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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, welche
eine Aktivität
als Exendin-Agonisten aufweisen.
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Exendin
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Die
Exendine sind Peptide, welche in dem Gift des Gila-Monsters gefunden
werden, einer in Arizona und Nordmexiko häufigen Eidechse. Exendin-3
[SEQ ID NO: 1] liegt in dem Gift von Heloderma horridum vor, und
Exendin-4 [SEQ ID NO: 2] liegt in dem Gift von Heloderma suspectum
vor (Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259–62, 1990;
Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402–05, 1992). Die Aminosäuresequenz
von Exendin-3 ist in 2 gezeigt. Die Aminosäuresequenz
von Exendin-4 ist in 3 gezeigt. Die
Exendine weisen einige Sequenzähnlichkeit
mit mehreren Mitgliedern der Glucacon-ähnlichen Peptidfamilie auf,
wobei die höchste
Homologie von 53% zu GLP-1 [7-36]NH2 [SEQ
ID. NO: 3] besteht (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650–55, 1993).
GLP-1[7-36]NH2, auch als Proglucagon [78-107]
oder einfach "GLP-1" bekannt, weist einen insulinotrophen
Effekt auf, die Insulinsekretion von β-Zellen des Pankreas stimulierend.
Die Aminosäuresequenz
von GLP-1 ist in 4 gezeigt. GLP-1
inhibiert auch die Glucagonsekretion aus α-Zellen des Pankreas (Ørsov,
et al., Diabetes, 42: 658–61,
1993; D'Alessio,
et al., J. Clin. Invest., 97: 133–38, 1996). Es wird von GLP-1
berichtet, dass es das Entleeren des Magens (Willms B, et al., J.
Clin. Endocrinol. Metab. 81(1): 327–32, 1996; Wettergren A, et
al., Dig Dis Sci 38(4): 665–73,
1993) und die Sekretion von Magensäure inhibiert. Schjoldager
BT, et al., Dig. Dis. Sci. 34(5): 7-03-8, 1989; O'Halloran DJ, et al.,
J. Endocrinol. 126(1): 169–73, 1990;
Wettergren A, et al., Dig. Dis. Sci. 38(4): 665–73, 1993). GLP-1[7-37], welches
einen zu sätzlichen
Glycinrest an seinem Carboxyterminus aufweist, stimuliert auch die
Insulinsekretion bei Menschen (Ørsov, et al., Diabetes, 42:
658–61,
1993). Es wurde ein Transmembran G-Protein-Adenylatcyclase-gekoppelter
Rezeptor aus einer β-Zelllinie
geklont, von dem angenommen wird, dass er für den insulinotrophen Effekt
von GLP-1 verantwortlich ist (Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 8641–45
(1992)).
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Es
wird berichtet, dass Exendin-4 an GLP–Rezeptoren auf Insulin-sekretierenden βTC1-Zellen,
an verteilten azinösen
Zellen des Pankreas von Meerschweinchen und an parietalen Zellen
des Magens wirkt; es wird von dem Peptid auch berichtet, dass es
die Freisetzung von Somatostatin stimuliert und die Freisetzung von
Gastrin in isolierten Mägen
inhibiert (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268: 19650–55, 1993;
Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69: 183–91, 1994; Eissele, et al.,
Life Sci., 55: 629–34,
1994). Es wurde berichtet, dass Exendin-3 und Exendin-4 cAMP-Produktion in und
Amylasefreisetzung aus pankreatischen acinösen Zellen stimuliert (Malhotra,
R., et al., Regulatory Peptides, 41: 149–56, 1992; Raufman, et al.,
J. Biol. Chem. 267: 21432–37,
1992; Singh, et al., Regul. Pept. 53: 47–59, 1994). Basierend auf ihren
insulinotrophen Aktivitäten wurde
die Verwendung von Exendin-3 und Exendin-4 zur Behandlung von Diabetes
mellitus und zur Vorsorge gegen Hyperglykämie vorgeschlagen (Eng,
US-Patent Nr. 5,424,286 ).
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Agenzien,
welche dazu dienen, die Entleerung des Magens zu verzögern, haben
als diagnostische Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen
einen Platz in der Medizin gefunden. Zum Beispiel ist Glucagon ein
Polypeptidhormon, welches von den α-Zellen der Langerhans'schen Inseln des
Pankreas produziert wird. Es ist ein hyperglykämisches Agens, welches Glucose
durch die Aktivierung von Glycogenolyse in der Leber mobilisiert.
Es kann in einem geringeren Ausmaß die Sekretion von Insulin
aus dem Pankreas stimulieren. Glucagon wird bei der Behandlung von
Insulin-induzierter Hypoglykämie
verwendet, z. B., wenn eine Verabreichung von Glucose intravenös nicht
möglich
ist. Da Glucagon die Motilität
des Gastrointestinaltrakts reduziert, wird es jedoch auch als diagnostisches
Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen genutzt.
Glucagon wurde auch in mehreren Studien zur Behandlung verschiedener
schmerzhafter gastrointestinaler Störungen, welche mit Krämpfen assoziiert
sind, verwendet. Daniel, et al. (Br. Med. J., 3: 720, 1974) berichteten
von einem schnelleren Nachlassen von Symptomen akuter Divertikulitis
bei mit Glucagon behandelten Patienten, verglichen mit denen, welche
mit Analgetika oder Antispasmodika behandelt wurden. Ein Übersichtsartikel
von Glauser, et al., (J. Am. Coll. Emergency Physns, 8: 228, 1979)
beschrieb ein Nachlassen von akutem ösophagialen Nahrungsmittelverschluss
nach Glucagontherapie. In einer anderen Studie befreite Glucagon
21 Patienten mit Gallentrakterkrankung deutlich von Schmerzen und
Empfindlichkeit, verglichen mit 22 mit Placebo behandelten Patienten
(M.J. Stower, et al., Br. J. Surg., 69: 591–2, 1982).
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Verfahren
zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Amylin-Agonisten
sind in der internationalen Anmeldung Nr.
WO 95/07098 , veröffentlicht am 16. März 1995,
beschrieben.
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Verfahren
zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Exendin-Agonisten sind
in
US 6,858,576 beschrieben.
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Bestimmte
Exendin-Agonisten sind in
WO
99/25727 und in
WO
99/25728 beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Peptidverbindungen nach Formel (I) [SEQ ID NO:
4] zur Verfügung
gestellt, wobei die Peptidverbindungen eine agonistische Exendin-Aktivität als ein
Agens zeigen, welches gastrische Motilität reguliert und die Entleerung
des Magens verlangsamt, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 17, 18, 19, 22, 24, 31, 32 und 35 aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung
dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung
in der Regulation der gastrointestinalen Motilität, welche mit einer Erkrankung
assoziiert ist, in der eine Steigerung oder eine Abnahme der gastrointestinalen
Motilität
therapeutisch wäre.
Zum Beispiel kann eine Regulation der gastrointestinalen Motilität ein Reduzieren
der gastrischen Motilität
oder ein Verlangsamen der Entleerung des Magens umfassen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
Dosis-abhängige
Effekte von Exendin-4 im Vergleich mit Verbindung 1 von 1 [SEQ
ID NO: 5] auf Plasma-Glucosespiegel
in db/db Mäusen.
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2 zeigt
einen Vergleich von Effekten von Exendin-4, Exendin-4-Säure und
Verbindung 1 von 1 [SEQ ID NO: 5] auf die Entleerung
des Magens.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Peptidverbindungen zur Verfügung gestellt, welche eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 17, 18, 19, 22, 24, 31, 32 und 35 aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner Zusammensetzungen zur Verfügung, welche
diese Verbindungen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser
Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in
der Regulation einer gastrointestinaler Motilität, welche mit einer Erkrankung
assoziiert ist, in der eine Steigerung oder eine Abnahme der gastrointestinalen
Motilität therapeutisch wäre. Zum
Beispiel kann eine Regulation der gastrointestinalen Motilität ein Reduzieren
der gastrischen Motilität
oder ein Verlangsamen der Entleerung des Magens umfassen.
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Die
oben in Bezug genommenen Verbindungen bilden Salze mit verschiedenen
anorganischen und organischen Säuren
und Basen. Solche Salze schließen
Salze ein, welche mit organischen und anorganischen Säuren hergestellt
wurden, z. B. HCl, HBr, H2SO4,
H3PO4, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Methansulfonsäure, Toluensulfonsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure und
Camphersulfonsäure.
Mit Basen hergestellte Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze,
z. B. Natrium- und Kaliumsalze und Erdalkalisalze, z. B. Calcium-
und Magnesiumsalze, ein. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoressigsäuresalze
sind bevorzugt. Die Salze können
durch konventionelle Mittel gebildet werden, wie durch ein zur Reaktion
Bringen der freien Säure-
oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehr Äquivalenten
der geeigneten Base oder Säure
in einem Lösungsmittel
oder einem Medium, in dem das Salz nicht löslich ist, oder in einem Lösungsmittel
wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt
wird, oder durch Austausch der Ionen eines bestehenden Salzes gegen
ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
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Nützlichkeit
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Die
oben beschriebenen Verbindungen sind in Anbetracht ihrer pharmakologischen
Eigenschaften nützlich.
Insbesondere sind die Verbindungen der Erfindung Exendin-Agonisten
und besitzen eine Aktivität
als Agenzien, um gastrische Motilität zu regulieren und eine Entleerung
des Magens zu verlangsamen, wie durch die Fähigkeit erwiesen wird, die
post-prandialen Glucosespiegel in Säugern zu reduzieren.
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Herstellung der Verbindungen
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Standard-Festphasen Peptidsynthese-Techniken
und bevorzugt mit einem automatisierten oder semi-automatisierten
Peptid-Synthesizer hergestellt werden. Typischerweise werden unter
Verwendung solcher Techniken eine α-N-Carbamoyl geschützte Aminosäure und
eine Aminosäure,
welche mit der wachsenden Peptidkette auf einem Harz verbunden ist,
bei Raumtemperatur in einem inerten Lösungsmittel wie Dimethylformamid,
N-Methylpyrrolidinon oder Methylenchlorid in der Anwesenheit von
Kopplungsmitteln wie Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol
in der Anwesenheit einer Base wie Diisopropylethylamin gekoppelt.
Die α-N-Carbamoyl-Schutzgruppe
wird von dem sich ergebenden Peptidharz unter Verwendung eines Reagenzes
wie Trifluoressigsäure oder
Piperidin entfernt, und die Kopplungsreaktion wird mit der nächsten gewünschten
N-geschützten
Aminosäure
wiederholt, welche zu der Peptidkette hinzugefügt werden soll. Geeignete N-Schutzgruppen
sind in der Technik gut bekannt, wobei t-Butyloxycarbonyl (tBoc)
und Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) hierin bevorzugt sind.
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Die
Lösungsmittel,
Aminosäurederivate
und 4-Methylbenzhydryl-Aminharz, welche in dem Peptid-Synthesizer
verwendet werden, können
von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erworben werden. Die
folgenden an den Seitenketten geschützten Aminosäuren können von
Applied Biosystems, Inc. erworben werden: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc),
Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ),
Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu),
Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) kann
von Applied Biosystems, Inc. oder Bachem Inc. (Torrance, CA) erworben
werden. Anisol, Dimethylsulfid, Phenol, Ethandithiol und Thioanisol
können
von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) erhalten werden. Air
Products and Chemicals (Allentown, PA) liefert HF. Ethylether, Essigsäure und
Methanol können
von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) erworben werden.
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Eine
Festphasen-Peptidsynthese kann mit einem automatischen Peptid-Synthesizer
(Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung
des NMP/HOBt (Option 1) Systems und tBoc- oder Fmoc-Chemie mit Capping
durchgeführt
werden (siehe Handbuch von Applied Biosystems für den ABI 430A Peptid-Synthesizer,
Version 1.3B, 1. Juli 1988, Abschnitt 6, Seiten 49–70, Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA). Boc-Peptidharze können mit
HF gespalten werden (–5°C bis 0°C, 1 Stunde).
Das Peptid kann von dem Harz durch Abwechslung von Wasser und Essigsäure extrahiert
werden, und die Filtrate werden lyophilisiert. Die Fmoc-Peptidharze
können
gemäß Standardverfahren
gespalten werden (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems,
Inc., 1990, Seiten 6–12).
Peptide können
auch unter Verwendung eines Advanced Chem Tech Synthesizers (Model
MPS 350, Louisville, Kentucky) zusammengesetzt werden.
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Peptide
können
durch RP-HPLC (präparativ
und analytisch) unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000 Systems
gereinigt werden. Eine C4, C8 oder C18 präparative Säule (10 μ, 2,2 × 25 cm; Vydac, Hesperia, CA)
kann zur Isolation von Peptiden verwendet werden, und Reinheit kann
unter Bestimmung einer C4, C8 oder C18 analytischen Säule bestimmt
werden (5 μ,
0,46 × 25
cm; Vydac). Lösungsmittel
(A = 0,1 TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/CH3CN)
können
der analytischen Säule
bei einer Flussrate von 1,0 ml/min und der präparativen Säule bei 15 ml/min zugeführt werden.
Aminosäureanalysen
können
mit dem Waters Pico Tag System durchgeführt und unter Verwendung des
Maxima Programms prozessiert werden. Peptide können durch Säurehydrolyse
in der Dampfphase (115°C,
20–24
h) hydrolysiert werden. Hydrolysate können mit Standardverfahren
derivatisiert und analysiert werden (Cohen et al., The Pico Tag
Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis,
Seiten 11–52,
Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Eine schnelle Atombombardmentanalyse
(fast atom bombardment analysis) kann mit M-Scan, Incorporated durchgeführt werden (West
Chester, PA). Eine Massenkalibration kann unter Verwendung von Cäsiumio did
oder Cäsiumiodid/Glycerol
durchgeführt
werden. Eine Plasmadesorptionsionisationsanalyse unter Verwendung
eines Nachweises der Flugzeit (time of flight detection) kann mit
einem Applied Biosystems Bio-Ion 20 Massenspektrometer durchgeführt werden.
Elektrospraymassenspektroskopie kann mit einer VG-Trio-Maschine durchgeführt werden.
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In
der Erfindung nützliche
Peptidverbindungen können
auch unter Verwendung von Gentechnik hergestellt werden, unter Verwendung
von nun in der Technik bekannten Methoden. Siehe z. B. Sambrook
et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor.
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Die
oben in Bezug genommenen Verbindungen können Salze mit verschiedenen
anorganischen und organischen Säuren
und Basen bilden. Solche Salze schließen Salze ein, welche mit organischen
und anorganischen Säuren
hergestellt wurden, z. B. HCl, HBr, H2SO4, H3PO4,
Trifluoressigsäure,
Essigsäure,
Ameisensäure,
Methansulfonsäure,
Toluensulfonsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure und
Camphersulfonsäure.
Mit Basen hergestellte Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze,
z. B. Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalisalze, z. B. Calcium-
und Magnesiumsalze, ein. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoressigsäuresalze
sind bevorzugt. Die Salze können
mit konventionellen Mitteln gebildet werden, wie z. B. durch ein
zur Reaktion Bringen der freien Säure- oder Baseformen des Produkts
mit einem oder mehr Äquivalenten
der geeigneten Base oder Säure
in einem Lösungsmittel
oder Medium, in dem das Salz unlöslich
ist, oder in einem Lösungsmittel wie
Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt
wird, oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes
gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
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Formulierung und Verabreichung
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Erfindungsgemäße Verbindungen
sind in Anbetracht ihrer Exendin-artigen Effekte nützlich,
und können
bequemerweise in der Form von Formulierungen zur Verfügung gestellt
werden, die zur parenteralen (einschließlich intravenösen, intramuskulären und
subkutanen) oder nasalen oder oralen Verabreichung geeignet sind.
In einigen Fällen
wird es bequem sein, ein Exendin oder einen Exendin-Agonisten und
ein anderes Agens gegen Entleerung des Magens, so wie Glucagon,
ein Amylin oder einen Amylin-Agonisten,
in einer einzigen Zusammensetzung oder Lösung zur gemeinsamen Verabreichung
zur Verfügung
zu stellen. In anderen Fällen kann
es von größerem Vorteil
sein, ein anderes Agens gegen die Entleerung getrennt von dem Exendin
oder Exendin-Agonisten
zu verabreichen. In noch anderen Fällen kann es von Vorteil sein,
ein Exendin oder einen Exendin-Agonisten entweder gemeinsam formuliert
oder getrennt von anderen Glucosesenkenden Agenzien wie Insulin
zur Verfügung
zu stellen. Ein geeignetes Format zur Verabreichung kann am besten
für jeden
Patienten individuell durch einen medizinischen Praktiker bestimmt
werden. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und ihre Formulierung sind
in Standardwerken zur Formulierung beschrieben, z. B. Remington's Pharmaceutical
Sciences von E.W. Martin. Siehe auch Wang, Y.J. und Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of
Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral
Science and Technology, Technical Report Nr. 10, Supp. 42: 2S (1988).
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In
der Erfindung nützliche
Verbindungen können
als parenterale Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion zur
Verfügung
gestellt werden. Sie können
z. B. in einem inerten Öl
suspendiert werden, geeigneterweise einem Pflanzenöl wie einem
Sesam-, Erdnuss-, Olivenöl
oder anderem akzeptablen Träger.
Bevorzugt sind sie in einem wässrigen
Träger
suspendiert, z. B. in einer isotonischen Pufferlösung bei einem pH von etwa
5,6 bis 7,4. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle Sterilisierungstechniken
sterilisiert werden, oder sie können
sterilfiltriert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen
enthalten, wie sie benötigt
werden, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie den pH-Wert
puffernde Agenzien. Nützliche
Puffer schließen
z. B. Natriumacetat/Essigsäure-Puffer
ein. Eine Form von Vorrats- oder „Depot"-Zusammensetzung
mit langsamer Freisetzung kann verwendet werden, so dass therapeutisch
effektive Mengen der Zusammensetzung über mehrere Stunden oder Tage
nach transdermaler Injektion oder Verabreichung in den Blutstrom
freigesetzt werden.
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Die
erwünschte
Isotonizität
kann unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch akzeptablen
Agenzien, zum Beispiel Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol,
Polyolen (zum Beispiel Mannitol und Sorbitol) oder anderen anorganischen
oder organischen zu lösenden
Substanzen erreicht werden. Natriumchlorid ist besonders für Puffer
bevorzugt, welche Natriumionen enthalten.
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Die
beanspruchten Verbindungen können
auch als pharmazeutisch akzeptable Salze (z. B. Säureadditionssalze)
und/oder Komplexe davon formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable
Salze sind nicht-toxische Salze in der Konzentration, in der sie
verabreicht werden. Die Herstellung solcher Salze kann die pharmakologische
Verwendung erleichtern, indem die physikalisch/chemischen Charakteristika
der Zusammensetzung verändert
werden, ohne dass die Zusammensetzung daran gehindert wird, ihren
physiologischen Effekt auszuüben.
Beispiele von nützlichen Änderungen
bei physikalischen Eigenschaften schließen eine Verringerung des Schmelzpunkts
ein, um eine Verabreichung über
die Mukosa zu erleichtern, und eine Erhöhung der Löslichkeit, um die Verabreichung
von höheren
Konzentrationen des Medikaments zu erleichtern.
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Pharmazeutisch
akzeptable Salze schließen
Säureadditionssalze
ein, zum Beispiel jene, welche Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfamat,
Acetat, Citrat, Lactat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat,
Benzensulfonat, p-Toluensulfonat, Cyclohexylsulfamat und Quimat
enthalten. Pharmazeutisch akzeptab le Salze können von Säuren wie Hydrochlorsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfaminsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzensulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure, und
Chinasäure
ein. Solche Salze können
z. B. hergestellt werden, indem man die freien Säure- oder Baseformen des Produkts
mit einem oder mehreren Äquivalenten
der geeigneten Base oder Säure
in einem Lösungsmittel
oder einem Medium zur Reaktion bringt, in dem das Salz unlöslich ist,
oder in einem Lösungsmittel
wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt
wird, oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes
gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
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Auch
Träger
oder Hilfsstoffe können
verwendet werden, um eine Verabreichung der Verbindung zu erleichtern.
Beispiele von Trägern
oder Hilfsstoffen schließen
Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker so wie Lactose,
Glucose oder Sucrose oder Arten von Stärke, Cellulosederivaten, Gelatine,
Pflanzenölen,
Polyethylenglykolen und physiologisch kompatiblen Lösungsmitteln
ein. Die Zusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen
können über verschiedene
Routen verabreicht werden, einschließlich intravenös, intraperitoneal,
subkutan und intramuskulär,
oral, topisch oder transmukosal.
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Wenn
gewünscht,
können
Lösungen
der obigen Zusammensetzungen mit einem Verdickungsmittel wie Methylcellulose
verdickt werden. Sie können
in Emulsionsform, entweder Wasser-in-Öl
oder Öl-in-Wasser, hergestellt
werden. Jedes einer großen
Vielzahl von pharmazeutisch akzeptablen emulsionsbildenden Agenzien
kann genutzt werden, einschließlich
z. B. Akazienpuder, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie
ein Tween) oder ein ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie
Alkalipolyetheralkoholsulfate oder -sulfonate, z. B. ein Triton).
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In
der Erfindung nützliche
Zusammensetzungen werden hergestellt, indem man die Zutaten nach
allgemein akzeptierten Verfahren mischt. Zum Beispiel können die
ausgewählten
Komponenten einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardvorrichtung
gemischt werden, um eine konzentrierte Mischung zu bilden, welche
dann durch das Hinzufügen
von Wasser oder Verdickungsmittel und eventuell eines Puffers zur
Kontrolle des pH oder eines zusätzlichen
Soluts zur Kontrolle der Tonizität
an die Endkonzentration und -viskosität angepasst werden kann.
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Zur
Verwendung durch den Arzt werden die Verbindungen in Form von Dosiereinheiten
bereitgestellt, welche eine Menge eines Exendin-Agonisten mit oder
ohne ein weiteres Agens gegen das Entleeren enthält. Therapeutisch effektive
Mengen eines Exendin-Agonisten zur Verwendung bei der Kontrolle
der Entleerung des Magens und bei Zuständen, bei denen eine Entleerung
des Magens vorteilhafterweise verlangsamt oder reguliert wird, sind
solche, die die post-prandialen Blutglucosespiegel verringern, bevorzugt
auf nicht mehr als etwa 8 oder 9 mM, oder so, dass die Blutglucosespiegel
so wie gewünscht
reduziert werden. Bei diabetischen oder glucoseintoleranten Individuen
sind Plasmaglucosespiegel höher
als bei normalen Individuen. Bei solchen Individuen kann eine vorteilhafte
Reduktion oder ein „Glätten" von post-prandialen
Blutglucosespiegeln erhalten werden. Wie durch die in dem Gebiet
Tätigen
erkannt werden wird, wird eine effektive Menge an therapeutischem
Agens von vielen Faktoren abhängen,
einschließlich
des Alters und des Gewichts des Patienten, des physischen Zustands
des Patienten, des Blutzuckerspiegels oder des Niveaus der Inhibition
des Entleerens des Magens, welches erhalten werden sollen, und anderer
Faktoren.
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Solche
pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich beim Bewirken von gastrischer
Hypomotilität
bei einem Subjekt und können
auch in anderen Störungen
verwendet werden, bei denen vorteilhafterweise die gastrische Motilität reduziert
wird.
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Die
effektive tägliche
Dosis der Verbindungen gegen das Entleeren wird typischerweise in
dem Bereich von 0,01 oder 0,03 bis etwa 5 mg/Tag liegen, bevorzugt
etwa 0,01 oder 0,5 bis 2 mg/Tag oder mehr bevorzugt etwa 0,01 oder
0,1 bis 1 mg/Tag für
einen Patienten mit 70 kg, verabreicht in einer einzigen Dosis oder in
aufgeteilten Dosen. Die exakte zu verabreichende Dosis wird durch
den betreuenden Kliniker bestimmt und hängt davon ab, wo die besondere
Verbindung in dem oben genannten Bereich liegt, genau wie von dem
Alter, Gewicht und Zustand des Individuums. Die Verabreichung sollte
bei dem ersten Zeichen von Symptomen oder kurz nach einer Diagnose
von Diabetes mellitus beginnen. Eine Verabreichung kann durch Injektion,
bevorzugt subkutan oder intramuskulär, durchgeführt werden. Oral aktive Verbindungen
können
oral gegeben werden, die Dosierung sollte jedoch 5- bis 10-fach
erhöht
werden.
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Allgemein
können
bei der Behandlung oder der Vorbeugung von erhöhten, unangemessenen oder unerwünschten
post-prandialen Blutglucosespiegeln die erfindungsgemäßen Verbindungen
Patienten mit Bedarf für
eine solche Behandlung in Dosisbereichen ähnlich den oben angegebenen
verabreicht werden, die Verbindungen werden jedoch häufiger verabreicht,
z. B. einmal, zweimal oder dreimal am Tag.
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Die
optimale Formulierung und Art der Verabreichung der Verbindungen
der vorliegenden Anmeldung an einen Patienten hängt von in der Technik bekannten
Faktoren wie der bestimmten Erkrankung oder der Störung, dem
gewünschten
Effekt und der Art des Patienten ab. Während die Verbindungen typischerweise
verwendet werden, um menschliche Patienten zu behandelt, können sie
auch verwendet werden, um ähnliche oder
identische Erkrankungen bei anderen Vertebraten, so wie anderen
Primaten, Bauernhoftieren wie Schweinen, Rindern und Geflügel und
Sporttieren und Haustieren wie Pferden, Hunden oder Katzen, zu behandeln.
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Um
das Verständnis
der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, sind die folgenden Beispiele
angefügt, welche
die Ergebnisse einer Folge von Experimenten beschreiben.
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BEISPIEL 1
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Herstellung eines amidierten Peptids mit
SEQ ID NO: [5]
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Das
oben identifizierte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt. Im Allgemeinen wurden bei der
Synthese durchgängig
Zyklen mit einzelnem Koppeln verwendet, und Fast Moc (HBTU-Aktivierung)-Chemie
wurde genutzt. An einigen Positionen war die Kopplung jedoch weniger
effizient als erwartet, und doppelte Kopplungen wurden benötigt. Insbesondere
bedurften die Reste Asp9, Thr7 und
Phe6 alle einer doppelten Kopplung. Das
Entschützen
(Entfernen der Fmoc-Gruppe) der wachsenden Peptidkette unter Verwendung
von Piperidin war nicht immer effizient. Eine doppelte Entschützung wurde
an Positionen Arg20, Val19 und
Leu14 benötigt. Endgültiges Entschützen des
fertiggestellten Peptidharzes wurde unter Verwendung einer Mischung
von Triethylsilan (0,2 ml), Ethandithiol (0,2 ml), Anisol (0,2 ml),
Wasser (0,2 ml) und Trifluoressigsäure (15 ml) gemäß Standardverfahren
(Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.)
erreicht. Das Peptid wurde in Ether/Wasser (50 ml) präzipitiert
und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in Eisessig rekonstituiert
und lyophilisiert. Das lyophilisierte Peptid wurde in Wasser gelöst. Die
Reinheit des Rohstoffs war etwa 55%.
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Bei
Reinigungsschritten und Analyse wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in
Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet.
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Die
Peptid enthaltende Lösung
wurde auf eine präparative
C-18-Säule
aufgetragen und gereinigt (10% bis 40% Lösungs mittel B in Lösungsmittel
A über
40 Minuten). Die Reinheit der Fraktionen wurde isokratisch unter
Verwendung einer analytischen C-18 Säule bestimmt. Reine Fraktionen
wurden vereinigt, was das oben identifizierte Peptid lieferte. Eine
analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt
mit einer beobachteten Retentionszeit von 14,5 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4131,7; gefunden 4129,3.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[6]
-
Das
oben genannte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse wurden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
25% bis 75% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt
mit einer beobachteten Retentionszeit von 21,5 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4168,6; gefunden 4171,2.
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BEISPIEL 3
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[7]
-
Das
oben identifizierte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse wurden Lösungs mittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt
mit einer beobachteten Retentionszeit von 17,9 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4147,6; gefunden 4150,2.
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BEISPIEL 4
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[17]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4145.6.
-
BEISPIEL 5
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[18]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4184.6.
-
BEISPIEL 6
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[19]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4145.6.
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BEISPIEL 7
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Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[22]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4115.5.
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BEISPIEL 8
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[24]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4131.6.
-
BEISPIEL 9
-
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[31]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Zusätzliche
doppelte Kopplungen werden an den Thioprolinpositionen 38, 37, 36
und 31 benötigt.
Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4209.8.
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BEISPIEL 10
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Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[32]
-
Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Zusätzliche
doppelte Kopplungen werden an den Homoprolinpositionen 38, 37, 36
und 31 benötigt.
Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 4193.7.
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BEISPIEL 11
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Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO:
[35]
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Das
oben identifizierte Peptid wird auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin
MBHA-Harz (Novabiochem,
0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied
Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie
in Beispiel 1 aufgereinigt. Zusätzliche
doppelte Kopplungen werden an den N-Methylanilinpositionen 38, 37,
36 und 31 benötigt.
Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B
(0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient
30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids wird dann durchgeführt, um
die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
(M): berechnet 3801.1.
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BEISPIEL 7
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Herstellung des C-terminalen Carbonsäurepeptids
entsprechend den obigen C-terminalen Amidsequenzenen
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Die
obigen Peptide der Beispiele 1 bis 35 werden auf dem sogenannten
Wang-Harz (p-Alkoxybenzylalacoholharz (Bachem, 0,54 mmol/g)) unter
Verwendung von mit Fmoc geschützten
Aminosäuren
(Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten,
entschützt
und auf eine ähnliche
Art wie in Beispiel 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel
A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel
B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Dann wird eine analytische RP-HPLC
(Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel
B in Lösungsmittel
A über
30 Minuten) des lyophilisierten Peptids durchgeführt, um die Retentionszeit
des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie
stellt eine experimentell bestimmte (M) zur Verfügung.
-
BEISPIELE A BIS D Verwendete
Reagenzien
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GLP-1
wurde von Bachem (Torrance, CA) erworben, alle anderen Peptide wurden
im Hause unter Verwendung von Synthesemethoden wie den hierin beschriebenen
hergestellt. Alle Chemikalien waren vom höchsten kommerziellen Grad.
Der cAMP SPA Immunoassay wurde von Amersham erworben. Die Radioliganden
wurden von New England Nuclear (Boston, MA) erworben. RINm5f-Zellen
(American Type Tissue Collection, Rockville, MD) wurden in DME/F12-Medium, welches 10%
fötales
bovines Serum und 2 mM L-Glutamin enthielt, wachsen gelassen. Die
Zellen wurden bei 37°C
und 5 CO2/95% befeuchteter Luft wachsen
gelassen, und Medium wurde alle 2 bis 3 Tage ersetzt. Die Zellen
wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, dann geerntet und unter
Verwendung eines Polytron-Homogenisierers homogenisiert. Zellhomogenate
wurden bis zur Verwendung gefroren bei –70°C gelagert.
-
Beispiel A
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GLP-1-Rezeptorbindungsstudien
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Die
Rezeptorbindung wurde durch Messung der Verdrängung von [125I]
humanen GLP-1 (7-36) oder [125I] Exendin
(9-39) von RINm5f Membranen beurteilt. Der Testpuffer enthielt 5 μg/ml Bestatin,
1 μg/ml
Phosphoramidon, 1 mg/ml bovines Serumalbumin (Fraktion V), 1 mg/ml
Bacitracin und 1 mM MgCl2 in 20 mM HEPES,
pH 7,4. Um die Bindung zu messen, wurden 30 μg Membranprotein (Bradford Protein
assay) in 200 μl Testpuffer
resuspendiert und mit 60 pM [125I] humanem
GLP-1 oder Exendin (9-39) und unmarkierten Peptiden für 120 Minuten
bei 23°C
in 96 Well-Platten (Nagle Nunc, Rochester, NY) inkubiert. Die Inkubationen
wurden durch schnelle Filtration mit kalter, mit Phosphat gepufferter
Salzlösung,
pH 7,4, durch mit Polyethylenimin behandelte GF/B-Glasfiberfilter (Wallac
Inc., Gaithersburg, MD) unter Verwendung eines Tomtec Mach II Plattenerntegeräts (Wallac
Inc., Gaithersburg, MD) beendet. Die Filter wurden getrocknet, mit
Szintillationsflüssigkeit kombiniert
und die Radioaktivität
in einem Betaplate flüssigen
Szintillationszähler
(Wallac Inc.) bestimmt.
-
Peptidproben
wurden in dem Test als duplikate Punkte bei 6 Verdünnungen über einen
Konzentrationsbereich von 10–6 M bis 10–12 M
laufen gelassen, um Antwortkurven zu bestimmen. Die biologische
Aktivität einer
Probe wird als ein IC50-Wert angegeben,
berechnet aus den Rohdaten unter Verwendung eines iterativen Kurvenanpassungsprogramms
unter Verwendung einer logischen Gleichung mit 4 Parametern (Prism,
GraphPAD Software).
-
BEISPIEL B Cyclase-Aktivierungsstudie
-
Der
Testpuffer enthielt 10 μM
GTP, 0,75 mM ATP, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM Phosphocreatin,
12,5 U/ml Creatinkinase, 0,4 mg/ml Aprotinin, 1 μM IBMX in 50 mM HEPES, pH 7,4.
Membranen und Peptide wurden in 100 ml Testpuffer in 96 Well-Platten
mit Filterunterseite (Millipore Corp., Bedford, MA) zusammengegeben. Nach
20 Minuten der Inkubation bei 37°C
wurde der Test durch Transfer des Überstands durch Filtration
in eine frische 96 Well-Platte unter Verwendung eines Millipore
Vakuum-Mehrfachverteilers
beendet. Der Gehalt an cAMP in den Überständen wurde durch einen SPA-Immunassay
quantifiziert.
-
Peptidproben
wurden in dem Test als triplikate Punkte bei 7 Verdünnungen über einen
Konzentrationsbereich von 10
–6 M bis 10
–12 M
gemessen, um Antwortkurven herzustellen. Die biologische Aktivität einer
bestimmten Probe wurde als ein EC
50-Wert
angegeben, wie oben beschrieben berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle
I tabelliert. TABELLE
I Aktivität in dem
RINm5f Cyclase-Test
| | EC50 |
Exendin-4 | [SEQ
ID NO: 2] | 0,23 |
Verbindung
1 | [SEQ
ID NO: 5] | 0,17 |
Verbindung
2 | [SEQ
ID NO: 6] | 0,23 |
Verbindung
3 | [SEQ
ID NO: 7] | 0,42 |
-
Beispiel C
-
Bestimmung des Blutglucosespiegels in
db/db Mäusen – 1 Stundenprotokoll
-
C57BL/6J-m=/=Leprdb-Mäuse
mit mindestens 3 Monaten Alter wurden für die Studie verwendet. Die Mäuse wurden
von dem Jackson Laboratory erhalten und durften sich für mindestens
1 Woche in dem Vivarium aklimatisieren. Die Mäuse wurden in Gruppen von 10
bei 22° ± 1°C bei einem
12:12 Hell:Dunkelzyklus beherbergt, wobei die Lichter um 6:00 Uhr
morgens angingen.
-
Allen
Tieren wurden 2 Stunden vor der Entnahme von Blutproben für die Basislinie
das Essen weggenommen. Etwa 100 μl
Blut wurden von jeder Maus über
Einstich ins Auge nach leichter Anästhesie mit Methophan entnommen.
Nach der Entnahme der Blutproben für die Basislinie zur Messung
von Plasmaglucosekonzen trationen erhielten alle Tiere eine subkutane
Injektionen entweder von Träger,
von Exendin-4 oder von Testverbindung in den angegebenen Konzentrationen.
Nach genau 1 Stunde nach den Injektionen wurden unter Verwendung
der gleichen Prozedur wieder Blutproben entnommen, und Plasmaglucosekonzentrationen
wurden gemessen.
-
Bei
jedem Tier wurde die prozentuale Veränderung in dem Plasmawert gegenüber dem
Basislinien-Wert berechnet und eine Dosis-abhängige Beziehung wurde unter
Verwendung von Graphpad PrizmTM Software
evaluiert.
-
5 zeigt die Effekte der Variation der
Dosis von Exendin-4 und Verbindung 1 von 1 [SEQ ID NO:
5] auf die Plasmaglucosespiegel.
-
Beispiel D
-
Die
folgende Studie wurde ausgeführt,
um die Effekte von Exendin-4, Exendin-4-Säure und eines Exendin-Agonisten
(Verbindung 1 von 1 [SEQ ID NO: 5]) auf die Entleerung
des Magens bei Ratten zu untersuchen. Dieses Experiment folgte einer
Modifikation des Verfahrens von Scarpignato, et al., Arch. Int. Pharmacodyn.
Ther. 246: 286–94
(1980).
-
Es
wurden männliche
Harlan Sprague Dawley (HSD) Ratten verwendet. Alle Tiere wurden
bei 22,7 ± 0,8°C in einem
12:12 Stunden Hell:Dunkelzyklus beherbergt (wobei Experimente während des
hellen Zyklus durchgeführt
wurden), und wurden ad libitum gefüttert und mit Wasser versorgt
(Diät LM-485,
Teklad, Madison, WI). Exendin-4 und Exendin-4-Säure wurden nach Standardpeptidsyntheseverfahren
synthetisiert. Die Herstellung von Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] ist
in Beispiel 1 beschrieben.
-
Die
Bestimmung des Entleerens des Magens durch das unten beschriebene
Verfahren wurde nach einem Fasten von –20 Stunden durchgeführt, um
sicherzustellen, dass der Magen keinen Speise brei enthalten würde, der
mit spektrophotometrischen Absorptionsmessungen Wechselwirken könnte.
-
Ratten
bei Bewusstsein erhielten über
eine Magensonde 1,5 ml eines akalorischen Gels, welches 1,5% Methylcellulose
(M-0262, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) und 0,05 Phenolrot-Indikator
enthielt. 20 Minuten nach der Magensondierung wurden die Ratten
unter Verwendung von 5% Halothan anästhesiert, der Magen freigelegt
und unter Verwendung von Arterienzangen an den pylorischen und unteren
Speiseröhrenschließmuskeln
verschlossen, entfernt und in eine alkalische Lösung geöffnet, welche auf ein festes
Volumen eingestellt wurde. Der Mageninhalt ergab sich aus der Intensität des Phenolrots
in der alkalischen Lösung, gemessen
durch Absorption bei einer Wellenlänge von 560 nm. Bei getrennten
Experimenten bei 7 Ratten wurden der Magen und der Dünndarm beide
ausgeschnitten und in eine alkalische Lösung geöffnet. Die Menge an Phenolrot,
welches aus dem oberen Gastrointestinaltrakt innerhalb von 20 Minuten
nach Sondierung wiedergewonnen werden konnte, war 89 ± 4%; Farbstoff,
welcher unwiderruflich an die luminale Oberfläche des Eingeweides zu binden
schien, könnte
den Rest ausgemacht haben. Um eine maximale Wiedergewinnung von weniger
als 100% Farbstoff zu berücksichtigen,
wurde der Prozentsatz von Mageninhalt, der nach 20 Minuten verblieb,
als ein Anteil des Mageninhalts ausgedrückt, der von Kontrollratten
wiedergewonnen wurde, die in dem gleichen Experiment direkt nach
der Sondierung geopfert wurden. Prozent Restmageninhalt = (Absorption
nach 20 min)/(Absorption bei 0 min) × 100.
-
In
Studien zur Basislinie ohne medikamentöse Behandlung wurde die Entleerung
des Magens über
20 Minuten bestimmt. In Dosisantwortstudien wurden Ratten mit 0,01,
0,1, 0,3, 1, 10 und 100 μg
Exendin-4, 0,01, 0,03, 0,1, 1, 10 und 100 μg Exendin-4-Säure
und 0,1, 0,3, 1, 10 und 100 μg
Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] behandelt.
-
Die
Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die
in 6 und Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse
zeigen, dass die Exendin-Agonisten
Exendin-4-Säure
und Verbindung 1 starke Inhibitoren des Entleerens des Magens sind. Der
E50 von Exendin-4 war 0,27 μg. Die EC50s von Exendin-4-Säure und von Verbindung 1 waren
vergleichbar (jeweils 0,12 μg
und 0,29 μg).
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TABELLE
II
Verbindung | EC50 (μg) |
Exendin-4 | 0,27 |
Exendin-4-Säure | 0,12 |
Verbindung
1 | 0,29 |
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