HU228934B1 - Eljárás inzulinvegyületek elõállítására - Google Patents
Eljárás inzulinvegyületek elõállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU228934B1 HU228934B1 HU0500037A HUP0500037A HU228934B1 HU 228934 B1 HU228934 B1 HU 228934B1 HU 0500037 A HU0500037 A HU 0500037A HU P0500037 A HUP0500037 A HU P0500037A HU 228934 B1 HU228934 B1 HU 228934B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- insulin
- compound
- process according
- peptide
- reaction
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 157
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 71
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 71
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 56
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 49
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 41
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 34
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 33
- -1 insulin compound Chemical class 0.000 claims description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 31
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 28
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 26
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 11
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 claims description 10
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 claims description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 claims description 6
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 claims description 3
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 101710180319 Protease 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 61
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 61
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 29
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 14
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 14
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 10
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 6
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- JNTDLWHHJMGLGD-UHNVWZDZSA-N ethyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O JNTDLWHHJMGLGD-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010065691 Biphasic Insulins Proteins 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100074216 Drosophila melanogaster Lasp gene Proteins 0.000 description 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 240000000233 Melia azedarach Species 0.000 description 1
- 101100109158 Mus musculus Asprv1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHYCRLGKOZWVEF-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hydrate Chemical compound O.CCOC(C)=O MHYCRLGKOZWVEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 description 1
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
eljárás inzulinvegyületek előállítására
A találmány tárgyát inzulin prekurzorok inzulinná alakításának. javított • eljárása képezi, szabadon megválaszthatóan inzulin-észteren keresztül,
Az inzulint a hasnyálmirigy termeli, ez a hormon a. véreukorszint szabályozásában játszik szerepet. Például humán, sertés és borjú inzulint, inzulin analógokat és kevert inzulinokat adnak be inzulinfüggő diabetes mellhús betegekbe, ezzel szabályozva vércukor koncentrációjukat.
A sertés és a borjú inzulinokat általában a hasnyálmirigyből állítják elő, A humán inzulin előállítható félig szintetikus módon sertés inzulinból. Alternatívaként a humán inzulin, valamint számos inzulin analóg génsebészet! eljárásokká! is állítható. Génsebészeti eljárásokkal, amelyek például végrehajthatók baktériumokban vagy élesztőkben, inzulin ' prekurzor állítható elő, melyet ezek után a kívánt termékké alakíthatunk. Ezt az átalakítást különböző módón valósíthatjuk meg.
Az egyik lehetőség az úgynevezett transzpeptidálás, ahol a peptidhasílás és a peptídkapcsolás egymás után történik azonos reakcíóelegybem azonos kísérleti körülmények között [Novo
4,343,888 számú Amerikai Egyesült Államok-bel dalmí bejelentési.
Egy másik lehetőség az első lépésben az inzulin prekurzor hasítása [Hoppe-Seyleris 2. Physíoi. Chem., 359., 799 (1978)] majd ezek után a közti termék izolálása, és a kívánt kapcsolás végrehajtása egy második reakciőelegyben, ami más mint az első lépésben használt (Natúré, 280, 412(1979)(.
A szakirodalomban leírtak szerint (EP 87,238 számú szabadalmi bejelentés^ a transzpeptídálási reakciót oldószeres rendszerben hajtjuk végre, mely előnyösen körülbelül 75-97 térfo·· gat%-ban legalább egy, vizes reakciőelegyben nem keveredő oldószert tartalmaz, beleértve legalább körülbelül bután-1,4-01(
A szakirodalomban leírtak szerint (4,579,820 számú Amerikai .Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés], a. transzpepdidálásí folyamatot L-specifikus szerín karboxipeptidáz enzim felhasználásával végzik, például karboxipeptidáz Y-nal.
A szakirodalomban leírtak szerint (Nordisk Insulmlaboratörium: 4,601,979 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés] a transzpeptidálást vagy csak a peptidkapcsolást vizes reakciőelegyben végzik, mely lényegében mentes szabad oldószerektől.
A szakirodalomban leírtak szerint (Nordisk ínsuJinlaborato·· Fiúm: WO 83/00504 számú szabadalmi bejelentés] a sertés terméket karboxipeptidáz A-val kezelik, az eredményül kapott dezala.nin-.B30 inzulin terméket alacsonyabb rendű alkoholban szuszpendálják, és ezt a szuszpenziöt L-treonm-észter és tripszin oldattal összekeverik. Az összes specifikus példában a dezalanin-B30 inzulin terméket izolálták, akár fagyasztva szárítással, akár kicsapássat
A találmány tárgya az eddigi nehézségek legalább egy részének legyőzése vagy mérséklése. így ezzel az összes nem. említett problémák teljes mértékben legyőzhetek vagy mérsékelheAhogy azt itt. hasz;
k, az aminosav arra az aminosavra vonatkozik, melyet nukleotid szekvencia kódolhat. Analóg, módon ez a szakkifejezés azokra az amínosavakra is vonatkozik, melyek karboxícsoportjárol a hidroxi részt és/vagy az aminocsoportról a hidrogént eltávolították.
Hasonlóképp, a peptídek és a pepüdmaradékok aniinosavakból épülnek fék Előnyösen, a pepiid több mini lö aminosavAhogy azt itt használjuk, az aminosavamid szakkifejezés olyan aminosav vegyületre vonatkozik, melynek C-terminálís végén szabadon megválaszthatőan karboxiamid csoportot alakítottak ki..
.Ahogy azt itt használjuk, a peptidamíd szakkifejezés olyan pepiidre vonatkozik, mely C terminális végén szabadon megválaszthatóan karboxamid csoportot alakítottak ki.
Ahogy azt ítt használjuk, az inzulin prekurzor szakkifejezés azokra a polipeptidekre vonatkozik, melyek két peptídláncbö! állnak, (ez megfelel az inzulin A és B láncának, és amit a továbbiakban. A és B láncnak nevezünk) melyek az inzulinnal azonosságot mutatnak, és amelyek egymáshoz két díszulfidhidon keresztül kapcsolódnak (az egyik ciszteín (Cys) egy másikhoz), ami a két peptidlánc között található, és amelyben a másik ciszteín az A láncon az A láncon lévő císzleinhez kapcsolódik. Ebben az inzulin prekurzorban a B láncon legalább egy lizin vagy argínin található. Szabadon megválaszthatőan ebben az inzulin prekurzorban az A és a B láncok egymással egy harmadik peptídláneon keresztül kapcsolódhatnak (ez megfelel, az inzulin kapcsoló peplidjenek) a. B lánc C terminálisa és az A lánc N terminálisa között. Ebben az esetben az A és a B láncok $
«Φ* egymással egy harmadik peptídláneon keresztül kapcsolódnak,, amikor is a harmadik peptid C terminálisán lizin található. Szabadon megválaszthatóan ennél az inzulin prekurzornál egy negyedik peptidláne kapcsolódhat a B lánc N terminálisához. A negyedik peptidláne ekkor a B lánc N-terminálisán keresztül kapcsolódik, amikor is· a negyedik lánc ^-terminálisán lizin található.
Továbbá ez az inzulin prekurzor aminosav összetételében a humán inzulinhoz képest legalább 80 %-bart azonos, előnyösen legalább 85 %-ban, még előnyösebben legalább 90 %-ban, és legelőnyösebben legalább 95 %-ban, azzal a. feltétellel, hogy a harmadik és a. negyedik peptidláncot ebben a számolásban nem. vesszők hgyelembe. A humán inzulinban, ahol a diszulfidbidak a CysA6 és CysAn között, a CysA7 és CysB7 között és a CysA2° és CysB19 között találhatok, a lizin a B29 helyzetben van.
Ahogy azt itt használjuk, az aminosavészter olyan amino.savra vonatkozik, mely C terminálisán karboxi-védőcsoportot hordoz, szabadon megválaszthatóan, hidroxí védőcsoportot.
Ahogy azt itt használjuk, a peptídészter olyan pepiidre vonatkozik, mely legalább C terminálisán karboxi-védőcsoportot hordoz, Szabadon raegwálaszthatóan bármelyik hidroxiesoport védhető, és szabadon megválaszthatóan bármelyik lizin s-ammocsoportjával származékot alakíthatunk ki, ez előnyösen hidrofób csoporttal történhet, például ilyen az aeilcsoport, mely legalább lö szénatomos. .Előnyősén a peptidészter nem több mint 10 aminosavból áll.
Ahogy azt itt használjuk, a nukleofil vegyület” szakkifejezés az aminosavészterre, aminosavamidra, pepiidre, peptidészterre és peptidamidra vonatkozik. Bármelyik ilyen amínosavészterben, •amínosavamidban, pepiidben, peptidészterben és peptídamidhan bármelyik liancsoportból. szabadon megválaszthatván származékot alakíthatunk ki, előnyösen például hidrofób csoporttal, például ilyen a legalább 10 szénatomos acilcsoporttal kialakított
Ahogy azt itt használjuk, az inzulin vegyület* szakkifejezés azokra az inzulinokra vonatkozik, melyek a következő források, bármelyikéből származhatnak: sertés inzulin, borjú inzulin, és humán inzulin- és ezek sói, mint például cinksók. és protamínsdk, Továbbá, ahogy azt itt használjuk, az inzulin vegyület szakkifejezés felölelheti az itt inzulin analógoknak'1 nevezett vegyületeket is. Ahogy azt itt használjuk, az inzulin analógok szakkifejezés azokra az inzulin vegyületekre vonatkozik, melyekben egy vagy több amínosavat másikra cserélnek, és/vagy azokra, melyekből egy vagy több amínosavat elvesznek, és/vagy amelyekhez egy vagy több amínosavat hozzáadnak, azzal a feltétellel, hogy a szóban forgó inzulin analóg kellő inzulin aktivitással rendelkezik. Az Inzulin analógok példáit a szakirodalomban leírták (5,618,913 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés; EP 264,516 számú szabadalmi bejelentés; EP 280,534 számú szabadalmi bejelentés; 5.750,407 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés; és 6,011,007 számú Amerikai ésL A mzi következők: inzulin aspart (azaz [Asp^sj humán inzulin), inzulin iispro (azaz (LysB2S,ProS29( humán inzulin), és inzulin glargin
A21 rB31 yB32l humán
Ahogy azt itt használjuk, az inzulin analóg” szakkifejezés azokat az analógokat is felöleli, melyeket inzulinszármazéknak nevezhetünk,
9 φ*.
azaz azokat a vegyületeket, melyeket a szakirodalomban jártas szakemberek általánosan inzulin származéknak tekintenek, vagy tankönyvekben így írtak le, például olyan inzulin szübsztitnenssel, mely a kiindulási inzulin molekulában nincs jelen. Az inzulin származékok példái azok az inzulinok, vagy inzulin analógok, melyek szabadon megválaszthatóan karboxamid-csoporttal szuhsztituáltak. Ide tartoznak azok a vegyületek is, melyeket mind az inzulin származékok, mind az inzulin analógok közé sorolnak, így ezeket is felöleli az inzulin analóg szakkifejezés. Az ilyen vegyületek példáit a. szakirodalomban leírták (5,750,497 és 6,011,007 számú Amerikai Egyesült.Államok-beli szabadalmi bejelentések}. A specifikus inzulin analógok további példái az inzulin detemir (azaz. dez-ThrB30 humán inzulin y LysB23 tetradekanoilk A találmány szerint előállított inzulin vegyületek antídiabetikus aktivitása kellően magas ahhoz, hogy a cukorbetegeknél használhatók .legyenek. Az anti-diabetíkus” aktivitás úgynevezett zsírsejt vizsgálattal határozható meg.
Ahogy azt itt használjuk, a pH-érték a pH mérővel mért értékre vonatkozik, ahol kálóméi és üveg elektród kombinációját mártjuk be az oldatba, amelyeket a mérőműszerrel összekötöttünk. A pH-érték az amit így mérünk. A pH mérőt vizes standard pufferekfcel kalibráljuk.
Ezek után röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. szekvencia aminosav sorrendje; Glu-{Glu-AIa}3-ProLys-; a 2. szekvencia aminosav sorrendje; Glu-Glu-Gly-Glu-ProLys~; és a 3. szekvencia sorrendje: Gly-Phe~Phe~Tyr-Thr~Lys-ProThr.
A találmány inzulin vegyületek előállítására vonatkozik. Ezeket az inzulin vegyületeket a gyógyításban használhatjuk. A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában azokat az inzulin vegyüieteket állítjuk elő. melyek B láncának C-terminálisán treonin (Thr) található.
A szakirodalomban jártas szakemberek, mint például orvosok, képesek az· inzulin. vegyüietek azon dózisainak meghatározására., mellyel a cukorbeteg gyógyítható.
A találmány szerinti eljáráshoz kiindulási anyagként inzulin prekurzort használunk, melyen mind pepiid hasítást, mind pepiid kapcsolást végzünk, mindkét reakciónak megfelelő körülmé nyek között, de ahol a közti termék izolálását nem végezzük el. Más szavakkal az inzulin prekurzort peptídhasításnak. vetjük alá, és az eredményül kapott terméken, azaz a közti anyagokon, peptídkapcsolást végzünk. A peptídhasításnak megfelelő körülmények a peptídkapcsolás körülményeivel nem egyeznek. Mivel a találmány első léi
SS.
te vagy azok a reakcióelegyben a peptídhasításnak kedvezzenek, és a második lépésben, azaz a kapcsolási lépésben, a reakciónak megfeleljenek, ezért ezek eltérnek egymástól.
A találmány egyik megvalósítási formájában az inzulin prekurzort az első lépésben elsődlegesen vizes közegben oldjuk, és a hasításhoz használt enzimet ehhez adagoljuk. Ez a reakeíóelegy szerves oldószertől mentes, vagy lényegében mentes lehet. Alternatívaként a reakeíóelegy bizonyos mennyiségű szerves oldószert, tartalmazhat, amely az inzulin prekurzor megfelelő oldékonyságát biztosíthatja.· Viszont legyünk tekintettel arra., hogy ne használjunk olyan sok szerves oldószert, amely az enzimatikus hasítást, károsan befolyásolja. A találmány szerinti eljárás első a reakció paramétereit, mint például pH-értéket,
hőmérsékletet, és időt úgy választjuk meg, hogy azok a lizin vagy az arginin aminosavlak) hasításának kedvezzenek.
Miután a hasítási reakció bizonyos kívánt mértékben végbement, a nukleofil vegyöletet és a szerves oldószert a réakcióeíeggyel úgy' .keverjük össze (a közti termék előzetes elkülönítése nélkül), hogy a nukleofil vegyület kapcsolása a kívánt közti termék lizin vagy arginin amínosavához megtörténjen. Ebben a lépésben a reakció paramétereket úgy állítjuk be, hogy az kedvezzen a kapcsolási reakciónak. A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában a nukleofil vegyület amínosavészter, például treonínészter, vagy peptidészter.
Ezek után, amennyiben szükséges, az eredményül kapott vegyületröl a védőcsoportjok) éltávolíIhatok.
Az ismert transzpepdidálásí reakciókhoz képest a találmány szerinti eljárás előnyei a következők: rövidebb, azonos enzim, mennyiséget és reakcióidőt alkalmaz, és mindemellett a kitermelés azonos vagy magasabb. A két reakeíóedényes rendszerhez képest, ahol a reakció vizes közegben, a közti termék elkülönítésével és szerves oldószer-víz keverékéhen végzett kapcsolási reakcióval történik, a találmány szerinti eljárás a kővetkező előnyökkel jár: rövidebb reakcióidő, kevesebb enzim, könnyebb foly am átirányítás.
Fontosabban, a találmány a következő megvalósítási lörmákra vonatkozik:
Ahogy az 1. igénypontból látható, először peptidhasítás történik, majd ezek után a kapcsolási reakció.
Röviden, a hasítási reakciót (azaz enzimatikus hasítást) a következő módon hajtjuk végre:
*<-<·
Az inzulin pre.kurzor enzimatíkus hasítása (azaz peptidhasítás) olyan, reakcióelegyben történik, mely legalább körülbelül 55 %, előnyösen legalább körülbelül 60 %, előnyösebben legalább 70 % vizet tartalmaz (tömegszázalékp
A találmány első megvalósítási formájának reakcióelegyében az inzulin prekurzor koncentrációja, melyben az enzimatíkus hasítás végbemegy., legalább 2 %, előnyösen körülbelül az 5-10 vegyes% tartományban található.
A hasítási reakciót semleges vagy lúgos közegben végezzük, előnyösen a ρΗ-érték körülbelül 6-11 tartományban található, előnyösebben ez a tartomány körülbelül 8-10.
A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában az inzulin prekurzor mennyiségéhez viszonyítva az enzim mennyisége hozzávetőleg 0,05-5 tömeg%, előnyösen hozzávetőleg 0,1-2 %.
A triptikus enzimet a találmány gyakorlatában nem védjük. A trípszin egy jól ismert enzim, mely nagy tisztaságban rendelkezésre áll, főleg borjú vagy sertés eredetű. Az Acromohacter tyiicus proteáz I (amit a továbbiakban ÁLP-vel jelölünk) mikrobiális forrásból származik, ez a kereskedelemben beszerezhető. Továbbá az enzimforma, függetlenül natív vagy rögzített jellegétől, szintén nem tartozik a találmány oltalmi körébe. Ba szükséges, a ü-termmálís arginin hasítására trípszin használható, míg a Cterminális lizín hasítására mind trípszin, mind ALP használható. A C-terminálís Iízin hasítására az ALP-t részesítjük előnyben.
Az aktív enzímszármazékok példái a következők: acetilezett trípszin, szukcirnlezett tripszin, glutáraldehiddel kezeit, tripszin és rögzített tripszin- vagy ALF-származékok, φ* lö * ♦ ♦ »♦·♦♦ X « V
Amennyiben rögzített trípszint vagy ALP-t használunk, -akkor a reakcióelegybe szuszpendáljuk, de oszlopba, is tölthetjük.
Az enzim hatását a következők együttes hatása nagymértékben meghatározza: víz vagy oldószer tartalom, pH~érték és a reakció hőmérséklete. A reakcióelegyben a szerves oldószer koncentrációjának növelése és a pH-érték csökkentése körülbelül semleges értékig a reakciót a hasítás irányából a kapcsolás irányába tereli, A hőmérséklet csökkentése a reakció sebességét csökkenti, de csökkentheti a melléktermek képződést, valamint
A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában az' inzulin prekurzort vizes közegben oldjuk fel, melyben az acetátíonok koncentrációja körülbelül 5-500 mM, előnyösen körülbelül 20-200 mM. Például nátrium-, kálium-, ammónium-acetát vagy trietil-ammönium-aeetát használható.
A találmány egyik megvalósítási formája szerint az inzulin prekurzor (pepiid) szerkezetét a (í) általános képlet írja le, ahol
Zn és Zjjí jelentése egymástól függetlenül két peptidcsoport, melyek n, illetőleg m aminosavból állnak, R1 jelentése peptid, mely szabadon megválaszthatóan lízint vagy arginínt tartalmaz, R2 jelentése aminosav vagy peptid, R3 jelentése peptid, mely szabadon megválaszthatóan kzínt vagy arginínt tartalmaz, R4 jelentése lizin vagy arginin vagy peptid, mely lizmt vagy arginínt tar talmaz, vagy R1 és R4 jelentése együttesen peptid, mely lizínt vagy arginínt tartalmaz, a két függőleges vonal a két cisztein között kialakult diszulödhidai jelzi, díszulfídhíd található az R1 és a Z« ciszteiniei között, * * * ♦ ♦ ¢, * * * * Φ** * κ * » $> » «· ♦ ♦ Μ '»♦«: **« *» 4«» *
Előnyösen, a találmány szerinti (1) általános képletű inzulin prekurzor aminosavait nukleotíd szekvenciák kódolhatják.
A találmány előnyben részesített megvalósítási formája szerint az inzulin prekurzorra jellemző, hogy' az R- és az R4 amino savainak száma körülbelül 8~50, A találmány egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában Zn 12 aminosavat tartalmaz. A találmány egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában 11 aminosavból áll. A találmány egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában az R2 1 aminosavat tartalmaz, például Asn-t vagy Gly-t. A találmány egy másik előnyben .részesített megvalósítási formájában R3 8 aminosavboi all.
A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában az inzulin prekurzor egyláncú, azaz a (!) általános képletű vegyületbén az R1 és R4 együttes jelentése peptid, mely lizint vagy arginint tartalmaz. így, előnyösen az inzulin prekurzor nem emlős eredetű, például sertés inzulin, nyűi inzulin, kutya inzulin vagy bálna inzulin.
A találmány egy’ másik megvalósítási formája szerint a (I) általános képletű inzulin prekurzor az Á1-A21. helyzetekben és a B1-B29. helyzetekben ugyanazokat az aminosavakat tartalmazza, mint a humán inzulin .azonos helyzeteiben.
A találmány egy másik megvalósítási formája szerint a (1) általános képletű inzulin prekurzor az A1-A21. és a B1-B29. helyzetekben azonos aminosavakat tartalmaz, azzal a feltevéssel, hogy a B28 Ásp,
A találmány egy másik megvalósítási formája szerint a (I) általános képletű inzulin prekurzor az A1-A21. és a B1-B29. helyzetekben ugyanazokat az aminosavakat tartalmazza, mint a * Χ· ♦ «> * * » $ X* X fcíx· *» * humán inzulin .azonos helyzeteiben, azzal a feltétellel, hogy a B29 aminosav Pro.
A találmány egy másik megvalósítási formája szerint a (í) általános képletü inzulin prekurzor az A1-A21, és a BI.-B29, helyzetekben ugyanazokat az aminosavakat tartalmazza, mint a humán inzulin azonos helyzeteiben, azzal a feltétellel,, hogy az A21 aminosav Gly és a. B31 és B32 aminosav Arg.
A találmány szerinti eljárásban használható specifikus inzulin prekurzorok példái a kővetkezők: humán és a majom proinzulin; (Ala3i,lys32j-dez(33-63] sertés proinzulin; sertés inzulin; (Asp2a]-dez(3O~65) humán proinzulin, mely N-terminálisan Glu(Glu-Ala|3-.Pro-Lys-t tartalmaz (a szekvencia száma: 1); és lAsp28.Met30;Trp31.Lys32]“dez(33-65) humán proinzulin, mely Nterminálisán Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-t tartalmaz (a szekvencia száma: 2).
Az 1. általános képletü inzulin prekurzorok a szakirodalomban leírtaknak megfelelően előállíthatok. vagy analóg módon (WO 01/49742, WO 01/49670, WO 01/079250 és WO 02/079254 számú szabadalmi bejelentések, amelyeket itt teljes egészében hivatkozásként építettünk be].
Az inzulin prekurzornak megfelelő szükséges közti terméket (azaz, a szükséges hasítási termékeket), melyek legalább egy Iízint vagy arginínt tartalmaznak, a lizin vagy argjrán aminosavaknál lebasífjuk, Továbbá, a kívánt közti termékben, az A és a B lánc, melyek egymással két diszulfidhiddal kapcsoltak, egymással nem kapcsolódnak peptidláneon keresztül, a B lánc Ó-terminálisa és az A lánc N-terminálisa között, A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a kívánt közti termék aminosavainak száma körülbelül 48-52, előnyösen * A » * y α· χ e » χ s· 4** * JB * *4* 1 *8 x ** sr Λ
sex Λ>* körülbelül 49-51, előnyösebben 50. A találmány egy másik megvalósítási formájában a kívánt közti termékben nem. több mint 4, előnyösen nem több mini. 3» előnyösebben nem több mint 2, és még előnyösebben nem több mint. í, olyan aminosav van jelen,, mely a humán inzulin megfelelő helyén nincs jelen,
A találmány egyik megvalósítási, formája szerint a szükséges inzulin prekurzor (a kívánt hasítási termék) szerkezetét a (II) általános képlet írja le, ahol
Zn és Z® jelentése egymástól függetlenül két peptídcsoport, melyek n, illetőleg m aminosavbói állnak, RA jelentése pepiid, R>2 jelentése aminosav vagy' pepiid, R>3 jelentése pepiid, R>4 jelentése Iizin vagy arginin vagy' pepiid, mely lizint vagy argtnint tartalmaz C-terminálisán, a két függőleges vonal a két cisztein között kiala kult díszulfidhidat jelzi, továbbá diszu.lfi.dhid található az RA és a 2k císzleínje között,
A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában az RA aminosavak Ál-Aő-ig megfelelnek a humán inzulin szekvenciájának, melynek szabadon megválaszthatoan egy vagy két amíno-savát más amínosawal cserélték ki, vagy melyben egy vagy több aminosav hiányzik. Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában az RA jelentése -Asn vagy' -Gly. Egy másik előnyben részesített megvalósítási formában az R>3 jelentése Bl-Bő-ig megfelel, a humán inzulin szekvenciájának, melynek szabadon megválaszthatóan egy vagy' két aminosavat más amínosawal cserélték ki, vagy melyben egy vagy több aminosav hiányzik. A találmány egy' másik előnyben részesített megvalósítási formájában a Rd jelentése B20-B29~ig megfelel a humán inzulin szekvenciájának, melynek szabadon « » í i * <•tv * * »» * * fc * *
X * megválaszthatóan egy vagy két amínosavat más aminosawal cserélték ki, azzal a feltétellel, hogy a B2S Asp, míg B29 Lys, és a B20-B28-ig megfelel a humán inzulin szekvenciájának, azzal a feltétellel, hogy a B28 Lys, melyek mindegyikében szabadon megválaszthatóan egy vagy két amínosavat kicseréltek más amino-savra, vagy egy' vagy két aminosav hiányzik, vagy ezen peptidek bármely részének C terminálisáról egy vagy több egymást követő amínosavat kihagytak, A. találmány egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában Zn jelentése A8A 19-ig a humán inzulin, melynek szabadon megválaszthatóan egy vagy két aminosavát más aminosawaí cserélték ki, vagy melyből egy vagy több aminosav hiányzik, A találmány egy másik előnyben részesített megvalósítási formájában Zm jelentése B8-B 18-ig a humán inzulin, melynek szabadon megválaszthatóan egy vagy’ két amínosavat más ammosawal cserélték ki, vagy’ amelyből egy vagy’ két aminosav hiányzik.
Mind a hasítási, mind a kapcsolási reakció során a reakció hőmérséklete fagypont és 50 °C között található. Az előnyben részesített hőmérséklet 0-25 «C,
A kapcsolási reakciót röviden a következő módon végezzük: Amennyiben a kívánt inzulin prekurzor legalább körülbelül 25 %.-a, előnyösen legalább 50 %-a, előnyösebben legalább 75 %-a, előnyösen legalább 85 %-a, még előnyösebben legalább 95 %-a a kívánt hasítási termékké átalakult, másrészt a nukleotíl vegyületet, valamint a szerves oldószert a hasítási reakció elegyébe belekevertük, akkor a reakeiőelegyben a kapcsolási reakciónak megfelelő körülményeket biztosítjuk. A hasítás százaléka (konverziói egyensúlyon alapul, mely a hasítási eiegyben a reakciót lehetővé teszi. Rendszerint az enzímatikus »8 ♦ ' ** hasítási reakció kezdetétől, és egy bizonyos idő elteltével, a kívánt termek kitermelése, azaz a kívánt hasítási termék., nő, és maximális koncentrációt ér el Ezek után a. kívánt hasítási termék kitermelése csökkenhet.
A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a. reakcióelegyből a hasítási reakció egyik eredményül kapott komponensét sem távolítjuk el, mielőtt a kapcsolási reakciót nem végeztük el. Ezt egyszerűen úgy végezhetjük el, hogy a hasítási reakció után a nukleoOl vegyületet és kellő mennyiségű szerves oldószert a rendszerhez hozzáadjuk. Ily módon például a hasítási lépésben használt enzim a kapcsolási lépésben is jelen
A találmány szerinti eljárás a. reakciőelegyben a kapcsolási reakciót is felöleli, mely a kívánt közti termékek mellett kis mennyiségben részlegesen hasított inzulin prekurzort és/vagy nem reagált inzulin prekurzort is tartalmaz,
A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a nukleofil vegyület aminosavamid vagy peptídamid, melyben a karoxamídcsoport nem szubsztituáit, vagy mono- vagy di-szubsztituált, nem több mint 16 szénatomos alkílcsoporttaí, mely slkílcsoportfökj a szomszédos nitrogénatommal gyűrűt képezhetnek, vagy a karboxamidesoport arílesoporttal mono- vagy di-szubsztituált, Az alifás szubsztituenseket előnyben, részesítjük. A szubsztituáit karboxamidcsoportok példái a kővetkezők: N,Ndimetílkarboxamid, Η,Ν-díetíikarboxamid és N-hexükarhexamid,
A találmány előnyben részesített megvalósítási formájában a nukleofil vegyület amínosavészter, melyben a karboxícsoportot védjük, és bármelyik bidroxicsoportot szabadon megválaszthatóan .szintén megvédhetjük. Egy további előnyben részesített megvalósítási formában a nukleofil vegyület treonínészter, melyben a karboxíesoport védett, és szabadon megválaszthatóan a hídroxícsoport is. így az L-treonin-észter általános képlete a kővetkező:
ahol R5 jelentése karboxli védőcsoport, és R6 jelentése hidrogén vagy hidroxil védőcsoport. A tisztánlátás érdekében a treoninészter általános képlete a kővetkező: CHx-CHfOR5)-CH(NH2.)COOR6, ahol R5 és R6 jelentése megegyezik a fentiekben megadottakkal.
Általában a nukleofil vegyületek beszerezhetők, a fennmaradók bármely ismert előállítási módszer analógiájára előállíthatok..
A nukleofil vegyületeket szabad bázis formában, vagy oldható ső, mint például hidrokloridok, acetátok, propionátok és buíirátok formájában alkalmazhatjuk.
Miután a kapcsolási reakció elkezdődött, ha szükséges, akkor a nukleofil vegyület feleslege ís jelen lehet a kapcsolási reakcióban, amikor is a mólarány a nukleofil vegyület és a kívánt közti termék között előnyösen több mint 5:1. Miután· a kapcsolási reakció elkezdődött, a nukleofil vegyület koncentrációja a határt az oldékonyság szabja meg.
A találmány szerinti öO %-os kitermeléshez fontos, hogy a reakció hőmérsékletét, víztartalmát és pH-értékét a megadott tartományok figyelembe vételével szabályozzuk,
A találmány gyakorlatához megfelelő oldószerek poláros természetűek, vízzel elegyedők, és előnyösen a kívánt közti terméket (például a (11) általános képletű vegyületeket) nagy kon* * « cenírációban képesek oldani, és nukieofílek. A. megfelelő szerves oldószerek példái a következők: N.N-dimetilformamíd, N,N-dimetilacetamíd, N-metilpirrolidon-2, és dimetil-szulfoxíd, és protikus oldószerek, mint például ecetsav, etanol, metanol, 2-propánok 1propánok butanoi és 1,4-hutá.ndiok A dioxán, aceton, tetrahidrofurán, formamid és aeetonitril szintén használható, és ezen felül a találmány szerves oldószereként még részlegesen vagy teljes mértékben aminosavésztert ís alkalmazhatunk, mint nukleohl vegyüietet. Az oldószer természete a rendszert egészében befolyásolja, és az egyik oldószer alkalmazási körülménye a másiknál nem mindig felel meg. A legjobb kitermelést aprotikus oldószerrel kapjuk, a találmányban ezeket tarjuk a legelőnyösebbeknek.
Nyilvánvaló, hogy amikor reakcióban a víztartalmat kiszámoljuk vagy meghatározzuk, akkor nukleohl vegyületként szerves oldószert tartunk szem előtt.
Savak., mint például sósav, hangyasav, ecetsav, propionsav vagy vajsav, vagy bázisok, mint például piridin, TRIS, N-metilmörfolin, tríefilamin vagy N-etilmorfolin, alkalmazása szabadon megválasztható. Ezeket azért adjuk a reakcióelegyhez, hogy a pH megfelelő értékű legyem Bár a találmány gyakorlatában sók vagy lúgok használhatók, mégis a szerves oldószereket részesítjük előnyben, különösen a fentiekben felsoroltakat, A szerves savak a legelőnyösebbek.
Miután, a kapcsolási reakció elkezdődött, a tripszín és az AbP tömegaránya (amit kristályos tripszinre vagy ALP-re vagy megfelelő tripszín mennyiségre, vagy megfelelő ALP-származékra vonatkoztatunk) a kívánt közti termékre viszonyítva a reakcióelegyben előnyösen körülbelül 1:1000-1:10, előnyösebben körülbelül 1:200-1:50,
Néhány esetben a hasítási lépésbe adagolt enzim elegendő a kapcsolási reakcióban ís, és ekkor a kapcsolási reakcióban további enzim adagolása nem szükséges. Más esetekben, a. kapcsolási lépés során, szükség lehet további enzim adagolására.
Amennyiben a kívánt közti termék koncentrációja és a nukleofíl vegyűlet mennyisége az oldatban nagy átalakítási sebességet tesz lehetővé, akkor az oldószert úgy választhatjuk meg, hogy az a .reakciópartnerek lehető legnagyobb oldékonyságát lehetővé tegye. A nukleofíl vegyűlet oldékonysága. különösen fontos, mivel ez a komponens nagy mennyiségben szerepelhet. Amennyiben a kapcsolási, reakció elkezdődött, a nukleofíl vegyület és a kívánt közti termék moláris aránya előnyösen meghaladja az 5:1 értéket, előnyösen nagyobb mint 50; 1. Amikor a kapcsolási reakció megkezdődött, a reakclóelegy ben a nukleofíl
A találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a nukleofíl vegyűlet karboxil védőcsoportokkal rendelkezik, melyek az eredményül kapott inzulin vegyületröl olyan .körülmények között távolíthatók el, melyek nem okoznak visszafordíthatatlan változásokat az inzulinban. Az ilyen karboxil védöcsoportok példái a következők: alacsonyabb rendű alkilok, mint például metil, etil és tercíer-hutíl, szubsztituált henzilcsoportok, mint például ρ-metoxíbenzil, difenílmetil és
2,4,6-trimetilbenziL és a kővetkező általános képletű vegyületek: -CH2-CH2-SO2R7, ahol R7 jelentése alacsonyabb rendű alkil, mint például metil, etil, propíl és n~butil.
A megfelelő hídroxil védőcsoportokat olyan körülmények között tudjuk eltávolítani, melyek az inzulin molekula φ φ visszafordíthatatlan megváltozását nem eredményezik. Az ilyen, csoport egyik példája lehet a tercier-butit
A további védőcsoportokat rendszerint a szakirodalomban leírtaknak megfelelően használjuk [Wunch: Métádén dér Organischen Chemle (Höuben-Weyi), XVII, szerkesztő: Eugen Mutter, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1974)},
A találmány egyik megvalósítási formája szerint a találmány szerinti eljárással, a (IV) általános képletü vegyületeket kapjuk, ahol
Zn és Zm jelentése egymástól függetlenül két peptidesoport, melyek n, illetőleg m armnosavhó! állnak, R·* jelentése peptid, R>2 jelentése aminosav vagy peptid, R>3 jelentése peptid, R>4 jelentése megegyezik a fentiekkel, R·6 jelentése olyan aminosav, amely kar boxi védőcsoporttal rendelkezik, vagy peptid, szabadon megválaszthatőan karboxilesoportján védve.
Az inzulin vegyületeken lévő bármely karbom-védőcsoport (például R8}, vagy bármelyik hidroxll védőcsoport (például R5) ismert, eljárásokkal eltávolítható. A karboxi-védőcsoport lehet; metil, etil, vagy a következő általános képletü csoport -CHs-CHsSOaR7, ahol R7 jelentése megegyezik a fentiekben leírtakkal, a szóban forgó védőcsoport lúgos körülmények között eltávolítható vizes közegben, előnyösen körülbelül pH~8~12 tartományban, például körülbelül 9,S-ös p.H.~n, Bázisként erős lúgok használhatók, mint például tercier amin, például thetilarmn, alkáli fémsök hidroxídjai, mint például nátrium .-hidroxi d. vagy az alkáli földfémek sói, mint például kalcium-, vagy magnéziumhidroxid. Amennyiben a karboxi- védőcsoport tercier buti.!, szubsztituáit benzíi, mint például p-mefoxihenzil vagy 2,4,-tnmetilbenzil, vagy' dífenilmetíl, akkor a szóban forgó csoport acídolí20 zissel eltávolítható, előnyösen, trífluoreceisavval. A trifluorecetsav adása történhet nem vizes körülmények között, vagy tartalmazhat bizonyos mennyiségű vizet is, vagy szerves oldószerrel, mint például diklőrmetánnal hígítható. A hídroxi-védőcsoport (példt
R5 buti!) acidolizissel eltávolítható, ahogy azt a lentiekben ismertettük.
Előnyösen az inzulin vegyületeket hídroxi-védőcsoport nélA találmány egy előnyben részesített megvalósítási formájában a találmány szerinti eljárás az inzulin prekurzort átalakítja (például a (I) általános képletü vegyületeket) inzulin vegyületté (például a (IV) általános képle tűvé), melyek €-terminális csoportján karboxi-védőcsoport található a B láncon, mely ezek után eltávolítható, kialakítva a nem karboxi-védőcsoportü inzulin vegyületek
A fenti magyarázatok és megfontolások alapján kialakított reakciókörülmények alkalmazásával a következő példákban az inzulin vegyület kitermelése több mint 60 %·, vagy több mint 80 %, bizonyos körülmények között eléri a 90 %-ot.
A találmány szerinti eljárással az inzulin vegyületek elfogadható tisztasággal nyerhetők ki, és terápiás felhasználáshoz tovább tisztíthatok.
Részletesebben, az inzulin aspart inzulin prekurzorböl például ALF enzimatikus hasítással, például N-terminálisán kiterjesztett formában, Glu-(Glu-Ala)3-Fro-Lys- (a szekvencia száma: 1) és nukleohl vegyülettel végzett kapcsolással előállítható, amit például L-treonm-metil-észterrel végzünk, maid ezek után hidrolízáljuk.
* «
Az inzulin Hspro például a prekurzor trípszínes hasításával, például sertés inzulinból, és nukleofil vegyűlettel végzett kapcsolással előállítható, mint például Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-ProThr-rel (a szekvencia száma; 3).
Az inzulin glargin például a prekurzor, mint például [Gly^öJdez(30-6S) humán promzuiínbó.1, ALP enzimes hasítással és nukleofil vegyűlettel végzett kapcsolással előállítható, mely utóbbihoz például Thr-Arg-Arg-OMe-t. használunk, majd hidrolizáljuk.
Az itt alkalmazott rövidítések megfelelnek az 1UPAC 1974ben jóváhagyott szabályainak (íUB Commíssion on Biochemieal Nomenclature, vide Collected Tentatíve- Rules 3s Recommendations of the Com.mixss.ion. on Biochemieal Nomenclature 1UPAC1UB, 2, kiadás, Maryland (1975)).
Az itt közzétett elképzelések, eredmények ezt megelőzően a szakirodalomban nem jelentek meg.
Ahogy azt itt használjuk a tartalmaz” szakkifejezés széles értelemű, így beleértjük a magában foglal stb. kifejezéseket is (EPO 'útmutatás C 4,13].
A következő példák bemutató, és nem korlátozó jellegűek.
1. Példa
200 mg [Ala31,Lys33]~des(33~63) sertés proínzulínt 1,35 ml vízbe felvettünk, és a pH-t lö pl trietüamlmial 9-re állítottuk. 375 pl. .N,N~dímetil~acetamid és 480 μί víz keverékét .gyenge keverés mellett a. fentiek az kapott oldathoz 315 pl 5,4 mg/ml Achromobacter h/hcws lizilspecifikus proteáz (EC 3.4.21.50) vizes oldatát adtuk (továbbiakban ALP-t). A pH-értéket 20 pl trietilamminnal 9,8-ra állítottuk, és a reakcióelegyei 1. óráig 23 «C-οη inkubáltuk, A ?2 reakcióelegyet 70 μ! sósavval lesavanyítottuk és jégfúrdőbe helyeztük. Ehhez 300 mg L-treonm-metíl-észter 4,85 ml N,Ndimetílacetamidos oldatát hozzáadtuk és a pH~t 450 μΐ 4 N sósavval 8,5-re állítottuk. A reakcióelegyet 4 óráig 23 °C-on inkubáltuk, majd a reakciót sósav adagolással megállítottuk (pH < 3). Fordított fázisú HFLC analízissel 4 mm x 250 mm 5 pm C18 szilikagél oszlopon (amit etaftol-víz eluenssel mostunk, mely 0,125 M ammőnium-szulfátot tartalmazott, ahol a pH-t 4~re állítottuk) megállapítottuk, hogy az átalakítás humán inzulín-metíl-észterré 5 óra után 86 %.
Összehasonlításként egylépéses reakciót hajtottunk végre.
100 mg (Ala3i,Lys32]~dez(33~63| sertés proinaulínt 887 al vízben és 175 pl Ν,Ν-dimetíl-acetamidban felvettünk. ISO mg htreonin-metii-észtert 2,265 μΐ Η,Ν-dimetílacetamidban feloldottunk, és lassan a jéggel hűtött oldathoz adagoltuk. A pH -t 340 μ! ecetsawal 6,5-re beállítottuk, és 158 μΐ 5,4 mg/ml vizes ALP oldatot adtunk hozzá. Az átalakítási reakciót lesavanvított minta•y kon RF-HPLC analízissel vizsgálatuk. 5 óra elteltével 53 %-os átalakítást kaptunk, 24 óra után a humán inzulin-metil-észterré
Az izolált humán .inzuUn-metii-észtert humán inzulinná alakítottuk vízben oldva pH ~ 10 értéken, 10 mg/ml koncentrációban. A reakciót 24 óra elteltével a pH 5,2-re állításával állítottuk meg (ehhez 1 H sósavat használtunk) és a kicsapódott humán inzulint eentrííugálással izoláltuk, és fordított fázisú .HPLC-vel tisztítottuk.
Azonos reakcióidőt, azaz 5 szerinti eljárás kitermelését ismert össze, és megállapítottuk, hogy 62 % anv élj árasokkal hasonlítottuk os javulást értünk el. A két
« φ X ** ** eljárásban azonos kitermelést kaptunk, amennyiben az egylépéses reakció idejét ötszörösére emeltük, szemben a találmány szerinti eljárással.
2. Példa
200 mg sertés· inzulint 1,37 ml vízben íelszuszpendáltunk és 294 ul N-metíl-2-pírrolidon és 326 pl víz elegyét lassan, keverés közben hozzáadtuk. A pH-értéket 10 pl 2 N nátríum-hidroxíddal 9,0-re állítottuk, és az eredményül kapott oldathoz 315 pl 5,4 mg/'ml vizes ALP oldatot adtunk. A p.H~t 12 pl 2 N nátríum-hidroxiddal 9,8-ra állítottuk és a reakcióelegyet 4 óráig 23 °C-on inkubáltuk. A reakcióelegyet 70 pl 4 N sósavval lesavanyí toltuk, és jégfurdöbe helyeztük. 300 mg L-treonin-metil-észter oldatot, melyet 4,4 ml N-metil-2-pirrohdonban készítettünk, lesavanyítottunk 500 pl 4 N sósavval Az inzulin oldatot lassan hozzáadtuk és a pH-t 50 pl 2 N sósavval 6,5 -re beállítottuk. A reakcióé legyet 4 óráig 23 üC~on inkubáltuk, majd a reakciót sósavas lesavanyítással megállítottuk (pH < 3). Fordított fázisú HPLC analízissel 4 mm x 250 mm 5 pm Cl8 szilikagél oszlopon (amit etanol-víz eluenssel mostunk, mely 0,125 M ammöníum-szulíátot tartalmazott, ahol a pH-t 4-re állítottuk) megállapítottuk, hogy 8 óra után a humán inzulin metii-észterré való átalakítás 86 %.
Összehasonlításként egylépéses reakciót hajtottunk végre.
100 mg sertés proinzulint íelszuszpendáltunk 848 pl víz és 147 pl N-metil-pírretidön. oldatában. 151) mg L-treonin-metil-észtért 2,2 ml N-metil-pirrolidonban feloldottunk, és lassan a jéggel hűtött oldathoz adagoltuk. A pH-t 340 pl ecetsawal 6,5-re beállí tottuk, és 158 pl 5,4 mg/ml vizes ALP oldatot adtunk hozzá. Az átalakítási reakciót 23 °C-on végzett inkubálás után RP-HPLC analízissel vizsgálatuk lesavanyított mintákon. Nyolc óra elteltével 54 %-os átalakítást kaptunk, a humán inzulin-metíl-észterré az átalakítás 48 óra után elérte a 86 %-ot.
Az izolált humán inzulín-metíl-észter lúgos hidrolízissel huAzonos reakcióidőt alkalmazva, azaz 8 órát, a találmány szerinti eljárás kitermelését ismert eljárásokkal hasonlítottuk össze, és megállapítottuk, hogy 59 %-os javulást értünk el, A két eljárásban azonos kitermelést kaptunk, amennyiben az egylépéses reakció idejét nyolcszorosra emeltük, szemben a találmány szerinti eljárással.
3. Példa
200 mg (Ásp2Sj~dez(30-65) humán proínzuiínt, mely N-terminálisán Glu~(Glu-Aiab~Ihm-Lys~ peptid kiterjesztést tartalmaz (a szekvencia száma: 1) 1,35 ml vízben felvettünk. 350 μΐ N,Ndímetílformamid és 425 μΐ víz elegyét gyenge keverés mellett hozzáadtuk, és a pH-t 45 pl trietílaminnal 9-re állítottuk, Áz eredményül kapott oldathoz 200 pl 8,5 mg/ml vízben oldott ALP-t adtunk és a pH~t 20 pl trietílaminnal 9,8-ra. állítottuk, A reakeíoelegyet 1 óráig 23 ®C-on inkubáltuk. A reakcióelegyet 70 pl 4 N sósavval lesavanyítottuk és jégfürdőbe helyeztük. 300 mg L-treonin-metíl-észter 4,95 ml N,N-dimetilformamídban felvett oldatát hozzáadtuk, és a pH-í 470 pl 4 N sósavval lesavanyitottuk, A reakcióelegyet 4 óráig 23 «C-οη inkubáltuk, majd a reakciót sósavas lesavanvítással megállítottuk (pH < 3). Fordított fázisú HPLC analízissel 4 mm x 250 mm 5 pm C18 szilikagél oszlopon (amit etanol-víz eluenssel mostunk, mely 0,125 M ammóniumszulfátot tartalmazott, ahol a pH-t 4-re állítottuk) » ** Xfc « fc « fc
megállapítottuk, hogy 5 óra után a (ÁspB2S} humán inzulin-metilészterré való átalakítás teljes.
Összehasonlításként egylépéses reakciót hajtottunk végre.
mg [Asp28j-dez(3ö-65) humán proinzuíínt, melyen Glu(Glu-Alajs-Pro-Lys-· fa szekvencia száma; 1) W-terminális kiterjesztés található, felszuszpendáltunk 887 pl víz és 175 pl N,N~dímetiltormamid oldatában. ISO mg L-treonín-metil-észtert 2,13 ml hbN-dimetüdormamídban feloldottunk, és lassan a. jéggel hűtött oldathoz adagoltuk. A pH t. 250 pl ecetsavval ő,5~re beállítottuk, és 118 pl 8,5 mg/ml vizes ALP oldatot adtunk hozzá. Az átalakítási reakciót lesavanyított mintákon RP-HPLC anaora a [Asp028] humán inzulin-metil- észterré az átalakítás 2.4 óra után to-Ot.
inzulinmietil-észter lúgos hidrolízissel
Az i sAspB28j~humán inzulinná alakítható.
Azonos reakcióidőt, azaz 5 órát alkalmazva, a taiálmány szerinti eljárás kitermelését ismert, eljárásokkal hasonlítottuk össze. A két eljárásban azonos kitermelést kaptunk, amennyiben az egylépéses reakció idejét ötszörösére emeltük, szemben a. találmány szerinti éli árassal.
1,5 g inzulin aspartot [Asp2^,Met3°.,Trp3i,'Lys32 humán proinzuíínt, mely N-terminálís Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lysoa szekvencia száma; 2) pepiidet tartalmazott, 3,5 g vízben felvettünk. Gyenge keverés közben környezeti hőmérsékleten a prekurzort 4 M ná.lrium-hídroxíd folyamatos adagolásával •érték 10,67. 3,7 g 45 tőmeg% etanol vizes
X Φ
4« ** oldatban hozzáadtunk 1,5 ml 5,8 mg/ml vizes ALP-t, és az reakeioelegyet 2 óráig ínkubáltuk. A pH-értéket 4 N sósavval 4,7re állítottuk be, 2,025 g L-treonin-etil-észtert feloldottunk 18,2 ml etanolban és az oldatot maximálisan 15 °C-on hozzáadtuk.
A pH-értéket 4 N sósavval 6,5-re beállítottuk. A hőmérsékletet környezeti hőmérsékletre állítottuk, és a reakeioelegyet 20 óráig ezen a hőmérsékleten Ínkubáltuk, Fordított fázisú HPLC analízissel 4 mm x .250 mm 5 pm Cl8 szilikagél oszlopon (amit etanol-víz eluenssel mostunk, mely 200 rnM ammónium-szulfátot tartalmazott, ahol a pH.~t 3,ö~ra állítottuk) megállapítottuk, hogy 20 óra után az inzulin aspart-etil-észterré való átalakítás 90,5 %os.
Az izolált inzulin aspart- etil -észter lúgos hidrolízissel inzulin asparttá. alakítható.
n.___________________
10,9- g inzulin aspart prekurzort |Asp2S,Met3ö,Trp31,Lys3'2Jdez(33--65) humán proinzulínt, mely N-terminális Glu-Glu-GlyGlu-Pro-Lys- (a szekvencia száma: 2) pepiidet tartalmazott, 49,3 g vízben felvettük. Gyenge keverés közben környezeti hőmérsékleten a prekurzort a kővetkező összetételű oldat folyamatos adagolásával feloldottuk: 0,36 M. nátrium-hidroxid, 0,27 M nátriumaeetát és 36 % N-metil-2-pirrolidon, A pH-értéket 9,7-re állítottuk, 9,2 ml 0,5 M nátrium-hídroxíddal, 7,1 ml 7,1 mg/ml koncentrácíőjú vizes ALP-t adtunk hozzá és a reakeioelegyet 5 óráig ínkubáltuk. A pH-értéket állandó értéken tartottuk 0,5 M nátriurn-hidroxíd adagolásával (pH ~ 9,7). A reakeioelegyet 5 °C~ra lehűtötték, és a pH-értéket 2,73 g 4 N sósavval 5,7-re állítottuk be. 14,02 g L-treonin-etíl-észtert hozzáadtunk, és a pli-t 4 N sóX savval 6,0-ra állítottuk. 344 g hideg (4 °C) N-metil-2-pirrolidont adtunk hozzá, A hőmérsékletet 22 ®C-ra állítottuk és a pH-értéket 4 N sósavval 6,5-re állítottuk. A reakciót ezen a hőmérsékleten 9 óráig végeztük. Fordított fázisú HPLC analízissel 4 mm x 250 min 5 pm. 08 szílikagél oszlopon (amit etanol-víz eluenssel mostunk, mely 200 mM ammómum-szulfátot tartalmazott, ahol a pH-t 3,6-ra állítottuk) megállapítottuk, hogy 14 óra után az inzulin aspart-etil-észterre való átalakítás 87,5 %-os.
Az izolált inzulin aspart-etiL észter lúgos hidrolízissel
As alábbiakban részletesen valamint számítógéppel olvasható formában is megadjuk a leírásban emli<110> Novo Nordisk A/S <120> Eljárás inzulinvegyületek előállítására <13G> 6325.204-WO <16G> 3 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211>9 <212> PRT
V *«
<210>2 <211>6 <212> PRT <213> Mesterséges <220>
<223> Peptid <400> 2
Glu Glu Gly Glu Pro Lys
5 <210>3 <211>8 <212> PRT <213> Mesterséges <220>
<223> Peptid <4Ö0> 3
Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr f GicsocSA
AAÍ A
Claims (13)
1. Eljárás Inzulin vegyűlet előállítására, azzal jellemezve, hogy a) egy reakcióelegyben, amely legalább körülbelül 55 %, előnyösen legalább körülbelül 80 %, előnyösebben legalább 70 % vizet (tőmegszázaiékban) tartalmaz, egy inzulin prekurzoron enzimatíkus hasítást végzünk, és b) a közti terméket egy az enztmátlkus hasításra szolgáló nukleofll vegyülettel kapcsoljuk a reakcíőelegyben, azzal a megkötéssel, hogy a reakcióelegy összetételét úgy módosítjuk, hogy a reakclóeiegy víztartalma körülbelül 10-50 tömeg%, előnyösen körülbelül 20-40 tömeg%, és c) ha szükséges, akkor a védöosoporte(ka)t eltávolítjuk, és ahol a kőztiterméket az a) hasítási lépés és a b) kapcsolási lépés között a reakciőelegyből nem izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hasítási lépéshez alkalmazott enzim a kapcsolási lépésben is jelen van.
3. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolási reakció megindítása előtt az inzulin prekurzor legalább körülbelül 25 %-át, előnyösen legalább 50 %-át, előnyösebben legalább körülbelül 75 %-át, előnyösen legalább 85 %~át, előnyösebben legalább 95 %-át hasítjuk köztitermékké.
4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimatíkus hasításhoz használt enzim tripszin vagy lizíl-speclfíkus proteáz, előnyösen Acbromobacfen /yácus proteáz 1.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleofll vegyölet egy aminosav-észter,
6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleofll vegyűlet treonin-észier.
7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleofll vegyűlet aminosav-amid.
·♦ * » »♦ ♦* * » * ♦ * ♦ χ* * * ** ♦ ♦ ♦ ·* * ♦ ♦» ** **
8. Az 1,4. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleoál vegyület egy
9, Az 1-4. ige nukieoflí vegyület egy bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, észter.
10. Az 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a leofil vegyület egy peptld~amid.
11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás tartalmazza a védőcsoport(ok)nak az Inzulinról történő eltávolítását is.
12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keletkező kapott inzulin vegyület 830 helyzetében treonsn található,
13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eredményül kapott vegyület a barnán inzulin, inzulin aspart, inzulin llspro, inzulin glargin vagy inzulin delemé.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200101716 | 2001-11-19 | ||
| PCT/DK2002/000765 WO2003044210A2 (en) | 2001-11-19 | 2002-11-15 | Process for preparing insulin compounds |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0500037A2 HUP0500037A2 (hu) | 2005-03-29 |
| HUP0500037A3 HUP0500037A3 (en) | 2010-01-28 |
| HU228934B1 true HU228934B1 (hu) | 2013-06-28 |
Family
ID=8160841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0500037A HU228934B1 (hu) | 2001-11-19 | 2002-11-15 | Eljárás inzulinvegyületek elõállítására |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1448786B1 (hu) |
| JP (1) | JP4404631B2 (hu) |
| KR (1) | KR100925381B1 (hu) |
| CN (1) | CN100424179C (hu) |
| AT (1) | ATE464390T1 (hu) |
| AU (1) | AU2002342597A1 (hu) |
| BR (1) | BR0213583A (hu) |
| CA (1) | CA2464616C (hu) |
| DE (1) | DE60236014D1 (hu) |
| ES (1) | ES2344448T3 (hu) |
| HU (1) | HU228934B1 (hu) |
| IL (2) | IL161358A0 (hu) |
| PL (1) | PL210437B1 (hu) |
| RU (1) | RU2376379C2 (hu) |
| WO (1) | WO2003044210A2 (hu) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006031962A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Amidiertes Insulin Glargin |
| DE102006031955A1 (de) * | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende |
| TW200902708A (en) * | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
| EP3228320B1 (de) | 2008-10-17 | 2019-12-18 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Kombination von einem insulin und einem glp-1-agonisten |
| CN102471368A (zh) * | 2009-08-11 | 2012-05-23 | 拜康有限公司 | 色谱方法及其纯化的化合物 |
| AR080669A1 (es) | 2009-11-13 | 2012-05-02 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina |
| UY33025A (es) | 2009-11-13 | 2011-06-30 | Sanofi Aventis Deustschland Gmbh | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1 metionina |
| MX339614B (es) | 2010-08-30 | 2016-06-02 | Sanofi - Aventis Deutschland GmbH | Uso de ave0010 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| RU2650616C2 (ru) | 2011-08-29 | 2018-04-16 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Фармацевтическая комбинация для применения при гликемическом контроле у пациентов с сахарным диабетом 2 типа |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| CN102703552B (zh) * | 2012-05-15 | 2014-10-29 | 山东阿华生物药业有限公司 | 重组人胰岛素的制备方法及其产品 |
| CN102816819B (zh) * | 2012-08-13 | 2014-10-29 | 山东阿华生物药业有限公司 | 提高人胰岛素前体融合蛋白酶切转换成b30缺苏氨酸人胰岛素产率的方法 |
| CN103305581B (zh) * | 2013-07-04 | 2015-05-27 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种重组人胰岛素的制备方法 |
| US10611813B2 (en) * | 2013-12-23 | 2020-04-07 | Biocon Research Limited | Method of production of human insulin methyl ester |
| CN107206058A (zh) | 2014-12-12 | 2017-09-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 甘精胰岛素/利西拉来固定比率配制剂 |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| TW201726702A (zh) * | 2015-09-24 | 2017-08-01 | 韓美藥品股份有限公司 | 生產胰島素之方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE50892B1 (en) | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
| JPS58501208A (ja) | 1981-08-10 | 1983-07-28 | ノルデイスク インシユリンラボラトリユ−ム | インシユリン誘導体の製造法 |
| DK149824C (da) | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| WO1983002772A1 (en) | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| IT1189353B (it) | 1982-06-07 | 1988-02-04 | Nordisk Insulinlab | Procedimento per la preparazione di insulina umana e suoi esteri |
| DK347086D0 (da) | 1986-07-21 | 1986-07-21 | Novo Industri As | Novel peptides |
| PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| IL84110A (en) * | 1986-10-14 | 1992-11-15 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to a human insulin |
| DE10075034I1 (de) | 1987-02-25 | 2001-05-23 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
| PL178466B1 (pl) | 1993-09-17 | 2000-05-31 | Novo Nordisk As | Pochodna insuliny i kompozycja farmaceutyczna do leczenia cukrzycy |
| US6011007A (en) | 1993-09-17 | 2000-01-04 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| DE60039074D1 (de) | 1999-12-29 | 2008-07-10 | Novo Nordisk As | Verfahren zur herstellung von insulinvorläufern und von analogen von insulinvorläufern |
| RU2002120513A (ru) | 1999-12-29 | 2004-03-27 | Ново Нордиск А/С (DK) | Способ производства предшественников инсулина и аналогов предшественников инсулина с повышенным выходом ферментации у дрожжей |
| ATE381573T1 (de) | 2000-04-14 | 2008-01-15 | Univ Maryland Biotech Inst | Verbesserte thermostabilität und temperaturresistenz von proteinen |
| WO2002079254A1 (en) | 2001-03-29 | 2002-10-10 | Janoff Edward N | Human monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae |
-
2002
- 2002-11-15 ES ES02779247T patent/ES2344448T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 RU RU2004118503/13A patent/RU2376379C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-11-15 PL PL369447A patent/PL210437B1/pl unknown
- 2002-11-15 KR KR1020047007129A patent/KR100925381B1/ko active IP Right Grant
- 2002-11-15 CA CA2464616A patent/CA2464616C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-15 CN CNB028229622A patent/CN100424179C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 IL IL16135802A patent/IL161358A0/xx unknown
- 2002-11-15 WO PCT/DK2002/000765 patent/WO2003044210A2/en active Application Filing
- 2002-11-15 JP JP2003545831A patent/JP4404631B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 EP EP02779247A patent/EP1448786B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 DE DE60236014T patent/DE60236014D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-15 BR BR0213583-3A patent/BR0213583A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-11-15 AU AU2002342597A patent/AU2002342597A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-15 HU HU0500037A patent/HU228934B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-11-15 AT AT02779247T patent/ATE464390T1/de not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-04-14 IL IL161358A patent/IL161358A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005509687A (ja) | 2005-04-14 |
| CN1589328A (zh) | 2005-03-02 |
| PL210437B1 (pl) | 2012-01-31 |
| KR100925381B1 (ko) | 2009-11-09 |
| IL161358A (en) | 2011-05-31 |
| HUP0500037A2 (hu) | 2005-03-29 |
| HUP0500037A3 (en) | 2010-01-28 |
| PL369447A1 (en) | 2005-04-18 |
| RU2376379C2 (ru) | 2009-12-20 |
| AU2002342597A1 (en) | 2003-06-10 |
| BR0213583A (pt) | 2004-08-24 |
| EP1448786B1 (en) | 2010-04-14 |
| RU2004118503A (ru) | 2005-06-10 |
| CA2464616A1 (en) | 2003-05-30 |
| EP1448786A2 (en) | 2004-08-25 |
| ES2344448T3 (es) | 2010-08-27 |
| IL161358A0 (en) | 2004-09-27 |
| JP4404631B2 (ja) | 2010-01-27 |
| WO2003044210A3 (en) | 2004-03-25 |
| WO2003044210A2 (en) | 2003-05-30 |
| DE60236014D1 (de) | 2010-05-27 |
| KR20050044855A (ko) | 2005-05-13 |
| AU2002342597A8 (en) | 2003-06-10 |
| CA2464616C (en) | 2012-07-24 |
| CN100424179C (zh) | 2008-10-08 |
| ATE464390T1 (de) | 2010-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU228934B1 (hu) | Eljárás inzulinvegyületek elõállítására | |
| JP5695909B2 (ja) | 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体 | |
| US6908897B2 (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| JP5973427B2 (ja) | 追加のジスルフィド結合を含有するインスリン類似体 | |
| DK1934252T3 (en) | METHOD FOR PRODUCING insulin conjugates | |
| EP0544466A1 (en) | Tri-arginine insulins | |
| US9090705B2 (en) | Process for preparation of insulin compounds | |
| JPH11130798A (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
| EP2720711A1 (en) | Multi substituted insulins | |
| NO864555L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av insulinpreparat. | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| KR20130036290A (ko) | 추가 이황화 결합을 함유하는 인슐린 유도체 | |
| CA2724510C (en) | Processes for refolding of insulin | |
| JP6013330B2 (ja) | 追加のジスルフィド結合を含有するヒトインスリン | |
| US20160024168A1 (en) | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs | |
| US7396903B2 (en) | Process for preparing insulin compounds | |
| CS271191A3 (en) | Enzymatic process of pre-proinsulins to insulins conversion | |
| CN114867743A (zh) | 形成磺酰胺与多肽的缀合物的方法 | |
| WO2012115637A1 (en) | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |