DE68927316T2

DE68927316T2 - Proteine mit anabolischen Fähigkeiten von Wachstumshormonen und vermindertem Einfluss auf den Carbohydrat-Metabolismus

Info

Publication number: DE68927316T2
Application number: DE68927316T
Authority: DE
Inventors: Gerald Wayne Becker; Carl Joseph Shaar
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1988-08-19
Filing date: 1989-08-15
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2009-08-16
Also published as: US5079345A; EP0356107A2; ES2092474T3; EP0356107B1; EP0356107A3; DE68927316D1; CA1339046C; JPH02108698A

Description

Humanes Wachstumsshormon (hGH) ist ein einkettiges Polypeptidhormon, das 191 Aminosäuren und zwei Disulfidbindungen enthält. hGH wird von den somatotropen Zellen der vorderen Hypophyse synthetisiert und spielt eine wichtige Rolle beim somatischen Wachstum durch die Wirkungen auf den Metabolismus von Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden. Es wurden zumindest vier unterschiedliche biologische Aktivitäten dem Wachstumshormonmolekül dei Säuger zugeschrieben, nämlich (1) Wachstumsförderung, (2) lactogene Aktivität, (3) diabetogene Aktivität und (4) Insulin-ähnliche Aktivität. Dieses Hormon wlifde erfolgreich bei Substitutionstherapien zur Behandlung von hypophysärem Minderwuchs verwendet. Aufgrund seiner anabolen Eigenschaften dürfte hGH ein Kandidat zur Verwendung bei der Behandlung einer Vielzahl von anderen Krankheitszuständen sein. Jedoch betrachtet man die Wirkungen auf den Kohlenhydratmetabolismus als potentielle Limitierungen der Brauchbarkeit in bestimmten Situationen. Wie erwähnt weist hGH eine frühe insulinähnliche Aktivität auf die bei Labortieren einen Abfall der Serumglucose und einen Abfall der freien Fettsäuren im Serum verursacht. Zusätzlich weist hGH eine diabetogene Aktivität auf, die einige Stunden nach der Verabreichung des Hormons an Versuchstiere beobachtet wird. Bei der Reaktion auf eine orale Glucosegabe wird sowohl der Serumglucosespiegel als auch der Insulinspiegel mit einer einhergehenden insulinresistenten Glucoseintoleranz erhöht. Obwohl die Daten der mit hGH behandelten erwachsenen Patienten beschränkt sind, besteht die Möglichkeit, daß dieselben metabolischen Störungen auftreten können. Aufgrund dessen ist eine nicht-diabetogene Form des hGH, die die anabolen Eigenschaften behält, zur Verwendung bei der Behandlung von erwachsenen Patienten äußerst wünschenswert.
Es wurde festgestellt, daß die Struktur von Wachstumshormonen verändert werden kann. um sowohl die insulinähnlichen als auch die diabetogenen Wirkungen unter Beibehaltung der gesamten oder eines Teil der anabolen Eigenschaften des Wachstumshormons zu eliminieren oder wesentlich zu verringern. Die Erfindung betrifft eine solche Klasse an Verbindungen.
Es war lange ein Forschungsziel, diese Aktivitäten zu trennen und eine "aktive Grundstruktur" eines Wachstumshormons zu isolieren, die nur oder vorwiegend anabole Aktivität aufweist. Obwohl viele Berichte in der Literatur existieren, die verschiedene Modifikationen des humanen Wachstumshormons (hGH) beschreiben, blieb das Ziel der Isolierung der "aktiven Grundstruktur" des Wachstumshormons unerfüllt.
Drei natürlich auftretende proteolytisch gespaltene zweikettige Formen des humanen Wachstumshormons wurden charakterisiert und mit 24K, α&sub2; und α&sub3; bezeichnet. Diese Derivate sind in einem zuusammenfassenden Artikel von Lewis et al., Rec. Progr. Horm. Res. 36, 477-508 (1980) beschrieben. Die 24 K Form, die aus der Hypophyse isoliert wurde, resultiert aus einer einzigen Spaltung an Phe139. Die α&sub2; Form wurde gespalten, um die Reste 135 bis 140 zu entfernen und der α&sub3; Form fehlen die Reste 135 bis 146. Diese Derivate zeigen im allgemeinen eine Potentierung der wachstumsstimulierenden Aktivität wie auch einen Anstieg der lactogenen Aktivität.
Zusätzlich zu den natürlich auftretenden Derivaten existiert eine ausführliche Literatur über die Verwendung von Enzymen, um das humane Wachstumshormon proteolytisch zu modifizieren. Unter den verwendeten Enzymen sind unter anderem Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin Thrombin, Subtilisin, Bromelain, Fibrinolysin und Pepsin.
Die Verwendung von Trypsin zur Modifizierung des humanen Wachstumshormons wurde das erstemal 1965 von Li und Samuelsson, Mol. Pharmacol. 1, 47-52 (1965) berichtet. Diese Autoren behandelten humanes Wachstumshormon mit Trypsin für unterschiedliche Zeitspannen und testeten dann die biologischen Aktivitäten der Ansätze. Sie fanden, daß ein Verdau für bis zu 30 Minuten zu einem geringen Verlust der wachstumsfördernden Aktivität führte, wie dies durch den Rattentibiatest gemessen wurde, oder zu einem geringen Verlust der lactogenen Aktivität führte, wie dies durch den Taubenkropfbeuteltest gemessen wurde. Längere Verdauzeiteil führten zu einem graduellen Verlust der wachstumsfördernden Aktivität und einem abrupten Verlust der lactogenen Aktivität. Später charakterisierten Graf et al., J. Biol. Chem. 257, 2365-2369 (1982) ein Produkt der Trypsinolyse von humanem Wachstumshormon als ein Derivat, dem die Reste 135 bis 145 fehlen. Dieses Derivat hat ähnliche Eigenschaften zum intakten Hormon in zwei Rezeptorbindungstests, einem Radioimmunassay und dem Rattentibiatest.
Das Enyzm Plasmin wurde ausgiebig verwendet, um das humane Wachstumshormon zu modifizieren. Mills et al., Endocrinol. 102, 1366-1376 (1978) berichten den Verdau von reduziertem und S-carbamidomethyliertem humanem Wachstumshormon mit der Isolierung von mehreren Fraktionen und Derivaten einschließlich (1) des S-carbamidomethylierten Fragments, das aus den Resten 1-134 besteht, (2) des Fragments 20-41, (3) des Fragments 95-134 (4) des carbamidomethylierten Fragments 1-134, das in einem nicht-kovalenten Komplex mit dem carbamidomethyliertem Fragment 141-191 gebunden ist, (5) des desaminierten nicht-kovalenten Komplexes aus dem carbamidomethylierten Fragment 1-134 und dem carbamidomethylierten Fragment 141-191, (6) eines 1:1 desamidierten nichtkovalenten Komplexes aus den carbamidomethylierten Fragmenten 1-134, 42-134 und 141-191, (7) Da, einer aus einer Anionenaustauscherfraktion des Plasminverdaus isolierten Fraktion, (8) Db, einer zweiten, noch saureren Fraktion, die von derselben Anionenaustauschersäule isoliert wurde und (9) Dc, einer dritten noch saureren Fraktion, die von derselben Anionenaustauschersäule isoliert wurde. Da und Db sind im Rattengewichtszunahmetest für die wachstumsfördernde Aktivität genauso wirksam, wie das humane Wachstumshormon. In einer zweiten Veröffentlichung von derselben Gruppe, Reagan et al., Endocrinol. 102, 1377-1386 (1978) sind diese Derivate biochemisch ausführlicher charakterisiert. Die Derivate (4) und (5) behalten den Großteil ihrer wachstumslördemden Aktrvitat im Rattengewichtszunahmetest und sind im lactogenen Test äußerst wirksam Im Gegensatz dazu weist das Derivat (6) nur etwa 1/3 der wachstumsfördernden Aktivität relativ zum intakten humanen Wachstumshormon auf ist aber im lactogenen Test genauso wirksam. Die Fraktion (7) behält die wachstumsfördernde Aktivität und die insulinähnliche Aktivität, wie dies durch die Glucoseoxidation in epididymalem Fettgewebe der Ratte gemessen wurde und zeigt eine etwas höhere lactogene Aktivität. Die Fraktion (8) behält die wachstumsfördernde Aktivität aber verliert etwa 1/2 der insulinähnlichen Aktivität. Die Fraktion (9) behält etwa 44 % der wachstumsfördernden Aktivität wurde aber nicht auf andere biologische Aktivitäten getestet. Der nicht-fraktionierte Plasminverdau weist etwa 1/2 der wachstumsfördernden Aktivität und etwa 1/2 der insulinähnlichen Aktivität von intaktem Wachstumshormon und etwa 3/4 der lactogenen Aktivität auf. Die diabetogene Aktivität einiger der Derivate wird in fettleibigen ob/ob Mäusen [Reagan, Diabetes 27, 883-888 (1978)] getestet. Der unfraktionierte Plasminverdau behält 100 % der diabetogenen Aktivität von intaktem huanem Wachstumshormon, wie auch das S-carbamidomethylierte Derivat. Die Derivate (4) und (6) sind ebenfalls diabetogen, das Derivat (2) weist jedoch keine diabetogene Aktivität auf.
Thrombin spaltet an einer einzigen Stelle innerhalb des humanen Wachstumshormonmoleküls, bei Arg134, was zu einem zweikettigen Molekül führt, bei dem die zwei Ketten durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die Reduktion und die Alkylierung der Disulfidbindung führt zu einem nicht-kovalenten Komplex der zwei Ketten. Einige Derivate dieser Art wurden aus Thrombinverdaus von humanem Wachstumshormon isoliert [Mills et al., Endocrinol. 107, 391- 399 (1980) und Reagan et al., Endocrinol. 109, 1663-1671 (1981)] einschließlich (1) des Derivats mit einer einzigen Spaltung an Arg134, (2) des S-carbamidomethylierten nicht-kovalenten Komplexes, (3) des S-aminoethylierten nicht-kovalenten Komplexes, (4) des S-carboxymethylierten nicht-kovalenten Komplexes, (5) des carbamidomethylierten Fragments 1-134 und (6) des carbamidomethylierten Fragments 135-191. Biologische Tests mit diesen Derivaten beinhalten den Rattengewichtszunahmetest für die Wachstumsförderung, die Oxidation der Glucose als Maß der insulinähnlichen Aktivität, den Test mit den fettleibigen ob/ob Mäusen für die diabetogene Aktivität und den N-Acetyllactosaminsynthasetest für die lactogene Aktivität. Das Derivat (1) ist in allen Tests außer dem diabetogenen Test, in dem es nicht getestet wurde, voll wirksam. Die Derivate (2) und (3) sind nur zu 50 % im Gewichtszunahmetest und zu 20 % im insulinähnlichen Test wirksam, sind aber zu 75-80 % im lactogenen Test wirksam. Erneut wurden diese zwei Derivate nicht im diabetogenen Test getestet. Das Derivat (4) weist nur 10 % der wachstumsfördernden Aktivität und 5 % der insulinähnlichen Aktivität auf, ist aber im lactogenen Test voll aktiv. Die Fragmente (5) und (6) haben nur eine geringe Aktivität im Gewichtszunahmetest und die insulinähnliche Aktivität ist sehr gering. Während jedoch das Fragment (5) 25-50 % der diabetogenen Aktivität von intaktem humanem Wachstumshormon aufweist, hat das Fragment (6) keine detektierbare Aktivität.
Li et al., J. Biol. Chem. 218, 41-52 (1956) untersuchten die biologischen Eigenschaften der Produkte eines Chymotrypsinverdaus von humanem Wachstumshormon. Sie fanden, daß steigende Inkubationszeiten zu einem graduellen Verlust der wachstumsfördernden Aktivität führen, wie dies im Rattentibiatest gemessen wurde. Jedoch behält der Verdau sogar nach 300 Minuten Inkubation immer noch 75 % der Aktivität von humanem Wachstumshormon. Es wurde eine "aktive Grundstruktur" durch Dialyse eines Chymotrypsinverdaus erhalten und zeigte volle Aktivi-
Es wurde Fibrinolysin zur Modifizierung von humanem Wachstumshormon durch eine Entfernung eines Peptids verwendet, das aus den Resten 138 bis 147 besteht [Lewis et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 67, 617-624 (1975)]. Dieses Derivat weist eine stark erhöhte wachstumsfördernde und lactogene Aktivität auf.
Der Verdau von humanem Wachstumshormon mit Bromelain führt zu einem Gemisch aus drei Komponenten, wobei alle drei ein aus den Resten 1-134 bestehendes großes Fragment und ein kleineres Fragment enthalten, das jeweils aus den Resten 143-191, 145-191 oder 146-191 besteht. Dieses Gemisch behält 70-80 % der wachstumsfördernden Aktivität von intaktem humanem Wachstumshormon und 100 % der insulinähnilichen Aktivität [Mills et al., Biochim. Biophys. Acta 742, 169-174 (1983)]. Falls das obige Gemisch reduziert und S-carbamidomethyliert wird, können alle drei der alkylierten kleineren Fragmente isoliert werden. Diese Fragmente können dann mit dem S-carbamidomethylierten Fragment 1-134 komplementiert werden, das aus einem Thrombinverdau erhalten wurde, was zu einem Gemisch aus nicht-kovalenten Komplexen führt, die aus den alkylierten Analoga der drei Derivate bestehen. Diese sind sowohl in Tests für die wachstumsfördernde Aktivität als auch für die insulinähnliche Aktivität wesentlich weniger wirksam.
Es wurde Pepsin verwendet, um humanes Wachstumshormon zu verdauen [Li. J. Gen. Physiol. 45, 169-178 (1962)]. Die wachstumsfördernde Aktivität nimmt mit zunehmender Verdauzeit ab, aber sogar nach 120 Minuten verbleiben etwa 66 % der ursprünglichen Aktivität. Die lactogene Aktivität bleibt nach 60 Minuten Verdau vollständig erhalten, aber ein weitergehender Verdau führt zum vollständigen Verschwinden dieser Aktivität. Eine "aktive Grundverbindung" wird aus dem Verdau durch Dialyse isoliert und behält 100 % der wachstumsfördernden Aktivität.
Eine begrenzte Hydrolyse des humanen Wachstumshormons mit Subtilisin fühil zur Bildung von drei zweikettigen Derivaten, S1, S2 und S3 [Lewis et al., Endocrinol. 101, 1587- 1603 (1977)). S1 besteht aus den Resten 1-139, die durch eine Disulfidbindung an ein Fragment gebunden sind, das aus den Resten 150-191 besteht. S2 besteht aus den Resten 1-139, die durch eine Disulfidbindung an ein Fragment gebunden sind, das aus den Resten 147-191 besteht. S3 ist ein desaminiertes Derivat von S2. Diese drei Derivate werden im Rattentibiatest getestet und besitzen eine ausgezeichnete wachstumsfördernde Aktivität. Sie werden auch in Hunden mittels oraler Glucosetoleranztests auf die diabetogene Aktivität getestet. S1 ist bei der Verursachung von Hyperglycamie und Hyperinsulinämie am aktivsten. S2 und S3 sind ebenfalls diabetogen aber weniger als S1.
Es existieren zwei Berichte in der Literatur, die ein verkürztes Analogon von hurnanem Wachstumshormon betreffen, das durch rekombinante DNA Technologie hergestellt wurde, welchem die ersten 13 Aminosäuren am Aminoterminus fehlen. [Gertler et al., Endocrinol. 18, 720- 726 (1986)] und Ashkenazi et al., Endocrinol. 121, 414-419 (1987)]. Dieses Analogon hemmt die lactogene Aktivität sowohl von humanem Wachstumshormon als auch von Rinderprolactin in Nb2 Zellen und in Explantaten von der milchproduzierenden Rindereuterdrüse. Jedoch weist es keine wachstumsfördernde Aktivitat in der Nb2 Zellinie auf, noch beeinflußt es die Glucoseaufnahme durch die Euterdrüsenexplantate. Es konkurriert mit radioaktiv markiertem humanem Wachstumshormon um die Bindung an Nb2 Zellen, IM-9 Zellen, an die mikrosomale Fraktion aus der milchproduzierenden Rindereuterdrüse und an die mikiosomale Fraktion aus der Rattenleber aber mit einer viel geringeren Affinität.
Andere Wachstumshormone, vor allem vom Rind, Geflügel und der Ratte, wurden proteolytisch unter Verwendung derselben Enzyme proteolytisch modifiziert, die für das humane Wachstumshormon verwendet wurden, und ihre biologischen Eigenschaften wurden untersucht. Die Ergebnisse sind im allgemeinen dieselben, die mit humanem Wachstumshormon erhalten wurden, das heißt die proteolytische Modifizierung der Hormone führt zu einer Veränderung der biologischen Eigenschaften. Es werden hier nur zwei Beispiele angegeben, eines unter Verwendung des Rattenwachstumshormons und Proteolyse durch Trypsin und das andere unter Venvendung von Rinder- und Geflügelwachstumshormon und Proteolyse durch Trypsin. Maciag et al., J. Biol. Chem. 255, 6064-6070 (1980) fanden, daß begrenzte Trypsinhydrolyse des Rattenwachstumshormons zur Erzeugung von zwei Fragmenten führt, wobei eines aus den Resten 1-95 und den Resten 134-191 besteht, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind, und das andere Fragment aus den Resten 96-133 besteht. Diese zwei Derivate wurden auf ihre Fähigkeiten zur Interaktion mit isolierten Hepatozyten und zur Stimulierung des Wachstums im Rattentibiatest untersucht. Das größere Fragment zeigt Bindungseigenschaften, die zu denen von intaktein Wachstumshormon ähnlich sind, aber weist eine geriuge oder keine wachstumsfördernde Aktivität auf Das kleinere Fragment interagiert schwach mit den Wachstumshormonrezeptorstellen, aber weist eine signifikante wachstumsfördernde Aktivität auf.
Graf und Li, Biochem. 13, 5408-5415 (1974) verdauten Rinder- und Geflügelwachstumshormone mit Trypsin und isolierten ein Fragment aus jedem Verdau, das den Resten 96-133 entspricht und ein Fragment aus dem Rinderwachstumshormonverdau, das den Resten 151-191 entspricht. Diese Derivate wurden im Rattentibiatest auf die wachstumsfördernde Aktivität getestet und alle drei weisen eine meßbare Aktivität auf.
Daher wurden viele Derivate von humanem Wachstumshormon beschrieben, die zu Veränderungen der biologischen Eigenschaften des Moleküls führen. Jedoch umfaßt keines dieser Derivate sowohl eine Verkürzung am N-Termihus wie auch eine Spaltung oder Deletion in der großen Schlaufe. Darüberhinaus behält keines dieser Derivate im wesentlichen die gesamte anabole Aktivitat, während es wesentlich verringerte insulinähnliche und diabetogene Aktivitäten aufweist.
Insbesondere liefert die Erfindung ein modifiziertes Wachstumshormon mit eineni Verlust von mindestens etwa 60 % der insulinähnlichen und diabetogenen Wirkungen des nativen Hormons und einem Erhalt von mehr als etwa 60 % der anabolen Wirkung des nativen Hormons.
Insbesondere betrifft diese Erfindung ein solches modifiziertes Wachstumshormon, das sich vom entsprechenden nativen Wachstumshormon unterscheidet durch
a) Eliminierung einer Aminosäuresequenz vom Aminoterminus der Struktur von humanem Wachstumshormon, wobei diese Sequenz mindestens aus den Arninosäureresten 1-5 aber nicht aus mehr als den Amihosäureresten 1-19 besteht, oder, falls es ein nicht-humanes Wachtumshormon ist, Elimerung einer äquivalenten Sequenz, und
b) Spaltung einer Peptidbindung an irgendeiner Stelle vom Carboxykest von Rest 127 bis zum Aminorest von Rest 153 der Struktur des humanen Wachstumshormons, oder falls es ein nichthumanes Wachstumshormon ist, Spaltung einer Peptidbindung an einem äquivalenten Rest.
Ein weiteres erfindungsgemäß modifiziertes Wachstumshormon ist eines, worin sich die Struktur von der des entsprechenden nativen Wachstumshormons unterscheidet durch:
a) Eliminierung einer Aminosäuresequenz vom Aminoterminus der Struktur von humanem Wachstumshormon, wobei diese Sequenz mindestens aus den Aminosäureresten 1-5 aber nicht aus mehr als den Aminosäureresten 1-19 besteht, oder, falls es ein nicht-humanes Wachtumshormon ist, Elinierung einer äquivalenten Sequenz, und
b) Eliminierung von einem oder mehreren der Aminosäurereste 128-152 der Struktur von humanem Wachstumshormon, oder falls es ein nicht-humanes Wachstumshormon ist, Eliminierung von einem oder mehreren äquivalenten Aminosäureresten.
Wie erwähnt betrifft die Erfindung die Feststellung, daß das Wachstumshormonmolekül strukturell modifiziert werden kann, um die insulinähnlichen und die diabetogenen Wirkungen unter Erhaltung der anabolen Aktivität wesentlich zu verringern.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind die, die mindestens etwa 70 % der anabolen Wirkung des nativen Hormons mit einem Verlust von mindestens etwa 90 % sowohl der insulinähnlichen als auch der diabetogenen Wirkungen des nativen Hormons aufweisen.
Der Ausdruck "modifiziert" soll wenn er hierin in Zusammenhang mit dem Wachstumshormon verwendet wird, nur die Struktur des Moleküls beschreiben und nicht dessen Quelle. Das heißt, daß ein "modifiziertes Wachstumshormon", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, nicht auf Moleküle beschränkt ist, die aus intaktem Wachstumshormon gebildet wurden. Das "modifizierte Wachstumshormon", wie es auch immer hergestellt wird, liegt innerhalb des Schutzumfangs der Verbindungen, die innerhalb der Erfindung beansprucht werden, solange dessen Struktur zusammenhängt mit und basiert auf dem Wachstumshormon, mit dem es in Zusammenhang steht.
Insbesondere und vorzugsweise ist, wenn das modifizierte Wachstumshormon strukturell mit dem humanen Wachstumshormon in Zusammenhang steht, die Struktur des modifizierten humanen Wachstumshormons so beschaffen, daß im Vergleich zum nativen Wachstumshormon am Aminoterminus eine Aminosäuresequenz entfernt wurde. Die entfernte Sequenz besteht mindestens aus den ersten fünf Aminosäureresten (Phe-Pro-Thr-Ile-Pro) aber aus nicht mehr als den ersten 19 Aminosäureresten
des humanen Wachstumshormons.
Obwohl der vom Aminoterminus enfernte Teil irgendwo zwischen den Resten 1-5 und den Resten 1-19 liegt, reicht die ausgeschnittene Sequenz vorzugsweise von den Resten 1-7 bis zu den Resten 1-12. Vor allem werden die Reste 1-8 entfernt.
Zusätzlich unterscheidet sich das modifizierte humane Wachstumshormon vorn nativen Wachstumshormon dadurch, daß die Peptidkette an einem Punkt gespalten wurde, der vom Carboxykest des Rests 127 (Arg) bis zum Aminorest des Rests 153 (Asp) reicht.
Wahlweise kann das modifizierte humane Wachstumshormon weiter durch die Eliminierung der gesamten durch die Reste 128-152 dargestellten Sequenz oder eines Teils hieiwon voll humanem Wachstumshormon verändert werden. Diese Sequenz lautet folgendermaßen:
Vorzugsweise ist die Struktur des modifzierten humanen Wachstumhormons so beschaffen, daß die Reste 135-145 eliminiert wurden.
Wenn das modifizierte Wachstumshormon dieser Erfindung auf einem nicht-humanen Wachstumshormon basiert, treffen die genannten Kriterien zu, wobei die einzige Ausnahme die ist, daß die Sequenzen, welche entfernt oder modifiziert wurden, zu denen analog sind, die oben für das humane Wachstumshormon definiert wurden.
Daher führt die Anwendung des oben Erwähnten zu Sequenzen, die in Abdel-Mequil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 6434-6437 (1987) auf Seite 6437 beschrieben sind, zu den folgenden Modifikationen in Bezug auf das entsprechende native Wachstumshormon:
Der Einfachheit halber werden die erfindungsgemäßen Verbindungen auf der Grundlage des nativen Hormons und den hiervon entfernten Teilen und/oder der internen Spaltstelle benannt. Daher sind Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen folgende:
Des1-5, 128-152-humanes Wachstumshormon
Des1-8, 130-139-Rinderwachstumshormon
Des1-15,132-145-Schweinewachstumshormon
Des1-10, Spaltung 132-133-humanes Wachstumshormon
Des1-8, 135-145-Humanes Wachstumshormon
Des1-14, 140-145-Geflügelwachstumshormon
Des1-12, 126-140-Pferdewachstumshormon
Des1-19, 130-133-Vogelwachstumshormon
Des1-9, 135-138-humanes Wachstumshormon
Des1-13, Spaltung 150-151-humanes Wachstumshormon
Des1-16, 129-132-humanes Wachstumshormon
Des1-11, Spaltung 143-144-humanes Wachstumshormon und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mittels rekombinanter DNA Routinetechniken hergestellt werden. Daher kann die gewunschte Verbindung als geradkettiges Molekül exprimiert werden, das eine selektive Spaltstelle an dem Punkt aufweist, an der schließlich die interne Spaltung beabsichtigt ist. Das Expressionsprodukt wird zuerst mittels bekannter Techiuk unter Bildung der zwei Disulfidbindungen jeweils durch Reaktion der Cysteinreste an den Positionen 53 und 165 und den Positionen 182 und 139 gefaltet, wie sie im humanen Wachstumshormon vorhanden sind.
Nach der Faltungsreaktion kann das entstehende Produkt durch bekannte Verfahren mittels Trypsin und Carboxypeptidase B gespalten werden. Diese Spaltung wird durch Zuschneidern des Expressionsmoleküls unter Einbau einer dibasischen Dipeptidsequenz an der Spaltstelle wie -Lys-Arg- oder -Arg-Arg- erreicht. Nach der Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase B wird das gewunschte Molekul unter dem Verlust des dibasischen Dipeptids gebildet.
Ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung sind vorher beschriebene Verbindungen die einen Methioninrest am Aminoterminus enthalten. Das Vorkommen eines Methioninrests tritt in den Fällen auf in denen das Produkt durch rekombinante DNA Technik hergestellt wurde und das entstehende einzelne geradkettige Proteinexpressionszwischenprodukt einen Startmethioninest enthält. Obwohl das Methionin durch bekannte Techniken entfernt werden kann, sei es durch direkte Abspaltung des Methionins oder durch Expression eines Proteins mit einer Spaltstelle, die die Methioninentfernung erleichert, werden Verbindungen die das Startmethionin noch behalten, als Teil der Erfindung betrachtet.
Bestimmte Verbindungen der Erfindung können ebenfalls durch die enyymatische Behandlung des nativen Hormons hergestellt werden. Daher erlaubt beispielsweise die kontrollierte Trypsinolyse von humanem Wachstumshormon die Bildung von Des1-8 135-145-humanes Wachstumshormon, eine der bevorzugten Verbindungen der Erfindung.
Wie erwähnt weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine anabole Wirkung auf die mit der eines Wachstumshormons vergleichbar ist, aber mit wesentlich verringerten insulinähnlichen und/oder diabetogenen Wirkungen wie sie bei den Wachstumshormonen vorkommen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aufgrund ihrer anabolen Wirkung brauchbar bei dem postoperativen Heilungsprozeß (Trauma), dem Turner Syndrom, vollständiger parenteraler Ernährung (TPN), dem Wachstum von kleinen Kindern mit normaler Statur (nicht notwendigerweise Zwergwuchs), beginnender Mangelernährung, Osteoporose (Langzeitbehandlung), Wundheilung, einschließlich durch Stase bedingte Ulcera, Decubitus-Ulcera und diabetischen ulcera, altersbedingten kachektischen Zuständen (allgemeiner Anabolismus) und chronischem Nierenversagen. Sie können auch in einer Vielzahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen verwendet werden und können durch eine Vielzahl an herkömmlichen Arten verabreicht werden, wie intramuskulär, intravenös, subkutan und intraperitoneal.
Bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen beinhalten die zur Injektion geeigneten pharmazeutischen Formen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einarbeitung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der gewunschten Menge eines als geeignet bekannten Lösemittels falls gewunscht zusammen mit verschiedenen anderen Routineinhaltsstoffen, hergestellt werden, wie sie in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. Es soll den Schutzumfang hiervon nicht beschränken.

Beispiel -- Herstellung von Des1-8, 135-145-humanes Wachstumshormon (Des1-8 135-145-hGH).

A. Umwandlung von humanem Wachstumshormon

Des1-8, 135-145-hGH wird durch die Wirkung von Trypsin auf das biosynthetische humane Wachstumshormon (hGH) hergestellt. Etwa 1 Gramm hGH wird in einer Konzentration von 10 mg/ml in einem Puffer aus 50 mM Tris-Acetat pH 7,5 gelöst und 20 mg Trypsin (TPCK) (Cooper Biomedical) werden unter Bildung eines Gewichtsverhältnisses von Trypsin zu hGH von 1/50 zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wird bei 37ºC für etwa 1 Stunde inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 5 mg des Trypsinhibitors N-Tosyl-L-Lysinchlormethylketon (TLCK) gestoppt wird. Das Reaktionsgemisch wird durch Filtration durch ein Milliporefilter (0,45 µm) geklärt und das gewunschte Produkt wird durch die folgenden Chromatographieverfahren gereinigt.

B. Q-Sepharose Fast Flow

Eine Säule (2,2 x 28 cm) wird mit etwa 100 ml Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) gepackt und in Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 8, 30 % Acetonitril, 0,10 M NaCl) äquilibriert Das geklärte Reaktionsgemisch vom vorhergehenden Schritt wird aufgetragen und das Protein wird mit einem linearen Salzgradienten eluiert, der durch Mischen von Puffer A und Puffer B (50 mM Tris-HCl pH 8, 30 % Acetonitril, 0,14 M NaCl) erzeugt wird. Der Gradient läuft von 0-100 % B über 960 Minuten bei einer Flußrate von etwa 26 ml/cm²/h. Die Elution des Proteins wird spektrophotometrisch bei 280 nm verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden durch Analyse mit dem später beschriebenen Mono Q Test lokalisiert.

C. Umkehrphasen-HPLC

Eine Umkehrphasen HPLC Säule (1 x 15 cm), die mit 10 µm C-8 Siliciumdioxid gepackt ist (Dupont) wird in einem Lösemittel äquilibriert, das aus 50 mM Tris-HCl pH 8, 16,5 % Acetonitril und 22,5 % n-Propanol besteht. Die vereinigten Fraktionen von der Q-Sepharose Fast Flow Säule werden aufgetragen und das Protein wird mit einem Gradienten elulert, der durch Mischen von Lösemittel A (50 mM Tris-HCl pH 8, 30 % Acetonitril) und Lösemittel B (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 % n-Propanol) erzeugt wird. Der Gradient läuft von 45-65 % B über 160 Minuten mit einer Flußrate von 0,25 ml/min. Die Elution wird spektrophotometrisch bei 220 nm verfolgt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden mittels des später beschriebenen Mono Q Tests lokalisiert.

D. Sephadex G25

Die Fraktionen von der Umkehrphasensäule, die das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt und auf eine Säule (2,2 x 26 cm) aufgetragen, die mit Sephadex G-25 gepackt wurde, um organische Lösemittel und Puffersalze zu entfernen. Die Säule wird mittels Ammoniak gepuffertem Wasser bei pH 8 äquilibriert, die vereinigten Fraktionen werden aufgetragen und das Protein wird mittels desselben Lösemittels bei einer Flußrate von 3 ml/min eluiert. Die Elution des Proteins wird spektrophotometrisch bei 280 um verfolgt und die Fraktionen, die eine signifikante Absorption enthalten, werden vereinigt und unter Bildung von 12,9 mg Des1-8, 135-145-hGH lyophilisiert.

E. Test für Des1-8, 135-145-hGH

Der Test, der verwendet wird, um die Produktbildung zu verfolgen und um Des1-8, 135-145- hGH in den Säulenfraktionen zu messen, ist ein chromatographlscher Test unter Verwendung einer Mono Q HR 5/5 Säule (Pharmacia). Die verwendeten Puffer sind A: 50 mM Tris-HCl pH 8, 30 % Acetonitril und B: 50 mM Tris-HCl pH 8, 30 % Acetonitril, 0,2 M NaCl. Die Flußrate beträgt 1,0 ml/min und der Gradient läuft von 0-100 % B über 20 Minuten. Die Elution des Proteins von der Säule wird spektrophotometrisch entweder bei 214 um oder bei 280 um verfolgt.

Biologische Aktivität von Des1-8, 135-145-hGH

Die anabolen Wirkungen des Wachstumshormons (GH) werden unter Zuiiickhaltung von Stickstoff, Wasser und Mineralien und unter Synthese von DNA, RNA und Protein im ganzen Körper exprimiert. Das Wachstumshormon weist auch zwei gegensätzliche Wirkungen auf (a) Eine frühe insulinähnliche Wirkung und (b) eine spätere diabetogene Wirkung. Die insulinähnliehen Wirkungen des GH werden am leichtesten im Labor mittels nüchtern belassenen (über Nacht) hypophysenektornierten Ratten gezeigt. Wenn das humane Wachstumshormon (hGH) nüchtern belassenen hypophysenektomierten Ratten verabreicht wird, verursacht es eine vorübergehende Abnahme der Konzenträtionen der Serumglucose und der freien Fettsäuren (FFA). Vorübergehende Abnahmen der Serumglucose- und FFA-Konzentrationen werden nicht bei nüchtern belassenen hypophysenektomierten Ratten eine Stunde nach der Injektion von Des1-8, 135-145-hGH hervorgerufen.
Die Ergebnisse des Experiments sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Die Wirkung von hGH und Des1-8, 135-145-hGH auf die Konzentrationen der Serumglucose und der freien Fettsäuren von nüchtern belassenen weiblichen hypophysenektomierten Ratten
a n = 6 Ratten/Grüppe
b Mittel ± SEM
* p≤0,05, signifiante Unterschiede werden mittels eines zweifachen Dunnett's Tests bestimmt.
Die Bestatigung der frühen insulinähnlichen Wirkungen des Wachstumshormons wird in vitro unter Verwendung von epididymalem Fettgewebe aus männhchen Ratten bestimmt. Normales Wachstumshormon, wie Insulin, stirnuliert die Aufliahme von Glucose in das epididymale Fettgewebe in vitro und verursacht, daß die Glucose zu Kohlendioxid (CO&sub2;) und Lipid umgewandelt wird. Die Tabelle 2 zeigt, daß während unterschiedliche hGH Dosen die Umwandlung von Glucose zu CO&sub2; verursachen, Des1-8, 135-145-hGH keine Wirkung auf diese Umwandlung hat. Die Tabelle 2 zeigt ebenfalls, daß während unterschiedliche Dosierungen von hGH die Umwandlung von Glucose zu Lipiden verursachten, keine Dosierung von Des1-8, 135-145-hGH dieselbe Umwandlung verursacht. Diese in vitro Ergebnisse bestätigen das Fehlen der Wirkungen in vivo und legen nahe, daß Des1-8, 135-145-hGH keine frühe insulinähnliche Aktivität aufweist. Tabelle 2 Die Wirkung von Des1-8, 135-145-hGH und die Oxidation Von Glucose zu Kohlendioxid des humanen Wachstumnshormons in epididymalen Fußfettgewebe in vitro
a Mittel ± SEM
* Die statistische Signifikanz der Mittel wird durch den Dunnett's Test bestimmt
Konträr zu seiner insulinännlichen Aktivität weist hGH auch eine diabetogene oder antlinsulinähnliche Aktivität auf Diese Aktivität tritt einige Stunden nach einer einzelnen Injektion von hGH auf Mehrfache Injektionen von hGH über einen langen Zeitraum können zu temporärem oder permanentem Diabetes (Insulinresistenter Glucoseintoleranz) führen. Die Verabreichung von Des1-8 135-145-hGH unter denselben Bedingungen hat keine Wirkung auf den Grundserumspiegel der Insulin- oder Glucosekonzentrationen in erwachsenen weiblichen Beaglehunden. Zusätzlich hat Des1-8 135-145-hGH keine Wirkung auf die Serumglucose- oder Insulinkonzentrationen in Reaktion auf eine orale Glucoseprovokation.
Zwei experimentelle Verfahren werden zur Demonstration der fehlenden Diabetogenität von Des1-8, 135-145-hGH verwendet: (a) die akute und (b) die chronische Verabreichung von Des1-8, 135-145-hGH an erwachsene weibliche Beaglehunde. Im ersten Experiment werden die Hunde einem oralen Glucosetoleranztest (OGTT) vor und 12 Stunden nach einer einzelnen subkutanen Injektion von Des1-8, 135-145-hGH (0,125, 0,250 oder 0,50 mg/kg) unterzogen. Keine dieser Dosen von Des1-8 135-145-hGH hat eine Wirkung auf die Grundserumspiegel der Insulin- oder Glucosekonzentrationen und keine dieser Dosen hat eine Wirkung auf Serumglucose- oder Insulinspiegel in Reaktion auf eine Glucoseprovokation. Im zweiten Experiment wird den Hunden eine kurze Behandlung (7 Injektionen über eine Zeitspanne von 7 Tagen) mit Des1-8, 135-145-hGH (0,250 und 0,500 mg/kg) durch subkutane Injektion verabreicht. Es werden vor dem Behandlungsstart und 12 Stunden nach der letzten Injektion von Des1-8 135-145-hGH Glucosetoleranztests verabreicht. Keine Dosis von Des1-8, 135-145-hGH hat eine Wirkung auf die Grundserunsspiegel der Glucose- oder Insulinkonzentrationen oder auf die Serumglucose oder das Insulin in Reaktion auf die orale Glucoseprovokation. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß Des1-8, 135-145-hGH keine diabetogene Wirkungen bei Hunden bei den verwendeten Dosen aufweist.
Die wachstumsfördernde Aktivität von Des1-8, 135-145-hGH wird in einem 10 Tage dauernden Biotest mittels hypophysenektomierten Ratten bestimmt und es werden die erhöhte Körpergewichtszunahme und die erhöhte proximale Tibiaknorpelweite gemessen. In allen durchgeführten Biotests zeigt Des1-8, 135-145-hGH etwa 70 Prozent der biologischen Aktivität von nativem hGH Zusätzlich zum Biotest verursacht Des1-8, 135-145hGH eine Reduzierung der Stickstoffkonzentrationen sowohl des Harns als auch des Serums. Diese anabole Wirkung zeigt, daß Des1-8, 135-145-hGH die Zurückhaltung von Stickstoff zur Verwendung bei der Proteinbiosynthese verursacht.

Claims

1. Modifiziertes Wachstumshormon mit einem Verlust von mindestens 60 % der insulinähnlichen und diabetogenen Wirkungen des nativen Hormons und einem Erhah yon mehr als 60 % der anabolen Wirkung des nativen Hormons.

2. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 1, worin die Struktur sich von der des entsprechenden nativen Wachstumshormons unterscheidet durch

a) Eliminierung einer Aminosäuresequenz vom Aminoterminus der Struktur von humanem Wachstumshormon, wobei diese Sequenz mindestens aus den Aminosäureresten 1-5 aber nicht aus mehr als den Aminosäureresten 1-19 besteht, oder, falls es ein nicht-humanes Wachtumshormon ist, Elinierung einer äquivalenten Sequenz, und

b) Spaltung einer Peptidbindung an irgendeiner Stelle vom Carboxylrest von Rest 127 bis zum Aminorest von Rest 153 der Struktur des humanen Wachstumshormons, oder falls es ein nicht-humanes Wachstumshormon ist, Spaltung einer Peptidbindung an einem äquivalenten Rest.

3. Modifiziertes Wachstumshormon nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin das entsprechende native Wachstumshormon humanes Wachstumshormon ist.

4. Modiziertes Wachstumshormon nach einem der Ansprüche 2 und 3, worin die vom Aminoterminus eliminierten Aminosäurereste mindestens die Aminosäurereste 1-7 aber nicht mehr als die Aminosäurereste 1-12 sind.

5. Modifiziertes Wachstumshormon nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin die vom Aminoterminus eliminierten Aminosäurereste die Aminosäurereste 1-8 sind.

6. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 1, worin die Struktur sich von der des entsprechenden nativen Wachstumshormons unterscheidet durch

a) Eliminierung einer Aminosäuresequenz vom Aminoterminus der Struktur von humanem Wachstumshormon, wobei diese Sequenz mindestens aus den Aminosäureresten 1-5 aber nicht aus mehr als den Aminosaureresten 1-19 besteht, oder, falls es ein nicht-humanes Wachtumshormon ist, Elinierung einer äquivalenten Sequenz, und

b) Eliminierung von einem oder mehreren der Aminosäurereste 128-152 der Struktur von humanem Wachstumshormon, oder falls es ein nicht-humanes Wachstumshormon ist, Eliminierung von einem oder mehreren äquivalenten Aminosäureresten.

7. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 6, worin das entsprechende native Wachstumshormon humanes Wachstumshormon ist.

8. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 7, worin die Reste 135-145 eliminiert wurden.

9. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 8, worin die vom Aminoterminus eliminierten Aminosäurereste mindestens die Aminosäurereste 1-7 aber nicht mehr als die Aminosäurereste 1-12 sind.

10. Modifiziertes Wachstumshormon nach Anspruch 9, worin die vom Aminoterminus eliminierten Amihosäurereste die Aminosäurereste 1-8 sind.

11. Modifiziertes Wachstunshormon nach einem der Anspruche 2 bis 10, worin der Aminoterminus weiter modifiziert ist, um einen Initiationsmethioninrest zu enthalten.

12. Verfahren zur Herstellung eines modifzierten Wachstumshormons nach einem der Anspruche 2 bis 11, gekennzeichnet durch Spaltung eines einkettigen, disulfidenthaltenden Vorläufermoleküls mit der Aminosäuresequenz des modifizierten Wachstumshormons, das eine Spaltstelle enthält, um die Erzeugung des modifzierten Wachstumshormons durch Spaltung an einer Position zu erlauben, die durch jeden der Aminosäurereste dargestellt wird, welche in der Aminosäuresequenz vom Carboxyfrest des Rests 127 bis zum Aminorest des Rests 153 der Struktur von humanem Wachstumshormon vorkommen, oder falls es ein nicht-humanes Wachstumshormon ist, an einer hierzu äquivalenten Position.

13. Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff ein modifiziertes Wachstumshormon nach einem der Anspruche 1 bis 11 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern hierfür enthält.

14. Modifiziertes Wachstumshormon nach einem der Anspruche 1 bis 11 zur Verwendung bei der Therapie.