少な（とも約６０
％を失っていることを意味する。“実質上全て”という
語句またはこの語句と類似した用語は、天然のホルモン
の同化活性の約６０％以上を保持していることを意味す
る。

本発明の好ましい化合物は、天然のホルモンの同化活性
の少なくとも約７０％を有し、天然のホルモンのインシ
ュリン様および糖尿病誘発活性の少なくとも約９０％を
失った化合物である。

本明細書において成長ホルモンに関連して使用される“
修飾”という語句は、単に分子の構造を記載することを
意図するものであって、その供給源を表すことを意図し
ない。即ち、本明細書で使用される“修飾成長ホルモン
°゛なる語句は、完全な成長ホルモンから製造される分
子に限定されない。しかしながら、製造された°゛修飾
成長ホルモン”は、その構造が、それが関連する成長ホ
ルモンの構造に関連し、かつ基づく限り、本発明の化合
物の範囲に包含される。

とりわけ、また好ましくは、修飾成長ホルモンがヒト成
長ホルモンに構造的に関連している場合、修飾ヒト成長
ホルモンの構造は、天然のヒト成長ホルモンに比較して
、アミノ末端でアミノ酸残基の配列が除去されたような
構造となるであろう。

除去される配列は、ヒト成長ホルモンの少なくとも最Ｆ
／Ｊの５アミノ酸残基（Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　
ｈｒ　−１１ｅ−Ｐｒｏ）であるが、最初の１９アミノ
酸残基（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−３ｅｒ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ”−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−ＭｅｔＬｅｕ−Ａｒｇ−ΔＩａ−
Ｈｉｓ−Ａｒｇ）より大きくない。

アミン末端から除去される部分は、残基１−５から残基
１−１９のいずれかの範囲となり得、好ましくは切断さ
れる配列は残基１−７から残基１１２の範囲となる。残
基１−８が除去されるのが最も好ましい。

更に、修飾ヒト成長ホルモンは、ペプチド鎖が残基１２
７（Ａｒｇ）のカルボキシル部分から残基１５３（Ａｓ
ｐ）のアミン部分までの範囲の点で切断されているとい
う点で天然のホルモンと異なる。

所望により、ヒト成長ホルモンの残基１２８１５２で表
される配列の全部またはいずれかの部分を除去すること
によって、修飾ヒト成長ホルモンを更に変更することが
できる。この配列は、以下の通りである：　−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ａｓｐ”−ＧｌｙＳ　ｅｒ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｎ　−Ｔ　１ｅＰｈｅ　−Ｌ
ｙｓ”’−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−ＬｙｓＰ
ｈｅ　−Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｓ　ｅｒ”’−
Ｈｉｓ　−Ａｓｎ 修飾ヒト成長ホルモンの構造は、残基１３５−１４５が
除去された構造であるのが好ましい。

本発明の修飾成長ホルモンが非ヒト成長ホルモンに基づ
く場合、除去されたかまたは修飾された配列がヒト成長
ホルモンのために上に定義された配列にアナローガスな
配列であることだけを除いて、前記の基準が適合する。

従って、例えば、これをアブデル−メタイル等（＾ｂｄ
ｅｌ−Ｍｅｑｕｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、ＳＡ、　８４．６４３４
−６４３７（１，９８７）　ｐａｇｅ　６４３７）に記
載の配列に適用すると、対応する天然の成長ホルモンに
対して以下の修飾体が得られる。

成長ホルモン　除去される　任意に除去され残基の範囲
、　る残基の範囲、 ブタ　　　　　　１ ウシ　　　　１ ヒツジ　　　１ ウマ　　　　　１ ニワトリ　　　１ ６〜１−２０　　　　　１２７ ６〜１−２０　　　　　１２７ ６〜１−２０　　　　　１２７ ５〜１−１９　　　　　１２６ ６〜１−２０　　　　　１２７ 便宜上、本発明の化合物を天然のホルモン、およびそれ
から除去された部分および／または鎖内部の切断点に基
づいて命名する。従って、本発明の化合物の例は： デスｌ−５＋　１２８−１５２−ヒト成長ホルモン、デ
スｌ　−、＋　１３０−１３８−ウシ成長ホルモン、デ
スｌ−１５＋　１３２−１４５−ブタ成長ホルモン、デ
スＩ１０＋スプリット（分裂）＋３２−１３３−ヒト成
長ホルモン デスｌ−８＋　１’３５−１４５−ヒト成長ホルモン、
デスｌ−１４＋１４゜−１４５−ヒツジ成長ホルモン、
デスｌ−１ｆｆｉ＋　１２８−１４０−ウマ成長ホルモ
ン、デスｌ−１１１＋　１３０−１１３−ニワトリ成長
ホルモン、デス１．□９＋　１３６−１３８−ヒト成長
ホルモン、デス、−１３スプリット＋５０−１５１−ヒ
ト成長ホルモン、デス、□＠＋　１．５−１３２−ヒト
成長ホルモン、デスｌ−１１＋スプリット＋４３−１４
４−ヒト成長ホルモン等である。

本発明の化合物は、現在では一般的となった組換えＤＮ
Ａ技術を使用して製造することができる。

従って、最終的に内部切断しようとする点に選択的切断
部位を有する直鎖状分子として、目的とする化合物を発
現することができる。発現生成物をまず、既知の方法を
使用して折り畳み（ひだ形成し）、それぞれ５３と１６
５位、および１８２と１８９位のシスティン残基の反応
によって、ヒト成長ホルモン中に存在するような２個の
ジスルフィド結合を生成させる。

ひた形成反応後、得られた生成物をトリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢを使用し、既知（１）　１３７
ｋによって切断することができる。この切断は、切断部
位に−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−または−Ａｒｇ−Ａｒｇ−の様
な二塩基性ジペプチド配列を組み込むように発現分子を
仕立てることによって達成される。トリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢで処理ケると、二塩基性ジペプ
チドの欠失を伴って所望の分子が生成される。

アミノ末端にメチオニン残基を有している前記の化合物
も本発明の範囲に包含される。メチオニン残基の存在は
、生成物が組換えＤＮＡ法によって製造された場合に起
こり、得られた一本鎖中間体タンパク発現生成物は開始
メチオニン残基を含有している。メチオニンは、メチオ
ニンの直接切断またはメチオニンの除去を助ける切断部
位を有するタンパクの発現による、既知の方法によって
除去することができるが、開始メチオニンを保持してい
る化合物も本発明の一部とみなされる。

本発明のある種の化合物は、天然のホルモンの酵素的処
理によっても製造することができる。即ち、例えばヒト
成長ホルモンを制御的にトリプシン分解すると、本発明
の好ましい化合物の１つであるデス１−１１＋　１３５
−＋４５−ヒト成長ホルモンが生成される。

前記した様に、本発明の化合物は、成長ホルモンの同化
作用に匹敵する同化作用を有するが、成長ホルモンに存
在するより実質上低下したインシュリン様および／また
は糖尿病誘発効果を有する。

本発明の化合物は、その同化活性のために、手術後（外
傷）の治癒過程；ターナ−症候群；総合非経口的栄養（
ＴＰＮ）、正常な低置１児の成長（小人症である必要は
ない）；栄養失調の回復；骨粗しよう症（長期治療）；
うっ面性潰瘍、しよくそう性潰瘍、糖尿病性泄瘍を包含
する傷の治癒；高齢悪液質性状態（全般的同化作用）；
および慢性腎不全に有用である。

この様に、これらは種々の医薬組成物および製剤に使用
することができ、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内の
様な種々の通常の経路によって投与することができる。

本発明の化合物を投与する場合、注射に好適な薬学的形
態は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液
または分散液に復元するための滅菌粉剤を包含する。

滅菌注射用溶液は、本発明の化合物を所望量の適当な許
容される溶媒、並びに所望により、医薬製剤に使用され
るその他の種々の通常の成分と組み合わせることによっ
て製造することができる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明するか、これ
らは本発明の範囲を限定するものではない。

火廊週　　デスｌ−８＋　１３ｆｉ−１４５−ヒト成長
ホルモン（デスｌ−ａ＋　ＩＣｌ３−１４ｆｌ　　ｈ　
Ｇ　Ｈ）の製造Ａ、ヒト成長ホルモンの変換 生合成ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）にトリプシンを作用
させることによって、デスＩ−ａ＋　１ｆｆ５−１４５
ｈＧＨを製造した。ｈＧＨ約１グラムを５ＱｍＭトリス
ー酢酸ｐＨ７，５緩衝液中、１０１ｇ／ｉｏ。

の濃度で溶解し、トリプシン（ＴＰＣＫ）（クーパー・
バイオメディカル（Ｃａｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｅｉｃ
ａｌ））２０Ｍｇを加え、１１５０のトリプシン／　ｈ
　Ｇ　Ｈ７ｎ比とした。この反応混合物を３７°Ｃで約
１時間インキユベートシ、この時点でトリプシン阻害剤
、Ｎ−１−シル−し一リジンクロロメチルケトン（ＴＬ
ＣＫ）５ｘｇを加えることによって反応を終結させた。

反応混合物をミリボア（Ｍ　ｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）
フィルター（０，４５μＲ）で濾過して澄明にし、所望
の生成物を単離し、以下のクロマトグラフィー工程によ
って精製した。

Ｂ、　　　Ｑ−セファロース・ファースト・フローカラ
ム（２，２Ｘ　２８ｃ＋ｎ）にＱ−セファロース・ファ
ースト・フロー（ファルマシア”）約ＬＯＯｍＱを充填
し、緩衝液Ａ（５０ｎ＋ＭトリスーＨＣＱｐＨ８，３０
％アセトニトリル、０．１０Ｍ　Ｎａ（１り中で平衡化
した。上の工程からの澄明な反応混合物を適用し、緩衝
液Ａと緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ト’）スＨＣａｐＨ８，３
０％アセトニトリル、０．１４Ｍ　ＮａＣ（りを混合す
ることによって得た直線状塩グラジェントでタンパクを
溶離した。グラジェントは約２６次Ｑ／ｃｍ”／時間の
流速で、９６０分間で０−１００％Ｂとした。タンパク
の溶出を２８Ｑｎｍにて分光光学的にモニターした。所
望の生成物を含有しているフラクションを、下記のモノ
Ｑ（ＭｏｎｏＱ）分析で分析することによって集めた。

Ｃ逆相Ｈ，ＰＬＯ １０ミクロンのＣ−８シリカ（デュポン（Ｄ　ｕｐｏｎ
ｔ）を充填した逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃカラム（ＩＸ１５ｃｍ
）を、５０　ｍＭ　トリス−ＨＣ（ｐＨ８，１６，５％
アセトニトリル、２２．５％ｎ−プロパツールからなる
溶媒中で平衡化した。Ｑ−セファロース・ファースト・
フローカラムから集めたフラクションを適用し、溶媒Ａ
（５０ｍＭｔ−リス−ＨＣ１２ｐＨ８，３０％アセトニ
トリル）と溶媒Ｂ（５０１１Ｍトリス−Ｈ（Ｊ）ｐＨ８
，５０％ｎ−プロパツール）を混合することによって得
たグラジェントでタンパクを溶離した。グラジェントは
０．２５ｘ＆／分の流速で、１６０分間で４５−６５％
Ｂとした。溶出を２２０μｍにて分光光学的にモニター
した。所望の生成物を含有しているフラクションを、下
記のモノＱ（ＭｏｎｏＱ）分析を使用して集めた。

Ｄ、セファデックスＧ２５ 所望の生成物を含有している逆相カラムからのフラクシ
ョンを集め、セファデックスＧ−２５を充填したカラム
（２，２Ｘ２６ＣＩ１１）にかけ、有機溶媒および緩衝
塩を除去した。ｐＨ８のアンモニア緩衝化水を使用して
カラムを平衡化し、集めたフラクションを適用し、同一
の溶媒を使用し、３好／分の流速でタンパクを溶出した
。タンパクの溶出を２８０μｍにて分光光学的にモニタ
ーし、有意な吸収を有するフラクションを果め、凍結乾
燥して、デス＋−ｓ＋＋＋ｓ−＋ａｓｈＧＨｌ　２．９
１１ｇを得Ｅ、デス＋−ｉ＋＋＊ｓ−＋４ｓｈＧＨの分
析生成物の形成をモニターし、カラムフラクション中の
デスＩ−８＋　＋ｓｓ−＋＊ｓｈＧ　Ｈを測定するため
に使用した分析は、モノＱ　ＨＲ５１５カラム（ファル
マシア）を使用するクロマトグラフィー分析であった。

使用した緩衝液は、Ａ：５０ｍＭ）リスＨＣｌ２ｐＨ８
，３０％アセトニトリルおよびＢ：５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｆｆｌ）Ｈ８，３０％アセトニトリル、０．２ＭＮａ
Ｃ（ｌであった。流速は１．ＯＲＱ　／分であり、グラ
ジェントは２０分間で０−１００％Ｂとした。カラムか
らのタンパクの溶出を２１４ｒ＋ａ＋または２８０μｍ
のいずれかにて分光光学的に追跡した。

デスｌ−８＋　＋ｓａ−＋＋５ｈＧｆ（の生物学的活性
成長ホルモン（ＧＨ）の同化作用は、窒素、水およびミ
ネラル類の保持および体中の総ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタ
ンパクの合成で表される。成長ホルモンはまた、２つの
逆の作用；　（ａ）初期インシュリン様効果および（ｂ
）後期糖尿病誘発効果を有している。ＧＨのインシュリ
ン様効果は、絶食させた（−夜）下垂体切除ラットを使
用する実験で非常に容易に証明される。絶食させた下垂
体切除ラットにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を投与する
と、血清中グルコースおよび遊離脂肪酸（Ｆ　Ｆ　Ａ）
濃度の一時的な低下を生じる。デスＩ−８＋　＋３５−
１４５ｔｌ　Ｇ　Ｈを腹腔内注射した１時間後の、絶食
させた下垂体切除ラットでは、血清中グルコースおよび
ＦＦＡ濃度の一時的な低下は起こらなかった。絶食させ
た雌性下垂体切除ラットについて行った試験の結果を第
１表に示す。

第１表　絶食させた下垂体切除ラットの血清中グルコー
スおよびＦＦＡ濃度に及ぼすｈＧＨおよびデスｌ−８１
ｒｚｓ−１ａｓｈ　Ｇ　Ｈの影響ｈＧ）Ｉ（２５μｇ） ｈＧＨ（５０μｇ） ｈＧＨ（ＩＱ（ｌμｇ） ｈＧｌｌ（２００μｇ） グルコース ＦＡ ８０．６±２．５　０．７３７±０．０２９５９．６±
３．４＊　０．３６６±０．０３５＊４７．５±３．９
ネ　（１，４８２士０．０７０ネ３２．４±２．６１　
０．２０２±０．０１２＊デス＋−ｓ、＋５ｓ−Ｉ−ｓ
ｈＧＨ（２５μｇ＞　　８５．２±２．１　０．７４７
±０．０２５デス＋−１ｚｓ−＋−５ｈＧＩｌ（５０μ
ｇ）　　７６．６±５．３　０．６０４±０．０６１デ
ス１−１１＋　１３５〜１４ｓｈＧ１１（１００μｇ）
８８．９±５．８　０．６５４１０．０５２ｂ＝平均値
±ＳＥＭ ＊：ｐ≦０．０５；有意差は、２−ティリング検定によ
り求めた。

ダネット 成長ホルモンの初期イン／ニリン様効果の確認は、雄性
ラット精巣上体脂肪組織を使用し、イン・ビトロで証明
された。インシュリンと同様、正常な成長ホルモンは、
イン・ビトロで精巣上体脂肪Ｋｉｌ　織へのグルコース
の取り込みを刺激し、グルコースの二酸化炭素（Ｃｏｗ
）および脂質への変換を生じることが示された。第２表
は、種々の投与量のｈ　Ｇ　！（によって、グルコース
からＣＯ２への変換が起こるが、デスＩ−ａ＋　＋３ｓ
−Ｉｈ５ｈ　ＧＨはその変換に何ら効果を有さなかっな
ことを示す。第２表はまた、種々の投与量のｈ　Ｇ　Ｈ
によって、グルコースから脂質への変換が起こるが、デ
スｌ−１１＋１３％、、、ｈＧＨはいずれの投与量でも
その変換を生じないことを示す。イン・ビトロにおける
これらの結果から、イン・ビボでこの効果がないことが
確認され、デスｌ−１＋Ｉ３Ｓ□、、ｈＧＨは初期イン
シュリン様活性を全く有していないことを示唆している
。

第２表　イン・ビトロの精巣上体脂肪束組織によるグル
コースの二酸化炭素への酸化に対するデスｌ−１１１５
−１４６）Ｉ　Ｇ　Ｈおよびヒト成長ホルモンの効果 Ａ、グルコースの二酸化炭素への変換 試験化合物　　　投与量　　ΔμＭグルコー（μ９／Ｒ
Ｑ）　　　スＣ／渭ｕ　Ｍ／３１１Ｒヒト成長ホルモン ０．０±０．０ ０．１±０．４’ ■、５土０．２＊ ２．５±０．４＊ デス１４＋　１３６−１４５ｈ　Ｇ　Ｈｏ、０士０．０ ０．４±０．２ ０．５±０．５ ０５土０．５ Ｂ、グルコースの脂質への変換 試験化合物　　　投与量 （μ９／ｕｃ） ヒト成長ホルモン ΔμＭグルコー スＣ／勲ｒｙ　Ｍ／３ＨＲ ０，０±０．０ ０．２十０１ １．８±０，５＊ ５．５±１５＊ デスＩ　−８＋　＋　３５−１４５　ｈ　Ｇ　Ｈｏ、０
±００ ０．３±０３ ０．０±１．０ ０．０±１０ ａ：平均値±ＳＥＭ ＊：平均値の統計的有意差はダネット検定によって求め
た。

その初期インシュリン様活性とは逆に、ｈＧＨは、糖尿
病誘発または抗インシュリン様活性をも有する。この活
性は、ｈＧＨ１回注射の数時間後に生じる。長期間にわ
たるｈＧＨの複数回注射は、−時的または永久的糖尿病
（インシュリン耐性グルコース許容性）に導くことがあ
る。同一条件下でデス１．□、、　、、、、、、ｈ　Ｇ
　Ｈを投与しても、雌性ピーグル成人における基準血清
中インシュリンまたはグルコース濃度に対して全く影響
がなかった。

更に、デス＋−ａｒＩｓ５−＋ａ５ｈＧＨは、経口グル
コースチャレンジへの応答において血清中グルコースま
たはインシュリン濃度に全く影響を示さなかった。

デス１４＋　１１５−１４ｉｈ　Ｇ　Ｈに糖尿病誘発性
がないことを証明するために、雌性ピーグル成人へのデ
スｌ−Ｌ　＋＊ｆｉ−＋’＋ｓｈ　Ｇ　Ｈの（ａ）急性
および（ｂ）慢性投与の２種類の試験方法を使用（、た
。第１の試験では、デス、ａ、Ｉｊ５−１＝Ｓ！”＋Ｇ
Ｈ（０，１２５・０．２５０または０．５０ご９／ｋｇ
）の１回皮下注射の前および１２時間後に、イヌに経口
グルコース許容試験（ＯＧＴＴ）を行った。デスｌ−１
１＋ｌ、ｌｓ□４５ｈＧＨのいずれの投与量も、基準血
清中インツユリンまたはグルコース濃度に影響を示さず
、いずれの投与量もグルコースチャレンジに対する応答
において血清中グルコースまたはインシュリン濃度に影
響を示さなかった。第２の試験では、イヌに短い期間（
７日間、７回の注射）のデスＩ−８＋Ｌ１５＋、５ｈｃ
Ｆ１（０，２５０および０．５００肩９／／９）皮下注
射処置を行った。経口グルコース１１性試験は、処置を
開始する前、およびデスＩ−８＋　１３５−＋ａ５？ｌ
　Ｇ１１の最後の注射の１２時間後に行った。デス、−
８゜３、−１４．ｈＧＨのいずれの投与量も、基準血清
中グルコースまたはインシュリンｌ農度、または経口グ
ルコースチャレンジに対する応答における血清中グルコ
ースまたはインツユリンに対して影響を有さなかった。

これらの試験の結果は、使用した投与量ではイヌにおい
て糖尿病誘発活性を示さないことを証明している。

デスＩ−ｋ　＋３ｓ−＋４ｓｈ　ＧＨの成長促進活性は
、下垂体切除うｙ）を使用し、体重増加の上昇および近
位脛骨軟骨の広さの増大を測定する、１０日間の生物学
的検定において証明された。行った全ての生物学的検定
において、デス、−８゜３．□、、ｈＧｌ［は、天然の
ｈＧＨの約７０％の生物学的活性を示した。この生物学
的検定以外に、デスｌ−８＋１３５、、、ｈＧＨは、尿
および血清の両者中の尿素窒素濃度に低下を生じること
が示された。この同化作用は、デス＋−ｓ＋＋＋ｓ−＋
４ｓｈＧＨがタンパク生合成で使用するための窒素の保
持を来すことを示している。

特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー 代 理 人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然のホルモンに比較して実質上低下したインシュ
   リン様および糖尿病誘発活性を有し、天然のホルモンの
   実質上全ての同化活性を保持している修飾成長ホルモン
   。 ２、対応する天然の成長ホルモンの構造とは、ａ）ヒト
   成長ホルモンの構造のアミノ末端から、少なくともアミ
   ノ酸残基１−５であって、アミノ酸残基１−１９を越え
   ない残基配列が除去されているか、または非ヒト成長ホ
   ルモンである場合、同等の配列が除去されており； ｂ）ヒト成長ホルモンの構造の残基１２７のカルボキシ
   部分から残基１５３のアミノ部分までのいずれかの点で
   ペプチド結合が切断されているか、または非ヒト成長ホ
   ルモンである場合、同等の残基においてペプチド結合が
   切断されており；ｃ）所望により、ヒト成長ホルモンの
   構造のアミノ酸残基１２８−１５２の１またはそれ以上
   の残基が除去されているか、または非ヒト成長ホルモン
   である場合、１またはそれ以上の同等のアミノ酸残基が
   除去されている、 点で構造を異にする請求項１に記載の修飾成長ホルモン
   。 ３、対応する天然の成長ホルモンがヒト成長ホルモンで
   ある請求項１または２に記載の修飾成長ホルモン。 ４、アミノ末端から除去されるアミノ酸残基が少なくと
   もアミノ酸残基１−７であるがアミノ酸残基１−１２以
   上ではない、請求項２または３に記載の修飾成長ホルモ
   ン。 ５、アミノ末端から除去されるアミノ酸残基がアミノ酸
   残基１−８である請求項２から４のいずれかに記載の修
   飾成長ホルモン。 ６、残基１２７のカルボキシ部分から残基１５３のアミ
   ノ部分までのいずれかの点のペプチド結合が、アミノ酸
   残基１２８−１５２の除去を伴わずに切断されている請
   求項２から５のいずれかに記載の修飾成長ホルモン。 ７、残基１２７のカルボキシ部分から残基１５３のアミ
   ノ部分までのいずれかの点のペプチド結合がアミノ酸残
   基１２８−１５２の１またはそれ以上の残基の除去を伴
   って切断される請求項２から５のいずれかに記載の修飾
   成長ホルモン。 ８、残基１３５−１４５が除去されている請求項７に記
   載の修飾成長ホルモン。 ９、アミノ末端から除去されるアミノ酸残基が少なくと
   もアミノ酸残基１−７であるがアミノ酸残基１−１２以
   上ではない請求項８に記載の修飾成長ホルモン。 １０、アミノ末端から除去されるアミノ酸残基がアミノ
   酸残基１−８である請求項９に記載の修飾成長ホルモン
   。 １１、アミノ末端が更に開始メチオニン残基を含むよう
   に修飾されている請求項２から１０のいずれかに記載の
   修飾成長ホルモン。 １２、修飾成長ホルモンのアミノ酸配列を有し、ヒト成
   長ホルモンの構造の残基１２７のカルボキシ部分から残
   基１５３のアミノ部分までのアミノ酸配列中に存在する
   いずれかのアミノ酸残基によって表される位置、または
   非ヒト成長ホルモンである場合はそれと同等の位置、に
   おける切断によって修飾成長ホルモンを生成することが
   できる切断部位、を有する、一本鎖であるジスルフィド
   含有前駆体分子を切断することからなる、請求項２から
   １１のいずれかに記載の修飾成長ホルモンの製造方法。 １３、請求項１から１１のいずれかに記載の修飾成長ホ
   ルモンを活性成分とし、１またはそれ以上の薬学的に許
   容し得る担体を含有してなる医薬製剤。 １４、治療に使用される請求項１から１１のいずれかに
   記載の修飾成長ホルモン。