DE69719360T2

DE69719360T2 - Zusammensetzungen und methoden zur steigerung der darmfunktion

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Publication number: DE69719360T2
Application number: DE69719360T
Authority: DE
Inventors: J. Drucker
Original assignee: 1149336 Ontario Inc
Current assignee: 1149336 Ontario Inc
Priority date: 1996-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: CA2274596A1; AU5220098A; EP0944396A1; US5952301A; CA2274596C; DK0944396T3; ES2193406T3; PT944396E; ATE233096T1; WO1998025644A1; DE69719360D1; EP0944396B1

Description

Diese Erfindung betrifft mit Glukagon verwandte Peptide in Kombination mit anderen Mitteln zur Verhinderung oder Behandlung von Ernährungs- oder Magen-Darm-Störungen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Glukagon-ähnliche Peptid-2 (GLP-2) ist ein Peptid mit 33 Aminosäuren, exprimiert in einer gewebespezifischen Weise von dem pleiotropen Glukagon-Gen. GLP-2 zeigt bemerkenswerte Homologie hinsichtlich der Aminosäuresequenz zu Glukagon und dem Glukagon-ähnlichen Peptid-1 (GLP-1). Weiterhin werden verschiedene Säugetierformen von GLP-2 in hohem Maße konserviert. Zum Beispiel unterscheiden sich das humane GLP-2 und das GLP-2 vom Degu (ein südamerikanisches Nagetier) von Ratten-GLP-2 durch eine bzw. drei Aminosäuren. Kürzlich wurde demonstriert, daß GLP-2 ein intestinotrophisches Peptidhormon ist (Drucker et al. (1996) PNAS, 93: 7911-7916). Wenn exogen gegeben, kann GLP-2 eine merkliche Zunahme der Proliferation von Dünndarmepithel der Testmaus erzeugen, anscheinend ohne unerwünschte Nebenwirkungen. Anschließend wurde gezeigt, daß Peptidanaloga von natürlichem GLP-2 mit Modifizierungen der Peptidsequenz erhöhte intestinotrophische Aktivität besitzen (siehe US-Patentschrift 5789379), zum Beispiel zeigen Analoga von GLP-2, welche resistent gegenüber Spaltung durch Dipeptidylpeptidase VI sind, welche im Gewebe der meisten Wirbeltiere vorhanden ist, erhöhte intestinotrophische Aktivität, wenn mit natürlich vorkommendem GLP-2 (WO 97/739031) verglichen wird. Darüber hinaus Wurde auch gezeigt, daß GLP-2 die maximale Transportgeschwindigkeit von D-Glucose durch die intestinale basolaterale Membran erhöht (Cheeseman and Tseng (1996) American Journal of Physiology 271: G477-G482).
Es wurde demonstriert, daß eine Anzahl von Peptidhormonen, strukturell nicht mit GLP-2 verwandt, unterschiedliche Grade intestinotrophischer Aktivität haben. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß der Insulin-Like Growth Factor-2 (insulinähnliche Wachstumsfaktor 2) (IGF-2) die Mitose der Kryptenzellen des Dünndarms in vivo fördert (US-Patentschrift 5482926). Es wurde auch gezeigt, daß der Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1), dessen Sequenz zu 64% mit IGF-2 identisch ist, und Peptidanaloga davon das Wachstum von Darmgewebe in vivo steigern (WO 91/12018). Es wurde gezeigt, daß Wachstumshormon (GH) eine Anzahl von physiologischen Auswirkungen einschließlich vermehrter Proliferation der Darmschleimhaut hat (siehe, zum Beispiel, Willmore, US-Patentschrift 5288703), wodurch die Absorptionskapazität des Darms gesteigert wird. Jedoch besitzt keines der vorstehenden Peptidhormone die Wirksamkeit oder Spezifität von GLP-2 bei der Förderung der Proliferation des Darmepithels.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß, wenn GLP-2 gemeinsam mit anderen Mitteln verabreicht wird, die Darmfunktion gesteigert wird. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß GLP-2 synergistisch mit den Peptidhormonen IGF-1 und/oder GH wirkt, wobei die Proliferation von Zellen im Dickdarm gefördert wird. Weiterhin führt die gemeinsame Verabreichung von GLP-2 mit entweder IGF- 1 oder GH zu einer Proliferation der Zellen des Dünndarmepithels und nachfolgender vergrößerter Dünndarmmasse. Die intestinotrophischen Auswirkungen dieser Kombinationstherapie auf den Dünn- und Dickdarm sind größer als diejenigen, die mit einem von GLP-2, IGF-1 oder GH allein zu sehen sind. Ein Aspekt der Erfindung ist die Kombination von GLP-2 mit IGF-1, um das Wachstum von Dünn- und/oder Dickdarmgewebe zu fördern.
Die Erfindung beruht zum Teil auch auf der Entdeckung, daß die gemeinsame Verabreichung von GLP-2 mit Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase IV die intestinotrophische Wirkung von GLP-2 steigert. Weiterhin führt die gemeinsame Verabreichung von GLP-2 mit einem DPP-IV-Inhibitor zu einer Proliferation der Zellen des Dickdarms und des Dünndarms und nachfolgender Zunahme der Masse des Dickdarms und des Dünndarms. Darüber hinaus ist eine statistisch signifikante Zunahme der Länge des Dickdarmes und des Dünndarms auch zu sehen, wenn GLP-2 gemeinsam mit einem DPP-IV-Inhibitor verabreicht wird. Die Verabreichung eines DPP-IV-Inhibitors allein führte nicht zu einer statistisch signifikanten Zunahme der Masse des Dickdarms oder des Dünndarms. Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung ist die Kombination von GLP-2 mit einem DPP-IV-Inhibitor, um das Wachstum zu fördern oder die Funktion des Dünn- und/oder Dickdarms zu steigern.
Deshalb ist ein Aspekt der Erfindung eine Zusammensetzung zur Steigerung des Wachstums und/oder der Funktion von Dünn- und/oder Dickdarmgewebe bei einem Säugetier, welche GLP-2 in Mischung mit mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2, GH und DPP-IV-Inhibitor, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Diese Zusammensetzungen der Erfindung können alternativ Analoga von GLP-2, IGF-1, IGF-2 und/oder GH einschließen, welche intestinotrophische Aktivitäten aufweisen.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Arzneimittelkombination, wie sie hier definiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Wachstums von Dünn- und/oder Dickdarmgewebe bei einem Säugetier bereit, indem die Serumspiegel von GLP-2, oder einem intestinotrophischen Analogon von GLP-2, und mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH und Analoga von GH und (ii) einem DPP-IV-Inhibitor, angehoben werden. Es kann vorgesehen werden, daß derartige Medikamente der Erfindung an ein Säugetier in einer wirksamen Menge von GLP-2 und einer wirksamen Menge von mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH, Analoga von GH und DPP-IV-Inhibitor, verabreicht werden, wobei das Säugetier mit Hormonen oder kleinen organischen Molekülen, die wirksam die Serumspiegel von GLP-2, IGF-1, IGF-2 und/oder GH erhöhen, behandelt wird und Gentherapie durchgeführt wird, um Zellen in dem Säugetier zu veranlassen, endogen GLP-2, IGF-1, IGF-2 und/oder GH zu erzeugen, oder Zellen gentechnisch zu bearbeiten, um GLP-2, IGF-1, IGF-2 oder GH allein oder in Kombination zu erzeugen, die dann in ein Säugetier implantiert werden können, um die gewünschte biologische Wirkung zu erzeugen.
Außerdem wird durch die Erfindung die Verwendung einer Arzneimittelkombination, wie sie hier definiert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Besserung einer Ernährungs- oder Magen-Darm- Störung bereitgestellt.
Die Zusammensetzungen und Medikamente der Erfindung sind zur Wiederherstellung oder Aufrechterhaltung der Magen-Darm-Funktion, zur Förderung der Heilung und des Nachwachsens von verletzter oder vereiterter/entzündeter Darmschleimhaut, zur Verringerung des Risikos einer Darmerkrankung, zur Verbesserung des Ernährungszustandes eines Säugetiers oder für die Behandlung oder Verhinderung von Ernährungs- oder Magen-Darm-Störungen bei einem Säugetier, speziell einem Menschen, verwendbar. Weiterhin sind die Medikamente und Zusammensetzungen der Erfindung zur Förderung des Zottenwachstums bei Patienten verwendbar, die an einer Krankheit wie beispielsweise Zöliakie, postinfektiöse Zottenatrophie und Kurzdarmsyndromen leiden.
Alternativ können die Zusammensetzungen und Medikamente der Erfindung verwendet werden, um die Proliferation des Dünn- und Dickdarms bei einem gesunden Vieh zu fördern, z. B. um vergrößerte Absorption von Nährstoffen beim Rind zu ermöglichen, was frühere Entwöhnung oder vergrößerte Milch- und Fleischproduktion erlaubt.
In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung von GLP-2, oder intestinotrophischen Analoga von GLP-2, und einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe von Peptidhormonen, bestehend aus IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH, Analoga von GH und/oder einem DPP-IV-Inhibitor, wie beispielsweise Pro(boro)Pro, bei der Herstellung einer pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Zubereitung für die Steigerung des Wachstums von Dickdarmgewebe bereitgestellt.
Weiterhin stellt die Erfindung noch Baukästen bereit, umfassend GLP-2, oder intestinotrophische Analoga von GLP-2, und mindestens ein anderes Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH, Analoga von GH und/oder DPP-IV-Inhibitor.
Derartige Zusammensetzungen werden in der Menge einer therapeutisch wirksamen Einheitsdosis oder Mehrfachdosis bereitgestellt.
Außerdem wird durch die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Förderung des Wachstums von Gastrointestinalgewebe oder -zellen bereitgestellt, welches den Schritt der in-vitro- Kultivierung des Gewebes oder der Zellen in einem Kulturmedium umfaßt, enthaltend eine wachstumsfördernde Kombination von sowohl GLP-2, oder einem intestinotrophischen GLP-2 Analogon, als auch mindestens einem anderen Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH und Analoga von GH. Diese Verfahren werden an Zellen in Kultur durchgeführt.

KURZE BEZUGNAHME AUF DIE ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht Messungen der Höhe der Krypte plus Zotte des proximalen Leerdarms (in um) (y-Achse) bei Tieren, denen zweimal täglich 10 Tage lang die angegebenen Hormone (außer daß GH nur einmal täglich gegeben wurde) injiziert wurden, wie nachstehend in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Behandlungsgruppen waren: PBS; Ratten-GLP-2; [Gly 2]hGLP-2; IGF-1; GH-(Protropin- Wachstumshormon); insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1-Analogon (LRIGF-1); IGF-1 + rGLP-2; GH + rGLP-2; LRIGF-1 + rGLP-2; IGF-1 + [Gly 2] hGLP-2; GH + [Gly 2] hGLP-2; und LRIGF-1 + [Gly 2] hGLP-2.
Fig. 2 veranschaulicht Messungen des Dünndarmgewichts bei Tieren, denen zweimal täglich die angegebenen Testzusammensetzungen injiziert wurden.
Fig. 3 veranschaulicht Messungen des Dickdarmgewichts bei Tieren, denen zweimal täglich die angegebenen Testzusammensetzungen injiziert wurden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft therapeutisch verwendbare Kombinationen von GLP-2 und mindestens einem anderen Mittel, wobei das andere Mittel ein intestinotrophisches Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2, GH oder einem Inhibitor der Dipeptidylpeptidase IV, ist. Überraschenderweise ist gefunden worden, daß GLP-2 (und seine Analoga), verabreicht allein an einen Säugetier, das Wachstum des Dünn- und Dickdarms veranlaßt. Jedoch werden, wenn GLP-2 in Kombination mit mindestens einem anderen Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe IGF-1, IGF-2 und GH, verabreicht wird, offensichtlich größere Auswirkungen auf das Wachstum von sowohl Dünn- als auch Dickdarmgewebe beobachtet.
Die Kombinationen der Erfindung können verwendet werden, um die Darmfunktion zu steigern. Insbesondere können die vorstehend erwähnten Kombinationen verwendet werden, um die Proliferation der Epithelzellen des Dünn- und Dickdarms zu fördern.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Kombination von GLP-2 mit einem DPP-IV- Inhibitor. In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Kombination von GLP-2 mit Pro(boro)Pro. In einer besonderen Anwendung betrifft die Erfindung die vorstehenden Kombinationen zur Förderung der Proliferation von Epithelzellen des Dünn- und Dickdarms.
Sofern nicht anderweitig festgelegt, bezeichnet der Begriff "GLP-2" hier insgesamt die verschiedenartigen natürlich erzeugten Formen von GLP-2, insbesondere die Säugetierformen. Die Erfindung umfaßt auch diejenigen Analoga von GLP-2, welche intestinotrophische Aktivität zeigen. Analoga von GLP-2 können auf intestinotrophische Aktivität getestet werden, indem das Mausmodell verwendet wird, das hier und in der US-Patentschrift 6184201 beschrieben ist. Kurz gesagt beinhaltet dieser Test ein Regime von 10 bis 14 Tagen mit einer zweimal täglichen (b.i.d.) subkutanen Injektion von 2,5 mg des GLP-2-Analogons (in PBS) pro kg Körpergewicht, wobei zur Kontrolle passende unbehandelte Tiere PBS allein erhalten. Alternativ können die Analoga einmal am Tag oder jeden zweiten Tag verabreicht werden. Bei Abschluß des Regimes werden die Tiere getötet und ihre Gedärme entnommen und gewogen. In dieser Weise kann die Wirkung von GLP-2 auf den Darm beurteilt werden.
Eine Anleitung über spezielle Analoga und Varianten von GLP-2, die in der vorliegenden Erfindung nützlich angewendet werden können, und eine Anleitung, wie andere herzustellen sind, ist in der US-Patentschrift 6184201 bereitgestellt.
Kurz gesagt kann eine beliebige Substitution, Addition oder Deletion von GLP-2, die die intestinotrophische Aktivität von GLP-2 nicht zerstört, in dieser Erfindung nützlich angewendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die GLP-2-Analoga mindestens so intestinotrophisch wie natürliches humanes GLP-2. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen hat das GLP-2-Analogon im Vergleich mit natürlichem humanen GLP-2 erhöhte intestinotrophische Aktivität. Zum Beispiel können solche Analoga erhöhte Serumstabilität, erhöhte Rezeptorbindung und erhöhte Signal-übertragende Aktivität haben. Andere Modifizierungen von GLP-2 und GLP-2-Analoga, die in dieser Erfindung nützlich verwendet werden können, sind diejenigen, die das Molekül resistent gegen Oxidation machen.
Die GLP-2-Analoga sind geeigneterweise Analoga von entweder humanem GLP-2 (hGLP-2) oder Ratten-GLP-2 (rGLP-2). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Ratten- oder humanes GLP-2 an Position 2 geändert, um durch Substituieren eines Gly für ein Ala DPP-IV-Resistenz zu übertragen. Humanes GLP-2 mit Gly, substituiert für Ala an Position 2, wird hier als [Gly 1] hGLP-2 bezeichnet.
Ähnlich umfassen die Begriffe "IGF-1", "IGF-2" und "GH", wie sie hier verwendet werden, wirksame Analoga und Varianten der natürlich erzeugten Peptide ebenso wie die natürlichen Peptide. Eine Anleitung über spezielle Analoga und Varianten von IGF-1, IGF-2 und GH, die in der vorliegenden Erfindung nützlich verwendet werden können, ist in den folgenden Veröffentlichungen bereitgestellt, welche hier durch Bezugnahme einbezogen sind: Vanderhoof et al. (1992) Gastroenterology 102: 1949- 1956; Steeb et al. (1994) Am. J. Physiol. 266: G1090-G1098; und Jones et al. (1995) Endocrine Reviews 16 : 3-34; Conlon et al. (1995) Journal of Endocrinology 146: 247-253; Francis et al. (1993) Biochemical Journal 293 : 713-719; Lewis et al. WO 93/20836; und Bozyczko-Coyne et al. WO 93/08826.
Sekretagoga, Faktoren, die imstande sind, die endogene Erzeugung der Versuchspeptidhormone zu erhöhen, können ebenfalls als Teil eines therapeutischen Regimes eingeschlossen werden, entweder an Stelle von oder als Ergänzung zu dem Versuchspeptidhormon, dessen Freisetzung sie stimulieren. So liegt der Einschluß solcher Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, innerhalb des Schutzbereichs der. Erfindung. Zum Beispiel wird die Erzeugung von endogenem GH durch den Wachstumshormon freisetzenden Faktor (GHRF) und durch Arginin vergrößert. Ähnlich ist dem Fachmann bewußt, daß Verbindungen, wie beispielsweise kleine Moleküle, die auf den geeigneten Rezeptor einwirken, um eine Zunahme in den Serumspiegeln eines des Versuchspeptidhormone zu veranlassen, in der vorliegenden Erfindung nützlich verwendet werden könnten.
Wie hier verwendet, ist der Begriff "DPP-IV-Inhibitor" ein Element oder eine Zusammensetzung, die die Fähigkeit der Dipeptidylpeptidase IV, das N-terminale Dipeptid von einem natürlich vorkommenden GLP-2 zu entfernen, verringert. Wichtigerweise muß für pharmazeutische und veterinärmedizinische Verwendung der DPP-IV-Inhibitor physiologisch tolerierbar sein. Verschiedene Typen von DPP-IV- Inhibitoren sind bekannt. In einer Ausführungsform wird der DPP-IV-Inhibitor aus einer der folgenden Klasse von Inhibitoren ausgewählt: kompetitive, z. B. Dipeptide, wie beispielsweise Gly-Pro und Gly-Leu, oder Tripeptide, wie beispielsweise Diprotin-A- oder Diprotin-B-Ubergangszustand-Inhibitoren, wie beispielsweise Boronsäure-Base-Verbindungen (Ksiack et al. (1996) J. Med. Chem. 29: 2087; Kubota et al. (1994) Clin. Exp. Immunol. 96: 292-296) (Umezawa et alt (1984) J. Antibiot. 37: 422); nicht-kompetitive, z. B. Anionen mit hoher Ladungsdichte, wie beispielsweise Phosphat und Citrat, und unkompetitive, z. B. Diethyl-p-nitrophenylphosphat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DPP-IV-Inhibitor ein kompetitiver oder Übergangszustand-Inhibitor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der DPP-IV-Inhibitor Pro(boro)Pro. Pro(boro)Pro ist weithin erhältlich, jedoch kann es nach dem Verfahren von Fientke et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. 188: 1550-9, welches hier durch Bezugnahme einbezogen ist, synthetisiert werden.
Wie hier verwendet, wird von einer Verbindung, wie beispielsweise einem Peptid, gesagt, daß sie "gemeinsam verabreicht" wird oder in "Kombination" mit einer anderen Verbindung ist, wenn entweder die physiologischen Auswirkungen beider Verbindungen oder die erhöhte Serumkonzentration beider Verbindungen gleichzeitig gemessen werden können. Mit Verbindungen, die das Niveau der endogenen Erzeugung erhöhen, kann, wenn "gemeinsam verabreicht" oder in "Kombination", die Serumkonzentration des endogen erzeugten Hormons und des anderen verabreichten Mittels ebenfalls gleichzeitig gemessen werden. So können Verbindungen entweder gleichzeitig, als getrennte oder gemischte Zusammensetzungen, verabreicht werden oder sie können nacheinander verabreicht werden, mit der Maßgabe, daß eine konstante Erhöhung ihrer Spiegel im Serum resultiert.
Wenn nicht anderweitig festgestellt, werden die Begriffe "Kombinationstherapie" und "Kombinationsbehandlungen" hier verwendet, um ein therapeutisches Regime zu beschreiben,. das die gemeinsame Verabreichung von GLP-2 oder einem Analogon, das imstande ist, die biologische Aktivität der Versuchsfaktoren zu erhöhen, beinhaltet, was zu einer Erhöhung des Ernährungszustands oder einer Zunahme von Darmmasse eines Patienten führt.
Wie hier verwendet sind die Begriffe "verbesserter Ernährungszustand" und "gesteigerte Darmfunktion" als eine Zunahme in der Aufnahme von Nährstoffen durch den Körper gegenüber Niveaus vor der Behandlung definiert. Zu derartigen Nährstoffen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Kohlenhydrate, Protein und Aminosäuren, Fett; Cholesterin und fettlösliche Vitamine, wasserlösliche Vitamine und Mineralien. Zu Mineralien, deren Aufnahme durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhöht werden kann, gehören, ohne darauf begrenzt zusein, Na, Ca, Mg, K, Zn und Fe. Zu Vitaminen, deren Absorption durch die vorliegende Erfindung vergrößert werden kann, gehören fettlösliche Vitamine, wie beispielsweise die Vitamin A, D, E und K, ebenso wie wasserlösliche Vitamine, wie beispielsweise B12 und Folsäure.
Wie hier verwendet soll der Begriff "Patient", ohne aber darauf begrenzt zu sein, Menschen, Vieh und Haustiere einschließen.
Es wird gesagt, daß ein Säugetier an Störungen, Krankheiten und medizinischen Zuständen des Darms leidet, wenn die Absorptionseigenschaften des Darms des Säugetiers verringert sind und/oder wenn Entzündung oder Verletzung des Gastrointestinaltrakts vorliegt, so daß Unbehagen und Krankheit verursacht werden. Eine Vielzahl von Tests kann angewendet werden, um zu bestimmen, ob ein Säugetier unter einem Malabsorptionssyndrom leidet. Zu diesen gehören Fettgehalt des Stuhls, Xyloseabsorption, Magen-Darm-Röntgenuntersuchungen, Dünndarmbiopsietest, der Schilling-Test für Vitamin B12- Absorption und der Sekretintest.
In einem Aspekt der Erfindung wird GLP-2 zur Verabreichung an Patienten in Mischung mit mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2, GH und dem DPP-IV-Inhibitor Pro(boro)Pro, in pharmazeutisch verträglicher Form (zum Beispiel als Zubereitung, die steril durch ein 0,22-m-Filter filtriert wird und im wesentlichen pyrogenfrei ist) bereitgestellt. Wünschenswerterweise wandern die Peptide, die zugemischt werden, in der HPLC als einzelne Peaks.
Die speziellen Formen von GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH, die für die Erfindung ausgewählt sind, können durch eine Vielfalt von Techniken hergestellt werden, die für die Erzeugung von Peptidprodukten bekannt sind. Diejenigen Formen von GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH, die natürlich vorkommen, können bekanntlich unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Proteinisolierungstechniken durch Extraktion aus dem natürlichen Ausgangstoff erhalten werden. Wie zum Beispiel von Buhl et al. (1988) J. Bio. Chem., 263 (18): 8621-8624, beschrieben ist, wird Isolierung und Reinigung von Schweine-GLP-2 aus Säure-Ethanol-Extrakten von Ileumschleimhaut durch eine Kombination von Größenauswahl und auf HPLC basierender Fraktionierung mit der Hilfe von Antikörper, gezüchtet gegen synthetisches Proglukagon 126-159, um die. Aufarbeitung zu überwachen, erreicht. Ähnlich kann GH aus Kadavern extrahiert werden, wie in der US-Patentschrift 2974088 beschrieben ist.
Als Alternative zur Extraktion können diejenigen Formen von GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH, die nur L-Aminosäuren einschließen, reproduzierbar und in kommerziellen Mengen durch Anwendung der Technologie mit rekombinanter DNA erzeugt werden. Für diesen Zweck werden Nukleinsäuren, die für die gewünschte Form von GLP-2, IGF-1 (siehe zum Beispiel die US-Patentschrift 5288931), IGF-2 und GH (siehe zum Beispiel Goeddel et al. (1979) Nature 281: 544-548) codieren, exprimierbar in einen Zellwirt eingebracht, welcher dann unter für Expression des speziellen Peptids oder Proteins geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Eine Vielfalt von Genexpressionssystemen ist für diesen Zweck angepaßt worden, und sie lenken typischerweise die Expression des gewünschten Gens von Expressionskontrollen, die natürlicherweise durch den gewählten Wirt verwendet werden. Da GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH für die Aktivität keine posttranslationale Modifizierung erfordern, kann ihre Erzeugung geeigneterweise in bakteriellen Wirten wie beispielsweise E. coli. erreicht werden. Für eine derartige Erzeugung kann DNA, codierend für das ausgewählte GLP-2, IGF-1, IGF-2 oder GH, nützlicherweise unter Expressionskontrollen der lac-, trp- oder PL-Gene von E. coli gestellt werden. Als Alternative zur Expression von DNA, codierend für GLP-2, IGF-1, IGF-2 oder GH per se, kann der Wirt angepaßt werden, GLP-2, IGF-1, IGF-2 oder GH als Fusionsprotein zu exprimieren, bei welchem das GLP-2, IGF-1, IGF-2 oder GH freisetzbar an ein Trägerprotein gebunden ist, das Isolierung und Stabilität des Expressionsprodukts erleichtert.
Für therapeutische Verwendung werden die Faktoren, die für die Verwendung in der Kombinationstherapie gewählt sind, mit mindestens einem Träger formuliert, der pharmazeutisch verträglich ist und zur Abgabe der Peptide durch den gewählten Weg der Verabreichung geeignet ist. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger sind diejenigen, die herkömmlicherweise mit auf Peptid basierenden Medikamenten verwendet werden, wie beispielsweise Verdünnungsmittel, Excipienten und dergleichen. Bezug kann zur Anleitung für Arzneimittelformulierungen im allgemeinen auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, genommen werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Verbindungen zur Verabreichung durch Infusion oder Injektion, entweder subkutan oder intravenös, formuliert und werden demgemäß als wässerige Lösungen in steriler und pyrogenfreier Form und gegebenenfalls gepuffert zu einem schwach sauren oder physiologischen pH verwendet. So können die Verbindungen in destilliertem Wasser oder wünschenswerter in Kochsalzlösung, gepufferter Kochsalzlösung oder 5%iger Dextroselösung verabreicht werden. Die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen kann, wenn gewünscht, durch Einbringen eines Löslichkeitsverbesserers, wie den Einschluß von Essigsäure für GLP-2-Formulierungen, erhöht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch verschiedene Peptidhormonkonjugate bereit. Die Peptidhormonzusammensetzungen der Erfindung umfassen Peptidhormon, das kovalent an ein oder mehrere wasserlösliche Polymere gebunden ist. Wasserlösliche Polymere, speziell Polyethylenglycol, sind mit Proteinen konjugiert worden, um zusätzliche wünschenswerte Eigenschaften bereitzustellen, während zumindest teilweise die wachstumsauslösenden Eigenschaften des Peptidhormons beibehalten wurden. Zu diesen wünschenswerten Eigenschaften gehören erhöhte Löslichkeit in wässerigen Lösungen, erhöhte Stabilität bei der Lagerung, verringerte Immunisierungsstärke, erhöhte Beständigkeit gegenüber proteolytischem Abbau und vergrößerte in-vivo-Halbwertszeit. Zu wasserlöslichen Polymeren, die für die Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignet sind, gehören Polyethylenglycolhomopolymere, Polypropylenglycolhomopolymere, Copolymere von Ethylenglycol mit Propylenglycol, wobei die Homopolymere und Copolymere unsubstituiert oder an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sind, polyoxyethylierte Polyole, Polyvinylalkohol, Polysaccharide, Polyvinylethylether, und a,b-Poly[(2-hydroxyethyl)-DL-aspartamid]. Polyethylenglycol wird besonders bevorzugt. Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Polymerkonjugaten von Proteinen sind unter anderen Stellen in der US-Patentschrift 4179337; der US-Patentschrift 4609546; der US-Patentschrift 4261973; der US-Patentschrift 405563; der US-Patentschrift 396083; der US-Patentschrift 441566; der US- Patentschrift 441298; der US-Patentschrift 4002531; der US-Patentschrift 4414147; der US-Patentschrift 378894; der US-Patentschrift 473286; der US-Patentschrift 474518; EP 152847; EP 98110 (veröffentlicht am 11. Januar 1984); JP 5792435 beschrieben.
Ein anderer Aspekt der Erfindung sind Formulierungen, die die andauernde Freisetzung von Peptidhormonen bereitstellen. Zu Beispielen solcher Depotformulierungen gehören Verbundstoffe mit biokompatiblen Polymeren, wie beispielsweise Poly(milchsäure), Poly(milch-co-glycolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure, Kollagen und dergleichen. Die Struktur, Auswahl und Verwendung von abbaubaren Polymeren in Vehikeln zur Arzneimittelabgabe sind in mehreren Veröffentlichungen besprochen worden, einschließlich A. Domb et al. (1992), Polymers for Advanced Technologies 3: 279- 292. Zusätzliche Anleitung bei der Auswahl und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen Formulierungen kann in dem Text von R. Langer (Hrsg.) "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" ("Biologisch abbaubare Polymere als Arzneimittelabgabesysteme"), Bd. 45 von "Drugs and Pharmaceutical Sciences", M. Dekker, New York, 1990, gefunden werden. Liposome können ebenfalls verwendet werden, um andauernde Freisetzung von Peptidhormonen bereitzustellen. Einzelheiten bezüglich der Verwendung und Herstellung liposomaler Formulierungen von interessierenden Arzneimitteln können unter anderen Stellen in der US-Patentschrift 4944948; der US-Patentschrift 5008050; der US-Patentschrift 4921706; der US-Patentschrift 4927637; der US-Patentschrift 4452747; der US-Patentschrift 4016100; der US-Patentschrift 4311712; der US-Patentschrift 4370349; der US-Patentschrift 4372949; der US- Patentschrift 4529561; der US-Patentschrift 5009956; der US-Patentschrift 4725442; der US-Patentschrift 4737323; der US-Patentschrift 4920016 gefunden werden. Depotformulierungen sind von besonderem Interesse, wenn es wünschenswert ist, ein hohe örtliche Konzentration der Zusammensetzungen der Erfindung bereitzustellen, z. B. nahe bei oder in dem Dünn- oder Dickdarm usw.
Zur Verwendung bei der Stimulierung von Darmwachstum bei einem Säugetier, einschließlich eines Menschen, stellt die vorliegende Erfindung in einem ihrer Aspekte eine Packung in Form eines steril gefüllten Fläschchens oder einer Ampulle bereit, die eine das Gewebewachstum fördernde Menge von GLP-2 in Mischung mit mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF- 1, IGF-2, GH und Pro(boro)Pro, in entweder Einheitsdosis- oder Mehrfachdosismengen enthält, wobei die Packung ein Etikett einschließt, das über die Verwendung ihres Inhalts für die Förderung der Magen-Darm- Funktion, z. B. zur Förderung des Wachstums des Dünndarms oder Dickdarms oder beider, unterrichtet. In einer Ausführungsform der Erfindung enthält die Packung GLP-2 und mindestens ein anderes Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2 und GH, und den gewünschten Träger als eine zur Verabreichung fertige Formulierung. Alternativ und gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung stellt die Packung das GLP-2 und mindestens ein anderes Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2 und GH, in einer Form, wie beispielsweise eine lyophilisierte Form, geeignet zur Rekonstitution in einem geeigneten Träger, wie beispielsweise gepufferte Kochsalzlösung, bereit. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Packung ein steril gefülltes Fläschchen oder eine Ampulle, enthaltend eine injizierbare Lösung, welche eine wirksame Menge von GLP-2 und mindestens einem anderen Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2 und GH, gelöst in einem wässerigen Vehikel, umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Packung eine steril gefülltes Fläschchen oder eine Ampulle, enthaltend eine injizierbare Lösung, welche eine wirksame Menge von GLP-2 und Pro(boro)Pro, gelöst in einem wässerigen Vehikel, umfaßt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das GLP-2 in Kombination mit mindestens einem anderen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2, GH und Pro(boro)Pro, verabreicht, um Patienten zu behandeln, denen gesteigerte Magen-Darm-Funktion guttun würde. In einem Aspekt sind Patientenkandidaten diejenigen, denen Proliferation und vermehrte Wiederherstellung und Restitution des Epithels des Dünndarmgewebes oder des Dickdarms oder beider guttun würde. Die Auswirkungen der Kombinationstherapie auf diese Gewebe, wie durch die hier dargestellten Ergebnisse bewiesen, sind dramatisch und würden offensichtlich denjenigen Patienten guttun, die an Krankheiten oder Zuständen leiden, die durch Abnormitäten in der Schleimhaut des Dünn- oder Dickdarmtrakts gekennzeichnet sind, welche Geschwüre und entzündliche Störungen; angeborene oder erworbene Verdauungs- oder Absorptionsstörungen einschließlich Malabsorptionssyndromen; und Krankheiten und Zustände, die durch Verlust der Schleimhautfunktion des Dünn- oder Dickdarms verursacht werden, einschließen. Im allgemeinen sind Patienten, denen entweder eine vergrößerte Darmmasse oder Regenerierung und Heilung von vorher existierendem normalen Schleimhautepithel und nachfolgende vergrößerte Schleimhautfunktion des Darms guttun würde, Kandidaten für die Behandlung mit der Erfindung. Zum Beispiel können Patienten nach einem Regime von Chemotherapie oder Radiotherapie, nach einem Zeitraum parenteraler Ernährung, nach oder während aktiver Magen-Darm-Erkrankung, oder wenn der Patient ein frühreifes Kind mit ungenügender Reifung des Gastrointestinaltrakts, und/oder Entzündung des GI-Trakts, wie veranschaulicht durch den Zustand nekrotisierender Enterokolitis, ist, behandelt werden.
Der Bequemlichkeit halber wird eine nicht erschöpfende Liste von Zuständen des Dünn- und Dickdarms, die nützlich durch die vorliegenden Kombinationen behandelt werden können, in der folgenden Tabelle bereitgestellt.

TABELLE I

STÖRUNGEN DES DÜNN- UND DICKDARMS

I Inadäquate Absorptionsoberfläche

A. Darmresektion oder -bypass
1. Mesenterische Gefäßkrankheit mit massiver Darmresektion
2. Enteritis regionalis mit multiplen Darmresektionen
3. Jejunoilealer Bypass
4. Darminfarkt durch Trauma, angeborene Abnormitäten, Volvulus, Ischämie usw.
5. Nekrotisierende Enterokolitis des Neugeborenen
6. Kurzdarmsyndrom
7 Sackgassensyndrom
B. Gastroileostomie (unabsichtliche)

II. Lymphgefäßverschluß

A. Intestinale Lymphangiektasie
B. Whipplesche Krankheit
C. Lymphom

III. Kardiovaskuläre Krankheiten

A. Konstriktive Perikarditis
B. Kongestive Herzinsuffizienz
C. Mesenterial-vaskuläre Insuffizienz
D. Vaskulitis
IV. Primäre absorptive Defekte der Schleimhaut
A. Entzündliche oder infiltrierende Erkrankungen
1. Enteritis regionalis
2. Amyloidose
3. Sklerodermie
4. Lymphom
5. Strahlungsenteritis
6. Eosinophile Enteritis
7. Tropische oder nichttropische Sprue
8. Infektöse Enteritis (bakteriell, viral oder pilzartig, zum Beispiel Cryptosporidium- oder Isospora-belli-Infektion bei HIV-Patienten)
9. HIV-assoziierte nichtinfektiöse idiopathische Enteritis
10. Postinfektiöse Enteritis
11. Kollagenöse Sprue
12. Nichtspezifische ulzerative Jejunitis
13. Mastozytose
14. Dermatologische Erkrankungen (z. B. Dermatitis herpetiformis)
15. Crohnsche Krankheit
16. Entzündliche Darmerkrankung
17. Kolitis
B. Biochemische oder genetische Abnormitäten
1. Nichttropische Sprue (gluteninduzierte Enteropathie), Zöliakie
2. Disaccharidmangel
3. Hypogammaglobulinämie
4. Abetalipoproteinämie
5. Hartnup-Krankheit
6. Zystinurie
7. Monosaccharid-Malabsorption

V. Endokrine und metabolische Krankheiten

A. Diabetes mellitus
B. Hypoparathyroidismus
C. Nebenniereninsuffizienz
D. Hyperthyreoidismus
E. Ulzerogener Tumor des Pankreas (Zollinger-Ellison-Syndrom, Gastrinom)
F. Karzinoidsyndrom
Zahlreiche Faktoren können von einem Kliniker in Betracht gezogen werden, wenn er eine optimale Dosis für eine gegebene Versuchsperson bestimmt. Unter diesen ist die Menge an Peptidhormon, die normalerweise vom Körper erzeugt wird, primär. Zu zusätzlichen Faktoren gehören die Größe des Patienten, das Alter des Patienten, der Allgemeinzustand des Patienten, die spezielle Krankheit, die behandelt wird, die Schwere der Erkrankung, das Vorhandensein anderer Arzneimittel bei dem Patienten, die in-vivo-Aktivität des Peptids oder Peptidanalogons und dergleichen. Die Versuchsdosierungen würden nach Berücksichtigung der Ergebnisse von Tierversuchen und der klinischen Literatur im Hinblick auf die Verabreichung von Peptidhormonen und Peptidhormon-Sekretagoga ausgewählt. Es wird vom Fachmann auf dem Gebiet anerkannt, daß Informationen, wie beispielsweise Bindungskonstanten und Ki, abgeleitet von kompetitiven in-vitro-Bindungsprüfungen, bei der Berechnung von Dosierungen ebenfalls verwendet werden können. Die hier nachstehend dargestellten Ergebnisse demonstrieren, daß Dosen der Kombination, die äquivalent zu etwa 0,1 mg/kg von GLP-2 und GLP-2-Analoga sind, zweimal täglich mit ungefähr 2 mg/kg IGF-1 zweimal täglich und/oder 1 mg/kg GH einmal am Tag, gemeinsam verabreicht über 10 Tage, sehr signifikante Zunahmen sowohl der Dünndarmmasse als auch der Dickdarmmasse erzeugen können. Es wird erwartet, daß viel kleinere Dosen, im ug/kg-Bereich und vielleicht hinein in den ng/kg-Bereich und vielleicht kürzere oder längere Dauer oder Frequenz der Behandlung gleichfalls therapeutisch verwendbare Ergebnisse erzeugen, z. B. eine statistisch signifikante Zunahme speziell der Dünndarmmasse.
Eine typische humane Dosis eines GLP-2-Peptids würde von etwa 10 ug/kg Körpergewich/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag, vorzugsweise von etwa 50 ug/kg/Tag bis etwa 5 mg/kg/Tag und am meisten bevorzugt etwa 100 ug/kg/Tag bis 1 mg/kg/Tag betragen. Da die GLP-2-Analoga der Erfindung bis zu 10 bis sogar 100 Mal stärker sein können als GLP-2, kann eine typische Dosis eines solchen GLP-2-Analogons niedriger sein, zum Beispiel von etwa 100 ng/kg Körpergewich/Tag bis 1 mg/kg/Tag, vorzugsweise 1 ug/kg/Tag bis 500 ug/kg /Tag und noch stärker bevorzugt 1 ug/kg/Tag bis 100 ug/kg/Tag.
Für die Verabreichung von GH an ein Säugetier, speziell an Menschen, kann ein Dosisbereich von 0,02-2,5 mg/kg/Tag verwendet werden; vorzugsweise können GH-Dosen von etwa 0,1-2 mg/kg/Tag reichen. Für die Verabreichung von IGF's können Dosierungen im Bereich von 1 ug bis 1 g/kg/Tag liegen. IGF-1 wird vorzugsweise an Menschen im Bereich von etwa 0,03-10 mg/kg/Tag, stärker bevorzugt von etwa 0,1 bis 4 mg/kg/Tag und am meisten bevorzugt um 0,5-1 mg/kg/Tag herum verabreicht. Typische Dosen für IGF-2 betragen etwa 0,5-5 mg/kg/Tag. Die für Analoga von IGF erforderliche Dosis kann 20- 50% kleiner sein als für natürlich vorkommendes IGF-1. Weiterhin können die Dosierungsgrößen und das Dosierregime, die für humane Verwendung am geeignetsten sind, in gut gestalteten klinischen Versuchen bestimmt werden.
In einem anderen von ihren Aspekten kann die Erfindung bei der Behandlung von Patienten, wie sie gerade identifiziert sind, verwendet werden, indem implantierte Intestinalzellen verwendet werden, die vor der Reimplantation oder Transplantation in einen Empfänger zur Proliferation in vitro oder in vivo regeneriert oder stimuliert worden sind. Konditionieren der Zellen ex vivo kann einfach durch Züchten der Zellen oder des Gewebes, die transplantiert werden sollen, in einem Medium, das mit einer wachstumsfördernden Menge der Kombinationen ergänzt worden ist und ansonsten zur Kultivierung dieser Zellen geeignet ist, erreicht werden. Die Zellen können nach einem geeigneten Konditionierungszeitraum dann entweder direkt in den Patienten implantiert werden oder sie können unter Verwendung einer eingeführten Einkapselungstechnologie eingekapselt und dann implantiert werden. Analoge Verfahrensweisen mit anderen Organen wie beispielsweise der Haut sind in Versuchen mit Menschen klinisch bereits ziemlich weit fortgeschritten. Zum Beispiel kann Haut in vitro regeneriert werden, indem man Hautzellen von einem Spender nimmt, sie in einer Gewebekultur aufzüchtet und dann die größer gewordene Hautmasse zur therapeutischen Verwendung (z. B. Behandlung von Verbrennungen, Geschwüren usw.) zurück in einen Patienten transplantiert.
Weiterhin können die Arzneimittelkombinationen der Erfindung für den praktischen Gebrauch unter Verwendung der Gentherapie vorgesehen werden. Die Empfängerzellen des Säugetiers oder Patienten (die ein beliebiger Typ von Zellen sein können, die aber vorzugsweise Fibroblasten oder Keratinozyten sind), können gentechnisch bearbeitet werden, daß sie in vitro einen oder mehrere der vorliegenden Wachstumsfaktoren oder Kombinationen von GLP-2 mit IGF-1 und/oder IGF-2 und/oder GH exprimieren, nachfolgend, vorzugsweise in einer Kapsel, zur in-vivo-Lieferung therapeutischer Mengen von diesen Peptiden reimplantiert werden. Eine Vielfalt von Transfektionstechniken ist gegenwärtig verfügbar und wird verwendet, um DNA in vitro in Zellen zu transferieren; einschließlich Calciumphosphat-DNA- Präzipitation, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation, liposomvermittelten DNA-Transfers oder Transduktion mit rekombinanten Virusvektoren. Solche ex-vivo-Behandlungsprotokolle sind vorgeschlagen worden, um DNA in eine Vielzahl von unterschiedlichen Zelltypen einschließlich Epithelzellen (US- Patentschrift 4868116; Morgan and Mulligan WO 87/00201; Morgan et al., 1987, Science 237: 1476-1479; Morgan and Mulligan, US-Patentschrift 4980286); Endothelzellen (WO 89/05345); Hepatozyten (WO 89/07136; Wolff et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3344-3348; Ledley et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335-5339; Wilson and Mulligan, WO 89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8437-8441); Fibroblasten (Palmer et al., 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055-1059; Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11-20; Rosenberg et al., 1988, Science 242: 1575-1578; Naughton & Naughton, US-Patentschrift 4963489); Lymphozyten (Anderson et al., US-Patentschrift 5399346; Blaese, R. M. et al., 1995, Science 270: 475-480); und hämatopoetischen Stammzellen (Lim, B. et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8892-8896; Anderson et al., US-Patentschrift 5399346) zu transferieren.
Wie durch das nachstehende Arbeitsbeispiel angezeigt wird, ist Gentherapie ein brauchbares Verfahren, um Wachstunshormone für die praktische Durchführung der Erfindung bereitzustellen. Speziell ist nachstehend ein Versuch beschrieben, in dem Zellen von einer Zellinie, die alle Glukagonpeptide sekretiert, in eine Maus implantiert werden. Die implantierten Zellen wachsen als Tumor, der GLP-2 sekretiert und Wachstum des Dünndarms veranlaßt. Da GLP-2 das einzige von Glukagon abgeleitete Peptid ist, von dem bekannt ist, daß es merklich das Dünndarmwachstum anregt, war die Wirkung auf das Dünndarmwachstum, die in diesem Versuch beobachtet wurde, sehr wahrscheinlich auf die Sekretion von GLP-2 zurückzuführen. Ähnlich können Zellen gentechnisch bearbeitet werden, um GLP-2 allein und/oder zumindest ein Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, IGF-2 und GH, zu erzeugen, und in ein Säugetier implantiert werden.
Alternativ kann man Gentherapie verwenden, um in vivo die Zellen des Empfängers zu transfektieren. Formulierungen von Nukleinsäure für solche in-vivo-Verfahren können einschließen: nackte DNA; Nukleinsäure, eingekapselt in Liposome, oder Liposome, kombiniert mit Rezeptorproteinen mit Virushülle (Nicolau et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (80: 1068); DNA, gekoppelt an einen Polylysin- Glycoprotein-Trägerkomplex; und Nukleinsäurefällungsmittel. Nukleinsäurezubereitungen können in vivo unter Verwendung einer der auf dem Fachgebiet bekannten Techniken, wie beispielsweise direkte Injektion, Elektroporation und Teilchenbeschuß, eingeführt werden. Zusätzlich sind "Genkanonen" für Genlieferung in Zellen hinein verwendet worden (australisches Patent 9068389).
Eine verwandte Herangehensweise könnte die Verwendung von modifizierter Gentherapie und Virusvektoren beinhalten, die die Genprodukte für GLP-2 und mindestens ein anderes Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe" bestehend aus IGF-1, IGF-2 und GH, codieren. Derartige Virusvektoren können verwendet werden, um verbliebenes Darmepithel bei Patienten mit Darmbeeinträchtigung zu infizieren, wodurch in vivo gezielte örtliche therapeutische Lieferung dieser Substanzen an den Darm bewirkt wird. Es ist jedoch für die praktische Durchführung der Erfindung nicht notwendig, daß alle Zellen transformiert werden oder selbst, daß Darmzellen transformiert werden. In der Tat können Zellen in einem beliebigen Gewebe, welche das gewählte Hormon in das Kreislaufsystem sekretieren können, zum Beispiel Muskelzellen, verwendet werden, um endogen Hormone zu erzeugen.
Die Sequenz solcher DNAs für die praktische Durchführung der Gentherapieverfahren kann leicht aus den Aminosäuresequenzen der ausgewählten GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH bestimmt werden, mit der Begrenzung, daß nur Formen, die genetisch codierte Aminosäuren enthalten, in dieser Weise erzeugt werden können. Verschiedene Expressionsvektoren, einschließlich Virusvektoren, die für die Einführung genetischer Informationen in humane Zellen geeignet sind, können angewendet werden und bringen die DNAs, die GLP-2, IGF-1, IGF-2 und GH codieren, unter Expressionskontrollen funktional in die Wirtszellen ein. Einmal genetisch verändert können die genetisch bearbeiteten Zellen dann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet eingeführt sind, implantiert werden.

BEISPIEL 1: WIRKUNG VON RATTEN-GLP-2 AUF DEN DÜNNNDARM

Dieser Versuch wurde entworfen, um die Wirkung von GLP-2 auf das Dünndarmwachstum zu untersuchen. Mäuse wurden mit humanem GLP-1, Ratten-GLP-2 oder ohne Peptid behandelt, und die Masse des Dünndarms wurde analysiert.
Für diesen Versuch wurden Ratten-GLP-2 und humanes GLP-1 (7-36-Amid) durch Anwendung der Herangehensweise der auf tBoc basierenden festen Phase auftragsspezifisch synthetisiert. Die Analyse des Ratten-GLP-2 durch analytische HPLC (20 ml) enthüllte eine Reinheit von 95%, hinreichend, um das Peptid vollständig zu lösen. Der pH wurde dann durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1 N NaOH (10-20 ml) wieder auf etwa 7,0 eingestellt, und das Lösungsvolumen wurde dann durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 10 ml eingestellt. Um die Formulierung zur Injektion herzustellen, wurden die 10 ml Peptidlösung und die 50 ml Lösung von 16%iger Gelatine unter Mischen vereinigt und Aliquote zur Injektion wurden in eine 0,5-ml-Insulinspritze gezogen. Die gleiche Verfahrensweise wurde verwendet, um das GLP-1 zu formulieren, mit der Ausnahme, daß, gegeben durch seine relativ größere Löslichkeit in Wasser, keine Säure/Base-Anpassung notwendig war.
Drei Gruppen von sechs Mäusen (8 Wochen alt, CD1-Weibchen von den Charles River Laboratories) wurden wie folgt behandelt. Jede Maus erhielt 10 Tage lang Injektionen. Die Injektionen wurden subkutan in einem Endvolumen mit 16% Gelatine abgegeben, wobei alle 12 Stunden 0,5 cm³ subkutan injiziert wurden. Mäuse, die mit GLP-1- oder GLP-2-Peptid behandelt wurden, erhielten 41,5 ug des entsprechenden Peptids in jeder Injektion. Kontrollmäuse erhielten 0,5 cm³ 16%ige Gelatinelösung, aber kein Peptid. Die Mäuse wurden bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser mit standardmäßigem Rattenfutter gefüttert, bis 12 Stunden vor der Tötung, zu welcher Zeit die Nahrung versagt wurde und nur Wasser gegeben wurde. Das. Gewicht des Dünndarms wurde bestimmt, indem der gesamte Darms herausgeschnitten wurde und der Magen (proximales Ende) und der Wurmfortsatz/Blinddarm/Dickdarm (distales Ende) entfernt wurde. Der verbleibende Dünndarm wurde mit Kochsalzlösung gereinigt, um Faeces zu entfernen, und gewogen. Die Ergebnisse sind nachstehend tabellarisch aufgeführt: TABELLE II
Diese Ergebnisse demonstrieren, daß bei einer Dosis von etwa 2 mg/kg (etwa 500 nmol/kg), GLP- 2, relativ sowohl zu der Kontrollgruppe, die kein Peptid erhielt, als auch zu der Gruppe, die ein anderes Glukagon-verwandtes Peptid, GLP-1, erhielt, eine statistisch signifikante (p < 0,05) Zunahme der Masse des Dünndarms nach zweimal täglicher Behandlung für 10 Tage aufwies. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß GLP-2 einen Hauptwachstumsfaktor des Intestinalgewebes ausmacht.

BEISPIEL 2: GEMEINSAME VERABREICHUNG VON GLP-2 MIT IGF-1 ODER GH

Die folgenden Versuche wurden gestaltet, um die Auswirkung der gemeinsamen Verabreichung von GLP-2 mit IGF-1 oder GH auf die Darmmasse eines Säugetiers zu untersuchen.
Achtundvierzig sechs Wochen alte weibliche CD1-Mäuse (ungefähr 25 Gramm, erhalten von den Charles River Laboratories) wurden vor dem Versuch für 1 Woche in der Tierhaltungseinheit akklimatisiert. Sie wurden in Käfigen mit Plastikboden und Drahtdeckel untergebracht, in einem 12-h- Licht/Dunkelheit-Zyklus gehalten, und ihnen wurde während der Untersuchung Futter und Wasser ad libitum erlaubt. Vier Tage vor Beginn der Behandlung wurden die Mäuse unter Verwendung einer Mettler- Waage PJ300 gewogen und statistisch in 1 von 12 Behandlungsgruppen verteilt. Für den Versuch wurden 10 Tage lang zweimal täglich am Morgen und am Abend subkutane Injektionen in das rechte Hinterteil gegeben. Jedoch wurde das Wachstumshormon (GH) nur eimnal am Tag am Morgen verabreicht. Am Tag 10 ließ man die Mäuse von 12 h mittags an fasten. Das Körpergewicht wurde außerdem am Tag 5 und am Tag 11 bestimmt.
Die Behandlungsgruppen bestanden aus den folgenden Peptiden und Peptidkombinationen. Die von jedem Tier pro Dosis erhaltene Menge Peptid ist neben jedem Eintrag vermerkt.
1. Kontrolle (PBS)
2. rGLP-2 (2,5 ug)
3. [Gly 2]hGLP-2 (2,5 ug)
4. IGF-1 (50 ug)
5. GH-(Protropin-Wachstumhormon) (25 ug)
6. Insulinähnlicher Wachstumfaktor-1-Analogon (LRIGF-1) (50 ug)
7. IGF-1 (50 ug) + rGLP-2 (2,5 ug)
8. GH (25 ug) + rGLP-2 (2,5 ug)
9. LRIGF-1 (50 ug) + rGLP-2 (2,5 ug)
10. IGF-1 (50 ug) + [Gly 2] hGLP-2 (2,5 ug)
11. GH (25 ug) + [Gly 2] hGLP-2 (2,5 ug)
12. LRIGF-1 (50 ug) + [Gly 2] hGLP-2 (2,5 ug)
Die Peptide wurden am Tag vor der ersten Injektion gewogen (Mettler-Waage AE 166), rekonstituiert und aliquotiert. Das Injektionsvolumen, 0,5 ml, war während des Versuchs unter Verwendung einer ¹/&sub2;-cm³-Insulinspritze U-100 (Becton Dickinson and Company, NT) konstant. Alle Peptidaliquote außer Protropin (GH) wurden bei -20ºC gehalten und. 60 Minuten vor der Injektion zum Auftauen entnommen. GH wurde bei 4ºC gehalten.
Kontrollmäuse (Gruppe 1) erhielten das gleiche Volumen (0,5 ml) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS-1x-137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,3). Peptide [Ratten-GLP-2 (5 ug/ml) und humanes [Gly 2] GLP-2 (5 ug/ml)] wurden in PBS rekonstituiert. Ein Mikroliter 1 N NaOH war erforderlich, um [Gly2]hGLP-2 in 1 ml aufzulösen.
Vorratslösungen von rekombinanten IGF-Peptiden (IGF-1, Lot #FJF-103; Long R3IGF-1 (LRIGF- 1), Lot# HJF-A01 GroPep Pty Ltd., Australien) wurden mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 10 mM HCl rekonstituiert. Uin die Absorption des Peptids auf der Plastikoberfläche zu minimieren, wurde das RIA Grade Bovine Serum Albumin (BSA) (BioLabs Lot 7943) zu der PBS-Arbeitslösung (100 ug/ml BSA Endkonzentration) hinzugegeben. Die Vorratslösung von Protropin (Wachstumshormon) (Lot C9009A2, Genentech Canada Inc., Burlington, ON) wurde mit Bacteriostatic-Wasser, geliefert in dem Baukasten, rekonstituiert. Die Arbeitslösung (SO ug/ml) wurde in PBS (ohne BSA) verdünnt. Kombinationsbehandlungen von GH + Ratten-GLP-2 und GH + [Gly 2]hGLP-2 wurden durch Mischen von 0,25 ml jedes Peptids verabreicht, welche in die gleiche Spritze aufgenommen wurden, um ein übereinstimmendes Injektionsvolumen von 0,5 ml aufrecht zu erhalten. Alle anderen Kombinationsbehandlungen (zum Beispiel rGLP-2 + IGF usw.) wurden am Anfang als getrennte Lösungen aufbereitet, zusammengemischt und als Aliquote eines einzigen Gemisches eingefroren, um als einzelne 0,5-ml-Injektionen verabreicht zu werden.
Die Mäuse wurden am Tag 11 getötet. Gewichtsmessungen wurden für das Herz, die Nieren, den Magen, den Dünndarm und den Dickdarm vorgenommen. Die Länge des Dünndarms wurde ebenfalls gemessen. Blut wurde durch Herzpunktion entnommen und das Plasma wurde für künftige Analyse eingefroren. Gewebe wurde für histologische Analyse ebenfalls entnommen. Die Ergebnisse waren wie folgt: TABELLE III AUSWIRKUNG AUF DEN DICKDARM
Diese Ergebnisse zeigen klar, daß GLP-2 in Kombination mit IGF-1 oder GH synergistisch wirkt, wobei Proliferation des Dickdarms verursacht wird. TABELLE IV Auswirkung auf den Dünndarm
Aus dem vorstehende Versuch ist auch klar, daß [Gly 2]hGLP-2 in Kombination mit IGF-1 oder GH eine Proliferation des Dünndarms erzeugt, die größer ist als die bei Verabreichung des Versuchspeptids allein. Es kann gesehen werden, daß die hier berichteten Ergebnisse für Ratten-GLP-2 fehlerhaft sind, gibt man die Ergebnisse, dargestellt in Beispiel 1, an, die erfolgreich wiederholt worden sind.

BEISPIEL 3: HISTOLOGISCHE ANALYSE

Die Auswirkungen der gemeinsamen Verabreichung der Peptidhormone von Beispiel 1 wurden weiterhin histologisch erforscht. Der Magen, der Dünndarm und der Dickdarm der Kontrollprobe und der behandelten Maus wurden unter Verwendung von in Paraffin eingebetteten Schnitten und standardmäßigen histopathologischen Techniken untersucht. Drei Segmente des Dünndarms, bestehend aus proximalem Leerdarm (8 cm distal zum Magenausgang), distalem Leerdarm (18 cm distal zum Magenausgang) und distalem Ileum (10 cm vor dem Blinddarm), und ein Segment des Dickdarms (proximal zum Blinddarm) wurden genommen. Die Gewebe wurden in 10%igem gepufferten Formalin fixiert und unter Verwendung von Standardtechniken in Paraffin eingebettet. Querschnittsschnitte von vier bis sechs Mikrometern wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Intestinalmikcrometrie wurde unter Verwendung des Image Analysis System (Bildanalysensystem) Leica Q500mc durchgeführt. Zehn gut ausgerichtete Zotten von jedem Schnitt wurden verwendet, um Zottenhöhe und Kryptentiefen zu bestimmen.
Die Ergebnisse für die Höhe von Krypte+Zotte im Leerdarm proximal dem Dünndarm sind in Fig. 1 dargestellt. Wie gesehen werden kann, ist die Zunahme der Höhe der Schleimhaut des Dünndarmepithels, ausgedrückt hier als Höhe von Krypte plus Zotte, beobachtet nach der Kombinationsbehandlung mit [Gly2]hGLP-2 und LRIGF-1, größer als die Höhe von Krypte plus Zotte, erhalten mit entweder [Gly2]GLP-2 oder LRIGF-1 allein.

BEISPIEL 4: GEMEINSAME VERABREICHUNG VON GLP-2 MIT IGF-2

Die Wirkung der gemeinsamen Verabreichung von IGF-2 mit entweder Ratten-GLP-2 oder [Gly2]hGLP-2 wurde auch an Mäusen untersucht. Gruppen von vier Mäusen wurden 10 Tage lang wie in Beispiel 2 behandelt, außer daß die Behandlungsgruppen und die Anfangsdosierungen wie folgt sind:
1. Kontrolle (PBS)
2. rGLP-2 (2,5 ug)
3. [Gly 2]hGLP-2 (2,5 ug)
4. LRIGF (50 ug)
5. IGF-2 (etwa 50 ug)
6. IGF-2 (etwa 50 ug) + rGLP-2 (2,5 ug)
7. IGF-2 (etwa 50 ug) + [Gly 2] hGLP-2 (2,5 ug)
8. IGF-2 (etwa 50 ug) + LRIGF (50 ug)
9. IGF-2 (etwa 50 ug) + [Gly 2] hGLP-2 (2,5 ug) + LRIGF (50 ug)
Wenn notwendig, kann die Dosis von IGF-2 um etwa das Zehnfache verringert oder vergrößert werden, um die Wirkung auf das Darmwachstum zu optimieren.
Die Ergebnisse zeigen, daß GLP-2 und GLP-2-Analoga, wenn gemeinsam mit IGF-2 verabreicht, synergistische Auswirkungen auf das Wachstum des Dickdarms zeigen.

BEISPIEL 5: ENDOGENE ERZEUGUNG VON GLP-2

Dieser Versuch wurde entworfen, um zu bestimmen, ob GLP-2 endogen in intestinotrophischen Mengen durch Zellen, die in das Säugetier implantiert werden, bereitgestellt werden könnte.
Zellen von entweder der enteroendokrinen STC-1-Zellinie der Maus oder InR1-G9-Inselzellen des Hamsters oder RIN1056A-Inselzellen der Ratte (Drucker et al. (19906) PNAS 93: 7911-7916, und Ehrlich et al. (1994) Am. J. Physio. 267: E662-E671), die alle von Glukagon abgeleiteten Peptidhormone einschließlich GLP-2 sekretieren, wurden subkutan auf dem Rücken einer nackten Maus implantiert. Diese Zellen wuchsen in vivo als fester Tumor. Vier Wochen nach der Implantation wurden die Tiere getötet. Der Dünndarm wurde entnommen, gereinigt und gewogen. Der Vergleich des Dünndarms in der Behandlungsgruppe mit Kontrollgruppen, entweder Mäuse ohne Tumore oder Mäuse mit subkutan implantierten Fibrosarkomen, die keine von Proglukagon abgeleiteten Peptidhormone, wie beispielsweise GLP-2, erzeugten, enthüllte, daß die Dünndarmmasse sich signifikant vergrößerte. So zeigte dieser Versuch, daß GLP-2 endogen einem Säugetier bereitgestellt werden konnte, indem GLP-2 erzeugende Zellen implantiert werden. Zusätzlich übte GLP-2, subkutan durch implantierte Zellen erzeugt, seine intestinotrophischen Wirkungen an einer distalen Stelle im Dünndarm aus. Andere Peptidhormone können einem Säugetier in ähnlicher Weise bereitgestellt werden, indem ex vivo genetisch bearbeitete Zellen implantiert werden, um das Peptidhormon zu erzeugen, oder Zellen in dem Säugetier veranlaßt werden, das Peptidhormon durch Gentherapie in vivo zu erzeugen.

BEISPIEL 6: GEMEINSAME VERABREICHUNG VON GLP-2 MIT PRO(BORO)PRO

Die Wirkung der gemeinsamen Verabreichung von Pro(boro)Pro mit humanem [Gly 2]GLP-2 wurde in Mäusen untersucht. Gruppen von fünf Mäusen wurden 10 Tage lang unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Protokolls behandelt, außer daß die Testmittel durch zwei getrennte Injektionen verabreicht wurden. Die Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion für die Tage 1-5 und durch subkutane Injektion für die Tage 6-10 verabreicht.
Eine Vorratslösung von Pro(boro)Pro wurde zur Injektion wie folgt hergestellt: Pro(boro)Pro wurde zu einer endgültigen Konzentration von 24 ug/ul in 1xPBS gelöst. Zu dieser Lösung wurden 10 ul 1n HCl gegeben, um einen endgültigen pH von 2,5 zu erreichen. 20-ul-Aliquote dieser Vorratslösung wurden bei -20ºC aufbewahrt. Unmittelbar vor der Verabreichung wurden die Aliquote aufgetaut und zu einer endgültigen Konzentration von 600 ug/ml in 1xPBS verdünnt, und der pH wurde auf zwischen zwei und drei eingestellt.
Die Behandlungsgruppen waren wie folgt:
1. PBS
2. PBS + Pro(boro)Pro
3. hGLP-2
4. hGLP-2 + Pro(boro)Pro
5. [Gly2]hGLP-2
6. [GIy2]hGLP-2 + Pro(boro)Pro
Die Auswirkung auf die Dünndarm- und Dickdarmmasse wird in den Fig. 2 und 3 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, daß gemeinsame Verabreichung von Pro(boro)Pro mit GLP-2 oder Analoga von GLP-2 die Masse des Dünndarms und des Dickdarms vergrößert, zu sehen, wenn GLP-2 oder Analoga von GLP-2 allein verabreicht werden.

ÄQUIVALENTE

Die vorstehende schriftliche Spezifizierung ist ausreichend, um den Fachmann zu befähigen, die Erfindung praktisch auszuführen. In der Tat ist beabsichtigt, daß verschiedene Modifizierungen der vorstehend beschriebenen Mittel zur Ausführung der Erfindung, die für den Fachmann auf dem Gebiet von Biologie, Medizin oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, innerhalb des Schutzbereichs der folgenden Patentansprüche liegen.

Claims

1. Arzneimittelkombination, verwendbar zur Steigerung der Funktion und/oder des Wachstums von, Gastrointestinalgewebe bei einem Patienten, umfassend

ein erstes Mittel, das GLP-2 oder ein intestinotrophisches Analogon davon ist, und

ein zweites Mittel ausgewählt aus (i) einem Peptidhormon, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IGF-1, Analoga von IGF-1, IGF-2, Analoga von IGF-2, GH und Analoga von GH, und (ii) einem DDP- IV-Inhibitor; und

einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Arzneimittelkombination nach Anspruch 1, wobei das zweite Mittel ein Peptidhormon ist.

3. Arzneimittelkombination nach Anspruch 2, wobei das zweite Mittel IGF-1 ist.

4. Arzneimittelkombination nach Anspruch 2, wobei das zweite Mittel IGF-2 ist.

5. Arzneimittelkombination nach Anspruch 2, wobei das zweite Mittel LRIGF-1 ist.

6. Arzneimittelkombination nach Anspruch 1, wobei das zweite Mittel ein DPP-IV-Inhibitor ist.

7. Arzneimittelkombination nach Anspruch 6, wobei das zweite Mittel Pro-boro-Pro ist.

8. Arzneimittelkombination nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das erste Mittel GLP-2 ist.

9. Arzneimittelkombination nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das erste Mittel ein intestinotrophisches Analogon von GLP-2 ist.

10. Arzneimittelkombination nach Anspruch 9, wobei das erste Mittel [Gly2]GLP-2 ist.

11. Verwendung der Arzneimittelkombination, definiert in einem der Ansprüche 1-10, bei der Herstellung eines Medikaments zur Steigerung des Wachstums und/oder der Funktion von Intestinalgewebe bei einem Patienten durch Erhöhen der Serumspiegel der Arzneimittelkombination.

12. Verwendung der Arzneimittelkombination, definiert in einem der Ansprüche 1-10, bei der Herstellung eines Medikaments zur Steigerung des Wachstums und/oder der Funktion von Intestinalgewebe bei einem Patienten.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament durch aufeinanderfolgende Verabreichung des ersten Mittels und des zweiten Mittels verabreicht werden soll.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei das Medikament an einen Patienten verabreicht werden soll, der gesteigertes Wachstum des Dünndarms benötigt.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei das Medikament an einen Patienten verabreicht werden soll, der gesteigertes Wachstum des Dickdarms benötigt.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei das Medikament an einen Patienten, leidend an einer Ernähnings- oder Magen-Darm-Störung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Enteritis, entzündlicher Darmerkrankung, Darminfarktbildung, Gefäßkrankheit, Lymphgefäßverschlüssen, Sklerodermie, Malabsorptionserkrankungen und einer endokrinen oder Stoffwechselerkrankung, verabreicht werden soll.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei das Medikament an einen Patienten, leidend an einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zöliakie, postinfektiöser Zottenatrophie, Sprue und Kurzdarmsyndrom, verabreicht werden soll.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 11-17, wobei der Patient ein Mensch ist,

19. Baukasten, umfassend eine Arzneimittelkombination nach einem der Ansprüche 1-10.

20. In-vitro-Verfahren zur Förderung des Wachstums von Gastrointestinalgewebe oder -zellen, welches den Schritt umfaßt, das Gewebe oder die Zellen in vitro in einem Kulturmedium, enthaltend eine Arzneimittelkombination, wie sie in einem der Ansprüche 1-10 definiert ist, zu kultivieren.