JPH09512008A - うっ血性心不全を治療するための、成長ホルモンとインスリン様成長因子との組み合わせ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 うっ血性心不全に罹っている哺乳動物における心筋の収縮性および心臓の性能を高める方法を開示する。第一の方法では、成長ホルモン(ＧＨ)とインスリン様成長因子(ＩＧＦ−Ｉ)との組み合わせの有効量を哺乳動物に投与することにより、うっ血性心不全に罹っている哺乳動物を治療する。第二の方法は、ＡＣＥ阻害剤の存在下、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせの有効量を哺乳動物に投与することからなる。この方法は、ＡＣＥ阻害剤を単独で用いて得られるレベル以上に、心筋の収縮性およひ心臓の性能の向上を起こす。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

Description

【発明の詳細な説明】 うっ血性心不全を治療するための、 成長ホルモンとインスリン様成長因子との組み合わせ 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤の存在下または不存在下 、成長ホルモンおよびインスリン様成長因子Ｉを用いて、うっ血性心不全に罹っ ている患者を治療する分野に関する。 ２．関連技術の説明 インビトロにおける研究は、ラットでのＧＨ分泌腫の移植による成長ホルモン (ＧＨ)の慢性分泌過多が、低いＡＴＰアーゼ活性Ｖ３アイソフォーム(isoform) へのイソミオシンパターンの著しいシフトにもかかわらず、分離された心臓の乳 頭筋の無負荷短縮速度に影響を及ぼすことなく、等尺力(isometric force)の増 加をもたらすことを示している。これらの結果は、ＧＨが、心筋をより無駄なく 機能させる心筋収縮パターンを誘発し得ることを示唆する。Ｔimsit,Ｊ.ら、Ｊ. Ｃlin.Ｉnvest．８６：５０７−５１５（１９９０）；Ｔimsit,Ｊ.ら、Ａcta.Ｐ aediatr.Ｓuppl．３８３：３２−３４（１９９２）。収縮性能の増加は、最大張 力とカルシウムに対する筋原線維の感受性との両方の増加を含め、収縮器官の特 性における特異的変化が原因であることが示された。Ｍayoux,Ｅ.ら、Ｃirculat ion Ｒesearch ７２（１）：５７−６４（１９９３）。しかし、慢性ＧＨ分泌過 多を患っている麻酔されたラットでのインビボにおける血流力学研究は、心臓の 性能に関する指数の増加または減少のいずれかを伴なって、相反する結果を与え ている。Ｐenney,Ｄ.Ｇ.ら、Ｃardiovascular Ｒesearch １９：２７０−２７７ （１９８５）；Ｒubin,Ｓ.Ａ.ら、Ｊ.Ｍol.Ｃell Ｃardiol．２２：４２９−４ ３８（１９９０）。これらの２つのインビボにおける研究間の不一致は、血流力 学に関する麻酔の作用と多分関係がある。さらに、臨床研究は、ＧＨの投与が、 健康な人間での心筋収縮および心拍出量を増加させることを実証している。Ｔhu esen,Ｌ.ら、Ｄan.Ｍed.Ｂull．３５（２）：１９３−１９６（１９８８）。Ｇ Ｈを用いての治療は、ＧＨが欠損している成人での心臓の性能の有意な増加およ び自動運動(exercise)能力の改善を引き起こす。Ｊorgensen,Ｊ.ら、Ｔhe Ｌanc et i：１２２１−１２２５（１９８９）；Ｃuneo,Ｒ.ら、Ｊ.Ａppl.Ｐhysiol.７ ０：６９５−７００（１９９１）；Ｃhristiansen,Ｊ.Ｓ.ら、Ａcta.Ｐaediatr. Ｓuppl．３８３：４０−４２（１９９２）；Ａmato,Ｇ.ら、Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrin ol.Ｍetab．７７：１６７１−１６７６（１９９４）；Ｃaidahl,Ｋ.ら、Ｃlin. Ｅndocrinol．４０：３９３−４００（１９９４）。先の研究は、２週間のＧＨ 処置が、うっ血性心不全に罹っている意識のあるラットでの、心室の収縮性を増 加させることにより、また末梢血管抵抗を減少させることにより、心機能を改善 することを示している。Ｙang,Ｒ.ら、Ｃlinical Ｒesearch ４２（２）：３２ ５Ａ（１９９４）。 インスリン様成長因子(ＩＧＦ−Ｉ)は、培養において筋細胞でのアクチン合成 を促進すること(Ｆlorini,Ｊ.Ｒ.、Ｍuscle and Ｎerve １０：５７７−５９８ ［１９８７］)、またインビトロにおいて新生児ラットの心細胞の収縮性を増加 させることが示されいる。Ｖetter,Ｕ.ら、Ｂasic Ｒes.Ｃardiol．８３：６４ ７−６５４（１９８８）。ＩＧＦ−Ｉの急性静脈内投与(注入またはボーラス注 射)は、健康な小羊での一回拍出量および心拍出量の増加を生ずる。Ｇluckmanら 、ＰＣＴ ＷＯ９２／１１８６５（１９９２）。ドキソルビシンで心筋症を誘発 させたラットでは、ＩＧＦ−Ｉを３週間用いての慢性治療が、心拍出量および一 回拍出量を増加させた。Ａmbler,Ｇ.Ｒ.ら、Ｃardiovascular Ｒesearch ２７： １３６８−１３７３（１９９３）。 グルコースの循環レベルに対するＧＨの作用は、ＩＧＦ−Ｉの作用とは正反対 である。ＧＨの投与は、ヒトでは、グルコース不耐症を引き起し得るか、血糖レ ベルを増加させて、高血糖症を生じ得る。Ｓherwin,Ｒ.Ｓ.ら、Ｄiabetologia ２４：１５５−１５６（１９８３）；Ｍetcalfe,Ｐ.ら、Ｄiabetologia ２０： １２３−１２８（１９８１）。対照的に、ＩＧＦ−Ｉの皮下投与または静脈内投 与は、ヒトでは、血中グルコースを低下させて、低血糖症を誘発し得る。Ｇuler ,Ｈ.Ｐ.ら、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed．３１７：１３７−１４０（１９８７）；Ｔakano ,Ｋ.ら、Ｅndocrinol.Ｊapan．３７（２）：３０９−３１７（１９９０）；Ｆro esch,Ｅ.Ｒ.ら、Ｔrends Ｅndocrinol.Ｍetab．１：２５４−２６０（１９９０ ）。さらに、臨床研究は、ＧＨ処置とＩＧＦ−Ｉ処置との組み合わせは、実質的 には、ＧＨ単独またはＩＧＦ−Ｉ単独のいずれかより同化を促進することを実証 している。その組み合わせはまた、健康な被験者では、ＧＨ単独により引き起こ される高血糖症を予防し、またＩＧＦ−Ｉ単独により誘発される低血糖症をも減 衰させる。Ｋupfer,Ｓ.Ｒ.ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest．９１：３９１−３９６（１９ ９３）；Ｃlemmons,Ｄ.Ｒ.ら、Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrinol.Ｍetab．７５：２３４− ２３８（１９９２）。 心不全は、約３００万人のアメリカ人を冒している。新たな心不全の患者は、 毎年約４００,０００に達する。うっ血性心不全は、左心室機能不全、自動運動 耐性の減少、生活の質の悪化、および平均余命の著しい短縮により特徴付けられ る症候群である。左心室の収縮性の減少は、その結果起こる全身性の動脈血管収 縮および静脈血管収縮に伴って、心拍出量の減少をもたらす。一回拍出量のさら なる減少という悪循環を促進した後、血管抵抗の上昇を増加させる、この血管収 縮は、レニン−アンジオテンシン系により幾分媒介されるらしい。この系の重要 な成分、血管収縮薬、アンジオテンシン IIはまた、アルドステロン分泌を刺激 し、多分、交換神経作動を高めて、バソプレッシン分泌を増加させるという作用 をも有する。Ｃohn,Ｊ.Ｎ.ら、Ｎ.Ｅngland Ｊ.Ｍed．３２５（５）：３０３− ３１０（１９９１）；Ｃaptopril Ｍulticenter Ｒesearch Ｇroup、Ｊ.Ａ.Ｃ. Ｃ．２（４）：７５５−７６３（１９８３）。カプトプリルのようなアンジオテ ンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤は、うっ血性心不全に罹っている患者に対する標 準的な療法となっている。これらの薬物は、うっ血性心不全に罹っている患者で は、血流力学プロフィールおよび自動運動耐性を改善し、また罹患率および死亡 率の範囲を減少させる。Ｋramer,Ｂ.Ｌ.ら、Ｃirculation ６７（４）：８０７ −８１６（１９８３）；Ｃaptopril Ｍulticenter Ｒesearch Ｇroup、Ｊ.Ａ.Ｃ . Ｃ．２（４）：７５５−７６３（１９８３）；Ｔhe ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ Ｔrial Ｓtudy Ｇroup、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed．３１６（２３）：１４２９−１４３５（１ ９８７）；Ｔhe ＳＯＬＶＤ Ｉnvestigators、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed．３２５（５） ：２９３−３０２（１９９１）。しかし、効能が証明されたにもかかわらず、Ａ ＣＥ阻害剤に対する反応は限定されている。機能的能力および自動運動時間の改 善は極く僅かであり、また死亡率は、減少されたとはいえ、依然として高いまま である。Ｔhe ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ Ｔrial Ｓtudy Ｇroup、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed. ３１６（２３）：１４２９−１４５３（１９８７）；Ｔhe ＳＯＬＶＤ Ｉnvesti gators、Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed．３２５（５）：２９３−３０２（１９９１）；Ｃoh n,Ｊ.Ｎ.ら、Ｎ.Ｅngland Ｊ.Ｍed．３２５（５）：３０３−３１０（１９９１ ）；Ｔhe Ｃaptopril−Ｄigoxin Ｍulticenter Ｒesearch Ｇroup、ＪＡＭＡ ２ ５９（４）：５３９−５４４（１９８８）。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉは各々、心臓 の性能を別々に改善することが示されている。しかし、今のところ、カプトプリ ルの存在下または不存在下、心不全でのＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせの効果 は評価されていない。 従って、本発明の目的は、うっ血性心不全に罹っている患者に対する治療方法 であって、該患者に、ＡＣＥ阻害剤に加えてＧＨおよびＩＧＦ−Ｉを投与するこ とからなる方法を提供することである。カプトプリルは単独で、例えば、末梢血 管抵抗を減少させることにより心機能を改善することは周知である。カプトプリ ルはＧＨおよびＩＧＦ−Ｉと一緒に、心臓の性能に関してカプトプリルが単独で 引き起こすよりも優れた改善を引き起こす。 本発明の別の目的は、うっ血性心不全に罹っている患者に対する治療方法であ って、ＡＣＥ阻害剤の不存在下、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせの有効量を用 いて、該患者を処置することからなる方法を提供することである。ＧＨとＩＧＦ −Ｉとを組み合わせての投与は、心室の収縮性の増加および末梢血管抵抗の減少 により心臓の性能の改善を生ずる。 うっ血性心不全に罹っている患者に対する心臓の性能の改善は、ＡＣＥ阻害剤 を用いて治療している患者では、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせを治療レジメ に加えることにより達成される。これらの患者での心臓の性能の改善はまた、治 療の最初から、ＧＨ／ＩＧＦ−ＩおよびＡＣＥ阻害剤の投与によっても達成され る。 発明の要約 本発明は、うっ血性心不全の治療方法であって、ＡＣＥ阻害剤を伴っての、ま たはＡＣＥ阻害剤を伴わずしての、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉ(ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ)の 有効量の投与により特徴付けられる方法を提供することにより、これらの目的を 達成する。 一態様において、本発明は、うっ血性心不全を示している哺乳動物を治療する 方法であって、該哺乳動物に、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせ、およびＡＣＥ 阻害剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉ の投与は、ＡＣＥ阻害剤を用いて処置した後に開始するのがよい。 別の態様において、本発明は、うっ血性心不全を示している哺乳動物を治療す る方法であって、該哺乳動物に、ＡＣＥ阻害剤の不存在下、ＧＨとＩＧＦ−Ｉと の組み合わせの有効量を投与することからなる方法を提供する。 図面の簡単な説明 第１ａ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの体 重(ＢＷ)に関する、成長ホルモン並びにインスリン様成長因子(ＧＨ／ＩＧＦ− Ｉ)の作用(線影を付けた棒グラフ)およびＧＨ／ＩＧＦ−Ｉに対する担体ビヒク ル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々のビヒクルのグ ループと比較した。 第１ｂ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの体 重に対する左心室重量の割合(ＬＶＷ／ＢＷ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用 (線影を付けた棒グラフ)およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＃ Ｐ＜０.０５、＃＃Ｐ＜０.０１、各々の水のグループと比較した。 第２ａ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでのＧ Ｈの血清レベルに関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ)およ びビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々のビヒ クルのグループと比較した。 第２ｂ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでのＩ ＧＦ−Ｉの血清レベルに関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラ フ)およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々 のビヒクルのグループと比較した。 第３図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの梗塞 の大きさに関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ)およびビヒ クル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。 第４ａ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの収 縮期動脈血圧(ＳＡＰ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラ フ)およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＃＃Ｐ＜０.０１、各々 の水のグループと比較した。 第４ｂ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの平 均動脈血圧(ＭＡＰ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ) およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々の ビヒクルのグループと比較した。＃＃Ｐ＜０.０１、各々の水のグループと比較 した。 第４ｃ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの心 拍数(ＨＲ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ)およびビ ヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。 第５ａ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの左 心室最大dＰ／dtに関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ)お よびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０. ０１、各々のビヒクルのグループと比較した。 第５ｂ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの左 心室拡張終期血圧(ＬＶＥＤＰ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付け た棒グラフ)およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊Ｐ＜０.０５ 、各々のビヒクルのグループと比較した。＃Ｐ＜０.０５、各々の水のグループ と 比較した。＾Ｐ＜０.０１、対照(水＋ビヒクル)のグループと比較した。 第６ａ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの心 指数(ＣＩ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ)およびビ ヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々のビヒクル のグループと比較した。＃Ｐ＜０.０５、各々の水のグループと比較した。 第６ｂ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの一 回拍出量指数(ＳＶＩ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラ フ)およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊０.０５、＊＊Ｐ＜０ .０１、各々のビヒクルのグループと比較した。＃＃Ｐ＜０.０１、各々の水のグ ループと比較した。 第６ｃ図は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置したラットでの全 身血管抵抗(ＳＶＲ)に関する、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの作用(線影を付けた棒グラフ) およびビヒクル単独の作用(空白の棒グラフ)を示す。＊＊Ｐ＜０.０１、各々の ビヒクルのグループと比較した。＃＃Ｐ＜０.０１、各々の水のグループと比較 した。＾Ｐ＜０.０１、対照(水＋ビヒクル)のグループと比較した。 発明の詳細な説明 ａ．定義 一般に、以下の用語または語句または略語は、説明、実施例、および請求の範 囲で使用される場合、指示された定義を有する。 本明細書中で使用する「ＢＷ」は、体重を示す。 本明細書中で使用する「ＣＯ」は、心拍出量を示す。 本明細書中で使用する「ＣＩ」は、心指数を示す。心指数は、心拍出量を体重 で割ったもの(ＣＯ／ＢＷ)として測定することができる。 本明細書中で使用する「ＨＲ」は、心拍数を示す。 本明細書中で使用する「ＬＶＥＤＰ」は、左心室拡張終期血圧を示す。 本明細書中で使用する「ＬＶＷ」は、左心室重量を示す。 本明細書中で使用する「ＭＡＰ」は、平均動脈血圧を示す。 本明細書中で使用する「ＳＡＰ」は、収縮期動脈血圧を示す。 本明細書中で使用する「ＳＶ」は、一回拍出量を示す。一回拍出量は、ＣＯ／ ＨＲとして測定することができる。 本明細書中で使用する「ＳＶＩ」は、一回拍出量指数を示す。一回拍出量指数 は、ＳＶ／ＢＷとして測定することができる。 本明細書中で使用する「ＳＶＲ」は、全身血管抵抗を示す。ＳＶＲは、ＭＡＰ ／ＣＩとして測定することができる。 本明細書中で使用する「うっ血性心不全」は、左心室機能不全、自動運動耐性 の減少、生活の質の悪化、および平均余命の著しい短縮により特徴付けられる症 候群を示す。左心室の収縮性の減少は、その結果起こる全身性の動脈血管収縮お よぴ静脈血管収縮に伴って、心拍出量の減少をもたらす。レニン−アンジオテン シン系により幾分媒介されるらしい、この血管収縮は、一回拍出量のさらなる減 少という悪循環を促進した後、血管抵抗の上昇を増加させる。 本明細書中で使用する「治療」は、うっ血性心不全を患っている患者での心筋 収縮および心臓の性能の増加の誘発、さらにはまたうっ血性心不全の予防を示す 。ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせをＡＣＥ阻害剤と共に使用すると、心筋収縮 および心臓の性能の増加レベルが、ＡＣＥ阻害剤の単独使用から得られるレベル 以上に増加される。 本明細書中で使用する「梗塞」は、不十分な血液供給から起こる壊死の領域を 示す。「心筋梗塞」は、不十分な冠状血液供給から起こる心筋壊死を示す。 本明細書中で使用する「哺乳動物」は、ヒト、家畜並びに飼育場の動物、およ びイヌ、ウマ、ネコ、雌ウシ等といったような、動物園、競技、またはペットの 動物を含め、哺乳動物として分類される動物を示す。好ましくは、本明細書中の 哺乳動物はヒトである。 本明細書中で使用する「ＡＣＥ阻害剤」は、アンジオテンシンＩのアンジオテ ンシンIIへの変換を防ぐ、アンジオテンシン変換酵素阻害薬物を示す。ＡＣＥ阻 害剤は、全身血管抵抗を減少させて、循環うっ血を軽減することにより、うっ血 性心不全に有利であり得る。ＡＣＥ阻害剤には、これらに制限されるものではな ルと呼ばれ、このＡＣＥ阻害剤は、化学的には、１−[(２Ｓ)−３−メルカプト −２−メチルプロピオニル]−Ｌ−プロリンと名付けられている。 本明細書中で使用する「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、天然配列または変 異体型の成長ホルモン、および天然、合成、または組み換え体であるとを問わず 、あらゆる起源から得られる成長ホルモンを示す。例には、ヒト天然配列を有す る天然ＧＨまたは組み換えＧＨであるヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)(ソマトトロピ ンまたはソマトロピン)、およびソマトレム、ソマトトロピン、並びにソマトロ ピンを含め、組み換えＤＮＡ技術によって産生される、あらゆるＧＨまたは変異 体を指す組み換え成長ホルモン(ｒＧＨ)が含まれる。組み換えヒト天然配列であ り、そのＮ末端にメチオニンを有する、または有していない成熟ＧＨがヒトへの 使用に好ましい。例えば、１９８８年７月５日に発行された米国特許番号第４, ７５５,４６５号およびＧoeddelら、Ｎature ２８２：５４４（１９７９）に記 載されている方法により、大腸菌(Ｅscherichia coli)で産生されるメチオニル ヒト成長ホルモン(met−ｈＧＨ)がさらに好ましい。Ｇenentech社より商標プロ トロ ニン残基の存在を除き、天然ポリペプチドと同じである。この加えられたアミノ 酸は、細菌タンパク合成プロセスの結果である。Ｇenentech社から商標ニュー ましい。この後者のｈＧＨは、このメチオニン残基を欠き、天然ホルモンのもの と同じアミノ酸配列を有する。Ｇrayら、Ｂiotechnology ２：１６１（１９８４ ）を参照。メチオニルｈＧＨとｈＧＨとは両方とも、等しい効力および薬物動態 学値を有する。Ｍooreら、Ｅndocrinology １２２：２９２０−２９２６（１９ ８８）。別の適当なｈＧＨ候補は、１９８７年６月２日に発行された米国特許番 号 第４,６７０,３９３号に記載されているような、純粋な体細胞原性活性を有し、 また乳汁産生活性を有していない、胎盤型のＧＨであるｈＧＨ変異体である。１ ９９０年５月３日に公開されたＷＯ９０／０４７８８および１９９２年６月１１ 日に公開されたＷＯ９２／０９６９０に記載されているようなＧＨ変異体もまた 含まれる。 本明細書中で使用する「ＩＧＦ−Ｉ」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、鳥類、 また好ましくはヒトを含め、あらゆる種から得られる、天然配列または変異体型 のインスリン様成長因子、および天然、合成、または組み換え体であるとを問わ ず、あらゆる起源から得られるインスリン様成長因子を示す。ＩＧＦ−Ｉは、ヒ ト血清から分離され、また組み換えにより産生されている。例えば、欧州特許第 １２３,２２８号および同第１２８,７３３号を参照。 本発明では、ブタを治療するにはブタのＩＧＦ−Ｉ、ヒツジを治療するにはヒ ツジのＩＧＦ−Ｉ、ウシを治療するにはウシのＩＧＦ−Ｉ等といったような、治 療すべき特定の種から得られる、その型のＩＧＦ−Ｉが動物への使用に好ましい 。本発明では、ヒト天然配列の、成熟ＩＧＦ−Ｉ、さらに好ましくは、例えば、 １９８７年８月５日に公開された欧州特許第２３０,８６９号；１９８４年１２ 月１９日に公開された欧州特許第１２８，７３３号；または１９８８年１０月２ ６日に公開された欧州特許２８８,４５１号に記載されている方法により製造さ れる、Ｎ末端メチオニンを有していないＩＧＦ−Ｉがヒトへの使用に好ましい。 さらに好ましくは、この天然配列のＩＧＦ−Ｉは組み換えにより製造され、また 臨床研究には、Ｇenentech社、南サンフランシスコ、カリフォルニアから入手す ることができる。 好ましいＩＧＦ−Ｉ変異体は、１９９１年１２月３１日に発行された米国特許 第５,０７７,２７６号、１９８７年２月２６日に公開されたＰＣＴ ＷＯ８７／ ０１０３８、および１９８９年６月２９日に公開されたＰＣＴ ＷＯ８９／０５ ８２２に記載されているものであり、すなわち、それらでは、少なくとも、グル タミン酸残基が成熟分子のＮ末端から３位に存在しないか、またはそのＮ末端で アミノ酸が５つまで欠失している。最も好ましい変異体は、欠失したＮ末端から 最初の３つのアミノ酸を有する(脳ＩＧＦ、tＩＧＦ−Ｉ、des(１−３)−ＩＧＦ −Ｉ、またはdes−ＩＧＦ−Ｉと様々に呼ばれている)。 ｂ．本発明を行うための方法 非経口、鼻腔内、経口を含め、あらゆる適当な技術により、または経皮吸収に より、ＩＧＦ−Ｉと組み合わせたＧＨを哺乳動物に直接投与する。それらは、同 じ経路により投与する必要がなく、また局所的に、または全身的に投与すること ができる。各々の物質に関する具体的な投与経路は、例えば、ｈＧＨまたはＩＧ Ｆ−Ｉを単独で用いての、認められる副作用もしくは予期される副作用、または 同化を促進する作用の減退を含め、医療歴に左右されるであろう。非経口投与に は、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、および腹腔内投与が含まれる。皮下および 静脈内の注射または注入が好ましい。 有効量であるよう、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉを投与する。ＧＨは、特定時間(例 えば、１日１回)に特定用量の注射形態でといったように、非連続的に投与する のがよく、ここでは、注射した時点で血漿ＧＨ濃度の上昇が起こった後、次の注 射の時間までに血漿ＧＨ濃度の降下が起こるであろう。別の非連続的投与法は、 初期バーストのような活性成分の不連続放出を与え、次いで、遅滞を与えた後、 活性成分を放出することが利用できる、多くの埋込み装置の使用から生じる。例 えば、米国特許番号第４,７６７,６２８号、第２欄、１９〜３７行。 しかし、さらに好ましくは、血中での継続的存在がＧＨの投与期間中ずっと維 持されるよう、ＧＨを投与する。このことは、最も好ましくは、例えば、浸透ミ ニポンプといったようなミニポンプでの連続注入によって成し遂げられる。ある いはまた、ＧＨの多数回にわたる注射(すなわち、１日１回以上、例えば、１日 ２回または３回)の使用により適切に成し遂げられる。 投与する場合、ＧＨをポリマーに複合させるか、または結合させて、その循環 半減期を増加させることができる。この目的に有用なポリエチレンポリオールお よびポリオキシエチレンポリオールの例には、ポリオキシエチレングリセロール 、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチ レングルコース等が含まれる。ポリオキシエチレングリセロールのグリセロール 骨 格は、例えば、動物およびヒトにおける、モノグリセリド、ジグリセリドおよび トリグリセリドで見受けられる骨格と同じである。 ポリマーは、あらゆる特定の分子量を有する必要はないが、分子量が約３,５ ００〜１００,０００、さらに好ましくは５,０００〜４０,０００であるのが好 ましい。好ましくは、ＰＥＧホモポリマーは置換されていないが、また一端がア ルキル基で置換されていてもよい。好ましくは、そのアルキル基は、Ｃ₁−Ｃ₄ア ルキル基であって、最も好ましくは、メチル基である。最も好ましくは、そのポ リマーは、ＰＥＧの非置換ホモポリマー、ＰＥＧのモノメチル置換ホモポリマー (ｍＰＥＧ)、またはポリオキシエチレングリセロール(ＰＯＧ)であって、約５, ０００〜４０,０００の分子量を有する。 ＧＨは、主として反応条件、ポリマーの分子量等に依存して、ＧＨの１つまた はそれ以上のアミノ酸残基でポリマー上の末端反応基に共有結合する。本明細書 中、反応基を有するポリマーは、活性化ポリマーと呼ばれている。反応基は、Ｇ Ｈ上の遊離アミノ基または他の反応基と選択的に反応する。しかし、最適な結果 を得ために選択される反応基の種類および量、さらにはまた使用されるポリマー の種類は、反応基がＧＨ上のあまりに多くの、特に活性な基と反応するのを避け るために、使用される個々のＧＨに依存するであろうことが分かるであろう。こ のことを完全に避けるのが不可能であり得るので、通例、タンパク質濃度に依存 して、タンパク質１モルにつき活性化ポリマーを約０.１〜１,０００モル、好ま しくは２〜２００モル使用することが推奨される。タンパク質１モルについての 活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持するためのバランスであるが、可 能なら、タンパク質の循環半減期を同時に最適化する。 残基は、１つまたは２つのシステインまたはＮ末端アミノ酸基といったような 、タンパク質上のあらゆる反応性アミノ酸であり得るが、好ましくは、反応性ア ミノ酸は、その遊離ε−アミノ基によって活性化ポリマーの反応基に結合するリ ジンであるか、またはアミド結合によってポリマーに結合するグルタミン酸また はアスパラギン酸である。 共有結合修飾反応は、ＧＨ上の反応基がリジン基であるならば、生物学的に活 性な物質を、好ましくは約pＨ ５〜９、さらに好ましくは７〜９で、不活性なポ リマーと反応させるために一般的に利用される、いずれかの適当な方法により行 われる。通例、その方法は、(少なくとも１つの末端ヒドロキシル基を有する)活 性化ポリマーを製造すること、このポリマーから活性な基質を製造すること、ま たその後、ＧＨを活性な基質と反応させて製剤に適当なＧＨを製造することを含 む。先の修飾反応は、１つまたはそれ以上の工程を含み得る幾つかの方法により 行うことができる。活性化ポリマーを一工程反応で製造するために使用すること ができる修飾物質の例には、シアヌル酸クロリド(２,４,６−トリクロロ−Ｓ− トリアジン)およびシアヌル酸フルオリドが含まれる。 一態様において、その修飾反応は二工程で行われ、ここでは、まず最初に、ポ リマーを、無水コハク酸または無水グルタル酸といったような酸無水物と反応さ せて、カルボン酸を形成した後、そのカルボン酸を、カルボン酸と反応すること ができる化合物と反応させて、ＧＨと反応することができる反応性のエステル基 を有する活性化ポリマーを形成する。そのような化合物の例には、Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸等が含まれ 、また好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたは４−ヒドロキシ−３− ニトロベンゼンスルホン酸を使用する。例えば、モノメチル置換ＰＥＧを、高温 、好ましくは約１００〜１１０℃で４時間、無水グルタル酸と反応させるのがよ い。このようにして製造したモノメチルＰＥＧ−グルタル酸を、ジシクロヘキシ ルカルボジイミドまたはイソプロピルカルボジイミドといったようなカルボジイ ミド試薬の存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、活性化ポリマ ー、メトキシポリエチレングリコリル−Ｎ−スクシンイミジルグルタレートを製 造した後、これをＧＨと反応させることができる。この方法は、Ａbuchowskiら 、Ｃancer Ｂiochem.Ｂiophys．７：１７５−１８６（１９８４）に詳細に記載 されている。別の例では、モノメチル置換ＰＥＧを無水グルタル酸と反応させた 後、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、４−ヒドロキシ−３−ニトロベ ンゼンスルホン酸(ＮＨＳＡ)と反応させて、活性化ポリマーを製造することがで きる。ＮＨＳＡは、Ｂhatnagarら、Ｐeptides：Ｓynthesis−Ｓtructure−Ｆunc tion、 Ｐroceedings of the Ｓeventh Ａmerican Ｐeptide Ｓymposium、Ｒichら(編) （Ｐierce Ｃhemical Ｃo.、Ｒockford、ＩＬ、１９８１）、９７−１００頁、 および「Ｎovel Ａgent for Ｃoupling Ｓynthetic Ｐeptides to Ｃarriers an d Ｉts Ａpplications」と題された、Ｎiteckiら、Ｈigh−Ｔechnology Ｒoute to Ｖirus Ｖaccines（Ａmerican Ｓociety for Ｍicrobiology：Ｗashington， Ｄ.Ｃ.、１９８６）により記載されている。 ＰＥＧに結合させたＧＨの具体的な製造方法には、ＰＥＧ−ＧＨに関する米国 特許番号第４,１７９,３３７号、およびＧＨに可逆的に、しかし共有結合により 結合させたＰＥＧを開示している米国特許番号第４,９３５,４６５号に記載され ている方法が含まれる。ＰＥＧ−ＧＨを製造するための他の具体的な方法には、 以下のことが含まれる。 メトキシポリエチレングリコールアルデヒド(Ｍe−ＰＥＧアルデヒド)を用い ての還元的アルキル化によるＰＥＧ化および精製は、ＰＢＳ(pＨ ７.０)中の２m g／ml ＧＨに、５mＭ Ｍe−ＰＥＧアルデヒド−５０００(分子量５,０００ダル トン)および２０mＭ ＮaＣＮＢＨ₃を加えて、室温で３時間穏やかに混合するこ とにより成し遂げられる。次いで、エタノールアミンを５０mＭとなるまで加え て、残りの未反応のＭe−ＰＥＧを還元的にアミド化(amidate)する。その混合物 を陰イオン交換カラム、ＦＰＬＣ Ｍono Ｑで分離する。過剰の未反応のＭe−Ｐ ＥＧはそのカラムに結合しないので、その混合物から分離することができる。見 掛け分子量が、未反応のＧＨの２０Ｋに対して、還元(reduced)ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅで３０Ｋおよび４０Ｋである、２つの主要なＰＥＧ化ＧＨ画分を得る。ＧＨ− ＧＨＢＰ複合体を同じ方法でＰＥＧ化して、ゲル濾過により１５０Ｋの誘導体を 得る。 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルＰＥＧ(ＮＨＳ−ＰＥＧ)を用いてのＰＥＧ化 および精製は、ＧＨの全リジン濃度の５倍モル過剰のＮＨＳ−ＰＥＧを、５０m Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液(pＨ ８.５)またはＰＢＳ(pＨ ７)中にＧＨを２mg／m l含む溶液に加えて、室温で１時間混合することにより成し遂げられる。精製物 をＳuperose １２サイジングカラムおよび／またはＦＰＬＣのＭono Ｑで分離す る。ＰＥＧ化ＧＨは、ゲル濾過により測定すると、反応のpＨにより、pＨ ８.５ で行う反応の場合は約３００ＫからpＨ ７.０の場合は４０Ｋまで大きさが変化 する。ＧＨ−ＧＨＢＰ複合体もまた、同じ方法でＰＥＧ化され、ゲル濾過から、 得られる分子量は４００〜６００Ｋdである。 ＰＥＧ−マレイミドを用いてのシステイン変異体のＰＥＧ化は、部位特異的変 異誘発によってＧＨの単一システイン変異体を製造し、それをＥ.coli １６Ｃ９ 菌株(deoＣタンパク質を産生しないＷ３１１０ ΔtonＡ phoＡ ΔＥ１５ Δ(arg Ｆ−lac)１６９ deoＣ２)から分泌させて、それを陰イオン交換カラムで精製す ることにより成し遂げられる。 菌株ＣＧＳＣ＃６０９２(第６０９２番、Ｅ.coli Ｇenetic Ｓtock Ｃenter、 Ｎew Ｈaven、Ｃonn.から入手でき、またＭarkら、Ｍolec.Ｇen.Ｇenet. １５５ ：１４５−１５２（１９７７）に記載されている、遺伝子型 trxＡ１ recＡ１ i lvＥ７２０：：tn５ metＥ７０ deoＣ２ lacＺ５３ rha５ malＢ４５ rpsＬ１５ １である)に由来するdeoＣ２対立遺伝子を７Ｃ１と呼ばれている菌株に伝達する ことにより、菌株１６Ｃ９を遺伝学的に構築した。 Ｐ１(Ｊ.Ｍiller、Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics［Ｃold Ｓpring Ｈarbor、Ｎ.Ｙ.：Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory、１９７２］)、および トランスポゾン遺伝学(Ｋlecknerら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol. １１６：１２５−１５９ ［１９７７］)から誘導されたファージＰ１Ｋcを用いての形質導入を伴う技術を 用いて、菌株７Ｃ１［遺伝子型 Ｗ３１１０ ΔtonＡ phoＡ ΔＥ１５ Δ(argＦ −lac)１６９を有する］を幾つかの工程で構築した。Ｆ−、λ−(野生型はＦ＋ 、λ＋である)のＫ１２菌株であるＥ.coli Ｋ１２ Ｗ３１１０(Ｂechmann、Ｂac t.Ｒev. ３６：５２５−５５７［１９７２］)を出発宿主として使用した。 まず最初に、Ｔn１０トランスポゾンをtonＡ遺伝子に挿入した後、不正確に切 除することにより、tonＡ遺伝子(fhuＡ)(Ｋadnerら、Ｊ.Ｂact. １４３：２５６ −２６４［１９８０］；Ｂachmann、Ｍicrobiol.Ｒev. ４７：１８０−２３０［ １９８３］)を欠失させた。 この方法の第一工程では、Ｅ.coli Ｗ３１１０を、λ：：Ｔn１０を用いてト ランスデュースし、Ｅ.coli Ｗ３１１０のＴn１０ホッププール(hop pool)を生 成した(Ｋlecknerら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.、上記)。 Ｌブロス中、Ｅ.coli Ｗ３１１０：：Ｔn１０ホッププールを細胞密度が約１ ×１０⁹／mlとなるまで３７℃で培養した。合計０.５mlの培養物を遠心分離して 、ペレットを、７.０×１０⁹pfuを含むλphi８０溶菌液(lysate)０.２ml中に再 び懸濁させた。ファージを３７℃で３０分間吸着させた。次いで、懸濁液を、テ トラサイクリン(１５μg／ml)を補ったＥＭＢプレート上に塗抹した。３７℃で 一晩インキュベートした後、コロニーをＬブロス３ml中にプールし、３７℃で一 晩培養し、２回洗浄して、Ｌブロス中に再び懸濁させた。この培養物でバクテリ オファージＰ１kc溶菌液を作製した(Ｍiller,Ｊ.Ｈ.、Ｅxperiments in Ｍolecu lar Ｂiology 、上記、３０４頁)。 このＰ１kc溶菌液により、Ｅ.coli ＡＴ９８２(第４５４６番、Ｅ.coli Ｇene tic Ｓtock Ｃenter、Ｎew Ｈaven、Ｃonn)をテトラサイクリン耐性に形質転換 させた。形質導入体を、テトラサイクリン(１５μg／ml)および４０μg／mlジア ミノピメリン酸(dap)を補ったＬブロスプレート上で選択した。その結果得られ た形質導入体をdap遺伝子(dap⁺、tet^R)のテトラサイクリン耐性および再生に関 してスクリーンした後、dap⁺、tet^R形質導入体をλphi８０耐性に関して試験し た。 次いで、幾つかのdap⁺、tet^R、λphi８０耐性菌株でＰ１kc溶菌液を作製した 。その溶菌液を使用して、Ｅ.coli Ｗ３１１０をテトラサイクリン耐性にトラン スデュースした。その形質導入体をλphi８０耐性に関してスクリーンし、選択 した。 テトラサイクリン感受性分離株をＷ３１１０ tonＡ：：Ｔn１０−λphi８０Ｒ 形質導入体から選択した。ＭaloyおよびＮunn、Ｊ.Ｂacteriol.、１４５：１１ １０（１９８１）。これらの分離株を単一コロニー精製後のλphi８０耐性およ びテトラサイクリン感受性に関して調べた。 ＤＮＡを幾つかのテトラサイクリン感受性λphi８０耐性変異体から分離して 、ＳstIIを用いて消化させた。放射能標識してＳstIIで消化させたλ：：Ｔn１ ０ ＤＮＡをプローブとして用い、ＳstIIで消化したＤＮＡをサザンブロット法によ り特性決定して、Ｔn１０が切除されているかどうかを測定した。Ｄavisら、Ａd vanced Ｂacterial Ｇenetics （Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory、Ｎew Ｙo rk、１９８０）。テトラサイクリン感受性分離株のうち１つは、λ：：Ｔn１０ に由来するＤＮＡと親のＷ３１１０ tonＡ：：Ｔn１０λphi８０Ｒに由来するＤ ＮＡとの間でのハイブリダイゼーションと比べて、Ｔn１０ハイブリダイゼーシ ョンバンドのうち２つを失っていることが示された。３つ目のハイブリダイゼー ションバンドは、移動度が変化し、Ｔn１０の不正確な切除により引き起こされ る欠失が起こったことを示した。 不正確なＴn１０切除を有する菌株に由来する外膜調製物のＳＤＳ−ゲル電気 泳動は、ＴonＡタンパク質であると推測されたバンドが、野生型のＴonＡタンパ ク質と比べて、電気泳動移動度が変化したことを明らかにした。その結果得られ たタンパク質は、λphi８０ファージ受容体タンパク質としては機能しなかった 。Ｔn１０の不正確な切除を受けた第２の独立の菌株は、ＳＤＳゲル上にＴonＡ タンパク質を示さなかった。 これらの菌株はいずれも、テトラサイクリン耐性への復帰(reversion)または λphi８０感受性への復帰を示さず、tonＡ遺伝子の部分的な欠失または完全な欠 失と共に、Ｔn１０トランスポゾンの全部または一部の不正確な切除が存在する ことを示した。従って、ＴonＡタンパク質(分子量７８，０００)は外膜から取り 除かれ、Ｗ３１１０ tonＡ菌株を幾つかのバクテリオファージに耐性とした。 次いで、プロリン生合成遺伝子に挿入されたカナマイシン耐性トランスポゾン (proＣ：：Ｔn５)への遺伝的結合により、２つ以上の欠失変異体、phoＡ Δ Ｅ １５(Ｓarthyら、Ｊ.Ｂact. １４５：２８８−２９２［１９８１］)およびΔ(ar gＦ−lac)１６９(Ｓchweizerら、Ｍol.Ｇen.Ｇenet. １９２：２９３−２９４［ １９８３］)をＷ３１１０ tonＡに同時に移入した。 トランスポゾンを、グルコース最少寒天プレート上で自然原栄養菌(pro⁺)復帰 変異体を選択することにより取り除いた。phoＡ変異体の導入は、０.２mＭ リン 酸塩および２０mg／Ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩を含 むグルコース最少寒天プレート上に白色のコロニーを形成する形質導入体として 認められた。同様に、Δ(argＦ−lac)１６９変異体は、酵素β−ガラクトシダー ゼの欠失を引き起こして、ＭacＣonkey−１％ ラクトース寒天プレート上に白色 のコロニーを形成する細胞となる。その結果は、菌株７Ｃ１であった。 最後に、ファージＰ１kcを用いての多工程の形質導入方法により、アルドラー ゼを除去するdeoＣ変異体(Ｂachmann、上記)を７Ｃ１に導入した。まず最初に、 以下のようにして、トレオニン栄養要求性を７Ｃ１に導入し、deoＣ遺伝子の領 域におけるトランスデュースされた染色体セグメントの陽性選択のための方法を 得た。 Ｐ１kcをトレオニン栄養要求体上で培養した。そのような栄養要求体は、Ｃla re Ｎ.ＢergおよびＤouglas Ｅ.Ｂerg、Ｍicrobiology−１９８１、「Ｂacteria l Ｔransposons」、１０７−１１６頁（Ａmer.Ｓoc．for Ｍicrobiology、Ｗash ington、ＤＣ、１９８１）に記載されている。 その結果得られた溶菌液を使用して、菌株７Ｃ１をテトラサイクリン耐性にト ランスデュースし、２５μg／ml テトラサイクリンを含むＬＢプレート上で形質 導入体を選択した。１４Ａ９と呼ばれる、その結果得られた菌株(tonＡΔ、pho ＡΔＥ１５、Δ(argＦ−lac)１６９ thr：：tn１０)は、高頻度で原栄養性に自 然に復帰したので、フザリン酸プレート(Ｊ.Ｂact. １４５：１１１０［１９８ １］)を使用して、菌株１６Ｃ４と呼ばれる、安定なテトラサイクリン感受性ト レオニン栄養要求体を選択した。 Ｐ１kcを上記のＣＧＳＣ＃６０９２株で培養した。 その結果得られた溶菌液を使用して、菌株１６Ｃ４を原栄養性にトランスデュ ースし、グルコース最少寒天プレート上で増殖物を選択した。菌株２Ｄ４から高 頻度でトランスデュースする溶菌液を得るには、Ｐ１kcファージを、この宿主で の増殖を２回循環させなければならなかった。菌株１６Ｃ４の５つの原栄養性形 質導入体を分離し、精製して、チミジン最少寒天プレート上での増殖に関して試 験した。これら５つの分離株のうち４つは、チミジンで培養することができなか ので、deoＣタンパク質の合成を排除するdeoＣ２変異体を得た。これら４つの分 離株のうち１つが蓄えられて(save)、菌株１６Ｃ９(ΔtonＡ、phoＡ、ΔＥ１５ 、Δ(argＦ−lac)１６９、deoＣ２)と呼ばれた。 ０.１Ｍリン酸ナトリウム(pＨ ７.５)中、モノメトキシＰＥＧアミンをスルホ −ＭＢsと室温で一時間反応させることにより、ＰＥＧ−マレイミドを作製して 、緩衝液をリン酸塩緩衝液(pＨ ６.２)に交換した。次に、ＧＨを過剰の遊離シ ステインと１時間混合して、最終混合物を、Ｍe−ＰＥＧアルデヒドでＰＥＧ化 されたＧＨとして、Ｍono Ｑカラムで分離した。 エステル結合は、化学的に、また生理学的に不安定であるので、エステル官能 基を含まない結合反応のＰＥＧ試薬を使用するのが好ましい。例えば、ＰＥＧ− モノメチルエーテルをホスゲンと反応させて、ＰＥＧ−クロロホルメートを得る ことにより、カルバメート結合を作製することができる。次いで、この試薬をＮ ＨＳエステルと同じ方法で使用して、リジン側鎖アミンを官能基化することがで きるであろう。別の例では、アミノ−ＰＥＧ−モノメチルエーテルをホスゲンと 反応させることにより、尿素結合を作製する。これは、リジンアミンと反応する であろうＰＥＧ−イソシアネートを生成するであろう。 ＰＥＧ試薬中に開裂可能なエステルを含んでいないＰＥＧ−ＧＨを作製する好 ７９−１３８４（１９８１）により報告されているように、ナフタレンナトリウ ムで滴定してアルコキシドを生成させた後、酢酸ブロモエチルで処理してエチル エステルを形成させ、次いで、水酸化ナトリウムおよび水で処理することによっ て対応するカルボン酸に加水分解することにより、メトキシポリ(エチレングリ コール)をカルボン酸に転換する。次いで、酢酸エチル中、その結果得られたカ ルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮＨＳと反応させることによ り、その結果得られたカルボン酸を、ＧＨのアシル化に適当なＰＥＧ−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミジルエステルに転換する。 次いで、ホウ酸ナトリウム緩衝液(pＨ ８.５)中、ＧＨに関して３０倍モル過 剰用い、その結果得られたＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を１２mg／ml ＧＨと室温で１時 間反応させて、トリス緩衝液中のＱセファロースカラムに適用して、塩グラジエ ントで溶離する。次いで、それを、０.３Ｍクエン酸塩緩衝液(pＨ ７.８)で平衡 化した別のカラム(フェニル Ｔoyopearl)に適用する。次いで、ＰＥＧ化ＧＨを 逆塩グラジエントで溶離し、プールして、Ｇ２５脱塩カラムを用い、緩衝液をマ ンニトール、グリシン、およびリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ ７.４)に交換して 、適当な製剤化されたＰＥＧ７−ＧＨを得る。 ＰＥＧ化ＧＨ分子およびＧＨ−ＧＨＢＰ複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾 過、ＮＭＲ、トリプシン(triptic)マッピング、液体クロマトグラフィー−質量 分光測定、およびインビトロにおける生物学的アッセイにより特徴付けることが できる。まず最初に、ＰＥＧ化の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過により 適当に示した後、ＮＭＲにより分析し、これは、ＰＥＧのメチレン水素に関して 特異的な共鳴ピークを有する。各々の分子上のＰＥＧ基の数は、ＮＭＲスペクト ルまたは質量分析から計算することができる。１０％ ＳＤＳ中でのポリアクリ ルアミドゲル電気泳動を、溶離緩衝液としての１０mＭ トリス−ＨＣl(pＨ ８. ０)、１００mＭ ＮaＣl中で適当に行う。どの残基がＰＥＧ化されているかを実 証するには、トリプシンマッピングを行うことができる。従って、１００mＭ 酢 酸ナトリウム、１０mＭ トリス−ＨＣl、１mＭ 塩化カルシウム(pＨ ８.３)中、 １００対１(mg基準)のタンパク質／酵素比でトリプシンを用いて、ＰＥＧ化ＧＨ を３７℃で４時間消化させて、pＨ＜４まで酸性にして、消化を停止させた後、 ＨＰＬＣ Ｎucleosil Ｃ−１８(４.６mm×１５０mm、５μ、１００Ａ)で分離す る。そのクロマトグラムを、ＰＥＧ化されていない出発物質のクロマトグラムと 比較する。次いで、各々のピークを質量分析により分析して、ピークにおけるフ ラグメントの大きさを確かめることができる。ＰＥＧ基を有するフラグメントは 、通常、注入後、ＨＰＬＣカラムに保持されず、またクロマトグラフから消失す る。そのようなクロマトグラフからの消失は、少なくとも１つのリジン残基を含 むであろう、ある特定のフラグメントに関するＰＥＧ化の指標である。次いで、 従来の方法により、ＰＥＧ化ＧＨを、それがＧＨＢＰに結合する能力に関してア ッセイすることができる。 利用される様々なＰＥＧ化法は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、３５ Ｋ、５１Ｋ、２５０Ｋ、および３００Ｋの見掛け分子量を有する、様々な種類の ＰＥＧ化された野生型ＧＨを産生し、これらは、それらの天然の流体力学量に近 くなければならない。これらは各々、ＰＥＧ１−ＧＨ、ＰＥＧ２−ＧＨ、ＰＥＧ ３−ＧＨ、およびＰＥＧ７−ＧＨと名付けられた。トリプシンマッピングの結果 から、ＰＥＧ１−ＧＨとＰＥＧ２−ＧＨとの両方が、Ｎ末端に９つのアミノ酸か らなる、クロマトグラムから欠け、またＰＥＧ化されているかもしれないフラグ メントを有しており、これらは、液体クロマトグラフのフロースルーにおいて見 い出される、大きな分子種の質量分析により確認することができる。ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥに関する分子量から、ＰＥＧ１−ＧＨは、Ｎ末端アミンに１つのＰＥＧを 有するかもしれず、ＰＥＧ２−ＧＨは、Ｎ末端アミンに２つのＰＥＧ分子を有し 、第三級アミドを形成するかもしれない。ＰＥＧ３−ＧＨは、ＮＭＲの結果に基 づき、１分子につき５つのＰＥＧ基を有し、またトリプシンマップに基づき、少 なくとも５つのペプチドが欠けており、それらがＰＥＧ化されていることが示唆 された。ＰＥＧ７−ＧＨ分子は、質量分析に基づき、１分子につき６〜７つのＰ ＥＧ基を有すると考えられる。 ＧＨにＰＥＧ基を加えるための部位、またそのような結合に好ましい残基であ る部位は、Ｎ末端メチオニンまたはフェニルアラニン、リジン３８、リジン４１ 、リジン７０、リジン１４０、リジン１４５、リジン１５８、およびリジン１６ ８である。ＰＥＧ化されないと思われる２つのリジンは、リジン１１５およびリ ジン１７２であった。 ＧＨはまた、持続性放出システムによっても適当に投与される。本発明で有用 な持続性放出組成物の例には、形作られた物品形態の半透性ポリマーマトリック ス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが含まれる。持続性放出マトリ ックスには、ポリアクチド(米国特許番号第３,７７３,９１９号、欧州特許第５ ８,４８１号)、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマ ー(Ｓidmanら、Ｂiopolymers ２２：５４７−５５６［１９８３］)、ポリ(２− ヒドロキシエチルメタクリレート)(Ｌangerら、Ｊ.Ｂiomed.Ｍater.Ｒes．１５ ：１６７−２７７［１９８１］、およびＬanger、Ｃhem.Ｔech．１２：９８−１ ０５［１９８２］)、エチレンビニルアセテート(Ｌangerら、Ｊ.Ｂiomed.Ｍater .Ｒes.１５：１６７−２７７［１９８１］)もしくはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒド ロキシ酪酸(欧州特許第１３３,９８８号)、またはＰＬＧＡミクロスフェアが含 まれる。持続性放出ＧＨ組成物にはまた、リポソームでエントラップされた(ent rapped)ＧＨも含まれる。ＧＨを含むリポソームは、本質的には既知の方法によ り調製される：ドイツ特許第３,２１８,１２１号；Ｅpsteinら、Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈwangら、Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許 第５２,３２２号；欧州特許第３６,６７６号；欧州特許第８８,０４６号；欧州 特許第１４３,９４９号；欧州特許第１４２,６４１号；日本特許出願第８３−１ １８００８号；米国特許番号第４,４８５,０４５号および同第４,５４４,５４５ 号；および欧州特許第１０２,３２４号。普通、リポソームは、脂質含量が約３ ０mol％コレステロールより多い、小さい(約２００〜８００オングストローム) 単層板型のものであり、選択された割合は、最適な治療のために調節される。加 えて、１９８９年８月１５日に発行された米国特許番号第４,８５７,５０５号に 記載されている ように、生物学的に活性な持続性放出製剤を活性化ポリサッカライドに共有結合 したＧＨの付加物から作製することができる。加えて、米国特許番号第４,８３ ７,３８１号は、脂肪またはワックスまたはそれらの混合物のミクロスフェア組 成物、および遅延放出のためのＧＨを記載している。 ＩＧＦ−Ｉは、注射(一回または多数回、例えば、１日に１〜４回)または注入 を含め、いずれの方法によっても投与することができる。ＧＨと一緒の場合には 、ＧＨに関して先に記載したように、血中での継続的存在が治療期間中ずっと保 たれるよう、ＩＧＦ−Ｉを製剤化することができる。従って、それをポリマーに 共有結合させるか、または上記のような持続性放出製剤にするのがよい。 加えて、ＩＧＦ−Ｉを、いずれかの１つまたはそれ以上の結合タンパク質、例 えば、現在知られている、すなわち、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦ ＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、またはＩＧＦＢＰ−６と共に適当 に投与する。ＩＧＦ−Ｉをまた、投与のために、受容体または抗体または抗体フ ラグメントに結合させてもよい。本明細書中、ＩＧＦ−Ｉに好ましい結合タンパ ク質はＩＧＦＢＰ−３であり、これは、１９９３年１１月２日に発行された米国 特許番号第５,２５８,２８７号、およびＭartin並びにＢaxter、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem ．２６１：８７５４−８７６０（１９８６）に記載されている。このグリコシル 化ＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、ヒト血漿中に見い出される１２０−１５０Ｋd の糖タンパク質複合体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の約５３Ｋdの酸安定成 分であり、内因性ＩＧＦの大部分を運んで、またＧＨにより調節もされる。 ＩＧＦ結合タンパク質をＩＧＦ−Ｉと共に投与することは、１９９３年２月１ ６日に発行された米国特許番号第５,１８７,１５１号に記載されている方法より 成し遂げられ得る。簡単に言えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰを約０.５：１ 〜約３：１、好ましくは約１：１のモル比で皮下ボーラス注射により有効量で投 与する。 好ましくは、ＩＧＦ−ＩとＧＨとの両方の投与は、例えば、静脈内方法または 皮下方法を利用する連続注入による。さらに好ましくは、その投与は、ＩＧＦ− ＩとＧＨとの両方に関して皮下である。 ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせによるうっ血性心不全の治療では、ＧＨとＩ ＧＦ−Ｉとの組成物を製剤化し、用量として、良好な医療実施にかなった方法で 投与するであろう。これに関連して考慮すべき因子には、処置すべき個々の哺乳 動物、個々の患者の臨床病態(特に、ＧＨまたはＩＧＦ−Ｉを単独で用いての治 療に関する副作用)、ＩＧＦ−ＩとＧＨとの組成物の送達部位、投与方法、投与 計画、および医者に知られている他の因子が含まれる。従って、本明細書中での 目的のための各々の成分の「有効量」は、そのような考慮すべき事項により決定 され、またうっ血性心不全の患者における心臓の性能を改善して、同様に重要な 他の病態を回復させる量である。 一般的な案として、１用量につき非経口投与されるＩＧＦ−ＩおよびＧＨの各 々の全医薬的有効量は、約１μg／kg／日〜１０mg／kg／日(患者の体重)の範囲 であろうが、上述のように、このことは、相当な治療判断を必要とするであろう 。治療の種類(その治療が慢性であるか、急性であるか)および患者の年齢(すな わち、初老、中年、もしくは若い成人に投与するか、または子供に投与するか) が用量に影響を及ぼすであろうと同様に、副作用の存在が用量に影響を及ぼすで あろう。急性処置に適する患者の例には熱傷患者が含まれ、この患者は、２〜４ 週間処置するのがよい。慢性処置に適する患者の例には初老が含まれ、この患者 には、一般的には、若い患者より薬物を少なく与える。４カ月が半慢性用量であ ろう。急性処置のための用量は、一般的には、より広い範囲であって、慢性処置 のための用量より高い上限を有する。 一般的規則として、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨの各々の好ましい用量は、少なくと も約０.０１mg／kg／日、またさらに好ましくは、ヒトに対し、各々のホルモン に関して約０.０１〜１mg／kg／日である。一層さらに好ましくは、各々のホル モンの用量は、約０.０１mg／kg／日〜０.２５mg／kg／日である。ＧＨに関して 具体的には、最も好ましい用量を約１０〜１００μg／kg／日の範囲で１日１回 与え、この用量は、最初の低い用量から傾斜的に上げていくのがよい。ＩＧＦ− Ｉに関して具体的には、最も好ましい用量を約５０−２００μg／kg／日(全日用 量)、好ましくは約５０−１５０μg／kg／日の範囲で１日２回与える(ＢＩＤ)。 連続的 に投与するなら、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨを各々、一般的には、例えば、ミニポン プを用いて、１日に１〜４回の注射により、または連続皮下注入により、約１μ g／kg／時間〜約５０μg／kg／時間の用量割合で投与する。静脈内バッグ溶液を また使用することもできる。適当な用量を選択する際に重要な因子は、例えば、 心臓の性能の改善、症状の軽減、自動運動耐性の増加、および／または生存の長 期化により測定されて、得られた結果である。 ＩＧＦ−ＩとＧＨの両方の用量を考える医者は、これらのホルモンを用いての 治療に関する既知の副作用を考慮に入れなくてはならないことに注意する。ｈＧ Ｈに関する副作用には、ナトリウム貯留および細胞外容量の拡大(Ｉkkosら、Ａc ta Ｅndocrinol．３２：３４１−３６１(１９５９)；Ｂiglieriら、Ｊ.Ｃlin.Ｅ ndocrinol.Ｍetab．２１：３６１−３７０（１９６１）)、さらにはまた高イン スリン症および高血糖症が含まれる。ＩＧＦ−Ｉの主要で明らかな副作用は、高 血糖症である。Ｇulerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ８６：２８６８− ２８７２（１９８９）。それどころか、ＩＧＦ−ＩとＧＨとの組み合わせは、両 方の物質の望ましくない副作用の減少をもたらし得(例えば、ＩＧＦ−Ｉに関す る高血糖症およびＧＨに関する高インスリン症)、またその分泌がＩＧＦ−Ｉに より抑制されるＧＨの血液レベルの回復をもたらし得る。 非経口投与の場合、一態様において、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨを、通例、単位投 薬量の注射可能形態(溶液、懸濁液、またはエマルション)で、医薬的に許容され 得る担体、すなわち、使用する投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒で あって、製剤の他の成分と適合する担体と共に、所望の純度で各々を混合するこ とにより製剤化する。例えば、製剤には、好ましくは、ポリペプチドに対して有 害であることが知られている酸化剤および他の成分は含まれない。 通例、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨを各々、液状担体または微細に粉砕された固形担 体またはそれら両方と均等かつ十分に接触させることにより、製剤を調製する。 次いで、もし必要ならば、生成物を所望の製剤に形作る。好ましくは、その担体 は、非経口担体であり、さらに好ましくは、レシピエントの血液と等張の溶液で ある。そのような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およ びデキストロース溶液が含まれる。本明細書中では、不揮発性油およびオレイン 酸エチルといったような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に有用である 。 担体は、適当には、等張性および化学安定性を高める物質のような添加物を少 量含む。そのような物質は、使用する投薬量および濃度でレシピエントに対して 無毒であり、またリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸 またはそれらの塩といったような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低 分子量(約１０残基未満)のポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペ プチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンといったようなタン パク質；ポリビニルピロリドンのような疎水性ポリマー；グリシン、グルタミン 酸、アスパラギン酸、またはアルギニンといったようなアミノ酸；セルロースも しくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含め、単糖 類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトー ルまたはソルビトールといったような糖アルコール；ナトリウムのような対イオ ン、および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧといったよう なイオン性界面活性剤が含まれる。 ＩＧＦ−ＩおよびＧＨは各々、一般的には、そのようなビヒクル中、約０.１m g／ml〜１００mg／ml、好ましくは１〜１０mg／mlの濃度、約４.５〜８のpＨで 個々に製剤化される。完全な長さのＩＧＦ−Ｉは、通例、約６以下のpＨで安定 であり；des(１−３)−ＩＧＦ−Ｉは、約３.２〜５で安定であり；ｈＧＨは、例 えば、７.４〜７.８のより高いpＨで安定である。前述の賦形剤、担体、または 安定剤の幾つかの使用がＩＧＦ−ＩまたはＧＨ塩の形成を起こすことが分かるで あろう。 加えて、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ、好ましくは完全な長さのＩＧＦ−Ｉを一緒に 適当な担体ビヒクル中で製剤化して、医薬組成物を形成することができる。一態 様において、製剤に使用される緩衝液は、組成物を混合して直ぐ使用するか、ま たは後の使用のために保存するかどうかにより左右されるであろう。混合した後 直ぐに使用するなら、完全な長さのＩＧＦ−ＩとＧＨとの混合物を、マンニトー ル、グリシン、およびリン酸塩(pＨ ７.４)中で製剤化することができる。この 混合物を保存すべきなら、クエン酸塩のような、pＨが約６の緩衝液中、０.１％ ポリソルベート２０またはポロキサマー１８８といったような、このpＨでＧＨ の溶解度を増加させる界面活性剤と共に製剤化する。最終調製物は、安定な液体 または凍結乾燥固体であるのがよい。 治療投与に使用されるべきＩＧＦ−ＩおよびＧＨは、無菌であるのが好ましい 。無菌性は、無菌濾過膜(例えば、０.２ミクロン膜)を通して濾過することによ り容易に成し遂げられる。ＩＧＦ−ＩとＧＨとの治療組成物は、通例、無菌アク セスポート、例えば、静脈内溶液バッグを有する容器、または皮下注射針により 剌すことができる栓を有するバイアルに入れられる。 ＩＧＦ−ＩおよびＧＨは、普通、器具または多用量容器、例えば、封管アンプ ルまたはバイアル中、水溶液として、または再構築用の凍結乾燥製剤として保存 されるであろう。凍結乾燥製剤の例として、１０mlのバイアルを、無菌濾過され た１％(ｗ／ｖ)水性ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ溶液５mlで満たして、その結果得られ た混合物を凍結乾燥する。静菌注射用水を用いて、凍結乾燥したＩＧＦ−Ｉおよ びＧＨを再構成することにより、注入溶液を調製する。 投与すべき有効量のＡＣＥ阻害剤は、もし使用するなら、医者または獣医の随 意であろう。投薬量の投与および調節を行って、うっ血性心不全の最適な処置を 得、また理想的には、利尿薬またはジギタリスの使用、および低血圧症並びに腎 障害といったような病態を考慮に入れる。その用量は、さらに、使用する阻害剤 の種類および処置する特定の患者といったような因子により左右されるであろう 。一般的には、使用する量は、ＡＣＥ阻害剤をＧＨおよびＩＧＦ−Ｉなしで投与 する場合に使用される量と同じ用量であろう。 従って、例えば、エナラプリルの試験用量は５mgであり、次いで、患者がそれ に耐性を示すにつれて、これを日に一度、１日に１０〜２０mgまで傾斜的に上げ ていく。別の例として、最初に、カプトプリルを６.２５mgの試験用量でヒトの 患者に経口投与した後、患者がそれに耐性を示すにつれて、その用量を１日２回 (ＢＩＤ)または１日３回(ＴＩＤ)２５mgまで段階的に上げていって、ＢＩＤまた はＴＩＤで５０mgまで滴定することができる。血圧の減少が低血圧症の兆しを伴 うかどうかを測定することにより、耐性レベルを見積もる。もし示されたなら、 その用量をＢＩＤまたはＴＩＤで１００mgまで増加させることができる。カプト プリルを、塩酸チアジンと組み合わせての活性成分として、また結腸に到達する までカプトプリルを保護する腸内放出または遅延放出コーティングを有するpＨ 安定化コアとして製造する。カプトプリルは、錠剤またはカプセルの形態で投与 するのに有効である。カプトプリルおよび他のＡＣＥ阻害剤と関係する投薬量、 投与、指示および反対指示に関する論議は、Ｐhysicians Ｄesk Ｒeference、Ｍ edical Ｅconomics Ｄata Ｐroduction Ｃo.、Ｍontvale、ＮＪ．２３１４−２ ３２０（１９９４）に見い出すことができる。 本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであ ろう。しかし、その実施例は、本発明の範囲を制限するものとして構成されるべ きではない。文献および特許引用は全て、本明細書中に明白に包含される。 実施例１ カプトプリルを用いて前処置および同時処置するか、または処置することなしに 、うっ血性心不全を治療するためのＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの使用 序論 この研究の目的は、カプトプリルまたは水のいずれかを用いて前処置および同 時処置するか、または処置することなしに、うっ血性心不全に罹っているラット でのヒトＧＨ／ＩＧＦ−Ｉの心臓への作用を評価することであった。 方法 手術前の少なくとも一週間、雄のＳprague−Ｄawley(ＳＤ)ラット(Ｃharles Ｒiver Ｂreeding Ｌaboratories,Ｉnc.、８週齢)を設備に順応させた。ラット にペレット化したラットの食物および水を自由に摂取させて、明るさおよび温度 を調節した部屋に収容した。 冠状動脈結紮 以前に記載されているように、心筋梗塞を左冠状動脈結紮により引き起こした 。 Ｇeenen,Ｄ.Ｌ.ら、Ｊ.Ａppl.Ｐhysiol．６３：９２−９６（１９８７）；Ｂutt rick,Ｐ.ら、Ａm.Ｊ.Ｐhysiol．２６０：Ｈ４７３−Ｈ４７９（１９９１）。そ れらのラットをペントバルビタールナトリウム(６０mg／kg、ip)で麻酔し、気管 切開により挿管して、人工呼吸器(Ｈarvard Ａpparatus Ｍodel ６８３)により 通気した。左側を開胸した後、７−０の絹の縫合糸を用いて、左冠状動脈をその 起始から約２mm結紮した。ラットは全て、Ａmerican Ｈeart Ａssociationによ り１９８４年１１月１１日に採用された「Ｐosition of the Ａmerican Ｈeart Ａssociation on Ｒesearch Ａnimal Ｕse」に従って取り扱った。４〜６週間結 紮すると、心筋梗塞は、ラットにおいてうっ血性心不全を起こした。 心電図 手術一週間後、光メトファン(metofane)麻酔下に心電図を得て、梗塞の発生を 証明した。胸部誘導を渡る異常Ｑ波の深度および存続により、結紮したラットを 部分群に分けた。Ｂuttrick,Ｐ.ら、Ａm.Ｊ.Ｐhysiol．２６０：Ｈ４７３−Ｈ４ ７９（１９９１）；Ｋloner,Ｒ.Ａ.ら、Ａm.Ｈeart Ｊ．１０６（５）：１００ ９−１０１３（１９８３）。ＥＣＧ研究結果は、梗塞の大きさに関する全体評価 を与え、また成長因子およびビヒクルで処置した結紮したラットでは、大きな梗 塞および小さな梗塞が別々に分布していないことを確証した。処置している間、 体重(ＢＷ)を週に２回測定した。 ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの投与 手術二週間後、ラットをカプトプリル(２ｇ／Ｌ)または水の処置レジメに３週 間置いた。カプトプリルまたは水での処置を開始してから３カ月後、ビヒクルま １日２回、皮下注射)と組換えヒトＩＧＦ−Ｉ(５０mＭ 酢酸ナトリウム緩衝液中 、１０mg／ml、２.５mg／mlフェノール、５.８４mg／ml ＮaＣl、および９mg／m l ベンジルアルコール、pＨ ５.４；２mg／kg／日、オスモティックポンプによ り皮下注入)との組み合わせを各々のグループのラットの処置に加えた。この方 法で処置を１４日間続けた。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉをビヒクルとしての(注射用) 水で投与した。処置している間、体重(ＢＷ)を週に２回測定した。 カテーテル法 ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉまたはビヒクルを用いての処置から１３日後、ラットをペン トバルビタールナトリウム(５０mg／kg、腹腔内)で麻酔した。動脈圧および心拍 数を測定するために、ヘパリン−生理食塩水溶液(５０Ｕ／ml)を満たしたカテー テル(ＰＥ−５０と融合させたＰＥ−１０)を、右大腿動脈を通して腹部大動脈に 埋込んだ。左心室圧およびdＰ／dtを測定するために、第２のカテーテルを、右 頸動脈を通して左心室に埋込んだ。熱希釈法により心拍出量を測定するために、 第３のカテーテルを、生理食塩水注入用に、右頸静脈を通して右心房に埋込んで 、サーミスタカテーテル(Ｌyons Ｍedical Ｉnstrument Ｃo.、Ｓylmar、ＣＡ) を大動脈弓に挿入した。それらのカテーテルを、皮下にくぐらせたステンレス鋼 針金の助けを借りて頸の後で肱置した後、固定した。カテーテルを埋込んだ後、 ラットを全て個々に収容した。 血流力学測定 カテーテル法を行った一日後、血流力学測定を、意識があって抑制されていな いラットで行った。心拍出量を測定するために、マイクロコンピューターシステ ム(Ｌyons Ｍedical Ｉnstrument Ｃo.)を用いて、サーミスタカテーテルを処理 し、また平均動脈圧(ＭＡＰ)、収縮期動脈圧(ＳＡＰ)、心拍数(ＨＲ)、左心室拡 張終期血圧(ＬＶＥＤＰ)および左心室最大dＰ／dtを測定するために、他の３つ のカテーテルをＧrass ７型ポリグラフ(Ｇrass Ｉnstruments、Ｑuincy、ＭＡ、 ＵＳＡ)に連結したＣＰ−１０型圧力変換器(Ｃentury Ｔechnology Ｃompany、 Ｉnglewood、ＣＡ、ＵＳＡ)に接続した。心拍出量を測定するために、室温の等 張生理食塩水(０.１ml)を頸静脈カテーテルによりボーラスとして注射した。熱 希釈曲線をＶＲ−１６サイマルトレース(simultrace)記録計(Ｈoneywell Ｃo.、 ＮＹ)によりモニターして、心拍出量(ＣＯ)をデジタル式マイクロコンピュータ ーにより得た。ＣＯから、一回拍出量(ＳＶ)、心指数(ＣＩ)、一回拍出量指数( ＳＶＩ)、および全身血管抵抗(ＳＶＲ)を計算することができる。 これらの血流力学パラメーターを測定した後、血液１mlを動脈カテーテルによ り集めた。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉを測定するために、血清を分離して、−７０℃ で保存した。 実験の最後に、ラットをペントバルビタールナトリウム(６０mg／kg)で麻酔し て、心臓をＫＣl(１Ｍ)の動脈内注射で拡張期に停止させた。心臓を摘出して、 心房および大きい管を心室から切り取った。その心室の重さを量って、１０％緩 衝化ホルマリンに固定した。 梗塞の大きさの測定 壁のない(free wall)右心室を左心室から切開した。その左心室を尖から底ま で４つの横径スライスに切断した。５μmの切片を切断し、封入して、マッソン 三色染色で染色した。梗塞を起こした左心室および梗塞を起こしていない左心室 の心内膜周径および心外膜周径を面積計 Ｄigital Ｉmage Ａnalyzerで測定した 。４つのスライス全ての梗塞を起こした周径および全左心室周径を合計して、全 周径に対する梗塞を起こした周径のパーセントとして表した。次いで、これら２ つの割合を平均して、梗塞の大きさのパーセントとして表した。 ホルモンアッセイ 血清ヒトＧＨを感受性ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｃelniker,Ａ.、Ｊ.Ｃlin. Ｅndocrinol.Ｍetab．６８：４６９−４７６（１９８９）；Ｇreenen,Ｄ.Ｌ.ら 、Ｊ.Ａppl.Ｐhysiol．６３：９２−９６（１９８７）。このアッセイは、ラッ トＧＨを検出しない。酸−エタノール抽出した後、標準としてヒトＩＧＦ−Ｉ( 研究試薬としてＧenentech,Ｉnc.から入手できる)、およびウサギ抗ＩＧＦ−Ｉ ポリクローナル抗体を用いて、全血清ＩＧＦ−Ｉをラジオイムノアッセイにより 測定した(Ｆurlanetto Ｒ.Ｗ.ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest．６０：６４８−６５７［ １９７７］；Ｚapf Ｊ.ら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest．６８：１３２１−１３３０［１ ９８１］)。許容範囲は１.２５〜４０ng／mlであったが、アッセイ内およびアッ セイ間変動は各々、５〜９％および６〜１５％であった。 統計分析 結果を平均±ＳＥＭとして表す。分散の二元分析および一元分析(ＡＮＯＶＡ) を行って、グループ間のパラメーターの差を評価した。次いで、Ｎewman−Ｋeul s法を用いて、有意差を後(post)hoc分析にかけた。Ｐ＜０.０５を有意とみなし た。 結果 ＢＷの増加は、カプトプリルで処置したラットまたは対照ラットにおいてより 、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉで処置したラットまたはカプトプリル＋ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉで 処置したラットにおいて有意に大きかった。カプトプリル単独では、ＢＷ増加は 変わらなかった。(第１ａ図)。ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉでは、水で処置したラットでの ＢＷに対する左心室重量の割合(ＬＶＷ／ＢＷ)は有意に変わらなかった。ＢＷに 対する左心室重量の割合(ＬＶＷ／ＢＷ)は、カプトプリルで処置したグループま たはカプトプリル＋ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉで処置したグループにおいて有意に減少し た(第１ｂ図)。 ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ処置は、水で処置したラットおよびカプトプリルで処置した ラットにおけるヒトＧＨおよびヒトＩＧＦ−Ｉの血清レベルを有意に増加させた (第２ａ図および第２ｂ図)。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの血清レベルの増加は、水で 処置したラットとカプトプリルで処置したラットとの間で違わなかった。 梗塞の大きさは、４つの実験グループにおいて違わなかった(第３図)。 ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉは、水で処置したラットにおいて、ＳＡＰを減少させて、Ｍ ＡＰを有意に減少させる傾向にあった(第４ａ図および第４ｂ図)。ＳＡＰおよび ＭＡＰは、対照グループまたはＧＨ／ＩＧＦ−Ｉグループと比べて、カプトプリ ルで処置したラットまたはカプトプリル＋ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉで処置したラットに おいて有意に減少した。カプトプリルまたはＧＨ／ＩＧＦ−Ｉではいずれも、Ｈ Ｒは有意に変わらなかった(第４ｃ図)。 ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ処置は、水で処置したラットとカプトプリルで処置したラッ トの両方において、左心室最大dＰ／dtの有意な増加を引き起こした(第５ａ図) 。カプトプリル単独処置では、dＰ／dtは変わらなかった。ＬＶＥＤＰは、対照 グループと比べて、３つの処置したグループ全てにおいて有意に減少した(第５ ｂ図)。 カプトプリルまたはＧＨ／ＩＧＦ−Ｉはいずれも、ＣＩおよびＳＶＩを増加さ せた(第６ａ図および第６ｂ図)。ＣＩおよびＳＶＩの増加は、カプトプリルで処 置したグループにおいてより、カプトプリル＋ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉで処置したグル ープにおいて有意に大きかった。ＳＶＲは、対照グループと比べて、３つの処置 したグループにおいて有意に減少した(第６ｃ図)。 要約 ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせを用いてのうっ血性心不全の治療は、カプト プリルの存在下または不存在下、左心室最大dＰ／dtの有意な増加を起こした。 この作用は、カプトプリル単独では見い出されなかった。 カプトプリルを単独で用いての慢性処置は、動脈圧、左心室拡張終期血圧およ び末梢血管抵抗の減少を引き起こした。これらの変化は、試験動物における心拍 出量および一回拍出量の増加を起こした。これらは、心不全に罹っているヒトお よび動物において明白な、ＡＣＥ阻害に関する周知の利点であった。 カプトプリルを用いての初期治療後、うっ血性心不全に罹っている哺乳動物の 処置レジメに加えられたＧＨおよびＩＧＦ−Ｉは、慢性ＡＣＥ阻害の作用に関す る背景以上に明らかな、心筋の収縮性および心臓の性能の増加の作用を誘発した 。さらに、ＬＶＷ／ＢＷにより測定される、心肥大を減少させる際のカプトプリ ルの有利な作用は、カプトプリル、ＧＨ、およびＩＧＦ−Ｉで処置したグループ において保たれる。データは、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉと組み合わせたカプトプリ ルが、うっ血性心不全における心臓の性能を改善することを示唆する。 これらの結果は、カプトプリルまたは他のＡＣＥ阻害剤を用いての治療期間後 、うっ血性心不全に罹っている患者には、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉを処置レジメに 加えるのが有利であろうことを示唆する。これらの結果はまた、患者には、ＡＣ Ｅ阻害剤の不存在下ですら、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせが有利であろうこ とをも示唆する。ＡＣＥ阻害剤の不存在下、ＧＨとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせが 有利である患者は、ＡＣＥ阻害剤を禁忌とする患者およびＡＣＥ阻害剤の副作用 に耐性がない患者である。 実施例２ うっ血性心不全に関して提唱される臨床治療 Ａ．関与 ＧＨの１日１回用量およびＩＧＦ−Ｉの１日２回用量でのＧＨおよびＩＧＦ− Ｉの患者自己投与を熟考する。各々の薬物の最初の用量は、同じ日に投与し、ま たＧＨに関して１０〜１００μg／kg／日およびＩＧＦ−Ｉに関して４０〜１２ ０μg／kg／日(１日２回与える)である。これらの範囲は、副作用および効き目 によって調節されるであろう。 患者は、以下のいずれかの理由で考慮から除外される： −(手術可能または不可能な)不正確な、主要な弁の心臓病、(禁断が試みられ ていないなら、アルコールを含め)特定の処置可能な病因、または手術可能な冠 状動脈疾患から起こる心不全。 −３カ月間未満の拡張された心筋症。 −胸痛または閉塞性末梢血管疾患により制限された自動運動。 −ＦＥＶ ₁＜６０％が予測される慢性閉塞性肺疾患。 −糖尿病または損なわれたグルコース耐性。 −手根管症候群歴または試験で陽性のティネル徴候に関する証拠。 −症候群性変形性関節症。 −活性悪性疾患。 Ｂ．結果 この組み合わせた処置に関して予期される結果には、以下のことが含まれる： 健康感の改善、自動運動耐性の増加、筋力並びにやせた体質量の増加、全身血管 抵抗の減少、心臓の性能の向上、および代償性心筋肥大の向上。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／３３３，９０９ (32)優先日 1994年11月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者 パオニ，ニコラス・エフ アメリカ合衆国94002カリフォルニア州 ベルモント、テラス・ドライブ1756番 (72)発明者 ヤン，レンフイ アメリカ合衆国94066カリフォルニア州 サン・ブルノ、シー・クリフ・ウェイ2045 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．うっ血性心不全を示す哺乳動物を治療する方法であって、ＧＨとＩＧＦ− Ｉとの組み合わせの有効量を該哺乳動物に投与することからなる方法。 ２．成長ホルモンがヒト成長ホルモンであって、ＩＧＦ−ＩがヒトＩＧＦ−Ｉ である、請求項１に記載の方法。 ３．哺乳動物がヒトである、請求項２に記載の方法。 ４．ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの各々の有効量が約０.０１〜約１mg／kg／日であ る、請求項３に記載の方法。 ５．ＧＨもしくはＩＧＦ−Ｉまたはその両方の投与が皮下または静脈内経路に よるものである、請求項４に記載の方法。 ６．ＧＨを１日１回投与して、ＩＧＦ−Ｉを１日２回投与する、請求項５に記 載の方法。 ７．うっ血性心不全が急性または慢性虚血から起こる、請求項１に記載の方法 。 ８．うっ血性心不全が心筋梗塞から起こる、請求項１に記載の方法。 ９．うっ血性心不全を示す哺乳動物を治療する方法であって、ＧＨ、ＩＧＦ− ＩおよびＡＣＥ阻害剤の組み合わせの有効量を該哺乳動物に投与することからな る方法。 １０．ＡＣＥ阻害剤を単独で用いての処置期間後にＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの投 与を開始する、請求項９に記載の方法。 １１．処置の最初からＧＨ、ＩＧＦ−ＩおよびＡＣＥ阻害剤を一緒に投与する 、請求項９に記載の方法。 １２．ＡＣＥ阻害剤がカプトプリルである、請求項９に記載の方法。 １３．成長ホルモンがヒト成長ホルモンであって、ＩＧＦ−ＩがヒトＩＧＦ− Ｉである、請求項９に記載の方法。 １４．哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。 １５．ＧＨもしくはＩＧＦ−Ｉまたはその両方の投与が皮下または静脈内経路 によるものである、請求項９に記載の方法。 １６．ＧＨを１日１回投与して、ＩＧＦ−Ｉを１日２回投与する、請求項１５ に記載の方法。 １７．うっ血性心不全が急性または慢性虚血から起こる、請求項９に記載の方 法。 １８．うっ血性心不全が心筋梗塞から起こる、請求項９に記載の方法。