JPH06505235A - 同化作用のためのｉｇｆ−ｉおよびｉｇｆｂｐの組合わせ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 同化作用のためのＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰの組合わせ本発明は哺乳類に、同 化または成長促進状態をもたらすことに関する。さらに詳しくは、本発明は、身 体全体および骨の成長の促進を初め、同化状態を引き起こすための、ＩＧＦ−１ と、該物質が結合する１またはそれ以上のタンパク質との複合物の使用に関する 。

循環系において、他の体液内で、そして培養細胞によって調整された培地内で、 ソマトメジン（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｔ　Ｉ）は、ＩＧＦ作用のモジュレー タ−と示唆されている、特異的に高親和性の担体タンパク質に結合する。

ＩＧＦ結合タンパク質（ＢＰ類）の歴史は、最初に血清中に特異的ソマトメジン 結合タンパク質が存在することが発見された１９８４年にさかのぼる。［ハイン ツ（Ｈｉｎｔｚ）　、　Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、、　 １３：　３ｌ−４２（１９８４）コ。現在では、４つの別個のＩＧＦＢＰ類がク ローン化され、配列決定されており、さらに、幾つかの他の、まだ完全には特性 化されていないＢＰ種が様々な組織で同定された。例えば、バクスターおよびマ ーチン（Ｂａｘｔｅｒ　ａｎｄ　Ｍａｒｔｉｎ）　、　Ｐｒｏｇ、　ｉｎＧｒｏ ｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、、　１：　４９−６８　（１９８９）；　ロガ ニら（Ｒｏｇｈａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、　ＦＥＢdＳ ｌｅｔｔ、、　２５５：　２５３−２５８　（１９８９）＋バウチスタら（Ｂａ ｕｔｉｓｔａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｃ１１ｎｉｃａｌＲｅｓ、、　３８：Ｐ Ａ１１７　（１９９０）参照。配列に基づいて、従来、認められ、他の名称で知 られていたＢＰ類の多くが、実際は同じであり、クローン化ＢＰ類に定義付けら れたクラス番号にあてはまることが分かった。これらＢＰ類の現状を明確にする ために、１９８９年６月にカナダのバンク−バーでＩＧＦ結合タンパク質に関す るワークショップが開催され、配列決定された結合タンパク質類についてＩＧＦ ＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−３の名称が提案された。バラード ら（Ｂａｌｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 　（Ｃｏｐｅｎｈ）、　１２１：　７５１−７５２　（１９８９）。そのワーク ショップで、他の特性化が不完全なＩＧＦＢＰ類はそれが配列決定されるまで、 サイズと起源により示すとの合意がなされた。その時から後に、後述する他のＩ ＧＦＢＰ、即ちＩＧＦＢＰ−４が配列決定された。

羊水が最初にＩＧＦＢＰ−１が検出された起源であった。チョチノフら（Ｃｈｏ ｃｈｉｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌ、Ｍ ｅｔａｂ、、　４４：９０２−９０８　（１９７７）。そ■^ ンパク質は胎児および母体の胎盤からも精製され、胎盤タンパク質と命名された 。キオスチネンら（Ｋｉｏｓｔｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏｇｙ、　１１８；１３７５−１３７８（１９８６）。成熟タンパク質 は２３４アミノ酸を含有し、分子量は２５．３ｋＤと予測された。リーら（Ｌｅ ｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｍｏｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、２：　４０４− ４１１　（１９８８）：　１０８９１０９７９２　（１９８９年１０月１９日公 開）。ＩＧＦＢＰ−１は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で還元の状態に応じて２８−３５ｋ Ｄの位置に泳動する。ＩＧＦＢＰ−１は血清中に少量ある結合タンパク質であっ て、不飽和血清ＩＧＦ結合部位を含有している。血清濃度は、インシュリン逆依 存性であり、日々で著しく変化し、その濃度は早朝に最も高い。これらの濃度は 妊娠中に数１００μｇ／Ｉに増大し、羊水中の濃度は血清中濃度の１０００倍と いう高さになる。

ＩＧＦＢＰ−２クラスの担体タンパク質はヒト胎児肝臓およびラットおよびウシ 細胞系から単離された。ピンカートら（Ｂｉｎｋｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　、 　ＥＭＢＯＪ、　、　８：２４９７−２５０２　（１９８９）；　ロゼンフェル トら（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ、ｌ１ｅｔａｂ、　７０：　５５１−５５３　（１９９０）。ヒト においては、成熟形は２８９アミノ酸を有し、見掛は上の分子量は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ上での還元状態に応じて３ｌ−４０ｋＤである。ヒトにおいて、脳を髄液に 高濃度のＩＧＦＢＰ−２が認められている。胎児組織にこのタンパク質が豊富で あることは、それが発達の制御に加担していることを示している。ＩＧＦＢＰ− ２はＩＧＦ−ＩＩに優先的に結合する。

血清ＩＧＦ類の大多数は２部分からなるＢＰ類と結合して分子量１２５−１５０ ｋＤの複合体を形成する。ＩＧＦＢＰ−３はこの複合体におけるＩＧＦ結合サブ ユニット（β−サブユニット）である。バクスターおよびマーチン（Ｂａｘｔｅ ｒ　ａｎｄ　１ｌａｒｔｉｎ）　、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＬＩＳＡ　８６：　６８９ｇ−６９０２（１９８X）。そ れは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の、それぞれ５３および４７ｋＤに相当する位１に、 主要および微量のバンドとして現れる酸に安定な糖タンパク質である。複合体の 他の成分は酸に不安定な、分子量８４−８６ｋＤの非−ＩＧＦ結合性サブユニッ ト（α−サブユニット）［バクスター（（Ｂａｘｔｅｒ）　１０９０１０５６９ ］およびＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１（γ−サブユニット）である。ＩＧＦＢ Ｐ−３（以前はＩＧＦＢＰ−５３として知られていた）のクローン化ｃＤＮＡの 配列決定により非グリコジル化タンパク質の分子量が２８．７ｋＤと予測され、 ＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦＢＰ−１と３３％の配列相同性を有することが判明した 。ウッドら（Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、　）　、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 、２：　１１７６−１１８５　（１９８８）；　１０８９１０９２U８ １９８９年１０月５日公開。

最も最近には、培養したヒト骨芽様ＴＥ８９骨肉腫細胞調整培地から２５ｋＤの ＩＧＦＢＰ−４が単離され、配列決定された。モハンら（ｌｌｏｈａｎ　ｅｔ　 ａｌ、　）　。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：８３３８−８３４ ２（１９８９）。同様に、同じでないとしても、ヒト前立腺がん細胞からＩＧＦ ＢＰが単離され配列決定された。パーカーら（Ｐｅｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　 、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ、、　７１：５３３ −５３５　（１９９０j。他 の同様のＩＧＦＢＰが大人のラット血清中に同定された。シモナカら（Ｓｈｉａ ＋ｏｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ、）　、ＢｉｏｃｈｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ ｏ＋ａｍ、、１６５：１８９−１９５　（１９８９）。

成人血清中のＩＧＦＢＰ濃度はＧＨ欠損または末端肥大症である個々人の成長ホ ルモン（ＧＨ）状態を反映していることが分かった。即ち、高濃度のＩＧＦＢＰ −３はＧＨの高濃度と関連している。マーチンおよびバクスター（Ｍａｒｔｉｎ 　ａｎｄ　Ｂａｘｔｅｒ）　、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏ、ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ ｏｌ、、　６１ニア９９−８０１　（１９８５）。正常■■ 件下、ヒト血漿中のＩＧＦ−１の約９５−９８％がＩＧＦＢＰ類と結合した。

結合活性を除くために各両分を抽出した後、ＩＧＦ−Ｉ　ＲＩＡにかける、ヒト 血清のサイズ分画による研究で、内因性ペプチドの７２％が１５０ｋＤ画分と結 合しており、２５％が５０ｋＤ画分と結合していることが分かった。ダイウハデ ィーら（Ｄａｕｇｈａｄａｙ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃ ｒｉｏｎｏｌ、）Ｉｅｔａｂ、、　５５：９１６−９Q １　（１９８２）。

文献はＩＧＦＢＰ−３に、ＩＧＦ−１の担体としてその循環中の半減期を延長す る消極的な役割と、ＩＧＦ−１活性のプロモーターとしての積極的な役割がある と推測している。例えば、ＢｉｏＧｒｏｗｔｈ、　Ｉｎｃ、は、ＩＧＦ−Ｉは傷 治癒動物モデルにおける治癒を有意に促進する、およびＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ ＢＰ−３の複合体は予試験でラットにおける皮質および繊維柱骨の骨成長を刺激 することを開示し、ＢＰは骨粗鬆症の治療に有用であることを示唆した。Ｂｉｏ ｖｅｎｔυｒｅＶｉｅｗ、　Ｖｏｌ、ＩＶ、　Ｎｏ、　１　（Ｊａｎ、　３１． １９８９）、　１９−２０頁参照。さらに、ＥＰ２９４．０２１および３７５． ４３８（ＢｉｏＧｒｏｖｔｈ、　Ｉｎｃ、　）をも参照。後者は、骨粗鬆症およ びヒトＧＨ欠損のような疾患の治療のために、そして骨の成長を刺激するために 骨組織に到達させることを含めて、傷を治療し動物の成長を増大するために、Ｉ ＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−１またはＩＧＦ−ＩＩとを併用することを開示しく例え ばＥＰ２９４゜０２１（７）８頁およびＥＰ３７５．４３８（７）　１１頁参照 ）。さらに、１０９０１００５６９（１９９０年１月２日公開）をも参照。これ らの思惑による使用にはなんらデータは示されていない。ＢｉｏＧｒｏｖｔｈの 科学者は、ＩＧＦＢＰ−３（ＩＧＦ−ＣＰと呼称）がラットにおいて、明らかに ＩＧＦ−指向骨成長を増大する、と１つの示唆をしている。ターキントンーベル サーら（Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎ−ｖｅｒｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｐｒｏ ｃｅｅｄＩｎｔｅｒｎ、　Ｓｙｍｐ、Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｒｅ１．Ｂｉｏａｃｔ、 　Ｍａｔｅｒ、、１６：２２３−２２４（１９８９）。しがしながらA プロトコールもデータも示されていない。

ヒト胎盤および肝がんｃＤＮＡライブラリーから得た２８−ｋＤのＩＧＦＢＰを ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１，または他の成長因子と一緒に投与するか、ある いは局所投与のための、傷または骨の治癒に有用な治療手段（ｄｅｖｉｃｅ）あ るいは骨粗鬆症の治療のための治療手段（ｄｅｖｉｃｅ）に適用される通常の組 成物として製剤化すれば、そのような手段からのソマトメジンの安定で制御され 放出のために価値がある。１０８９１０８６６７　（１９８９年９月２１日公開 、８−９頁）。

ラットＢＲＬ−３Ａに同等な他のヒトＢＰであって、ＩＧＦとの併用が骨粗セ症 、Ｌａｒｏｎ−型小人症、貧血、下垂体機能低下症、および傷等の治療に有用で あることが報告された（ＥＰ　３６９．９４３（１９９０年５月２３日公開）、 第１５１１参照）。

ＩＧＦ強化または阻害活性を有するＩＧＦ−１およびＩＧＦ−Ｉ　Ｉ　ＢＰ類は ＷＯ３９１０９７９２（１９８９年１０月１９日公開）に開示されている。

さらに、赤ん坊ハムスターの腎臓およびヒト皮膚繊維芽細胞を用いて行った研究 に基づいて、ＩＧＦＢＰは、貯蔵庫として作用し、小量のＩＧＦ−１を連続的に 放出し続け、かくして受容体占有の安定状態を創製し７それは１時的な高濃度の ＩＧＦ−１よりも良好なマイトジェン刺激と思われる。プラムら（Ｂｌｕｍｅｔ 　ａｌ、　）　、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２５：　７６６−７２２（ １９８９）。

しかしながら、最近の総説によると、ＩＧＦＢＰ類の正確な生物活性に関して疑 問が投げかけられている。例えばザップら［Ｚａｐｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｒｏ ｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ：　ＦｒｏｆｆｉＧｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃ１１ｎｉｒａｌ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｋａｒｏｌｊｎｓｋａ　Ｎｏｂｅｌ　Ｃｏｎｆｅ ｒ■獅モ■@５Ｃｒ ｉｅｓ、　ＥｄｓＪｉｃｋｉ　５ａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒ ｅｓｓ　１９９０）、　ｐ、２２７］はＩＧＦ作用に対するＩＧＦ担体タンパク 質の促進作用と同時に阻害作用がインビトロで観察されたことを下記の文献を引 用して述べている。デメローら（ＤｅＭｅｌｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、　）Ｂｉｏｃ ｈｅＩｌｌ、　Ｂｊｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｂ、　Ｃｏｍｅ、　１５６：１９９−２ ０４　（１９８８）：エルギンら（ＥＩＢｉｎ　ｅ■ ａｌ、　）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。８ ４：　３２５４−３２５８　（１９８７）＋　フナウェルお謔■ スミス（Ｋｎａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ）　、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７：　７２５２−７２T６ （１９８０）：メウリら（Ｍｅｕｌｉ　ｅｔ　ａｌ、　）、　Ｄｉａｂｅｔｏｌ ｏｇｉａ、１４：２５５−２５９　（１９７８）；　シビビラー（Ｓｃｈｗｉｗ ｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３：１６９−１７１　（ １９８６）。ザップらは、既知の異なるＩＧＦＢＰ種がＩＧＦの成長促進作用を 阻害または高めることに関し相違するかどうかは不明であると述べている。

同じ本の２４１頁には、バールら（Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　）が、一般に、ｊ ＧＦＢＰｉがＩＧＦＢＰ−３と同様にＩＧＦ−Ｉのアミノ酸取り込みとＤＮＡ合 成促進作用を阻害すると述べている（参考　ワルトンら（Ｗａｌｔｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、　）　、　Ｐ、　Ｓ、　Ｅ、　Ｂ、　Ｍ、　１９０：３１５−３１９　（ １９８９））。

１９８８年の総説記事では、近年のＩＧＦＢＰ類への興味の増大にもかかわらず 、それらの機能はまだ殆んど理解されていないと報告している。バクスター　（ Ｂａｘｔｅｒ、　Ｃｏｍｐ、ＢｉｏｃｈｅｔＰｈｙｓｉｏｌ、９１Ｂ、　２２９ −２３５　（１９８８）、　ｐ、２３２−２３３）　純o クスターはＢＰ類が必ずしもＩＧＦ類の活性を阻害しないこと、およびＢＰ類を 産生する細胞型はオートクリン様式でそれらのＩＧＦへの義務を促進し得ること と関連した幾つかの証拠を指摘している。例として、ヒト血漿由来の高分子量複 合体がインシュリン様活性に関するラット脂肪細胞検定で生物活性を有している こと、培養ヒト繊維芽細胞が細胞のＩＧＦ結合増大作用を持つ３５ｋＤのＢＰを 分泌していること、並びに羊水ＢＰの精製品が、ブタ平滑筋細胞および様々な種 の繊維芽細胞のＤＮＡ合成に対するＩＧＦ−１の刺激作用を有意に促進すること が指摘された。さらに、ＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−Ｉとを１：１の比率で連続投 与すると、ＩＧＦ−１の低血糖作用が阻害されたことが示された。スペーサーら （Ｓｐｅｎｃｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　２ｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ； 　Ｓｙｍｐｏｓｉｕ＋ｓ　ｏｎ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆ ａｃｔｏｒｓ／Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ　Ｊａｎｕａｒｙ　１２−１６．１９ ９１、Ｐｒｏｇｒ≠香@Ａｎ ｄ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｐ、２６９゜その他、ＩＣＦ−１を必要とする細胞の 近くに、局所的に製造されるＩＧＦ−■を濃縮させるために、ＩＧＦＢＰ類はあ らゆる組織で局所的に製造されており、ＢＰ類に結合したＩＧＦ−１と循環系の ＩＧＦ−１の活性な役割を減少しているという見解もある。ルサクソンら（Ｉｓ ａｋｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、 　８：４２６−４３８　（１９８７）。例えば、ＩＧＦ−１はＧＨにより、局所 的に骨内で製造されている［エルシンら（Ｎｉｌｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、 　５ｃｉｅｎｃｅ、２３３：５７１−５７４　（１９８６）］そしてＧＨ受容体 が軟骨細胞に発見された［エルシン（Ｎｉｌｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、Ｊ、 Ｅｎｄｏｃｒ、１２２＋６９−７７　（１９８９）］。

さらに、コノバー［αｔｎｏｖｅｒ、　７２ｎｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎ ｇ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｐｒｏｇ、　Ａｂｓｔｒａ ｃｔ　１８６０ｕｎｅ　１９９０）コは最近の仕事で、インビトロでのＩＧＦＢ Ｐ類のＩＧＦ−１活性の促進における活性がＢＰのみに暴露された細胞に依存す ることを示した。あらかじめ混合しておいたＢＰおよびＩＧＦ−１と一緒にイン キュベートした細胞はＩＧＦ−１になんら応答しなかった。ＢＰのみを細胞とイ ンキュベートし、次いでＩＧＦ−１を加えると、加えたＩＧＦ−１の活性は増大 した。これらのデータはＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ類の同時混合および複合体 （コンプレックス）の同時注入はＩＧＦ−１活性の促進に至らないことを示唆し ている。

本発明は１ＧＦ−１とＩＧＦＢＰとの複合体（コンプレックス）を皮下注射で投 与することにより哺乳類での成長を促進する特異的な方法を提供することを目的 とする。

また本発明は、低血糖の危惧なく、患者に大量のＩＧＦ−Ｉを投与する方法を提 供することを目的とする。

これらおよび他の目的は当業者に明らかであろう。

発明の要約 従って、本発明は哺乳類における同化状態を引き起こす方法を提供するものであ って、当量のＩＧＦ−１を単独で投与した時に比べて、哺乳類内で大きい同化状 態を引き起こすことができるよう、哺乳類に有効量のＩＧＦＢＰ−１とＩＧＦ− １とを、ＩＧＦＢＰのＩＧＦ−［に対するモル比的０．５：１から約３・１で、 ポーラス皮下注射により共−投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）する ことを含む方法を提供するものである（ここに、哺乳類に成長ホルモンを共に投 与することはない）。

好ましくは、ＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ−３である。ＩＧＦｉとＩＧＦＢＰ−３の 共−投与はＩＧＦＩ単独の３倍以上大きい成長応答をもたらした。誰かの理論を 借らずとも、この効果が薬物動力学または半減期事象である、あるいはＩＧＦＢ Ｐ−３が、結合しているにもかかわらず、ＩＧＩ”ｌに同化効果を発揮せしめｔ ：と信じられる。ＴＧＦＢＰはＩＧＦｉの低血糖作用を阻害するが同化作用を阻 害しないので、急性低血糖の恐第１なしにＩＧＦ−Ｉの大量投与ができる。ＩＧ ＦＢＰと結合したＩＧＦ−１の皮下注射が成長期の骨に効果的であり、軟骨プレ ート幅を増大し、全面的な同化作用を有することが分かった。逆にＩＧＦ−Ｉそ れ自身は皮下注射の場合には比較的不活性である。データが、全体重量の増加、 および器官の重量の増加を初め、全哺乳類で普遍的な同化作用を示しているとい う事実は、同化作用が他の状況′、例えば栄養ストレス状況においても観察され るてあろうことを示唆している。

図面の簡単な説明 図１は初期血中グルコース値に対して正常化した、ＩＧＦ−１単独、ＩＧＦ−■ プラスＩＧＦＢＰ−３を第１実験のためのラットに静脈注射した後の、２０分血 中グルコース値を示す。

図２は第２実験における図１と同じ値を示す。

図３は下垂体切除ラットに賦形剤、ＩＧＦ−１，、ＩＧＦ−１プラスＩＧＦＢＰ −３を、記載のｍｇ／ｋｇ／日の用量で７日間、ミニポンプを通して投与した場 合の体重増加に対する効果を示すグラフである。

図４は図３記載と同様に処置された一ト垂体切除ラットにおける賦形剤、ＩＧＦ ｌ、ＩＧＦ−１プラスＩＧＦＢ１”３の様々な器官の重量増加に対する効果を示 すグラフであり、器官の重量は賦形剤処理対照に対する％で示されている。

図５は３つの異なる用量で記載の量のＩＧＦ−Ｉを１日２回皮下注射しで投与し た下垂体切除ラットにおける体重増加に対する効果を示すグラフである。

図６は図５と同様に、賦形剤、ＩＧＦ−Ｉ　（２つの異なる用量で）、ＩＧＦ− ■プラスＩＧＦＢＰ−３を下垂体切除ラット投与し、３日処置した後の体重増加 に対する効果を示すグラフである。

図７は図６と同様に、賦形剤、ＩＣＦ−１（２つの異なる用量で）、ＩＧＦ−■ プラスＮＧＦＢ！”３を下垂体切除ラットに投与した後の脛骨前端ブレートの幅 に対する効果を示すグラフである。

図８は、過去にｈＨＧによる治療を受けたことがない（ＰｒｅｖＲｘＮｏ）が、 治療を受けたことがある（ＰｒｅｖＲｘＹｅｓ）、様々な成長阻害病因を有する 患者の成長速度（ｃｍ／年）を示す棒グラフである。Ｎは記載の用量（ｍｇ／ｋ ｇ）のｈＨＧで治療された患者の数を示す。図８ＡはｈＨＧ治療の最初の年のデ ータ、図８ＢはｈＨＧ治療の２年目のデータを示す。

図９は、１−２．３−５．６−８．９−１１．１２−１４．１５−１７年問およ び１７年以上、記載の用量のｈＨＧで治療された患者の年間（１２力月）成長速 ｔ（ｃｍ、／年）を示す棒グラフである。Ｎは各年令グループの患者数である。

本明細書中、ｒｌＧｌ−ＩＪとは、ＩＧＦＢＰの適当な部位に結合することを条 件として、ウノ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好ましくはヒト等の任意の種由来の 、天然の配列または変異した形の配列の、そして天然、合成、または組換え等の 任意の供給源からのインシュリン様成長因子−■を指す。本発明において動物に 用いるには、処置される個々の動物種から得られたＩＧＦ−１が好ましい。例え ば、ブタを処置するにはブタＩＧＩ−１，ヒツジを処置するにはヒツジＩＧＦ− １，ウシを処置するにはウシＩＧＩ−Ｉ等々である。本発明においてヒトに用い るのに好ましいのは、ヒト天然配列、成熟ＩＧＦ−１，より好ましくはＮ−末端 メチオニンのないもので、例えばＥＰ２３０．８６９　（１９８７年８月５日公 開）、ＥＰ１２８．７３３　（１９８４年１２月１９日公開）、またはＥＰ２８ ８，４５１　（１９８８年１０月２６日公開）に記載されている方法で調製され るものである。より好ましいのは、組換え法で製造され、ジェネンテク（Ｇｅｎ ｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ ）から臨床研究のために入手可能な、組換え的に製造された天然配列ＩＧＦ−１ である。また、カビゲン（ＫａｂｉＧｅｎ　ＡＢ、　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗ ｅｄｅｎ）から入手可能な、胎盤膜を用いるラジオレセプターアッセイによる測 定で約１４．０００．１１位／ｍｇの比活性を有する■ＧＦ−１も好ましい。

最も好ましいＴＧＦ−１変異体はＰＣＴＷＯ８７１０１０３８（１９８７年２月 ２６日公開）およびＰＣＴＷＯ８９１０５８２２（１９８９年１月２９日公開） に記載のものであって、少なくとも、成熟分子のＮ−末端から第３位のグルタミ ン酸残基を欠くか、Ｎ−末端に５アミノ酸までの欠失を有する分子である。最も 好ましい変異体はＮ−末端から最初の３アミノ酸が欠失されているものである（ ｂｒａｉｎｌ　ＧＦ　−Ｌ　ｔ　ＩＧＦ−１，ｄｅｓ−（１−３）ＩＧＦ　−Ｌ ｄｅｓ−１ＧＦ−１等様々な名称が付されている）。

本明細書中、ｒｌＧＦＢＰＪとは上記のごとく、１９８９年６月にカナダのバン ク−バーで開かれたＩＧＦ結合タンパク質に関するワークショップで定義されバ ラードら［（Ｂａｌｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　）　、＾ｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌ、（Ｃｏｐｅｎｈ）、　１２１：　７５１−７５２　（１９８９）］の報 告にあるように、循環系において、他の体液内で、そして培養細胞によって調整 された培地内で、ＩＧＦ−１と結合するタンパク質を指す。この語句にはＩＧＦ ＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５ およびＩＧＦＢＰ−６が含まれ、さらにあらゆる既知のＩＧＦ結合タンパク質に 共通の特性を有する、まだ同定されていない他のものがある。この語句はヒトＩ ＧＦＢＰ類と同様、ウシ、ヒツジ、ブタおよびウマ等の種の動物のヒトＩＧＦＢ Ｐ同等物を包含する。それがＩＧＦ−Ｉの適当な結合ドメインに結合する限り、 天然、合成または組換えによるものであってよい。

本明細書中、ｒＡＬｓＪという語句は上記のＢａｘｔｅｒ（Ｗｏ　９ｆＭＯ５６ ９）に記載のＩＧＦＢｒ’−３とＩＧＦ−Ｉとの１２５−１５０ｋＤ複合体の、 酸に弱い、８４−８６ｋＤの非ＩＧＦ−結合サブユニット、またはその動物同等 物、好ましくはヒトＡ　Ｌ　Ｓを指す。それは天然、合成または組換えのいずれ の供給源であってもよい。

本明細書中、ｒｌＧＦＢＰ−３Ｊ　とｌｔ、上記ナラヒｌ：１．ＷＯ３９１０９ ２６８（１９８９年１０月５日公開）およびウッドら（ｆｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｍｏ１ｅｃｕｒａｌ　Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌｏｇｙ：前掲）に定義されてい る通りであるが、ヒトＩＧＦＢＰ−３と同様、ウシ、ヒツジ、ブタおよびウマ等 の種の動物のヒトＩＧＦＢＰ−３同等物を包含する。

それがＩＧＦ−１の適当な結合ドメインに結合する限り、天然、合成または組換 え等の任意の供給源によるものであってよい。

本明細書中、「哺乳類」とはヒトならびに動物を指す。治療候補としての哺乳類 には、ウシ、ヒツジおよびブタなどの商業上重要な動物が含まれる。本発明に好 ましい哺乳動物はヒトである。

本明細書中、「同化状態をもたらす」という語句は全体重増加を促進すると同時 に、正常な成長曲線、即ち、骨芽細胞によって引き起こされる骨プレー］・の直 線的な製造、によって示される個人の幼少、子供および青年期に経験した身長の 伸びの動力学、ならびに骨の様々な部分から導かれる骨芽細胞の増殖を指す。正 常な成長パターンを回復することにより、患者はより満足のいく成長曲線に近付 く。ＧＨに比１較的抵抗性であるが同化作用の誘導治療が必要な患者の例として 、ターナ−症候群、ＧＨ治療には殆ど応笛しないＧＩ４欠損小児、彼らの成長プ Ｌ−−−１−が閉じる約２．３年前に正常な成長曲線が鈍化または遅くなったと いう経験のあるＰ供、１−れらの子供はＧＨ投与のみではもはや子供の成長を増 大できない、いわゆる正ギな免除フ）低い子供、およびＧＨへのＩＧＦ−１応答 が科学的に遮匪さＡ−１，た廚ち（即ちｒ（ルアコルチーコイド治療６Ｊより） あるいはＧ　Ｈｌ−＊、ｔずろＸ（着パ用応答が自然に減少１７、ている成べの １幣者が含まれる。

さらに、本発明方法（よ異化状態にあり、そして／ブヨｔ−は上置の減、少苓経 験１、°７−いる妊婦、骨粗髭症の女性患者の治療および骨修復に有用である。

本発明を実施するための形聾 本発明方法は、Ｉ　Ｇ　Ｆ　−、−１とＩ　Ｇ　Ｆ　！Ｉ　Ｐとイ、約（）、５ ・１から：３：ｌのモルＬ’ｒ皮下（ＳＣ）ポーラス注射する、二ｉ：：＋：： より共−投Ｊｊすることを色む。治療（５，用いるＩＧＦ−１，、！＝ＩＧＦＢ Ｐとの混合物を製剤化し、個々の患者の臨床状態（ＩＧＦ−１単独使用の場合に 了解されたまたは予測されるあらゆる副作用または減少同化作用は−含め）、是 正すべき特定の成長の阻害または異化状態、用いるべき特定のＩＧＦＢＰ、混合 物を到達させるべき部位、および医師に既知の他の因子、を考慮に入れ良い医療 の実施に適合する方法で投与される。本発明にとって、ＩＧＦｉおよびＩＧＦＢ Ｐの「有効量」とは、２つの薬物が投与前に、ＩＧＦＢＰのＩＧＦ−１に対する モル比にして約０．５：１から約３１の範囲で、あらかじめ混合されることを理 解し、並びに投与された量が治療された叡者内で同じ方法、同じ処方および経路 で、同量のＩＧＦ−Ｉ、ただしＩＧＦＢＰをも投与することはない、を投与した 場合に得られる同化作用以上の同化状態を引き起こすことを理解した上で、考察 し決定される。

ＩＧＦＢＰは１個のＩＧＦＢＰであっても、２またはそれ以上のＩＧＦＢＰの混 合物であってもよい。用いられる好ましいＩＧＦＢＰはＩＧＦＢＰ−３である。

ＩＧＦＢＰ−３はまた、混合物の第３の成分としてＡＬＳを、Ｉ　ＧＦＢＰ−３ に対するＡＬＳのモル比的１＝１で伴っていてもよい。ＡＬＳが存在することで ＩＧＦ−１を血液中に自然に担持する１２５−１５０ｋＤの３成分複合体を形成 することが出来る。

投与はＧＨ１即ち、あらゆる種の成長ホルモンまたは組換えｈ　ｌＩＧのような 成長ホルモ゛／変異体、例えば、米国特許Ｎｏ、４．７５５．４６５（１，９８ ８年７月５日発効）およびゲ・リプルら（Ｇｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　２８２：５４４　（１９７９））に記載の組換えメチオニルｈＨＧ 、お上びＮ−末端メヂオニン苓欠（、ジェネンテク（Ｇ　ｅｎｅ口ｔｅｅｌ＋、 　Ｉｎｃ、　）からＮｕｔｒｏｐｉｎ’の商樟で臨床および研究に従事する研究 者に入手可能なｒ　ｈ　Ｇ　Ｉ−Ｔ、およびイーライ・リリー（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ ｌｙ）から購入可能なｒｈＧＨ等のあらゆる成長ホルモンの不在下で行われる。

一般的な説としで、ｓｃ：投与におけるＩＧＦ−１の用量あたりの総薬剤的有効 量は患者の体ｔあメ：ｌ）、約１μｇ／ｋｇ／日から１００ｗ＋ｇ／ｋｇ／日の 範囲であるが、」二重のごとく、これは大いに治療時の裁量に任せられており、 ＩＧＦ−１単独の場合の低血糖効果の可能性により、ＩＧＦ−１の最大投与量は それを単独で用いる場合よりも少ないであろう。好ましくは、この用量は少なく とも０　、１　ｍｇ／ｋｇ／日であり、さらに好ましくは約１−２０−ｇ／ｋｇ ／日である。最も好ましくは、ＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ複合体またはＩＧＦＢＰ が分解した場合、遊離で残った過剰のＩＧＦ−１が患者にとって決定的でないよ う、それ自身では患者に低血糖を起こさない量とする。

ＳＣ投与におけるＩＧＦＢＰの用量あたりの総薬剤的有効量は一般的に、ＩＧＦ ＢＰとＩＧＦ−１のモル比が約０．５：１から３＝１、好ましくは約０．８１か ら１．５＋１である。もしもモル比が０．５：１以下になるとＩＧＦＢＰによっ て結合されないＩＧＦ−１の過剰が望ましくない低血糖作用を有し得るが、比率 が約３・１より大きくなるとＩＧＦ−１の活性がかなり減少され得る。

適当な用量の選択におけるキー因子は、副作用、特に低血糖、を最適に最小にす る１方で、効果を最大にするという成果である。有効結果は、医師が適当と考え るような、本明細書で定義する、体重の増加、低脂肪量、骨の成長、または正常 な範囲に近い満足いく成長により、あるいは哺乳類の同化状態を測定する他の基 準により、測定される。

ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰの混合物は、ＩＧＦ−１がＢＰと複合体を形成している ので、それ自体ＩＧＦｉの放出制御製剤を構成するが、ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ との混合物を、ｓｃポーラス注射に適合する放出制御製剤を生産することが既知 である他の物質と一緒に投与することも適当である。そのような組成物はリポソ ームにより包囲されたＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰを含む。ＩＧＦ−１およびＩ ＧＦＢＰｔ含有するリポソームは自体既知の方法で製造する、：とができる［Ｄ Ｅ　３．２１８．１２１：エプスタインら（Ｅｐｂｔｅｉｒ＋　ｅｔ　ａｌ、　 ）　、　Ｉ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｅｉ、　１１ｓＡ、、８２：　３ ６８８−３６９２　（１９８５）：ファンら（Ｈｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　 、　ＰｒｏｃA　Ｎａ ｔ１＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１．ｓ＾、　７７：４０３０−４０３４　（１９８ ０）＋ＥＰ　５２．３２２；　ＥＰ　３６．６７６；　ＥＰ@８８．０４６； ＥＰ　１４３．９４９＋　ＥＰ　１４２．６４１；　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｐａｔ 、　Ａｐｐｌｎ、　８３−１１．８００８：　ＵＳＡ　Ｐａ煤A　Ｎｏｓ、　４ ゜ ４８５、０４５および４．５４４．５４５゜ＥＰ　１０２．３２４］　ｃ、通常 、リポゾームは小さい（約２００−８００オングストローム）単層小胞型であり 、脂質含有量はコレステロールが約３９ＩＩｌｏｌパーセント以上であり、ＩＧ Ｆ−１／ＩＧＦＢＰ治療を最適にするよう調節された割合が選択される。

通常、皮下投与のためには、所望の純度のＧＦ−１とＩＧＦＢＰとを一緒に混合 し、さらに製剤的に許容される担体を同時にまたは追加して、１回投与注射剤形 （溶液、懸濁液または乳化剤）とする。製剤的に許容される担体とは、投与され る量および用いる濃度において受容体に無毒であり、製剤の他の成分と適合し得 るものである。例えば、製剤は、酸化剤やその他のポリペプチドに対して分解性 であることが既知の化合物を含有しないことが好ましい。また、混合物はＩＧＦ −１とＩＧＦＢＰとの混合製剤が貯蔵容器内であるいは注射後に分解しないよう 、アプロチニンのようなプロテアーゼインヒビター等の保存剤を含有することが 好ましい。

一般に、製剤はＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰを均一に、そして緊密に液体担体と 混合することで製造することが好ましい。そのような担体ベヒクルの例として、 水、食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。

固定オイル（ｆｉｘｅｄ　ｏｉｌ）やオレイン酸エチル等の非水性ベヒクルも、 リポソームと同様、本発明に有用である。

担体は等強性や化学的安定性を増大する物質等の添加物を少量含有することが適 当である。そのような物質は用いられる用量および濃度で受容者に無毒であり、 以下のものが含まれる。りん酸、クエン酸、コハク酸および酢酸等のバッファー および他の有機酸またはその塩のバッファー（完全長さＩＧＦ−Ｉにはクエン酸 のバッファーが好ましい）：アスコルビン酸のような抗酸化剤：ポリアルギニン やトリペプチド等の低分子量（１０残基以下）ポリペプチド：血清アルブミン、 ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水 性ポリマーニゲリシン、グルタミン酸、アスアラギン酸、またはアルギニン等の アミノ酸：単糖類、三糖類およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マ ンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、 マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような対 イオン、および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧ等の非イ オン性界面活性剤。

典型的には、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰを約０１諺ｇ／＋＋１から１００諺ｇ ／璽１、好ましくは１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ約４５−８においてその ようなベヒクルで注射用に製剤化する。完全長さのＩＧＦＩは通常約ｐ　Ｈ６を 越さないｐＨで安定である。上記の賦形剤、担体、またはある安定剤等の使用で ！ＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ複合体の安定性を促進することが理解されよう。

治療目的に用いられるＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰは無菌でなければならない。

滅菌は滅菌ろ過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通すことで容易に行える。治 療用のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ組成物は通ｎ、滅菌を行っ口を有する単一ま たは複数投与容器、例えば、皮下注射用の剣で突き刺すことができる栓を有する 密封アンプル、バッグ、バイアルに入れて保存する。組成１物は水溶液としであ るいは再構成するための凍結乾燥品として保存される。凍結乾燥製剤の例として 、１０ｓ】バイアルに滅菌濾過したＩＧＦ−１およびＮＧＦＢＰの１％（ｗ／ｖ ）水溶液を入わ、得られた混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した１ＧＦ−１を注 射用滅菌水で再構成することで注射溶液を調製する。

以下の実施例は、本発明の実施にあたり、既知の１つの態様を示すだめのもので あり、本発明はこれらの実施例に限定されると考えられるべきでない。本明細書 に記載のあらゆる学術および特許文献をここに引用する。

実施例Ｉ ＩＧＦＢＰの血中グルコース濃度への効果２つの別々の研究でＩＧＩ”ｌをそれ のみであるいは様々な用量のＩＧＦＢＰ−３と一緒にし、そして共−投与し、た 。基準血液試料と、タンパク質注射後の血液試料を採取した。血中グルコースを 別の血漿で測定した。ＩＧＦ−１はそれ自身から予測される血中グルコースの減 少をもたらした。用量依存性で■ＧＦＢＰ−３はＩＧＦ−１の血中グルコース低 下作用を阻害した。最初の実験で何効と思われた量の１ＧＦＢＮ”−３を用いた 反復実験でこの観察を確認した。

ＩＧＦＢＰ−３それ自身は非活性であった。

２つの別々の実験で雌性矯小ラット（７０−７０日令、１００−１４０ｇ）をケ タミン／キシラジンで麻酔し、血液試料採取のために１力ｓ−，，ｊ、１ノを移 植した。血液の採取は、１２頭のラットから同時に採取できるよう、自動血液採 取装置で行った。３つ（実験１）または２つ（実験２）の基準血液試料各１００ μｍを５分間隔て採取した。次いで、試験物質を類カテーテルを通してポーラス 注射によって投与した。血液試料を注射から４０分間は１０分間隔で、以後１２ ０分までは２０分間隔で採取した。試料を遠心し血漿を保持し、Ｍｏｎａｒｃｈ ２０００血液化学アナライザーでグルコースを分析した。

組換λヒ１−ＩＧＦ−１は、ＥＰ２３０，８６９　（１９８７年８月５日公開） に記載の一般的手法によりＥ、ｃｏｌｉにより産律されるヒ１−ＩＧＦ−Ｉ、ま たはカビゲン（ＫａｂｉＧｅｎ　ＡＢ、　Ｓｔｏｅｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ） から市販品を入手可能な、胎盤膜を用いるラジオレセブターアッ（τイによる測 定で約１４．０００単位／Ｉ１ｇの比活性を有するヒトＩＧＦ−Ｉ、またはジェ ネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｅｂ、　Ｉｎｃ、　５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｅ ｉｓｃｏ、　ＣＡ）から臨床研究のために入手可能なヒトＩＧＦ−Ｉをクエン酸 バッフ　７−中、５＋ｇ／ｍｌで用いた。組換えＩＧＦＢＰ−３はＷＯ３９１０ ９２６８（１９８９年１０月５日公開）およびウッドら（Ｗｃｘｘｌ　ｅｔ　ａ ｌ前掲）、ムックら［Ｍｕｋｋｕ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｉｎ５ｕｌｉｎ（ｉ ｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｌ’ｒｏｔｅｉｎｓ、　 Ｄｒｏｐ@ａｎｄ　Ｈｉｎｔ ｚ　ｅｄｓ、　、　（Ｅｌｓｅｖｊｃｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｊｓｂｅｒ ｓ、　１９８９）コに記載のごとくにして哺乳類細胞で発現させ精製した。

実験Ｉ ＩＧＦ−ＩＧ５０μｇ／ｍｌに希釈しこの溶液０．５ｗ１ｌをラブｔ−（２５μ ｇ／ラット）に与えた。様々な濃度のＩＧＦＢＰ−３をＩＧＦ−１（５０μｇ／ 諒１）とＩＴＪｌインキｓべ　ｈした。ＩＣ；ＦＢＰ−３１１１度が５０．１０ １．及び２００１ｚｇ／ｍｌとなるよう、ＩＧＩ−１２５μｇと一緒に２５．５ ０および１００　ＩｔｇのＩＧＦＢＰ−３を共−投与した。

１）３匹の動物が２５　ｔ−ｔ　ｇのＩＧＦｉを投与さ第１た。

２）３匹の動物が２５μｇのＩＧＩ−１と２５７１ｇのＩＧＦＢＩ−１−３を投 与された。

３）３匹の動物が２５μｇのＩＣＦ−１と５０１１ｇの１ＧＩ４３Ｐ−３を投与 された。

４）３匹の動物が２５μｇのＩＧＦ−１と１００μｇのｉ　Ｇ　Ｆ　Ｂ　Ｐ　− ３を投上記のようにしてＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−３を調製し、投与した。

この実験では、ただ１つの用量でＩＧＦＢＰ−３をＩＧＦ−Ｉ組み合わせ、ＩＧ ＦＢＰ−３を単独で投与した。

６）４匹の動物が２５μｇのＩＧＦ−Ｊを投与された。

７）４匹の動物が５ＧＦｇのＩＧＦＢＰ−３を投与された。

８）４匹の動物が２５μｇのＩＧＦ−１と５ＧＦｇのＩＧＦＢＰ−３を投与実験 １の全結果を図１に示す。データは試験物質の注射５分前の血液試料カベ１００ ％の値になるよう正常化されている。注射前には血中グルコースカ犬安定である ことが分かる。ＩＧＦ−Ｉは血中グルコースの５３±】３％の減少（平均値±Ｓ Ｄ）を惹起した。ＩＧＦＢＰ−３の投与量が増大するにつれ、この応答は階段状 に阻害された。

図２は実験１および２の両方の初期血中グルコースに対して正常化されｔこ２０ 分間血中グルコース値を示す（上記の１群から４群、および６群力）ら８群）。

実験２では、ＩＧＦ−１は２０分て初期値の５８±５％の血中グツ１ノコース減 少をもたらした。これは実験１で誘導されたレベルと変わらなし１゜実験２でｆ ｉｌＧＦＢＰ−３のみが血中グルコースに影響せず（初期値の９９±４％）、２ ０分目では、ＩＣ；ＦＢＰ−３＋ＩＧＦ−１が血中グルコース初期値の９３±５ ％をもたらした。

実施例ｌＩ ２０匹の８５−１０５ｇの下垂体切除ラット（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ）　 、　Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を、成長スターシス（ｓｔａ ｓｆｓＸ　Ｔ　ｇ以内の体重の増加または減少）の達成のために１０日間にわた って４回体重測定した。それらにペレットラブ（ｐｅｌｌｅｔｅｄ　１ａｂ）を 摂取させ、水は任意にとらせた。それらを光と温度を調節した部屋にグループ飼 育（５匹／ケージ）した。次いでその初期体重に基いて無作為に３群に分けた。

ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、２個の浸透圧ミニポンプ（２００１、 デリバリ−速度１μｌ／時／ポンプ）を皮下に配した。毎日ラットを秤量し７日 後に殺し、様々な器官を摘出した。

この実験にはＩＧＦ−１として実施例１で用いたクエン酸バッファー中５＋ｇ／ ｍ１のＩＣＦ−１を用いた。用いたＩＧＦＢＰ−３は実施例ｊに記載のものであ る。

各実験群が以下の通りになるよう、ポンプは賦形剤（クエン酸バッファー）また はＩＧＦ−１、またはｌＧ１−１プラスＩＧＦＢＰ−３を含有していた。

１）賦形剤ポンプ（ｎ＝８） ２）ＩＧＦ−１デリバリ−（０、３ｍｇ／　ｋｇ／日）　（ｎ、＝８）３）ＴＧ Ｆ−１デリバリ−（０、３＋＊ｇ／ｋｇ／日）プラスＩＧＦＢＰ−３デリバリ− （０、９ｍｇ／　ｋｇ／日）　（ｎ＝６）結果 図３は７日間の体重増加を示す。賦形剤−処置下垂体切除ラットは実験器官中、 予測どおりの体重増加の不足を示した。用いた用量（０，３謹ｇ／ｋｇ／日）の ＩＧＦ−１はこの用量の皮下注射投与に予測された体重増加を示した。ＩＣＦ− １をＩＧＦＢＰ−３と１：１のモル比で結合させたデリバリ−ではＩＧＦ−Ｉ誘 導体重増加は有意に減少されなかった。

図４はＩＧＦ−１処置ラツトにおける器官の重さ応答へのＩＧＦＢＰ−３への効 果を示す。胸腺、肺臓、腎臓はすべてＩＧＦ−１処ヲの後、予測された湿重量の 有意な増加を示した。しかしながら、これらの１ＧＦ−Ｉ感受性器官はＩＧＦＢ Ｐ−３の存在下では異なる反応を示した。ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−３とが一緒 にデリバリ−さ４］ると、肺臓は有意に成長したが、胸腺と腎臓は有意な成長応 答を示さなかった。

図３および４の両者で、ダンカンマルチプルｌノンジテスト（Ｄｕｎｃａｎ　Ｍ ｕｌｔｉｐｌｅＲａｎｇｅ　Ｔｅ５ｔ）によるフォローアツプ比較を用い、相違 を統計学的に分析（ＡＮＯＶＡ）した。０．０５以下のｐ値を有意と考えた。す べてのデータは群あたり６−８匹の動物に関する平均値±ＳＤとして表されてい る。アステリクスは賦形剤処置対照に比べて統計学的に有意であることを意味す る。（※ｐ＜０．０５、※※ｐ＜０．０１） 実施例ｌｌｌ ５ｃ注射によるデリバリ− 予試験では、１日２回、３日間（６注射）皮下注射投与されたＩＧＦ−１（実施 例■およびＩＩに記載）はＸＧＦ−１の皮下ミニポンプ注入のはるかに太きＬ％ 効果に比べ、下垂体切除ラットの体重増加に非常に小さい効果しか及ぼさな力＼ つた。図５は３つの異なる用量でＩＧＦ−Ｉを皮下注射した場合の体重増加を示 す。

ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦＢＰ−３皮下注射への効果を試験するための新しい実験 では、２６匹の雌性ラブｈ　（８５−１０５ｇ）　（Ｔａｅｏｎｉｅ、　Ｇｅｒ ｍａｎｔｏｖｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を１紀のごとく体重スタンスを確立する ために１０日間にわたって４回体重測定した。そわらにペレットラブ（ｐｅｌｌ ｅｔｅｄ　ｔａｂ）を摂取させ、水は任意にとらせた。それらを光と温度を調節 した部屋でグループ飼育（５匹／ケージ）した。次いでその初期体重に基づいて 無作為に３群に分けた。う・ソトに０．１および２日の午前８時と午後５時の１ 日２回（合計６注射）　、０．１ｍｌづつ皮下注射した。午前の注射に際して体 重測定を行った。３日目（６回目の注射から約１６時間後）にラットを殺し、様 々な器官を摘出した。ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−３は実施例ＩおよびＩＩで 用いたものであった。実験群は以下の通りである。

１）賦形剤注射 ２）ＩＧＩ−１デリバリ−（０，３ｍｇ／ｋｇ、７日）（１５メｚｇ／日を２回 注射）３）ＩＧＩ−１デリバリ−（０゜９ｍｇ／ｋａ／Ｒ）（４５／／ｇ／Ｄを ２回注射）４）ＩＧＦ−Ｉデリバリ−（０，３礒ｇ／ｋｇ／日）プラス１ＧＦＢ Ｐ−３デリバリ−（０、８ｍｇ／ｋｇ／日）（１日あたり１５１Ｉｇの１ＧＦ− Ｉと４０μｇの頁ＧＦＢＰ−３を２回注射） 結果 賦形剤−処置下垂体切除ラブ（・は実験期間中、わずかな体重増加を示した。

低投与量（０，３＋ｇ／ｋｇ／日）のＩＧＦ−１は体重を増加しなかったが、高 投与量（０，９■ｇ／ｋｇ／日）はわずかな体重増加を示した。驚いたことに、 それ自身では体重増加をもたらさなかった低投与量ＩＧＦ−１が、ＩＧＦＢＰ− ３との結合物のデリバリ−では大きい体重増加を誘導した。図６はこのデータを 示す。統計学的な比較は、ＡＮＯＶＡ、次いでＤｕｎｃａｎの試験により行った 。※奈※は賦形剤及び高および低投与量のＩＧＦ−１に対してｐ＜０．００１、 ※は賦形剤に対してｐ＜０．０５を表す。

殺した時、脛骨を摘出しその周囲の領域をホルマリンで固定化し、脱灰し、長手 方向にそって切片化し、染色し、貴地ブレー１−幅をマイクロメーターを用い光 学顕微鏡で検査した。図７は結果を示す。統計学的な比較は、Ｄｕｎｃａｎｉの 試験に従い、ついでＡＮＯＶＡにより、行った。図７においてシンボルは賦形剤 処理対照に対する統計学的有意性を示す（高投与ＩのＩＧＦ−１に対して、※※ ※はｒ）＜０．００１または＃※はｐ＜Ｑ、０１）。賦形剤処理した、下垂体切 除対照における平均プレート幅は歴史的に得られたデータと一致して２２８ミク ロンであった。低投与量のＩＧＦｉはプレート幅を有意に増加しなか。

たが、高投与量のＩＧＦｉは有意な青酸＃（平均２９１ミクロン）を与えた。

再び、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３との組み合わせは非常に大きい骨成長を４１ えた。

器官の重さ、絶対量および相対量のいずれも、は肝臓、胛臓、胸腺および心臓に 関して不変であった。腎臓の絶対重量は不変であったが、相対腎臓重量は増加し た（ＩＧＦ−ＩプラスＩＧＦＢＰ−３処理ラツトと賦形剤および低投与量ＩＧＦ −１群との比較（ｐ＜０．０５））。

実施例Ｉ−実施例ＩＩＩの結論 ＩＧＦ−Ｉの有意な同化特性は、遊離のＩＧＦ−１が遅い注入によってデリバリ −された場合にのみ認められた。例えば、ＩＧＦ−Ｉの複数注射、１日２回、は 同化応答の誘導に比較的無効である。ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３との皮下注入 による共−投与はＩＧＦ−１の効果を増加しなかった。ＩＧＦ−１の成長促進活 性の強化が観察されたのは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ−３とのポーラス皮下注射 の時のみであった。ＩＧＦＢＰ−３が大量のＩＧＦ−１によって誘導された低血 中グルコースを阻害することが分かる。かくして、ＩＧＦＢＰと結合したポーラ ス皮下注射によるＩＧＦ−１のデリバリ−によって、短期間代謝応答（低血糖） が最小になるので、より広範な治療インデックスを伴い、低い頻度の注射が可能 となる。

ＩＧＦＢＰ−３と結合したＩＧＦ−１はインビボ半減期が長く、この方法による ＩＧＦ−１のデリバリ−は循環血液中ＩＧＦ−１を維持するであろう。かくして ＩＧＦＢＰ類はＩＧＦ−１の皮下注射による大量投与のための、潜在的放出制御 系となるであろう。さらに、血液中で循環しているＩＧＦ−１は同化作用を有し ており、このことは、ＩＧＦ−Ｉのデリバリ−がＩＧＦ−１の同化性を強化する はずであり、それにより、ＩＧＦ−ｉの短期間代謝効果対長期間同化特性の比を 改善することを意味する。ＩＧＦ−１の好ましい投与形はＩＧＦＢＰ−３と分離 したとき、他のＩＧＦＢＰ類と結合せず、完全長さのＩＧＦ−１よりもより活性 であると予測されるｄｅｓｌＧＦ−１である。

実施例ＩＶ 併用治療のための２つの臨床シナリオ 疑い無＜　ＩＧＦＢＰ、好ましくはＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−１の随伴投与の利 点を持つ２つの適切な臨床シナリオ（筋書）を以下に記載する。

１）少なくとも１２力月のＧＨ投与の後、遅い成長を示す患者天然（以前に治療 を受けていない）または以前に治療を受けた患者（ＧＨ投与の中断の後）のいず れも、成長速度の第２年低下を示すことは、小児内分泌学者によく認められてい る。この状況はＧＨ欠損型低身長（例えば、特発性、器官性、中隔−視覚形成異 常（Ｓ−ＯＤ）　、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）等）等の病因とは独立である。図 ８参照。

即ち、成長速度が遅くなっている期間中、ＩＣＦ−１とＩＧＦＢＰにより治療す ることで、この第２年の無応答を補償して年間速度を増大する。

２）最大に効果的なＧＨ投与のための時間が殆ど無い患者患者がＧＨ欠損と診断 された時点で年令が過ぎていた場合、かれらの低身長を訂正するための時間が殆 ど無い。これは図９に示されており、この図は７つの年令グループにおける患者 についての年間成長速度を報告したものである。

例えば、彼らの成長プレートが閉じるまで２−３年しか残っていない年令の大き い患者はかさらに直線的な成長を示すことはありそうもない。これらの患者は彼 らの成長速度を最適にするためにＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−３との併用で治療さ れ得る。

考察とまとめ 本明細書に示した結果はＩ　ＧＦ”−１治療が用いられるあらゆる状況において 、医師および農業者にとって意義深い。ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰとの併用治療の レジンによれば、ＩＧＦ−１単独で治療する場合よりも低用量（少なくとも約９ 倍少ない）ＩＧＦ−Ｉで、ＩＧＦ−１単独の場合と同等の応答を得ることができ る。これはＩＧＦ−１の副作用（即ち、低血糖）を最小にする等の状況で特に重 要である。

■ＩＧＦ−１２０Ｌ１９ 時間（分） 時間（日） ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ 日Ｇ、　６ 年齢層 ＦＩＧ、９ 国際調査報告 −ＩＩｌｅ＋’ｍｍｊｍ１１酊−一−Ｊｌ＆　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１００３４５ 国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類における同化状態を引き起こす方法を提供するものであって、当量の ＩＧＦ−Ｉを単独で投与した時に得られる同化作用よりも大きい同化作用を哺乳 類で引き起こすことができるよう、ＩＧＦＢＰのＩＧＦ−Ｉに対するモル比約０ ．５：１から約３：１で、有効量のＩＧＦＢＰとＩＧＦ−Ｉとを、哺乳類にボー ラス皮下注射によって共−投与することを含む方法（ただし、成長ホルモンをも 哺乳類に投与することはない）。
2. ２．哺乳類か動物である請求項１の方法。
3. ３．ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰがそれぞれ、ウシ、ヒツジまたばブタＩＧＦ− ＩおよびＩＧＦＢＰであり、動物がウシ、ヒツジ、またはブタである請求項２の 方法。
4. ４．哺乳類がヒトである請求項１の方法。
5. ５．ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ−３である請求項１の方法。
6. ６．ＩＧＦ−Ｉがヒト天然配列、成熟ＩＧＦ−Ｉであり、ＩＧＦＢＰがヒトヒト ＩＧＦＢＰ−３である請求項４の方法。
7. ７．ＩＧＦ−Ｉがクエン酸バッファー、ｐＨ６を含有する滅菌した、等張性溶液 中に含有されている請求項６の方法。
8. ８．ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ−Ｉに対するモル比が約０．８：１から１．５：１ である請求項６の方法。
9. ９．混合物がさらにヒトＡＬＳを含んでいる請求項６の方法。
10. １０．ＩＧＦ−Ｉか、ヒト天然配列ＩＧＦ−Ｉの３位グルタミン酸が他のアミノ 酸で置換されているか、欠失しているヒト天然配列ＩＧＦ−Ｉ同族体である請求 項４の方法。
11. １１．ＩＧＦ−Ｉがｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉである請求項１０の方法。
12. １２．ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉが酢酸、ｐＨ３．２−４．５を含有する滅 菌した、等張性溶液中に含有されている請求項１１の方法。
13. １３．ＩＧＦＢＰがヒトＩＧＦＢＰ−３である請求項１０の方法。
14. １４．ＩＧＦ−Ｉの有効量が少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日である請求項１の 方法。
15. １５．ＩＧＦ−Ｉの有効量が１−２０ｍｇ／ｋｇ／日である請求項４の方法。
16. １６．治療されるべきヒトが、過去の成長ホルモン単独による治療で最大年間成 長レベルに達した後、減少したヒトである請求項４の方法。
17. １７．治療されるべきヒトが、そのヒトの成長プレートが閉じる２−３年前の年 令である請求項４の方法。
18. １８．ＩＧＦ−Ｉの有効量が、最大成長応答を与えるＩＧＦ−Ｉ単独の量より少 ない、請求項４の方法。
19. １９．治療されるべきヒトが妊婦である請求項４の方法。