DE69523747T2 - Die kombination des wachstumhormones und des insulinähnlichen wachstumsfaktors-i zur behandlung von kongestivem herzversagen - Google Patents

Description

1. Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Verwendung von Wachstumshormon und Insulin-artigem Wachstumsfaktor I in Gegenwart oder Abwesenheit eines Angiotensin-Umwandlungsenzym- (ACE-) Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Patienten, die an dekompensierter Herzinsuffizienz leiden.
2. Beschreibung des Standes der Technik
• Untersuchungen in vitro haben gezeigt, dass chronische Hypersekretion von Wachstumshormon (GH) durch Einpflanzung eines GH-ausscheidenden Tumors in Ratten zu erhöhter isometrischer Kraft führt, ohne die Verkürzungsgeschwindigkeit isolierter Herz- Papillarmuskel in unbelastetem Zustand zu beeinträchtigen, trotz einer deutlichen Verlagerung des Isomyosinmusters zur V3-Isoform mit niedriger ATPase-Aktivität. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GH ein Myokard-Kontraktionsmuster herbeiführen kann, das es dem Herzmuskel ermöglicht, ökonomischer zu arbeiten. J. Timsit et al., J. Clin. Invest. 86, 507-515 (1990); J. Timsit et al., Acta. Paediatr. Suppl. 383, 32-34 (1992). Es wurde gezeigt, dass die Zunahme der Kontraktionsleistung auf spezifische Veränderungen in den Eigenschaften des Kontraktionsapparats zurückzuführen ist, einschließlich einer Zunahme sowohl der maximalen Anspannung als auch Myofibrillen- Empfindlichkeit für Kalzium. Hämodynamische Untersuchungen in vivo an narkotisierten Ratten, die chronische GH-Hypersekretion zeigten, haben jedoch widersprüchliche Ergebnisse gebracht, mit entweder erhöhten oder verringerten Herzleistungsindices. D. G. Penney et al., Cardiovascular Research 19, 270-277 (1985); S. A. Rubin et al., J. Mol. Cell Cardiol. 22, 429-438 (1990). Die Widersprüchlichkeit zwischen diesen beiden Untersuchungen in vivo steht vermutlich mit den Wirkungen der Narkose auf die Hämodynamik in Zusammenhang. Weiters hat eine klinische Untersuchung gezeigt, dass die GH-Verabreichung die Myokard-Kontraktionskraft und das Herzminutenvolumen beim gesunden Menschen erhöht. L. Thuesen et al., Dan. Med. Bull. 35(2), 193-196 (1988). Behandlung mit GH bewirkt eine signifikante Steigerung der Herzleistung und eine Verbesserung der Belastbarkeit bei Erwachsenen mit GH-Defizienz. J. Jorgensen et al., The Lancet i, 1221-1225 (1989); R. Cuneo et al.,J. Appl. Physiol. 70, 695-700 (1991); J.S. Christiansen et al., Acta. Paediatr. Suppl. 383, 40-42 (1992); G. Amato et al.,J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1671-1676 (1994); K. Caidahl et al., Clin. Endocrinol. 40, 393-400 (1994). Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass zweiwöchige GH-Behandlung die Herzfunktion verbessert, indem sie bei Ratten mit dekompensierter Herzinsuffizienz bei Bewusstsein die Ventrikel-Kontraktionskraft erhöht und den peripheren Gefäßwiderstand verringert. R. Yang et al., Clinical Research 42(2), 325A (1994).
• Es ist gezeigt worden, dass Insulin-artiger Wachstumsfaktor (IGF-I) die Actin-Synthese in Myocyten in Kultur fördert (J.R. Florini, Muscle and Nerve 10, 577-598 [1987]) und die Kontraktionskraft von Cardiozyten neonataler Ratten in vitro erhöht. U. Vetter et al., Basic Res. Cardiol. 83, 647-654 (1988). Akute intravenöse Verabreichung (Infusion oder Bolus-Injektion) von IGF-I führt zu Steigerungen des Schlagvolumens und des Herzminutenvolumens bei normalen Lämmern. Gluckman et al., PCT WO 92/11865 (1992). Bei Ratten mit Doxorubicin-induzierter Cardiomyopathie führt dreiwöchige chronische Behandlung mit IGF-I zu einer Erhöhung des Herzminutenvolumens und des Schlagvolumens. G. R. Ambler et al., Cardiovascular Research 27, 1368-1373 (1993).
• Die Wirkung von GH auf die Glucosemengen im Kreislauf ist der von IGF-I entgegengesetzt. GH-Verabreichung kann Glucose-Unverträglichkeit bewirken oder den Blutzuckerspiegel erhöhen, was bei Menschen zu Hyperglykämie führt. R. S. Sherwin et al., Diabetologia 24, 155-156 (1983); P. Metcalfe et al., Diabetologia 20, 123-128 (1981). Im Gegensatz dazu kann subkutane oder intravenöse Verabreichung von IGF-I den Blutglucosespiegel verringern, was bei Menschen Hypolgykämie verursacht. H. P. Guler et al., N. Engl. J. Med. 317, 137-140 (1987); K. Takano et al., Endocrinol. Japan. 37(2), 309-317 (1990); E. R. Froesch et al., Trends Endocrinol. Metab. 1, 254-260 (1990). Weiters hat eine klinische Untersuchung gezeigt, dass die Kombination aus GH und IGF-I- Behandlung wesentlich stärker anabolisch ist als GH oder IGF-I alleine. Die Kombination verhindert auch bei normalen Versuchspersonen die Hyperglykämie, die durch GH allein verursacht wird, und schwächt die Hypoglykämie, die durch IGF-I allein verursacht wird. S. R. Kupfer et al., J. Clin. Invest. 91, 391-396 (1993); D. R. Clemmons et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75, 234-238 (1992).
• Von Herzinsuffizienz sind etwa 3 Millionen Amerikaner betroffen. Jährlich gibt es etwa 400.000 neue Fälle von Herzinsuffizienz. Dekompensierte Herzinsuffizienz ist ein Syndrom, das durch Dysfunktion der linken Kammer, verringerte Belastbarkeit, beeinträchtigte Lebensqualität und deutlich verkürzte Lebenserwartung gekennzeichnet ist. Verringerte Kontraktionskraft der linken Kammer führt zu verringertem Herzminutenvölumen mit daraus folgender systemischer arterieller und venöser Gefäßverengung. Diese Gefäßverengung, die den Teufelskreis weiterer Reduktionen des Schlagvolumens, gefolgt von einem erhöhten Gefäßwiderstand, fördert, scheint teilweise durch das Renin-Angiotensis-System vermittelt zu werden. Die Schlüsselkomponente dieses Systems, der starke Vasokonstriktor Angiotensin II, hat auch die Wirkung, die Aldosteron-Ausscheidung zu stimulieren, was möglicherweise den sympathischen Antrieb verstärkt und die Vasopression-Ausscheidung steigert. J. N. Cohn et al., N. England J. Med. 325(5), 303-310 (1991); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C. 2(4), 755-763 (1983). Angiotensin-Umwandlungsenzym- (ACE-) Inhibitoren, wie z. B. Captopril, sind zur Standardtherapie für Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz geworden. Diese Arzneimittel verbessern das hämodynamische Profil und die Leistungsfähigkeit und verringern die Krankheits- und Sterblichkeitsrate bei Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz. B. L. Kramer et al., Circulation 67(4), 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C. 2(4), 755-763 (1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316(23), 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 325(5), 293-302 (1991). Dennoch ist, trotz der erwiesenen Wirksamkeit, die Reaktion auf ACE-Inhibitoren begrenzt gewesen. Die Verbesserung der funktionellen Kapazität und Belastungszeit ist nur gering, und die Sterblichkeit ist zwar verringert, aber immer noch hoch. The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316(23), 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 325(5), 293-302 (1991); J. N. Cohn et al., N. Engl. J. Med. 325(5), 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JA- MA 259(4), 539-544 (1988). Von GH und IGF-I ist jeweils getrennt gezeigt worden, dass sie die Herzleistung verbessern. Bisher jedoch sind die Wirkungen der Kombination aus GH und IGF-I bei Herzinsuffizienz noch nicht bewertet worden, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Captopril.
• Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von GH und IGF-I zusätzlich zu einem ACE-Inhibitor bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz vorzusehen. Es ist allgemein bekannt, dass Captopril allein beispielsweise die Herzfunktion verbessert, indem es den peripheren Gefäßwiderstand verringert. Captopril gemeinsam mit GH und IGF-I bewirkt eine stärkere Verbesserung der Herzleistung als Captopril alleine.
• Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine wirksame Menge einer Kombination aus GH und IGF-I in Abwesenheit eines ACE-Inhibitors für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz bereitzustellen. Die Verabreichung von GH und IGF-I in Kombination ergibt eine Verbesserung der Herzleistung durch erhöhte Kammer-Kontraktionskraft und verringerten peripheren Gefäßwiderstand.
• Eine Verbesserung der Herzleistung bei Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz kann bei Patienten erreicht werden, die mit ACE-Inhibitoren behandelt werden, indem das Behandlungsschema durch eine Kombination aus GH und IGF-I ergänzt wird. Eine Verbesserung der Herzleistung bei diesen Patienten kann auch durch Verabreichung von GH/IGF-I und eines ACE-Inhibitors von Beginn der Behandlung an erreicht werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Ziele erreicht, indem die Verwendung einer wirksamen Menge von GH und IGF-I (GH/IGF-I) mit oder ohne einen ACE-Inhibitor zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz bei einem Säugetier vorgesehen ist.
• Gemäß einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer Kombination aus GH und IGF-I und eines ACE-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz bei einem Säugetier vor. Mit der Verabreichung von GH und IGF-I kann nach einem Zeitraum der Behandlung mit dem ACE-Inhibitor begonnen werden.
• Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge einer Kombination aus GH und IGF-I in Abwesenheit eines ACE-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz vor.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Fig. 1a zeigt die Wirkung von Wachstumshormon und Insulin-artigem Wachstumsfaktor (GH/IGF-I) (schraffierte Balken) und Trägervehikel für GH/IGF-I allein (leere Balken) auf das Körpergewicht (BW) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe.
• Fig. 1b zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf das Verhältnis zwischen dem Gewicht der linken Kammer und dem Körpergewicht (LVW/BW) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. # P< 0,05, P< 0,01, vergleichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe.
• Fig. 2a zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf die Serum-GH-Spiegel von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe.
• Fig. 2b zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf die Serum-IGF-I-Spiegel von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe.
• Fig. 3 zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf die Infarkt-Größe von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten.
• Fig. 4a zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den systolischen Arteriendruck (SAP) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe.
• Fig. 4b zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den mittleren Arteriendruck (MAP) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe. P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe.
• Fig. 4c zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf die Herzfrequenz (HR) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten.
• Fig. 5a zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den maximalen dP/dt der linken Kammer von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. * P< 0,05, ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe.
• Fig. 5b zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den end-diastolischen Druck der linken Kammer (LVEDP) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten.
• *P< 0,05, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe. # P< 0,05, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe. ^ P < 0,01, verglichen mit der Vergleichs- (Wasser+Vehikel-) Gruppe.
• Fig. 6a zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den Herzindex (C1) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel-Gruppe. # P< 0,05, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe.
• Fig. 6b zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den Schlagvolumen-Indes (SVI) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. * P< 0,05, ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel- Gruppe. P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe.
• Fig. 6c zeigt die Wirkung von GH/IGF-I (schraffierte Balken) und Vehikel allein (leere Balken) auf den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) von mit Wasser behandelten und mit Captopril behandelten Ratten. ** P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Vehikel- Gruppe. P< 0,01, verglichen mit der jeweiligen Wasser-Gruppe. ^ P< 0,01, verglichen mit der Vergleichs- (Wasser+Vehikel-) Gruppe.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG a. Definitionen
• Im Allgemeinen haben die folgenden Worte oder Phrasen oder Abkürzungen die angegebene Definition, wenn sie in der Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen verwendet werden:
• Wie hierin verwendet bedeutet "BW" Körpergewicht ("body weight").
• Wie hierin verwendet bedeutet "C0" Herzminutenvolumen ("cardial output").
• Wie hierin verwendet bedeutet "C1" Herzindex ("cardial index"). Der Herzindex ist als Herzminutenvolumen dividiert durch das Körpergewicht (CO/BW) messbar.
• Wie hierin verwendet bedeutet "HR" Herzfrequenz ("heart rate").
• Wie hierin verwendet bezeichnet "LVEDP" den end-diastolischen Druck der linken Herzkammer ("left ventricular end-diastolic pressure").
• Wie hierin verwendet bezeichnet "LVW" das Gewicht der linken Herzkammer ("left ventricular weight").
• Wie hierin verwendet bedeutet "MAP" mittlerer arterieller Druck ("mean arterial pressure").
• Wie hierin verwendet bedeutet "SAP" systolischer arterieller Druck ("systolic arterial pressure").
• Wie hierin verwendet bedeutet "SV" Schlagvolumen ("stroke volume"). Das Schlagvolumen ist als C0/HR messbar.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "SVI" den Schlagvolumenindex ("stroke volume index"). Der Schlagvolumenindex ist als SV/BW messbar.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "SVR" den systemischen Gefäßwiderstand ("systemic vascular resistance"). Der SVR ist als MAP/C1 messbar.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "dekompensierte Herzinsuffizienz" ein Syndrom, das durch Dysfunktion der linken Herzkammer, reduziertes Leistungsvermögen, beeinträchtigte Lebensqualität und deutlich verkürzte Lebenserwartung gekennzeichnet ist. Verringerte Kontraktionskraft der linken Herzkammer führt zu verringertem Herzminutenvolumen mit daraus folgender systemischer arterieller und venöser Gefäßverengung. Diese Gefäßverengung, die teilweise durch das Renin-Angiotensis-System vermittelt zu sein scheint, fördert den Teufelskreis weiterer Reduktionen des Schlagvolumens, gefolgt von einem erhöhten Gefäßwiderstand.
• Wie hierin verwendet bedeutet "Behandlung" das Herbeiführen einer erhöhten Myocard-Kontraktionskraft und einer erhöhten Herzleistung bei Patienten, die an dekompensierter Herzinsuffizienz leiden, sowie die Vorbeugung gegen dekompensierte Herzinsuffizienz. Wenn die Kombination aus GH und IGF-I in Verbindung mit einem ACE-Inhibitor verwendet wird, wird das Ausmaß der erhöhten Myocard-Kontraktionskraft und der Herzleistung über jene angehoben, die aus der Verwendung des ACE-Inhibitors allein resultieren.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "Infarkt" einen Nekrose-Bereich, der aus unzureichender Blutversorgung resultiert. "Myokard-Infarkt" bezeichnet Myokard-Nekrose, die aus unzureichender Koronardurchblutung resultiert.
• Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "Säugetier" jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere sowie Zoo-, Sport- oder Streicheltiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier gemäß vorliegender Erfindung der Mensch.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "ACE-Inhibitor" Angiotensin-Umwandlungsenzym hemmende Arzneimittel, die die Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II verhindern die ACE-Inhibitoren können bei dekompensierter Herzinsuffizienz nützlich sein, indem sie den systemischen Gefäßwiderstand verringern und Kreislaufstauung aufheben. Zu den ACE-Inhibitoren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, jene mit den Markennamen Accupril® (Quinapril), Altace® (Ramipril), Capoten® (Captopril), Lotensin® (Benazepril), Monopril® (Fosinopril), Prinivil® (Lisinopril), Vasotec® (Enalapril) und Zestril® (Lisinopril). Ein Beispiel für eine ACE-Inhibitor ist jener, der unter dem Markennamen Capoten® verkauft wird. Generisch als Captopril bezeichnet, ist die chemische Bezeichnung für diesen ÄCE-Inhibitor 1-[(25)-3-Mercapto-2-methylpropionyl]-L-prolin.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "Wachstumshormon" oder "GH" das Wachstumshormon in nativer Sequenz oder eine Variante davon, und von jeder beliebigen Quelle, gleichgültig, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. Beispiele sind Human-Wachstumshormon (hGH), das natürlich oder rekombinantes GH mit der nativen Humansequenz (Somatotropin oder Somatropin) ist, sowie rekombinantes Wachstumshormon (rGH), mit dem jedes GH oder eine Variante bezeichnet ist, die durch DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt wird, einschließlich Somatrem, Somatotropin und Somatropin. Gemäß vorliegender Erfindung für die Verwendung beim Menschen bevorzugt wird die rekombinante Human-Nativsequenz, reifes GH mit oder ohne ein Methionin an ihrem N-Terminus. Mehr bevorzugt wird Methionyl-Human-Wachstumshormon (met-hGH), das in Escherichia coli erzeugt wird, beispielsweise nach dem Verfahren, das in dem am 5. Juli 1988 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.755.465 und in Goeddel et al., Nature 282, 544 (1979), beschrieben wird. Met-hGH, das von Genentech, Inc., unter dem Markennamen Protropin® verkauft wird, ist abgesehen vom Vorhandensein eines N-terminalen Methioninrests mit dem natürlichen Polypeptid identisch. Diese zusätzliche Aminosäure ist ein Ergebnis des bakteriellen Proteinsyntheseverfahrens. Ebenfalls bevorzugt wird rekombinantes hGH, das von Genentech, Inc. unter dem Markennamen Nutropin® erhältlich ist. Diesem letzteren hGH fehlt dieser Methioninrest, und es weist eine Aminosäuresequenz auf, die mit jener des natürlichen Hormons identisch ist. Siehe Gray et al., Biotechnology 2, 161 (1984). Sowohl Methionyl-hGH als aus hGH weisen äquivalente Potenzen und pharmakokinetische Werte auf. Moore et al., Endocrinology 122, 2920- 2926 (1988). Ein weiterer angemessener hGH-Kandidat ist eine hGH-Variante, die eine Plazenta-Form von GH mit reiner somatogener und ohne laktogene Aktivität ist, wie in dem am 2. Juni 1987 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.670.393 beschrieben. Ebenfalls enthalten sind GH-Varianten, wie in der am 3. Mai 1990 veröffentlichten WO 90/04788 und der am 11. Juni 1992 veröffentlichten WO 92/09690 beschrieben.
• Wie hierin verwendet bezeichnet "IGF-I" den Insulin-artigen Wachstumsfaktor von jeder Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd, Vogel und vorzugsweise Mensch, in Nativ-Sequenz oder in Variantenform, und von jeder Quelle, gleichgültig, ob natürlich, synthetisch oder rekombinant. IGF-I ist aus Human-Serum isoliert und rekombinant erzeugt worden. Siehe z. B. die EP-A-123.228 und 128.733.
• Gemäß vorliegender Erfindung für die Verwendung beim Tier bevorzugt wird jene Form von IGF-I von der speziellen behandelten Spezies, wie z. B. Schweine-IGF-I zur Behandlung von Schweinen, Schaf-IGF-I zur Behandlung von Schafen, Rinder-IGF-I zur Behandlung von Vieh usw. Gemäß vorliegender Erfindung zur Verwendung beim Menschen bevorzugt wird die Human-Nativsequenz, reifer IGF-I, mehr bevorzugt ohne ein N-terminales Methionin, beispielsweise hergestellt durch das Verfahren, das in der am 5. August 1987 veröffentlichten EP-A-230.869; in der am 19. Dezember 1984 veröffentlichten EP-A-128.733; der in der am 26. Oktober 1988 veröffentlichten EP-A-288.451 beschrieben wird. Mehr bevorzugt wird dieser Nativsequenz-IGF-I rekombinant hergestellt und ist von Genentech, Inc., South San Francisco, CA, für klinische Untersuchungen erhältlich.
• Die bevorzugten IGF-I-Varianten sind jene, die in dem am 31. Dezember 1991 ausgegebenen US-Patent Nr. 5.077.276, in der am 26. Feburar 1987 veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 87/01038 und der am 29. Juni 1989 veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 89/05822 beschrieben werden, d. h. jene, worin zumindest der Glutaminsäurerest an Position 3 vom N-Terminus des reifen Moleküls fehlt, und jene, die eine Löschung von bis zu 5 Aminosäuren am N-Terminus aufweisen. Bei der am meisten bevorzugten Variante sind die ersten drei Aminosäuren vom N-Terminus gelöscht (verschiedentlich als Gehirn-IGF, tIGF-I, des(1-3)-IGF-I oder des-IGF-I bezeichnet).
b. Arten der Durchführung der Erfindung
• Das GH in Kombination mit IGF-I wird dem Säugetier direkt durch eine geeignete Technik verabreicht, einschließlich parenteraler, intranasaler, oraler Verabreichung oder durch Absorption durch die Haut. Sie brauchen nicht auf dem gleichen Weg verabreicht zu werden und können lokal oder systemisch verabreicht werden. Der genaue Verabreichungsweg jedes Mittels hängt beispielsweise von der Krankengeschichte des Patienten, einschließlich jeglicher wahrgenommener oder vorhergesehener Nebenwirkungen oder reduzierter anabolischer Effekte bei Verwendung von hGH oder IGF-I alleine ab. Beispiele für parenterale Verabreichung sind subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle und intreperitoneale Verabreichung. Subkutane und intravenöse Injektion oder Infusion werden bevorzugt.
• Das GH und der IGF-I werden so verabreicht, dass sie in wirksamen Mengen vorliegen. Das GH kann diskontinuierlich verabreicht werden, etwa zu bestimmten Zeiten (beispielsweise einmal täglich) in Form einer Injektion in einer bestimmten Dosis, wo es einen Anstieg der GH-Konzentration im Plasma zur Zeit der Injektion und dann einen Abfall der GH-Konzentration im Plasma bis zum Zeitpunkt der nächsten Injektion geben kann. Ein weiteres Verfahren zur diskontinuierlichen Verabreichung resultiert aus der Verwendung vieler verfügbarer Implantatvorrichtungen, die eine diskontinuierliche Freisetzung von Wirkbestandteil, wie z. B. einen Anfangsschub, und dann eine Verzögerung vor der Freisetzung des Wirkbestandteils vorsehen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.767.628, Spalte 2, Zeilen 19-37.
• Mehr bevorzugt wird das GH jedoch so verabreicht, dass es kontinuierliche Präsenz im Blut aufweist, die für die Dauer der Verabreichung des GH beibehalten wird. Das wird am meisten bevorzugt durch kontinuierliche Infusion beispielsweise über Minipumpen, wie z. B. eine Osmose-Minipumpe, erreicht. Alternativ dazu wird das geeigneterweise durch Einsatz häufiger GH-Injektionen erreicht (d. h. mehr als einmal täglich, beispielsweise zweimal oder dreimal täglich).
• Für die Verabreichung kann GH komplexiert oder an ein Polymer gebunden werden, um seine Halbwertszeit im Kreislauf zu erhöhen. Beispiele für Polyethylenpolyole und Polyoxyethylenpolyole, die für diesen Zweck nützlich sind, umfassen Polyoxyethylenglycerin, Polyethylenglykol, Polyoxyethylensorbit, Polyoxyethylenglucose oder dergleichen. Die Glycerin-Hauptkette für Polyoxyehylenglycerin ist die gleiche Hauptkette wie sie beispielsweise bei Tieren oder Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt.
• Das Polymer muss kein bestimmtes Molekulargewicht aufweisen, es ist jedoch vorzuziehen, dass das Molekulargewicht zwischen etwa 3.500 und 100.000, mehr bevorzugt zwischen 5.000 und 40.000 liegt. Vorzugsweise ist das PEG-Homopolymer unsubstituiert, es kann aber auch an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Vorzugsweise ist die Alkylgruppe eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alklgruppe, und am meisten bevorzugt eine Methylgruppe. Am meisten bevorzugt ist das Polymer ein unsubstituiertes Homopolymer von PEG, ein Monomethyl-substituiertes Homopolymer von PEG (mPEG) oder Polyoxyethylenglycerin (POG) und weist ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 40.000 auf.
• Das GH ist über einen oder mehrere der Aminosäurereste des GH an eine reaktive Endgruppe am Polymer gebunden, hauptsächlich abhängig von den Reaktionsbedingungen, dem Molekulargewicht des Polymers usw. Das Polymer mit der bzw. den reaktiven Gruppe(n) wird gemäß vorliegender Erfindung als aktiviertes Polymer bezeichnet. Die reaktive Gruppe reagiert selektiv mit freien Amino- oder anderen reaktiven Gruppen auf dem GH. Es versteht sich jedoch, dass die Art und Menge der gewählten reaktiven Gruppe, sowie die Art des eingesetzten Polymers, um optimale Ergebnisse zu erzielen, vom speziellen eingesetzten GH abhängt, um zu vermeiden, dass die reaktive Gruppe mit zu vielen besonders aktiven Gruppen auf dem GH reagiert. Da dies möglicherweise nicht vollständig zu vermeiden sein wird, wird empfohlen, dass je nach der Protein-Konzentration im Allgemeinen etwa 0,1 bis 1.000 Mol, vorzugsweise 2 bis 200 Mol, aktiviertes Polymer pro Mol Protein eingesetzt werden. Die endgültige Menge an aktiviertem Polymer pro Mol Protein ist ein Gleichgewicht, um optimale Aktivität beizubehalten, während gleichzeitig nach Möglichkeit die Halbwertszeit des Proteins im Kreislauf optimiert wird.
• Die Reste können zwar beliebige reaktive Aminosäuren auf dem Protein sein, wie z. B. ein oder zwei Cysteine oder die N-terminale Aminosäuregruppe, vorzugsweise ist die reaktive Aminosäure jedoch ein Lysin, das durch seine freie &epsi;-Aminogruppe an die reaktive Gruppe oder das aktivierte Polymer gebunden ist, oder Glutamin- oder Asparaginsäure, die über eine Amidbindung an das Polymer gebunden ist.
• Die kovalente Modifikationsreaktion kann durch jedes geeignete Verfahren erfolgen, dass allgemein eingesetzt wird, um biologisch aktive Materialien mit inerten Polymeren umzusetzen, vorzugsweise bei etwa pH 5 bis 9, mehr bevorzugt 7 bis 9, wenn die reaktiven Gruppen auf dem GH Lysingruppen sind. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren die Herstellung eines aktivierten Polymers (mit zumindest einer Hydroxyl-Endgruppe), das Herstellen eines aktiven Substrats aus diesem Polymer, und daraufhin das Umsetzen des GH mit dem aktiven Substrat, um das für die Formulierung geeignete GH herzustellen. Die obige Modifikationsreaktion kann durch mehrere Verfahren durchgeführt werden, die eine oder mehrere Stufen umfassen können. Beispiele für Modifizierungsmittel, die eingesetzt werden können, um das aktivierte Polymer in einer Einstufen-Reaktion zu erzeugen, sind Cyanursäurechlorid (2,4,6-Trichlor-S-triazin) und Cyanursäurefluorid.
• Gemäß einer Ausführungsform findet die Modifikationsreaktion in zwei Stufen statt, worin das Polymer zunächst mit einem Säureanhydrid, wie z. B. Bernsteinsäure- und Glutarsäureanhydrid, umgesetzt wird, um eine Carbonsäure zu bilden, und die Carbonsäure dann mit einer Verbindung umgesetzt wird, die zum Umsetzen mit der Carbonsäure fähig ist, um ein aktiviertes Polymer mit einer reaktiven Estergruppe zu bilden, die zum Umsetzen mit dem GH fähig ist. Beispiele für solche Verbindungen sind N-Hydroxysuccinimid, 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure und dergleichen, und vorzugsweise werden N-Hydroxysuccinimid oder 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure verwendet. Beispielsweise kann monomethylsubstituiertes PEG bei erhöhten Temperatur, vorzugsweise etwa 100 bis 110ºC, über 4 h mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden. Die so hergestellte Monomethyl-PEG-Glutarsäure wird dann mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart eines Carbodiimidreagens, wie z. B. Dicyclohexyl- oder -isopropylcarbodiimid, umgesetzt, um das aktivierte Polymer, Methoxypolyethylenglykolyl-N-succinimidylglutarat, zu erzeugen, das dann mit dem GH umgesetzt werden kann. Dieses Verfahren wird im Detail von Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186 (1984), beschrieben. In einem weiteren Beispiel kann das monomethylsubstituierte PEG mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden, gefolgt von der Reaktion mit 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (HNSA) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, um das aktivierte Polymer zu bilden. HNSA wird von Bhatnagar et al., "Peptides: Synthesis-Structure-Function", Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (Hrsg.) (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981) S. 97-100, und von Nitecki et al., High-Technology Route To Virus Vaccines (American Society for Microbiology: Washington, D. C. 1986) mit dem Titel "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and lts Applications" beschrieben.
• Spezifische Verfahren zur Herstellung von an PEG konjugiertem GH sind die Verfahren, die in US-Patent Nr. 4.179.337 bezüglich PEG-GH und in US-Patent Nr. 4.935.465 beschrieben werden, das PEG offenbart, das reversibel aber kovalent an GH gebunden ist. Andere spezifische Verfahren zur Herstellung von PEG-GH umfassen folgende:
• PEG-ylierung mit Methoxypolyethylengylkolaldehyd (Me-PEG-Aldehyd) durch reduktive Alkylierung und Reinigung wird durch Zugabe von 5 mM Me-PEG-Aldehyd-5000 (Molekulargewicht 5.000 Dalton) und 20 mM NaCNBH&sub3; zu 2 mg/ml GH in PBS, pH 7,0 und schonendes Vermischen bei Raumtemperatur für 3 h erreicht. Ethanolamin wird dann zu 50 mM zugegeben, um das verbleibende nicht-umgesetzte Me-PEG reduktiv zu amidieren. Das Gemisch wird auf einer Anionenaustauschsäule, FPLC-Mono-Q, aufgetrennt. Das überschüssige, nicht-umgesetzte Me-PEG bindet sich nicht an die Säule und kann dann vom Gemisch abgetrennt werden. Zwei Hauptfraktionen von PEG-yliertem GH werden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 30K und 40K - im Vergleich zu 20K des nicht umgesetzten GH - auf reduziertem SDS-PAGE erhalten. GH-GHBP- Komplex wird auf die gleiche Weise PEG-yliert, um ein Derivat von 150K durch Gel-Filtration zu erhalten.
• PEG-ylierung mit N-Hydroxysuccinimidyl-PEG (NHS-PEG) und Reinigung werden durch Zugabe von NHS-PEG in einem 5-fachen Molüberschuss zur Gesamt-Lysinkonzentration von GH zu einer Lösung erreicht, die 2 mg/ml GH in 50 mM Natriumboratpuffer bei pH 8,5 oder PBS bei pH 7 und Vermischen bei Raumtemperatur für 1 h erreicht. Die Produkte werden auf einer Superose 12-Größenausschlusssäule und/oder Mono Q mittels FPLC aufgetrennt. Das PEG-ylierte GH variiert in der Größe je nach dem pH der Reaktion von etwa 300 K für die bei pH 8,5 durchgeführte Reaktion bis 40 K für pH 6,0, wie durch Gelfiltration gemessen. Der GH-GHBP-Komplex wird auf die gleiche Weise ebenfalls PEG-yliert, mit einem resultierenden Molekulargewicht von 400 bis 600 kD laut Gelfiltration.
• PEG-ylierung der Cystein-Mutanten von GH mit PEG-Maleimid wird erreicht, indem eine einzelne Cystein-Mutante von GH durch stellengerichtete Mutagenese hergestellt wird, sie aus einem E. coli 16C9-Stamm (W3110 &Delta;tonA phoA &Delta;E15 &Delta;(argF-lac)169 deo- C2, das kein deoc-Protein erzeugt), sekretiert wird und auf einer Anionen-Austauschsäule gereinigt wird.
• Stamm 16C9 wurde genetisch konstruiert, indem das deoC2-Allel von Stamm CGSC- #6092 (Nr. 6092 erhältlich vom E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn., USA und von Mark et al., Molec. Gen. Genet. 155, 145-152 (1977), beschrieben, mit dem Genotyp trxA1 recA1 ilvE4720an5 metE70 deoC2 IacZ53 rha5 maIB45 rpsL151) in einen als 7C1 bezeichneten Stamm übertragen wurde.
• Stamm 7C1 [mit dem Genotyp W3110 &Delta;tonA phoA &Delta;E15 &Delta;(argF-lac)169] wurde in mehreren Schritten unter Einsatz von Techniken konstruiert, die Transduktionen mit dem Phagen P1Kc, der aus P1 erhalten wurde (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics [Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972]), und Transposon-Genetik (Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125-159 [1977]) umfasst. E. coli K12 W3110, das ein K12-Stamm ist, der F-, &lambda;- ist (die Wildform ist F+, &lambda;+) (Bachmann, Bact. Rev. 36, 525-557 [1972]) wurde als Ausgangswirt verwendet.
• Zunächst wurde das tonA-Gen (fhuA) (Kadner et al., J. Bact. 143, 256-264 [1980]; Bachmann, Microbiol. Rev. 47, 180-230 [1983]) durch Insertion und nachfolgende ungenaue Exzision eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen deletiert.
• Im ersten Schritt dieses Verfahrens wurde E. coli W3110 mit &lambda;::Tn10 transduziert, um ein Tn10 hop-Pool von E. coli W3110 zu erzeugen (Kleckner et al., J. Mol. Biol., s.o.).
• Der E. coli W3110::Tn10 hop-Pool wurde in L-Brühe bei 37ºC bis zu einer Zelldichte von etwa 1 · 10&sup9;/ml gezüchtet. Insgesamt 0,5 ml der Kultur wurden zentrifugiert, und das Pellet wurde in 0,2 ml eines &lambda;phi80-Lysats resuspendiert, das 7,0 · 10&sup9; pfu enthielt.
• Der Phage wurde 30 min lang bei 37ºC adsorbieren gelassen. Die Suspension wurde dann auf EMB-Platten ausplattiert, die mit Tetracyclin (15 ug/ml) ergänzt waren. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden die Kolonien in 3 ml L-Brühe gepoolt, über Nacht bei 37ºC gezüchtet, zweimal gewaschen und in L-Brühe resuspendiert. Ein Bakteriophagen-P1kc-Lysat wurde auf dieser Kultur hergestellt (J. H. Miller, Experiments in Molecular Biology, s.o., S. 304).
• E. coli AT982 (Nr. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn., USA) wurde durch dieses P1kc-Lysat zu Tetracyclin-Resistenz transduziert. Transduktanden wurden auf L-Brühe-Platten, ergänzt mit Tetracyclin (15 ug/ml Diaminopimelinsäure (dap)), selektiert. Die resultierenden Transduktanden wurden auf Tetracyclinresistenz und die Regeneration des dap-Gens (dap&spplus;, tetR) gescreent. dap&spplus;, tetR-Transduktanden wurden dann auf &lambda;phi80-Resistenz getestet.
• P1kc-Lysate wurden dann an mehreren dap&spplus;, tetE, &lambda;phi80-resistenten Stämmen hergestellt. Die Lysate wurden verwendet, um E. coli W3110 zu Tetracyclinresistenz zu transduzieren. Die Transduktanden wurden bezüglich &lambda;phi80-Resistenz gescreent und selektiert.
• Tetracyclin-empfindliche Isolate wurden aus den W3110 tonA: Tn10-&lambda;phi80R-Transduktanden selektiert. Maloy und Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 (1981). Diese Isolate wurden nach Einzelkolonie-Reinigung auf &lambda;phiß0-Resistenz und Tetracyclin-Empfindlichkeit überprüft.
• DNA wurde aus mehreren Tetracyclin-empfindlichen &lambda;phi80-resistenten Mutanten isoliert und mit SstII gespalten. Die SstII-gespaltene DNA wurde durch das Southern-Blot- Verfahren charakterisiert, wobei radioaktiv markierte und SstII-gespaltene &lambda;::Tn10-DNA als Sonde verwendet wurde, um zu bestimmen, ob das Tn10 ausgeschnitten worden war. Davi et al., Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980). Von einem der Tetracyclin-empfindlichen Isolate wurde gezeigt, dass es im Vergleich zur Hybridisierung zwischen DNA vom &lambda;::Tn10 und dem parentalen W3110 tonA::Tn10lphiß0R zwei der Tn10-Hybridierungsbanden verloren hatte. Eine dritte Hybrisierungsbande wies eine veränderte Mobilität auf, was darauf hinweist, dass eine durch das unpräzise Ausschneiden von Tn10 verursachte Deletion erfolgt war.
• SDS-Gel-Elektrophorese von Außenmembran-Präparaten vom Stamm mit einer unpräzisen Tn10-Exzision zeigte, dass die Bande, von der angenommen wurde, dass sie das TonA-Protein sei, im Vergleich zum TonA-Protein der Wildform veränderte elektrophoretische Mobilität aufwies. Das resultierende Protein war als ein &lambda;phi80-Phagenrezeptorprotein nicht-funktionell. Ein zweiter unabhängiger Stamm, der ebenfalls unpräzise Exzision von Tn10 erfahren hatte, zeigte kein TonA-Protein auf dem SDS-Gel.
• Keiner dieser Stämme zeigte Rückkehr zu Tetrayclin-Resistenz oder zu &lambda;phi80-Anfälligkeit, was darauf hinweist, dass es eine unpräzise Exzision des gesamten oder eines Teils des Tn10-Transposons gemeinsam mit entweder einer teilweisen oder einer vollständigen Deletion des tonA-Gens gab. So wurde das TonA-Protein (MG 78.000) aus der Außenmembran eliminiert, was den W3110-tonA-Stamm für mehrere Bakteriophagen resistent machte.
• Dann wurden zwei weitere Deletionsmutationen, phoA &Delta; E15 (Sarthy et al., J. Bact. 145, 288-292 [1981]) und &Delta; (argF-lac)-169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet. 192, 293-294 [1983]) gleichzeitig durch genetische Bindung an ein Kanamycin-Resistenztransposon, das in ein biosynthetisches Prolin-Gen (proC::TnS) insertiert war, in W3110 tonA übertragen.
• Das Transposon wurde durch Selektion bezüglich eines spontanen prototrophen (pro&spplus;) Revertanten auf Glucose-Minimal-Agarplatten elimiert. Die Einführung der phoA-Mutation wurde als Transduktanden erkannt, die weiße Kolonien auf Glucose-Minimal-Agarplatten mit 0,2 mM Phosphat und 20 mg/l, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat bilden. Ebenso bewirkt die &Delta;(argF-lac)169-Mutation den Verlust des Enzyms &beta;-Galactosidase und führt zu Zellen, die weiße Kolonien auf MacConkey-1%-Lactose-Agarplatten bilden. Das Ergebnis war Stamm 7C1.
• Schließlich wurde die deoC-Mutation (Bachman, oben), durch die die Aldolase entfernt wurde, durch ein Mehrstufen-Verfahren von Transduktionen unter Einsatz des Phagen P1kc in 7C1 eingeführt. Es wurden Standard-Transduktionsverfahren eingesetzt. Zunächst wurde Threonin-Auxotrophie in 7C1 eingeführt, um ein Mittel für die positive Selektion von transduzierten chromosomalen Segmenten in der Region des deoC-Gens wie folgt bereitzustellen:
• P1kc wurde auf einem Threonin-Auxotroph gezüchtet, wobei solche Auxotrophen in Clare N. Berg und Douglas E. Berg, Microbiology 1981, "Bacterial Transposons", S. 107- 116 (Amer. Soc. for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) beschrieben werden.
• Das resultierende Lysat wurde verwendet, um Stamm 7C1 zu Tetracyclin-Resistenz zu transduzieren, wobei bezüglich Transduktanden auf LB-Platten selektiert wurde, die 25 pg/ml Tetracyclin enthielten. Der resultierende Stamm mit der Bezeichnung 14A9 (tonA&Delta;, phoA&Delta;E15, &Delta;(argF-lac)169 thr:an10) kehrte mit hoher Häufigkeit spontan zu Prototrophie zurück, und so wurden Fusarmsäureplatten (J. Bact. 145, 1110 [1981]) verwendet, um ein stabiles Tetracycfin-empfindliches Threonin-Auxotroph mit der Bezeichnung Stamm 16C4 zu erhalten.
• P1kc wurde auf Stamm CGSC Nr. 6092 gezüchtet wie oben beschrieben.
• Das resultierende Lysat wurde verwendet, um Stamm 16C4 zu Protrophie zu transduzieren, wobei bezüglich Wachstum auf Glucose-Minimal-Agarplatten selektiert wurde. Um ein Hochfrequenz-Transduktionslysat von Stamm 2D4 zu erhalten, musste der P1kc- Phage auf diesem Wirt zweimal bezüglich Wachstum zyklisiert werden. Fünf prototrophe Transduktanden von Satamm 16C4 wurden isoliert, gereinigt und auf Thymidin- Minimal-Agarplatten auf Wachstum getestet. Vier von fünf dieser Isolate konnten sich auf Thymidin nicht vermehren und hatten daher die deoC2-Mutation erhalten, die die Synthese von deoc-Protein eliminiert. Eines dieser vier Isolate wurde aufbewahrt und als Stamm 16C9 bezeichnet (&Delta;tonA, phoA, &Delta;E15, &Delta;(argF-lac)169, deoC2).
• PEG-Maleimid wird durch Umsetzung von MonomethoxyPEG-Amin mit Sulfo-MBs in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5 für 1 h bei Raumtemperatur hergestellt und der Puffer auf Phosphatpuffer pH 6,2 ausgetauscht. Als nächstes wird GH mit einem freien zusätzlichen Cystein eine Stunde lang eingemischt, und das fertige Gemisch wurde auf einer Mono-Q-Säule wie bei Me-PEG-Aldehyd-PEG-yliertem GH aufgetrennt.
• Da Esterbindungen chemisch und physiologisch labil sind, kann es vorzuziehen sein, ein PEG-Reagens in der Konjugierungsreaktion zu verwendet, das kein Ester-Funktionalität enthält. Beispielsweise kann eine Carbamat-Bindung durch Reaktion von PEG-Monomethylether mit Phosgen hergestellt werden, was das PEG-Chlorformiat ergibt. Dieses Reagens kann dann auf die gleiche Weise wie der NHS-Ester verwendet werden, um Lysin-Seitenketten-Amine zu funktionalisieren. Bei einem weiteren Beispiel wird eine Harnstoff-Bindung hergestellt, indem der Amino-PEG-Monomethylether mit Phosgen umgesetzt wird. Das erzeugt ein PDG-lsocyanat, das mit Lysinaminen reagiert.
• Eine bevorzugte Art der Herstellung von PEG-GH, das keinen spaltbaren Ester im PEG- Reagens enthält, wird wie folgt beschrieben: Methoxypoly(ethylenglykol) wird durch Titration mit Naphthalinnatrium, um das Alkoxid zu bilden, gefolgt von Behandlung mit Bromethylacetat, um den Ethylester zu bilden, gefolgt von Hydrolyse zur entsprechenden Carbonsäure durch Behandlung mit Natriumhydroxid und Wasser in eine Carbonsäure umgewandelt, wie von Bückmann et al., Macromol. Chem. 182, 1379-1384 (1981), berichtet. Die resultierende Carbonsäure wird dann in einen PEG-N-Hydroxysuccinimidylester umgewandelt, der für die Acylierung von GH geeignet ist, indem die resultierende Carbonsäure mit Dicyclohexylcarbodiimid und NHS in Ethylacetat umgesetzt wird.
• Das resultierende NHS-PEG-Reaens wird dann mit 12 mg/ml GH unter Einsatz eines 30- fachen molaren Überschusses gegenüber GH in einem Natriumboratpuffer, pH 8,5, bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt und auf eine Q-Sepharose-Säule in Tris-Puffer aufgebracht und mit einem Salzgradienten eluiert. Dann wird es auf eine zweite Säule (Phenyl Toyopearl) aufgebracht, die in 0,3 M Natriumcitratpuffer, pH 7,8 äquilibriert wurde. Das PEG-ylierte GH wird dann mit einem reversen Salzgradienten eluiert, gepoolt und unter Verwendung einer G25-Entsalzungssäule in einen Mannit-, Glycin-, und Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 Puffer-ausgetauscht, um ein geeignetes formuliertes PEG7-GH zu erhalten.
• Die PEG-ylierten GH-Moleküle und der GH-GHBP-Komplex können durch SDS-PAGE, Gelfiltration, NMR, Trypsinkartierung, Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und biologische Tests in vitro charakterisiert werden. Das Ausmaß der PEG-ylierung wird geeigneterweise zunächst durch SDS-PAGE und Gelfiltration gezeigt und dann durch NMR analysiert, das einen spezifischen Resonanzpeak für die Methylenwasserstoffe von PEG aufweist. Die Anzahl an PEG-Gruppen auf jedem Molekül kann aus dem NMR-Spektrum oder durch Massenspektrometrie berechnet werden. Polyacrylamidgel- Elektrophorese in 10% SDS erfolgt geeigneterweise in 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl als Eluierungspuffer. Um zu zeigen, welcher Rest PEG-yliert wird, kann Trypsinkartierung durchgeführt werden. So wird PEG-yliertes GH mit Trypsin in einem Protein/Enzym-Verhältnis von 100 : 1 auf mg-Basis bei 37ºC für 4 h in 100 mM Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Kalziumchlorid, pH 8,3, gespalten und auf einen pH < 4 angesäuert, um die Spaltung vor der Trennung auf HPLC Nucleosil C-18 (4,6 mm · 150 mm, 5 um, 100A) zu stoppen. Das Chromatogramm wird mit jenem von nicht-PEGyliertem Ausgangsmaterial verglichen. Jeder Peak kann dann durch Massenspektrometrie analysiert werden, um die Größe des Fragments im Peak zu verifizieren. Das bzw. die Fragment(e), das/die PEG-Gruppen tragen, werden üblicherweise nach der Injektion nicht auf der HPLC-Säule gehalten und verschwinden aus dem Chromatogramm. Ein solches Verschwinden aus dem Chromatogramm ist ein Hinweis auf die PEG-ylierung auf diesem speziellen Fragment, das zumindest einen Lysinrest enthalten sollte. PEG- yliertes GH kann dann durch herkömmliche Verfahren auf seine Fähigkeit getestet werden, sich an das GHBP zu binden.
• Die verschiedenen eingesetzten PEG-ylierungsverfahren erzeugten verschiedene Arten von PEG-yliertem GH der Wildform mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 35K, 51K, 250K und 300K laut Größenausschlusschromatographie, das nahe bei ihrem nativen hydrodynamischen Volumen liegen sollte. Diese wurden als PEG1-GH, PEG2-GH, PEG3-GH bzw. PEG7-GH bezeichnet. Nach den Ergebnissen der Trypsinkartierung fehlte sowohl beim PEG1-GH als auch beim PEG2-GH das N-terminale Fragment aus 9- Aminosäuren im Chromatogramm, und sie waren möglicherweise PEG-yliert, was durch die Massenspektrometrie der großen Molekülspezies bestätigt werden konnte, die im Durchfluss der Flüssigchromatographie zu finden war. Aufgrund des Molekulargewichts bei SDS-PAGE kann PEG1-GH zwei PEG-Moleküle auf dem N-terminalen Amin aufweisen, wodurch ein tertiäres Amid gebildet wird. Das PEG3-GH weist auf Basis des NMR- Ergebnisses etwa 5 PEG-Gruppen pro Molekül auf, und laut der Trypsinkartierung fehlten zumindest 5 Peptidfragmente, was darauf hinweist, dass sie PEG-yliert sind. Aufgrund von Massenspektrometrie wird angenommen, dass das PEG7-GH-Molekül 6 bis 7 PEG-Gruppen pro Molekül aufweist.
• Die Stellen für die Hinzufügung von PEG-Gruppen an GH und jene, die bevorzugte Reste für eine solche Konjugation sind, sind N-terminales Methionin oder Phenylalanin, Lysin 38, Lysin 41, Lysin 70, Lysin 140, Lysin 145, Lysin 158 und Lysin 168. Zwei Lysine, die anscheinend nicht PEG-yliert waren, waren Lysin 115 und Lysin 172.
• Das GH wird geeigneterweise auch durch Retard-Systeme verabreicht. Beispiele für Retard-Zusammensetzungen, die gemäß vorliegender Erfindung nützlich sind, sind semipermeable Polymermatrices in Fom von Formteilen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln. Zu den Retard-Matrices zählen Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP-A-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und &gamma;-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 [1983]), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 [1981], und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 [1981]) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP-A-133.988), oder PLGA-Mikrokugeln. Retard-GH-Zusammensetzungen umfassen auch in Liposomen eingebettetes GH. Liposome, die GH enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: siehe DE-A-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP-A-52.322; EP-A-36.676; EP-A-88.046; EP-A-143.949; EP-A- 142.641; japanische Patentanmeldung Nr. 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP-A-102.324. Üblicherweise gehören die Liposome dem kleinen (etwa 200 bis 800 Ångstrom) unilamellaren Typ an, bei dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil auf die optimale Therapie eingestellt ist. Außerdem kann eine biologisch aktive Retard-Formulierung aus einem Addukt aus dem GH hergestellt werden, das kovalent an ein aktiviertes Polysaccharid gebunden ist, wie im am 15. August 1989 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.957.505 beschrieben. Außerdem beschreibt US-Patent Nr. 4.837.381 eine Mikrokugel-Zusammensetzung aus Fett oder Wachs oder einem Gemisch davon mit GH zur langsamen Freisetzung.
• Der IGF-I kann auf jedem Weg verabreicht werden, einschließlich von Injektionen (einzeln oder merhfach, z. B. 1 bis 4 pro Tag) oder Infusionen. Wie beim GH kann der IGF-I so formuliert werden, dass er im Verlauf der Behandlung ein kontinuierliches Vorhandensein im Blut aufweist, wie oben für GH beschrieben. Daher kann er kovalent an ein Polymer gebunden werden oder zu einer Retard-Formulierung gemacht werden, wie oben beschrieben.
• Außerdem wird der IGF-I geeigneterweise gemeinsam mit einem oder mehreren seiner Bindungsproteine verabreicht, beispielsweise jenen, die zur Zeit bekannt sind, d. h. IGF- BP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 oder IGFPB-6. Der IGF-I kann zur Verabreichung auch an einen Rezeptor oder Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden werden. Das bevorzugte Bindungsprotein für IGF-I gemäß vorliegender Erfindung ist IGFBP-3, das im US-Patent Nr. 5.258.287, ausgegeben am 2. November 1993, und von Martin und Baxter, J. Biol. Chem. 261, 8754-8760 (1986), beschrieben wird. Dieses glykosylierte IGFBP-3-Proein ist eine Säure-stabile Komponente mit etwa 53 kD auf einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gel eines 125-150 KD-Glykoproteinkomplexes, der in Human-Plasma zu finden ist, der die meisten endogenen IGFs trägt und auch durch GH reguliert wird.
• Die Verabreichung des IGF-Bindungsproteins mit IGF-f kann nach dem Verfahren erfolgen, das in dem am 16. Februar 1993 ausgegebenen US-Patent Nr. 5.187.141 beschrieben wird. Kurz zusammengefasst werden die IGF-I und IGFBP in wirksamen Mengen durch subkutane Bolus-Injektion in einem Molverhältnis von etwa 0,5 : 1 bis etwa 3 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 1, verabreicht.
• Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung sowohl von IGF-I als auch GH durch kontinuierliche Infusion, beispielsweise unter Einsatz intravenöser oder subkutaner Mittel. Mehr bevorzugt erfolgt die Verabreichung sowohl bei IGF-I als auch GH subkutan.
• Bei der Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz durch GH und IGF-I in Kombination werden die GH- und IGF-I-Zusammensetzungen auf eine Weise formuliert, dosiert und verabreicht, die in Einklang mit guter medizinischer Praxis steht. Zu den Faktoren, die in diesem Zusammenhang zu berücksichtigen sind, gehören das jeweils behandelte Säugetier, der klinische Zustand des individuellen Patienten (insbesondere die Nebenwirkungen der Behandlung mit GH oder IGF-I allein), die Seile der Abgabe der IGF-1- und der GH-Zusammensetzung(en), das Verabreichungsverfahren, der Verabreichungsplan und andere Faktoren, die Ärzten bekannt sind. Die "wirksamen Mengen" jeder Komponente für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind somit durch derartige Überlegungen bestimmt, und es handelt sich dabei um Mengen, die die Herzleistung verbessern oder andere Bedingungen von ähnlicher Bedeutung bei Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz verbessern.
• Als allgemeiner Vorschlag liegt die pharmazeutisch wirksame Gesamtmenge von IGF-I und GH bei parenteraler Verabreichung pro Dosis jeweils im Bereich von etwa 1 ug/kg/- Tag bis 10 mg/kg/Tag an Patienten-Körpergewicht, obwohl das, wie oben angemerkt, weitgehend therapeutischem Ermessen unterliegt. Das Vorliegen von Nebenwirkungen beeinflusst die Dosen, ebenso wie die Art der Behandlung (d. h. ob die Behandlung chronisch oder akut erfolgt) und das Alter des Patienten (d. h. ob sie älteren Personen, Personen mittleren Alters, jungen Erwachsenen oder Kindern verabreicht werden). Beispiele für Patienten, bei denen akute Behandlung angemessen ist, sind Patienten mit Verbrennungen, die etwa 2 bis 4 Wochen lang behandelt werden können. Beispiele für Patienten, bei denen chronische Behandlung angemessen sind, sind ältere Menschen, die typischerweise weniger Arzneimittel erhalten als jüngere Patienten. Vier Monate wäre eine halb-chronische Dosis. Die Dosis für die akute Behandlung liegt typischerweise in einem weiteren Bereich und hat eine höhere Obergrenze als die Dosis für chronische Behandlung.
• Als allgemeine Regel beträgt die bevorzugte Dosis für IGF-I und GH jeweils zumindest etwa 0,01 mg/kg/Tag, und mehr bevorzugt für Menschen zwischen etwa 0,01 und 1 mg/- kg/Tag für jedes Hormon. Noch mehr bevorzugt berägt die Dosis jedes Hormons etwa 0,01 mg/kg/Tag bis 0,25 mg/kg/Tag. Spezifisch für GH wird die am meisten bevorzugte Dosis einmal täglich im Bereich von ewa 10 bis 100 ug/kg/Tag verabreicht, wobei die Dosis von einer anfänglich niedrigeren Dosis ausgehend gesteigert werden kann. Eine zu hohe Anfangsdosis an GH kann Ödeme verursachen. Spezifisch für IGF-I wird die am meisten bevorzugte Dosis zweimal täglich (BID) im Bereich von etwa 50 bis 200 ug/kg/Tag (Gesamttagesdosis), vorzugsweise etwa 50 bis 150 ug/kg/Tag verabreicht. Bei kontinuierlicher Verabreichung werden IGF-I und GH jeweils typischerweise in einer Dosisrate von ewa 1 ug/kg/h bis etwa 50 ug/kg/h, entweder durch 1 bis 4 Injektionen pro Tag oder durch kontinuierliche subkutane Infusionen verabreicht, wobei beispielsweise eine Minipumpe zum Einsatz kommt. Es kann auch eine intravenöse Lösung aus einem Beutel verwendet werden. Der Schlüsselfaktor bei der Auswahl einer angemessenen Dosis ist das erzielte Ergebnis, wie beispielsweise durch verbesserte Herzleistung, Beseitigung der Symptome, Steigerung der Leistungsfähigkeit und/oder längeres Überleben gemessen.
• Es ist anzumerken, dass Praktiker, die Dosen sowohl von IGF-I als auch GH bestimmen, die bekannten Nebenwirkungen der Behandlung mit diesen Hormonen berücksichtigen sollten. Bei hGH umfassen die Nebenwirkungen Natrium-Retention und Ausweitung des extrazellulären Volumens (Ikkos et al., Acta Edocrinol. 32, 341-361 (1959); Biglieri et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 21, 361-370 (1961)), sowie Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Die Haupt-Nebenwirkung von IGF-1 ist offenbar Hypoglykämie. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2868-2872 (1989). Tatsächlich kann eine Kombination von IGF-I und GH zu einer Reduktion dieser unerwünschten Nebenwirkungen beider Mittel (z. B. Hypoglykämie für IGF-I und Hyperinsulinismus für GH) und zur Wiederherstellung der Blutspiegel an GH führen, dessen Ausscheidung durch IGF-I unterdrückt wird.
• Zur parenteralen Verabreichung werden bei einer Ausführungsform IGF-I und GH im Allgemeinen formuliert, indem sie jeweils im gewünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Einheitsdosisform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt werden, d. h. einem, der für Rezipienten in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen nichttoxisch ist und der mit anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich ist. Beispielsweise umfasst die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und anderen Verbindungen, von denen bekannt ist, dass die für Polypeptide schädlich sind.
• Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der IGF-I und das GH jeweils gleichmäßig und eng mit flüssigen Trägern oder feinzerteilten festen Trägern oder beiden in Kontakt gebracht werden. Dann wird, falls notwendig, das Produkt in die gewünschte Formulierung gebracht. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, mehr bevorzugt eine Lösung, die mit dem Blut des Rezipienten isotonisch ist. Beispiele für solche Trägervehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Nicht-wässrige Vehikel, wie z. B. fixierte Öle und Ethyloleat, sind gemäß vorliegender Erfindung ebenfalls nützlich, ebenso wie Liposome.
• Der Träger enthält geeigneterweise kleinere Mengen an Additiven, wie z. B. Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen. Derartige Materialien sind in den eingesetzten Dosierungen und Konzentration für die Rezipienten nichttoxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze; Oxidationshemmer, wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide, z. B. Polyarginin oder Tri peptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose oder ihrer Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Geliermittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; Gegenionen, wie z. B. Natrium, und/oder nicht-ionogene Tenside, wie z. B. Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
• IGF-I und GH werden typischerweise einzeln in solchen Vehikeln in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 10 mg/ml, beieinem pH von ewa 4,5 bis 8 formuliert. IGF-I voller Länge ist allgemein bei einem pH von nicht mehr als etwa 6 stabil; des(1-3)-IGF-I ist bei etwa 3,2 bis 5 stabil; hGH ist bei einem höheren pH von beispielsweise 7,4 bis 7,8 stabil. Es versteht sich, dass die Verwendung von bestimmten der obigen Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von IGF- I- oder GH-Salzen führt.
• Außerdem kann der IGF-I und GH, vorzugsweise der IGF-I voller Länge, gemeinsam in einem geeigneten Trägervehikel formuliert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden. Bei einer Ausführungsform hängt der zur Formulierung verwendete Puffer davon ab, ob die Zusammensetzung unmittelbar nach dem Vermischen verwendet oder für die spätere Verwendung gelagert wird. Wenn es unmittelbar nach dem Vermischen eingesetzt wird, kann ein Gemisch aus IGF-I voller Länge und GH in Mannit, Glycin und Phosphat, pH 7,4, formuliert werden. Wenn das Gemisch gelagert werden soll, wird es in einem Puffer bei einem pH von etwa 6, wie z. B. Citrat, mit einem Tensid formuliert, das die Löslichkeit des GH bei diesem pH erhöht, wie z. B. 0,1% Polysorbat 20 oder Poloxamer 188. Das Endpräparat kann ein stabiler flüssiger oder lyophilisierter Feststoff sein.
• IGF-I und GH zur Verwendung für die therapeutische Verabreichung sind vorzugsweise steril. Sterilität wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erreicht (z. B. Membranen mit 0,2 um). Therapeutische IGF-1- und GH-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise einen Beutel oder eine Phiole mit intravenöser Lösung, der bzw. die einen Stopfen aufwiest, der mit einer Injektionsnadel durchstochen werden kann.
• IGF-I und GH werden üblicherweise als wässrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution in Einheits- oder Mehrfachdosis-Behältern gelagert, beispielsweise abgedichteten Ampullen oder Phiolen. Als Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung werden 10 ml-Phiolen mit 5 ml sterilfiltrierten 1%igen (Gew./Vol.) wässrigen IGF-I- und GH-Lösungen gefüllt, und das resultierende Gemisch wird lyop iilisiert. Die Infusionslösung wird hergestellt, indem der bzw. das lyophilisierte IGF-I und GH unter Einsatz von bakteriostatischem Wasser zur Injektion rekonstituiert wird.
• Die wirksame zu verabreichende Menge an ACE-Inhibitor, wenn dieser eingesetzt wird, liegt im Ermessen des Arztes oder Veterinärs. Die Dosis-Verabreichung und Einstellung erfolgt so, dass eine optimale Behandlung der dekompensierten Herzinsuffizienz erzielt wird und berücksichtigt idealerweise die Verwendung von Diuretika oder Digitalis sowie Affektionen wie Hypotension und Nierenschädigung. Die Dosis hängt außerdem von Faktoren wie der Art des verwendeten Inhibitors und dem jeweils behandelten Patienten ab. Typischerweise ist die eingesetzte Menge die gleiche Dosis wie jene, die verwendet wird, wenn ACE-Inhibitoren ohne GH und IGF-I zu verabreichen sind.
• Daher beträgt beispielsweise eine Test-Dosis Enalapril 5 mg, die dann auf 10 bis 20 mg pro Tag, einmal täglich gesteigert wird. Wenn der Patient es verträgt. Als weiteres Beispiel wird Captopril zunächst Personen oral in einer Testdosis von 6,25 mg verabreicht, und die Dosis wird dann, wenn der Patient es verträgt, auf 25 mg zweimal täglich (BID) oder dreimal täglich (TID) gesteigert und kann auf 50 mg BID oder TID getitert werden. Die Toleranzhöhe wird abgeschätzt, indem ermittelt wird, ob eine Verringerung des Blutdrucks von Anzeichen für Hypotension begleitet ist. Fall indiziert, kann die Dosis auf bis zu 100 mg BID oder TID erhöht werden. Captopril wird zur Verabreichung als Wirkbestandteil in Kombination mit Hydrochlorthiazid erzeugt, und als pH-stabilisierter Kern mit einem enterischen oder Retard-Überzug, der Captopril schützt, bis es den Dickdarm erreicht. Captopril ist zur Verabreichung in Tabletten- oder Kapselform erhältlich. Eine Erörterung der Dosierung, Verabreichung, Indikationen und Gegenindikationen, die mit Captopril und anderen ACE-Inhibitoren verbunden sind, findet sich im Physicians Desk Reference, Medical Economics Data Production Co., Montvale, NJ. 2314- 2320 (1994).
• Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel besser verstanden werden. Das Beispiel sollte jedoch nicht als den Schutzumfang der Erfindung einschränkend interpretiert werden. Alle Literatur- und Patent-Zitate sind ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen.
BEISPIEL 1
• Verwendung von GH/IGF-I zur Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz mit und ohne vorherige oder gleichzeitige Behandlung mit Captopril
Einleitung
• Das Ziel dieser Untersuchung bestand darin, die Auswirkungen von Human-GH/IGF-I auf das Herz bei Ratten mit dekompensierter Herzinsuffizienz mit oder ohne vorherige Behandlung mit Captopril oder Wasser zu bewerten.
Verfahren
• Sprague-Dawley- (SD-) Rattenmännchen (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Alter 8 Wochen) wurden vor dem Eingriff zumindest 1 Woche lang im Labor akklimatisiert. Den Ratten wurde ein pelletiertes Rattenfutter und Wasser ad libitum gefüttert und sie wurden einem Raum mit reguliertem Licht und regulierter Temperatur untergebracht.
Koronararterienligation
• Myokardinfarkt wurde durch Ligation der linken Koronararterie erzeugt, wie zuvor beschrieben. D. L. Geenen et al., J. Appl. Physiol. 63, 92-96 (1987); P. Butterick et al., Am. ). Physiol. 260, H473-H479 (1991). Die Ratten wurden mit Natriumpentobarbital (60 mg/kg, ip) narkotisiert, über Tracheotomie intubiert und mit einem Beatmungsgerät (Harvard Apparatus Modell 683) beatmet. Nach einer linksseitigen Thoracotomie wurde die linke Koronararterie etwa 2 mm von ihrem Ursprung mit einer 7-0-Seidennaht ligiert. Alle Ratten wurden nach der "Position of the American Heart Association on Research Animal use", die am 11. November 1984 von der American Heart Association angenommen worden war, behandelt. Nach 4 bis 6 Wochen Ligation führte Myokardinfarkt zu dekompensierter Herzinsuffizienz bei den Ratten.
Elektrokardiogramm
• Eine Woche nach der Operation wurden Elektrokardiogramme unter leichter Metofan- Narkose erhalten, um die Entwicklung von Infarkten zu dokumentieren. Die ligierten Ratten wurden nach der Tiefe und Beharrlichkeit pathologischer Q-Wellen über die präkardialen Leitungen in Gruppen unterteilt. P. Buttrick et al., Am. J. Physiol. 260, H473- H479 (1991); R. A. Kloner et al., Am. Heart J. 106(5), 1009-1013 (1983). Die ECG-Ergebnisse lieferten eine grobe Abschätzung der Infarktgröße und gewährleisteten, dass große und kleine Infarkte nicht unterschiedlich in den ligierten Raten verteilt waren, die mit Wachstumsfaktoren und Vehikel behandelt wurden. Das Körpergewicht (BW) wurde während der Behandlung zweimal pro Woche gemessen.
Verabreichung von GH und IGF-1
• Zwei Wochen nach der Operation wurden die Ratten drei Monate lang auf eine Behandlung mit Captopril (2 g/l, im Trinkwasser) oder Wasser gesetzt. Drei Monate, nachdem die Captopril- oder Wasser-Behandlung begonnen hatte, wurden der Behandlung der Ratten Vehikel oder eine Kombination aus rekombinantem GH (Nutropin®, Marke von Genentech, Inc.; 2 mg/kg/Tag einmal täglich, subkutane Injektion) und rekombinantem Human-IGF-I (10 mg/ml in 50 mM Natriumacetatpuffer, 2,5 mg/ml Phenol, 5,84 mg/ml NaCl, und 9 mg/ml Benzylalkohol, pH 5,4; 2 mg/kg/Tag, subkutane Infusion durch Osmosepumpen) hinzugefügt. Die Behandlung wurde auf diese Weise für 14 Tage fortgesetzt. GH und IGF-I wurden in Wasser (zur Injektion) als Vehikel verabreicht. Das Körpergewicht (BW) wurde während der Behandlung zweimal wöchentlich gemessen.
Katheterisierung
• Nach 13tägiger Behandlung mit GH/IGF-I oder Vehikel wurden die Ratten mit Pentobarbital-natrium (50 mg/kg, intraperitoneal) narkotisiert. Ein Katheter (PE-10 fusioniert mit PE 50), gefüllt mit Heparin-Salzlösung (50 E/ml) durch die rechte Oberschenkelarterie in die Bauchschlagader implantiert, um den arteriellen Blutdruck und die Herzfrequenz zu messen. Zum Messen der Drücke der linken Kammer und dP/dt wurde ein zweiter Katheter in durch die rechte Halsschlagader in die linke Herzkammer implantiert. Zur Messung des Herzminutenvolumens durch ein Thermodilutionsverfahren wurde ein dritter Katheter durch die rechte Jugularvene zur Injektion von Kochsalzlösung in die rechte Arterie implantiert, und ein Thermistorkatheter (Lyons Medical Instrument Co., Sylmar, Kalifornien, USA) wurde in den Aortabogen eingesetzt. Die Katheter wurden im Nacken mit Hilfe eines subkutan tunnelierten Edelstrahldrahts nach außen gelegt und dann fixiert. Nach der Katheter-Implantation wurden alle Ratten einzeln untergebracht.
Hämodynamik-Messungen
• Einen Tag nach der Katheterisierung wurden an den bei Bewusstsein befindlichen und nicht eingesperrten Ratten Hämodynamik-Messungen durchgeführt. Die Thermistor-Katheter wurde zur Bestimmung des Herzminutenvolumens unter Verwendung eines Mikrocomputersystems (Lyons Medical Instruments Co.) ausgewertet, und die anderen drei Katheter waren an einen Druckwandler, Modell CP-10 (Century Technology Company, lnglewood, Kalifornien, USA) angeschlossen, der an einen Grass Modell 7 Polygraphen angeschlossen war (Grass Instruments, Quincy, MA, USA), um den mittleren Arteriendruck (MAP), den systolischen Arteriendruck (SAP), die Herzfrequenz (HR), den end-diastolischen Druck der linken Kammer (LVEDP) und das linke Kammer-Maximum dP/dt zu messen. Für die Messung des Herzminutenvolumens wurde isotonische Kochsalzlösung (0,1 ml) bei Raumtemperatur als Bolus über den Jugufarvenen-Katheter injiziert. Die Thermodilutionskurve wurde mittels VR-16-Simultrace-Recorder (Honeywell Co., NY) überwacht, und das Herzminutenvolumen (C0) wurde ditigal mit dem Mikrocomputer erhalten. Aus dem C0 können das Schlagvolumen (SV), der Herzindex (C1), der Schlagvolumen-Index (SVI) und der systemische Gefäßwiderstand (SVR) berechnet werden.
• Nach der Messung dieser hämodynamischen Parameter wurde 1 ml Blut durch den Arterienkatheter abgenommen. Das Serum wurde abgetrennt und bei -70ºC zur Messung von GH und IGF-I gelagert.
• Als Abschluss der Versuche wurden die Raten mit Pentobarbitalnatrium (60 mg/kg) narkotisiert, und das Herz wurde in Diastole mit intraatrialer Injektion von KCl (1 M) angehalten. Das Herz wurde entgenommen, und der Vorhof und die großen Gefäße wurden von der Herzkammer abgeschnitten. Die Herzkammer wurde gewogen und in 10% gepuffertem Formalin fixiert.
Infarktgrößenmessung
• Die freie Wand der rechten Herzkammer wurde von der linken Herzkammer abgeschnitten. Die linke Kammer wurde von der Spitze zur Basis in vier quergerichtete Scheiben geschnitten. 5 um-Abschnitte wurden abgeschnitten, fixiert und mit Massons'- Trichromfarbe eingefärbt. Die endokardialen und epikardialen Umfänge der linken Kammer mit Infarkt und ohne Infarkt wurden mit einem Planimeter Digital Image Analyzer bestimmt. Der Umfang des Infarktbereichs und der Umfang der gesamten linken Herzkammer aller vier Scheiben wurde summiert und als Prozentsatz des Umfangs des Infarktbereichs, bezogen auf den Gesamt-Umfang ausgedrückt. Aus diesen beiden Verhältnissen wurde dann der Mittelwert gebildet und als Prozentsatz der Infarktgröße ausgedrückt.
Hormontests
• Human-GH im Serum wurde mittels Empfindlichkeits-ELISA gemessen. A. J. Celniker, Clin. Endicrinol. Metabol. 68, 469-476 (1989); D. L. Greenen et al., J. Appl. Physiol. 63, 92-96 (1987). Bei diesem Test wird kein Ratten-GH festgestellt. Der Gesamt-IGF-I im Serum wurde nach Säure-Ethanol-Extraktion durch Radioimmuntest (R. W. Furlanetto et al., J. Clin. Invest. 60, 648-657 [1977]; J. Zapf et al., J. Clin. Invest. 68, 1321-1330, [1981]) gemessen, indem Human-IGF-I (erhältlich von Genentech, Inc. als Forschungsreagens) als Standard und ein polyklonales Kaninchen-Anti-IGF-I-Antiserum verwendet wurde. Der annehmbare Bereich betrug 1,25-40 ng/ml, während die Intra- und Inter-Test-Variabilitäten 5 bis 9% bzw. 6 bis 15% betrugen.
• Statistische Analyse
• Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD angegeben. Zweiweg- und Einweg-Analyse (ANOVA) wurden durchgeführt, um Unterschiede in den Parametern zwischen den Gruppen zu bewerten. Signifikante Unterschiede wurden dann unter Einsatz des Newman-Keuls-Verfahrens post hoc-Analyse unterzogen. p< 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Ergebnisse
• Die Zunahme des BW war bei den mit GH/IGF-1- oder mit Captopril+ GH/IGF-I-behandelten Ratten größer als bei den mit Captopril behandelten oder den Vergleichs-Ratten, Captopril allein änderte die BW-Zunahme nicht (Fig. 1a). GH/IGF-I veränderte das Verhältnis zwischen dem Gewicht der linken Kammer und BW (LVW/BW) bei mit Wasser behandelten Ratten nicht signifikant. Das Verhältnis zwischen dem Gewicht der linken Herzkammer (LVW/BW) war bei der mit Captopril oder Captopril+ GH/IGF-1-behandelten Gruppe signifikant verringert (Fig. 1b).
• GH/IGF-1-Behandlung erhöhte die Mengen an Human-GH und Human-IGF-I im Serum sowohl bei mit Wasser als auch bei mit Captopril behandelten Ratten signifikant (Fig. 2 und Fig. 2b). Die Zunahme der Mengen an GH und IGF-I im Serum war bei mit Wasser behandelten und bei mit Captopril behandelten Ratten nicht unterschiedlich.
• Die Infarktgröße war bei den vier Versuchsgruppen (Fig. 3) nicht unterschiedlich.
• GH/IGF-I tendierte dazu, SAP zu verringern und MAP bei mit Wasser behandelten Ratten signifikant zu verringern (Fig. 4a und 4b). SAP und MAP wurden in der mit Captopril oder mit Captopril+GH/IGF-1-behandelten Gruppe im Vergleich zur Vergleichs- oder GH/IGF-I-Gruppe signifikant verringert. Weder Captopril noch GH/IGF-I veränderte die HR signifikant (Fig. 4c).
• GH/IGF-1-Behanldung verursachte sowohl bei mit Wasser- als auch bei mit Captopril behandelten Ratten eine signifikante Erhöhung des maximalen dP/dt der linken Herzkammer (Fig. 5a). Alleinige Captopril-Behandlung veränderte dP/dt nicht. LVEDP war bei allen drei behandelten Gruppen im Vergleich zur Vergleichsgruppe signifikant verringert (Fig. 5b).
• Weder Captopril noch GH/IGF-I erhöhte C1 und SVI (Fig. 6a und 6b). Die Zunahme von C1 und SVI war bei der mit Captopril+GH/IGF-1-behandleten Gruppe signifikant stärker als bei der mit Captopril behandelten Gruppe. SVR war bei den drei behandelten Gruppen im Vergleich zur Vergleichsgruppe signifikant verringert (Fig. 6c).
Zusammenfassung
• Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz mit einer Kombination aus GH und IGF-I führte zu einer signifikanten Zunahme des maximalen dP/dt der linken Herzkammer, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Captopril. Diese Wirkung ist mit Captopril allein nicht festzustellen.
• Chronische Behandlung mit Captopril allein bewirkte eine Verringerung des Arteriendrucks, des end-diastolischen Drucks der linken Kammer und des peripheren Gefäßwiderstands. Diese Veränderungen führten bei den Testtieren zu einem erhöhten Herzminutenvolumen und Schlagvolumen. Dabei handelt es sich um bekannte Vorteile der ACE-Hemmung, die bei Menschen und Tieren mit Herzinsuffizienz zu Tage treten.
• GH und IGF-I, die dem Behandlungsplan eines Säugetiers mit dekompensierter Herzinsuffizienz nach einem anfänglichen Zeitraum der Behandlung mit Captopril hinzugefügt wurden, führten Wirkungen einer erhöhten Myokard-Kontraktionskraft und Herzleistungen bei, die über dem Hintergrund der Wirkung chronischer ACE-Inhibition deutlich sind. Weiters wird die günstige Wirkung von Captopril bei der Reduktion von Herz- Hypertrophie, wie durch LVW/BW gemessen, in der mit Captopril, GH und IGF-I behandelten Gruppe beibehalten. Die Daten weisen darauf hin, dass Captopril in Kombination mit GH und IGF-I die Herzleistung bei dekompensierter Herzinsuffizienz verbessert.
• Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass nach einem Zeitraum der Behandlung mit Captopril oder einem anderen ACE-Inhibitor ein Patient mit dekomperisierter Herzinsuffizienz von der Hinzufügung von GH und IGF-I zum Behandlungsschema profitiert. Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass ein Patient auch ohne einen ACE-Inhibitor von einer Kombination aus GH und IGF-I profitiert. Patienten, die von einer Kombination aus GH und IGF-I in Abwesenheit eines ACE-Inhibitors profitieren sind jene, bei denen es eine Gegenindikation gegen einen ACE-Inhibitor gibt, und jene, die die Nebenwirkungen eines ACE-Inhibitors nicht vertragen.
BEISPIEL 2 Vorgeschlagene klinische Behandlung von dekompensierter Herzinsuffizienz A. Intervention
• Es ist an eine Patienten-Selbstverabreichung von GH und IGF-I in einer einzigen täglichen Dosis von GH und einer zweimaligen täglichen Dosis von IGF-I gedacht. Die Anfangsdosis jedes Arzneimittels wird am selben Tag verabreicht und beträgt 10 bis 100 pg/kg/Tag an GH und 40 bis 120 pg/kg/Tag an IGF-I (zweimal täglich verabreicht). Diese Bereiche werden eingestellt, um die Nebenwirkungen und die Wirksamkeit zu berücksichtigen.
• Patienten werden aus einem der folgenden Gründe aus den Überlegungen ausgeschlossen:
• - Herzinsuffizienz aufgrund unkorrigierter Primärklappen-Herzerkrankung (operierbar oder nicht), spezifische behandelbare Etiolgoien (einschließlich Alkohol, wenn Abstinenz nicht versucht worden ist) oder operable Koronararterienerkrankung.
• - Erweiterte Cardiomypathie mit einer Dauer von weniger als drei Monaten.
• - Durch Brustschmerz oder obstruktive periphere Gefäßerkrankung begrenzte Leistungsfähigkeit.
• - Chronische obstruktive Lungenerkrankung mit einer FEV&sub1; &le; 60% der vorgesagten.
• - Diabetes mellitus oder beeinträchtigte Glucose-Toleranz.
• - Karpaltunnelsyndrom in der Krankengeschichte oder Anzeichen für positives Tinel-Zeichen bei der Untersuchung.
• - Symptomatische Osteoarthirits.
Aktive Bösartigkeit: B. Ergebnisse
• Zu den erwarteten Ergebnissen dieser kombinierten Behandlung gehören:
• Verbessertes Wohlgefühl, erhöhte Belastbarkeit, erhöhte Muskelstärke und magere Körpermasse, veringerter systemischer Gefäßwiderstand, erhöhte Herzleistung und erhöhte kompensatorische Myokard-Hypertrophie.

Claims (11)

1. Verwendung von GH und IGF-I zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, das dekompensierte Herzinsuffizienz aufweist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Wachstumshormon Human-Wachstumshormon ist und der IGF-I Human-IGF-I ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Säugetier ein Mensch ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Menge an GH und IGF-I zwischen 0,01 und etwa 1 mg/kg/Tag liegt.

5. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Verabreichung von GH oder IGF-I oder beiden auf subkutanem oder intravenösem Weg erfolgt.

6. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das GH einmal täglich verabreicht wird und der IGF-I zweimal täglich verabreicht wird.

7. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die dekompensierte Herzinsuffizienz aus akuter oder chronischer Ischämie oder aus Myokardinfarkt resultiert.

8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament weiters einen ACE-Inhibitor umfasst.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin mit der Verabreichung von GH und IGF-I nach einem Zeitraum der Behandlung mit dem ACE-Inhibitor allein begonnen wird.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das GH, der IGF-! und ACE-Inhibitor gemeinsam von Beginn der Behandlung an verabreicht werden.

11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der ACE-Inhibitor Captopril ist.