JP2005509687A

JP2005509687A - インスリン化合物の製造方法

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Publication number: JP2005509687A
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Inventors: ボグスネス、アレ; クリスティアンセン、イングン; バルシュミット、パー
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Abstract

インスリン前駆体をインスリン化合物に変換する好ましい方法として、水性媒体中で酵素ペプチド開裂を行い、かつ、その後、生成する中間体生成物を除くことなく、アミノ酸エステル又はペプチドエステル及び有機溶媒を添加して所望のカップリングを行う。

Description

本発明は、インスリン前駆体を場合によりインスリンエステルを介してインスリン化合物に変換する改良された方法に関する。

インスリンは血糖濃度の制御に関与する膵臓ホルモンである。例えば、ヒト、ブタ、及びウシのインスリン、インスリン類似体及び混合インスリンはインスリン依存糖尿病の患者に血糖濃度の制御するために与えられる。

ブタ及びウシインスリンは、膵臓腺から調製するのが通常である。ヒトインスリンはブタインスリンから半合成的に調製できる。代りにヒトインスリン及び多くのインスリン類似体は遺伝子工学によって調製できる。例えば細菌又はイースト内で行われる遺伝子工学によって、インスリン前駆体が調製され、その後所望の生成物に変換される。この変換は種々の方法で行うことができる。

一つの可能性はいわゆるトランスペプチド化であり、ペプチド開裂及びペプチドカップリングが同一の反応混合物内で同一の反応条件化で連続して行われる。例えば特許文献１参照。
米国特許第４，３４３，８９８号（Novo Industri）他の可能性は、第１工程でインスリン前駆体を開裂させ、例えば非特許文献１参照、その後中間体を単離し、次いで第１工程で用いたのとは別の反応混合物内で所望のカップリングを行う。例えば非特許文献２参照。 Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem.359(1978),799 Nature 280(1979),412 特許文献2によると、トランスペプチド化反応は少なくとも約５０％(容量／容量）ブタン-1,4-ジオールを含む少なくとも１の非水性反応混合性溶媒を約７５％及び９７％(容量／容量)の間で包含する溶媒系内で行われる。欧州特許第８７，２３８号特許文献３によると、トランスペプチド化工程はＬ−特異性セリンカルボキシペプチダーゼ酵素、例えばカルボキシペプチダーゼＹを用いて行われる。米国特許第４，５７９，８２０号特許文献４によると、トランスペプチド化又はペプチドカップリングのみは有機溶媒を実質的に含まない水性反応媒体内で行われる。米国特許第４，６０１，９７９号（Nordisk Insulinlaboratorium）特許文献５によると、ブタ製品がカルボキシペプチダーゼＡで処理され、生成するデス(des)-アラニン-Ｂ３０インスリン製品を低級アルコールに懸濁し、この懸濁体をＬ-スレオニンエステル及びトリプシンの溶液と混合した。全ての特定の例でデス-アラニン-Ｂ３０インスリン製品は凍結乾燥又は沈殿によって単離された。ＷＯ８３／００５０４号（Nordisk Insulinlaboratorium）本発明の目的は先行技術の欠点の少なくとも一部を克服するか又は改良することにある。

定義

ここで用いる「アミノ酸」の語は、ヌクレオチド配列でコードできるアミノ酸をいう。同様に、カルボキシ基からヒドロキシ基が除かれた及び/又はアミノ基から水素が除かれたアミノ酸であるアミノ酸残基の語に適用される。

同様に、ペプチド及びペプチド残基の語はアミノ酸残基からなる。好ましくはペプチドは１０を越えないアミノ酸残基を含む。

ここで用いるアミノ酸アミドの語は場合により置換されたＣ末端カルボキサミド基をいう。

ここで用いるペプチドアミドの語は場合により置換されたＣ末端カルボキサミド基をいう。

ここで用いる「インスリン前駆体」の語は、２個のペプチド鎖（インスリンのＡ及びＢ鎖に対応し、以後Ａ及びＢ鎖と称する）からなるポリペプチドをいい、これは、インスリンと同様に、２個のペプチド鎖間の２個のジスルフィド架橋（一方のシステイン(Cys)残基から他のシステイン残基に）を介して互いに結合しており、インスリンのように、Ａ鎖の１のシステイン残基からＡ鎖の他のシステイン残基へのジスルフィド架橋がある。このインスリン前駆体においてＢ鎖に少なくとも１のリシン又はアルギニン残基がある。場合により、このインスリン前駆体では、Ａ鎖及びＢ鎖はＢ鎖のＣ末端とＡ鎖のＮ末端との間の第３ペプチド鎖（インスリンの連結ペプチドに対応する）を介して互いに結合している。Ａ鎖とＢ鎖がこの第３ペプチド鎖を介して結合している場合は、この第３ペプチドのＣ末端にはリシンが存在する。場合により、このインスリン前駆体では第４ペプチド鎖がＢ鎖のＮ末端に結合していることがある。この第４ペプチド鎖がＢ鎖のＮ末端に結合する場合は、リシンがこの第４ペプチド鎖のＣ末端に存在する。

更に、このインスリン前駆体では、ヒトインスリンと比較して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸残基の同一性がある。但し、この計算では第３及び第４ペプチド鎖は無視する。ヒトインスリンでは、Ｃｙｓ^A5及びＣｙｓ^A11の間、Ｃｙｓ^A7及びＣｙｓ^B7の間、並びにＣｙｓ^A20及びＣｙｓ^B18の間にジスルフィド架橋があり、Ｂ２９位にはリシンがある。

ここで用いる「アミノ酸エステル」の語は、Ｃ末端カルボキシ保護基及び場合によりヒドロキシ保護基を有するアミノ酸をいう。

ここで用いる「ペプチドエステル」の語は、少なくともＣ末端カルボキシ基がカルボキシ保護基を有するペプチドをいう。場合により、ヒドロキシ基が保護され、及び場合によりリシン残基のε-アミノ基が好ましくは疎水性基例えば少なくとも１０炭素原子を有するアシル基によって誘導体化される。ペプチドエステルは１０を越えないアミノ酸残基を含むことが好ましい。

ここで用いる求核性化合物は、アミノ酸エステル、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドエステル、及びペプチドアミドをいう。これらのアミノ酸エステル、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドエステル、及びペプチドアミドのいずれにおいて、任意のリシン基のアミノ基は場合により、好ましくは疎水性基、例えば少なくとも１０炭素原子を有するアシル基で誘導体化される。

ここで用いる「インスリン化合物」の語は、ブタインスリン、ウシインスリン及びヒトインスリンのような任意の種のインスリン及び亜鉛塩、及びプロタミン塩のようなその塩をいう。更に、ここで用いる「インスリン化合物」の語は、簡潔に「インスリン類似体(analogue)」と称し得るものをいう。ここで用いるインスリン類似体は、１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたインスリン化合物、及び/又はそれから１以上のアミノ酸残基が欠如したもの、及び/又は１以上のアミノ酸残基が付加されたものであって、該インスリン類似体が十分なインスリン活性を有するものをいう。インスリン類似体の例は米国特許第５，６１８，９１３号、欧州特許第２５４，５１６号、欧州特許第２０８，５３４号、米国特許第５，７５０，４９７号、及び米国特許第６，０１１，００７号及びその等価物に記載されている。具体的なインスリン類似体の例には、インスリンaspart（即ち［Ａｓｐ^B26］ヒトインスリン）、インスリンlispro（即ち［Ｌｙｓ^B28，Ｐｒｏ^B29］ヒトインスリン）及びインスリンglargin（即ち［Ｇｌｙ^A21，Ａｒｇ^B31，Ａｒｇ^B32］ヒトインスリン）がある。ここで用いる「インスリン類似体」の語は、インスリン誘導体と称することができるもの、即ち当業者がインスリンの誘導体と一般に考えるもの、一般の教科書参照、例えば親インスリン分子に存在しない置換基を有するインスリンをも包含する。インスリン誘導体の例には、場合により置換したカルボキサミド基を有するインスリン又はインスリン類似体がある。またインスリン誘導体及びインスリン類似体の両者と考えることができる化合物もここでインスリン類似体の語に包含される。このような化合物の例は米国特許第、７５０，４９７号及び米国特許第６，０１１，００７号及びその等価物に記載されている。更に具体的なインスリン類似体の例には、インスリンdetermir(即ち、des-Ｔｈｒ^B30ヒトインスリンγＬｙｓ^B29テトラデカノイル）がある。本発明で調製されるインスリン化合物は、糖尿病患者を治療するのに十分に高い抗糖尿病活性を有する。抗糖尿病活性はいわゆるフリーファットセルアッセイ(free fat cell assay)を用いて測定できる。

ここで用いるｐＨ値の語は、ｐＨ計に連結したカロメル組合せガラス電極をｐＨ値を測定すべき溶液に直接に浸漬することによってｐＨ計で測定した値である。ｐＨ計は水性標準緩衝液で較正する。

図の簡単な説明

配列表(SEQ ID) No.1はペプチド部分Glu-(Glu-Ala)₃-Pro-Lys-である。配列表(SEQ ID)No.2はペプチド部分Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-である。配列表(SEQ ID)No.3はペプチド部分Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr である。

発明の簡単な説明

本発明は、インスリン化合物の製造方法に関する。これらのインスリン化合物は医薬として用いることができる。本発明の好ましい態様において、Ｂ鎖のＣ末端にスレオニン(Thr)を有するインスリン化合物が調製される。

当業者、例えば医者は糖尿病患者にインスリン化合物を投与する量及び時期を定めることができる。

本発明方法の出発原料はインスリン前駆体であり、両反応に有利な条件下でペプチド開裂及びペプチドカップリングを受けるが中間体の単離は行われない。換言すると、インスリン前駆体はペプチド開裂を受け、そして生成物、即ち中間体がペプチドカップリングを受ける。ペプチド開裂に有利な条件はペプチドカップリングに有利な条件と同一ではない。従って、本発明の第１段階、即ち開裂工程又は開裂反応で、反応混合物の反応条件はペプチド開裂に有利なように選定され、本発明の第２段階、即ちカップリング工程又はカップリング反応で、反応混合物の反応条件はペプチドカップリングに有利なように変更される。

本発明の１態様において、インスリン前駆体は、第１工程で、優勢な水性媒体に溶解し、開裂に用いる酵素を加える。この反応混合物は有機溶媒を含まないか又は実質的に含まないものでもよい。或は、反応混合物は、インスリン前駆体の適正な溶解度を確保できる一定量の有機溶媒を含むこともできる。然し、酵素開裂に望ましくない影響を有するほど多くの有機溶媒を用いないことが望ましい。本発明方法の第１工程において、ｐＨ値、温度及び時間のような反応パラメータは、リシン残基又はアルギニン残基で開裂が有利になるように選ばれる。

開裂反応が一定の所望の程度まで起こったときに、求核化合物及び有機溶媒を（中間体を予め単離することなく）反応混合物に混合し、その結果所望の中間体のリシン又はアルギニン残基への求核化合物のカップリングが起こる。この工程で、反応パラメータはカップリング反応に有利なように設定する。本発明の好ましい態様では、求核化合物はアミノ酸エステル、例えばスレオニンエステル、又はペプチドエステルである。

その後、保護基は、所望ならば、生成化合物から除くことができる。

既知のトランスペプチド化反応と比較すると、本発明方法で得られる利点は、同一量の酵素及び類似又はより高い収量での全体として短い反応時間である。水性媒体中での開裂、中間体の単離、及び有機溶媒及び水の混合物中でのカップリングの２ポット反応と比較すると、本発明方法で得られる利点は、短い全反応時間、より少量の酵素の使用及び容易なプロセスフローである。

より詳細には、本発明は次の態様に関する。

発明の詳細な説明

請求項１に示されるように、まずペプチド開裂が起こり、その後、カップリング反応が起こる。

簡潔には、開裂反応（即ち酵素開裂）は次のように行われる。

インスリン前駆体の酵素開裂（即ちペプチド開裂）は、少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも７０％の水（重量／重量）を含む反応混合物中で行われる。

本発明の好ましい態様では、酵素反応が行われる反応混合物中のインスリン前駆体の濃度は、少なくとも２％、好ましくは約５〜約１０％（重量／容量）の範囲内である。

開裂反応は、好ましくは約６〜約１１の範囲、より好ましくは約８〜約１０の範囲のｐＨ値を有する好ましくは中性又はアルカリ性媒体中で行われる。

本発明の好ましい態様において、インスリン前駆体の量と比較した酵素の量は、約０．０５〜約５％（重量／重量）、好ましくは約０．１〜約２％の範囲内である。

トリプシン酵素(Tryptic enzyme)は本発明の実施に重要ではない。トリプシンは、特にウシ又はブタ源から高純度で入手できるよく特徴付けられた酵素である。微生物源からアクロモバクターリティカスプロテアーゼＩ（Acromobacter lyticus protease I、以後ＡＬＰと称する）が得られる。更に、酵素形態、天然の酵素であるか活性固定化酵素又は酵素誘導体であるかは、本発明の実施に重要ではない。アルギニンのＣ末端で分裂することが望まれる場合にはトリプシンを用いることができ、リシンのＣ末端で分裂することが望まれる場合には、トリプシン又はＡＬＰを用いることができる。リシンのＣ末端で分裂するためにはＡＬＰが好ましい。

活性酵素誘導体の例として、アセチル化トリプシン、スクシニル化トリプシン、グルタルアルデヒド処理トリプシン、及び固定化トリプシン又はＡＬＰ誘導体を挙げることができる。

固定化トリプシン又はＡＬＰを用いる場合には反応混合物中に懸濁させるかカラム内にパックできる。

大部分は酵素の作用は水及び溶媒の含量、ｐＨ値、及び反応温度の相互関係で制御できる。反応混合物内の有機溶媒の濃度を増加し、ｐＨ値を中性付近に低下させると通常の酵素反応は開裂からカップリングの方に移行する。温度の低下は反応を低下させるが副生物形成及び酵素変性をも低下させることがある。

本発明の好ましい態様では、インスリン前駆体は、アセテートイオン濃度が約５ｍＭ〜約５００ｍＭの範囲、好ましくは約２０ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲内である水性媒体に溶解する。例えば、酢酸ナトリウム、カリウム、アンモニウム又は酢酸トリエチルアンモニウムを用いることができる。

本発明の１態様によると、インスリン前駆体（ペプチドである）は、次の一般式Ｉで示すことができる。

式中、Ｚ_ｎ及びＺ_ｍは、互いに独立して、それぞれｎ個及びｍ個のアミノ酸残基を含む２個のペプチド部分をそれぞれ示し、Ｒ^１は、ペプチド残基が場合によりリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基を示し、Ｒ^２はアミノ酸残基又はペプチド残基を示し、Ｒ^３はペプチド残基が場合によりリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基を示し、Ｒ^４はリシン又はアルギニン残基又はペプチド残基がリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基を示し、又はＲ^１及びＲ^４は共にリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基であり、２個の垂直線は２個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を示し、更に、Ｒ^１及びＺ_ｎに存在する２個のシステイン残基の間にジスルフィド結合がある。

好ましくは、式Ｉのインスリン前駆体に存在するアミノ酸残基はヌクレオチド配列によってコードできるものである。

本発明の好ましい態様によると、共にＲ^１及びＲ^４におけるアミノ酸残基の数が約８〜約５０の範囲内であるインスリン前駆体が用いられる。本発明の他の好ましい態様では、Ｚ_ｎは１２アミノ酸残基を含む。本発明の他の好ましい態様では、Ｚ_ｍは１１アミノ酸残基を含む。本発明の他の好ましい態様では、Ｒ^２は１アミノ酸残基、例えばＡｓｎ又はＧｌｙを含む。本発明の他の好ましい態様では、Ｒ^３は６アミノ酸残基を含む。

本発明の好ましい態様では、インスリン前駆体は単一鎖前駆体、即ちＲ^１及びＲ^４が共にリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基である式Ｉの化合物である。従って、インスリン前駆体は、ブタインスリン、ウサギインスリン、イヌインスリン又はクジラインスリンのような哺乳類インスリンではないことが好ましい。

本発明の他の態様によると、式Ｉのインスリン前駆体は、同一の位置におけるヒトインスリンに存在するようにＡ１からＡ２１の位置及びＢ１からＢ２９の位置に同一のアミノ酸残基を含む。

本発明の他の態様によると、式Ｉのインスリン前駆体はＡ１からＡ２１の位置及びＢ１からＢ２９の位置において同一のアミノ酸残基を含むが、Ｂ２８アミノ酸残基はＡｓｐである。

本発明の他の態様によると、式Ｉのインスリン前駆体は、Ａ１からＡ２１の位置及びＢ１からＢ２９の位置において、同一の位置におけるヒトインスリンに存在するように同一のアミノ酸残基を含むが、Ｂ２８アミノ酸残基はＬｙｓであり、Ｂ２９アミノ酸残基はＰｒｏである。

本発明の他の態様によると、式Ｉのインスリン前駆体は、Ａ１からＡ２１の位置及びＢ１からＢ２９の位置において、同一の位置におけるヒトインスリンに存在するように同一のアミノ酸残基を含むが、Ａ２１アミノ酸残基はＧｌｙであり、Ｂ３１及びＢ３２アミノ酸残基は両者ともＡｒｇである。

本発明方法に用いることができる具体的なインスリン前駆体の例は、ヒトインスリン、モンキーインスリン、［Ａｌａ³¹，Ｌｙｓ³²］-デス（３３−６３）ブタプロインスリン、ブタインスリン、［Ａｓｐ²⁸］-デス（３０−６５）ヒトプロインスリンであってＧｌｕ-（Ｇｌｕ−Ａｌａ）_３−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．１）でＮ末端延長されたもの、及び［Ａｓｐ²⁸，Ｍｅｔ³⁰，Ｔｒｐ³¹，Ｌｙｓ³²］−デス（３３−６５）ヒトプロインスリンであってＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ-（配列表Ｎｏ．２）でＮ末端延長されたものである。

式Ｉのインスリン前駆体は、ここに引用してその内容を導入される公開番号ＷＯ０１／４９７４２、ＷＯ０１／４９８７０、ＷＯ０１／０７９２５０、及びＷＯ０２／０７９２５４の国際出願に記載されたように又は記載と類似して調製することができる。

所望の中間体生成物（即ち、所望の開裂生成物）は、少なくとも１個のリシン又はアルギニン残基が開裂されてリシル又はアルギニル残基部分をそれぞれ形成するインスリン前駆体に対応する。更に、所望の中間体生成物において、互いに２個のジスルフィド結合で連結するＡ及びＢ鎖はＢ鎖のＣ末端及びＡ鎖のＮ末端の間のペプチド鎖を介して互いに連結されていない。本発明の好ましい態様では、所望の中間体生成物に存在するアミノ酸残基の数は、約４８〜約５２の範囲、好ましくは約４９〜約５１の範囲、更に好ましくは５０である。本発明の他の好ましい態様では、ヒトインスリンの対応する位置に存在しない所望の中間体生成物に存在するアミノ酸残基が４を越えず、好ましくは３を越えず、更に好ましくは２を越えず、特に好ましくは１を越えない。

本発明の１の態様によると、所望の中間体生成物（所望の開裂生成物）は、式ＩＩで示すことができる。

式中、Ｚ_ｎ及びＺ_ｍは、互いに独立して、それぞれがｎ個及びｍ個のアミノ酸残基を含む２個のペプチド部分をそれぞれ示し、Ｒ’^１はペプチド残基を示し、Ｒ’^２はアミノ酸残基又はペプチド残基を示し、Ｒ’^３はペプチド残基を示し、Ｒ’^４はリシン又はアルギニン又はＣ末端にリシン又はアルギニン残基を含むペプチド残基を示し、２個の垂直線は２個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を示し、更にＲ’^１及びＺｎに存在する２個のシステイン残基の間にジスルフィド結合がある。

本発明の好ましい態様では、Ｒ’^１はヒトインスリンのＡ１〜Ａ６のこの順序でのアミノ酸残基であるが、場合により１又は２のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているか又は１又は２のアミノ酸残基が存在しない。他の好ましい態様において、Ｒ’^２は−Ａｓｎ又は−Ｇｌｙである。他の好ましい態様において、Ｒ’^３はヒトインスリンのＢ１〜Ｂ６のこの順序でのアミノ酸残基であるが、場合により１又は２のアミノ酸が他のアミノ酸残基で置換されているか又は１又は２のアミノ酸残基が存在しない。他の好ましい態様では、Ｒ’^４はヒトインスリンのＢ２０〜Ｂ２９のこの順序でのアミノ酸残基、Ｂ２８にＡｓｐ及びＢ２９にＬｙｓを有することを条件としてヒトインスリンのＢ２０〜Ｂ２９のこの順序でのアミノ酸残基、及びＢ２８にＬｙｓを有することを条件としてヒトインスリンのＢ２０〜Ｂ２８のこの順序でのアミノ酸残基であって、それぞれにおいて場合により１又は２のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているか又は１又は２のアミノ酸残基が存在しないもの、又はそのＣ末端から１以上の連続アミノ酸残基が除かれたこれらのペプチド残基のいずれかの部分である。本発明の他の好ましい態様では、Ｚ_ｎはヒトインスリンのＡ８〜Ａ１９のこの順序でのアミノ酸残基であって、場合により１又は２のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたもの又は１又は２のアミノ酸残基が存在しないものである。本発明の他の好ましい態様では、Ｚ_ｍはヒトインスリンのＢ８〜Ｂ１８のこの順序でのアミノ酸残基であって、場合により１又は２のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているもの又は１又は２のアミノ酸残基が存在しないものである。

開裂反応及びカップリング反応の両者の間において、反応温度は反応混合物の凍結点から約５０℃の範囲内である。好ましい温度は約０℃から約２５℃の範囲内である。

簡潔に述べると、カップリング反応は次のように行われる。
インスリン前駆体の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９５％が所望の中間体生成物に開裂されたとき、一方では求核化合物及び、他方では有機溶媒を開裂が行われた反応混合物に混合してカップリング工程に便利或は有利な反応条件を得る。開裂（変換）の割合は開裂に用いた反応混合物における可能な平衡に基づく。通常は酵素開裂反応の始めからそして一定の時間が経過するまで、所望の中間体生成物、即ち所望の開裂生成物の収量は増加し、最高濃度に達する。その後、所望の開裂生成物の濃度は減少する。

本発明の好ましい態様では、カップリング反応が起こる前に開裂反応で生じる反応混合物から除かれる成分はない。これを行う単純な方法は、開裂反応後に、求核化合物及び十分な量の有機溶媒を加えることである。例えば、このようにして開裂工程に用いた酵素をカップリング工程にも用いる。

本発明方法は、所望の中間体生成物がほかにも少量の部分開裂インスリン前駆体及び/又は未反応インスリン前駆体を含む反応混合物内でのカップリング反応をも包含する。

本発明の他の好ましい態様では、求核化合物は、アミノ酸アミド又はペプチドアミドであって、カルボキサミド基が置換されていないか又は１６以上の炭素原子のアルキル基でモノ又はジ置換され、このアルキル基は隣接窒素原子と共に環又はカルボキサミド基を形成することができ、アリール基でモノ又はジ置換されている。脂肪族置換体が好ましい。置換カルボキサミド基の例は、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド、及びＮ−ヘキシルカルボキサミドである。

本発明の好ましい態様では、求核化合物はカルボキシル基が保護され、任意のヒドロキシ基が場合により保護されているアミノ酸エステルである。本発明の更に好ましい態様では、求核化合物はカルボキシル基が保護され、ヒドロキシル基が保護されているスレオニンエステルである。従って、Ｌ−スレオニンは次の一般式ＩＩＩａによって示される。

式中、Ｒ^６はカルボキシル保護基を示し、Ｒ^５は水素又はヒドロキシル保護基を示す。一層明確にするために、スレオニンエステルは一般式ＣＨ_３−ＣＨ（ＯＲ^５）−ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＲ^６［式中、Ｒ^６及びＲ^５は上記の通りである。］で表すことができる。

求核化合物は既知化合物もあり、他の求核化合物は既知化合物の調製と類似の方法又は既知方法と類似の方法で調製できる。

求核化合物は、遊離の塩基又は塩酸塩、アセテート、プロピオネート、及びブチレートのようなその可溶性塩の形態で用いることができる。

カップリング反応が開始するとき、実質的に過剰の求核化合物が、好ましくは約５：１を越える求核化合物と所望の中間体生成物との間のモル比で、カップリング反応混合物溶液に存在することが望ましい。カップリング反応が開始するとき、反応混合物内の求核化合物の濃度は、好ましくは０．１モルを越えるべきであるが上限濃度はその溶解度である。

本発明の実施の重要な観点として考えられる６０％収率を得るために、反応温度、水含量及びｐＨ値は記載の範囲内で相互に関連している。

本発明の実施に適した有機溶媒は、水と混和できる極性溶媒、好ましくは（例えば式ＩＩの）所望の中間体生成物及び求核化合物を高濃度で含むことができるものである。適当な有機溶媒の例は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、Ｎ−メチルピロリドン−２、及びジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒及び酢酸、エタノール、メタノール、２−プロパノール、１−プロパノール、ブタノール及び１，４−ブタンジオール等のプロトン性溶媒である。ジオキサン、アセトン、テトラヒドロフラン、フォルムアミド、及びアセトニトリルも用いることができ、求核化合物として用いられるアミノ酸エステルであっても全て又は部分的に有機溶媒として用いることができる。溶媒の特性は全体としての系に影響を与え、高収率のある溶媒の生産性に適した関係は異なる溶媒には適用できない。最高の収量結果は非プロトン性溶媒で得られ、非プロトン性溶媒は本発明の実施に最も好ましい。

明らかに反応混合物中の水の含量の計算又は決定の場合には、求核化合物は有機溶媒と考えられる。

塩酸、義酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の酸、ピリジン、ＴＲＩＳ、Ｎ−メチルモルフォリン、トリエチルアミン、又はＮ−エチルモリフォリン等の塩基の添加は任意である。これらは適当なｐＨ値をもたらすために反応混合物に含まれる。鉱酸又は塩基は本発明の実施に用い得るが、有機酸及び塩基、特に上記のものは好ましい。有機酸が最も好ましい。

カップリング反応が開始するとき、反応混合物中のトリプシン又はＡＬＰ（結晶トリプシン又はＡＬＰとして計算されたもの又は対応するトリプシン又はＡＬＰ誘導体の量）及び所望の中間体生成物の間の重量比は、約１：１０００〜約１：１０の範囲内であることが好ましく、約１：２００〜約１：５０の範囲内であることが特に好ましい。

若干の場合には、開裂工程において添加された酵素がカップリング反応を行うのに十分であり、このような場合には、カップリング工程の間に更なる量の酵素を添加する必要はない。他の場合には、カップリング工程の間に追加量の酵素を添加することが望ましいことがある。

溶液中の所望の中間体生成物及び求核化合物の高濃度が高変換速度を促進する限り、溶媒の選択は反応体が極めて溶解性である溶媒に向けられる。特に求核化合物の溶解性は、反応体は高濃度で存在すべきであるので、重要である。カップリング反応が開始するとき、求核化合物の所望の中間体生成物に対するモル比は５：１を越えること、好ましくは５０：１を越えることが好ましい。カップリング反応が開始するとき、反応混合物中の求核化合物の濃度は少なくとも０．１モルであることが好ましい。

本発明の好ましい態様では、インスリン分子に実質的な不可逆的変化を生じない条件下で生成インスリン化合物から除き得るカルボキシル保護基を有する求核化合物を用いる。このようなカルボキシル保護基の例として、低級アルキル、例えばメチル、エチル及びtert-ブチル、p-メトキシベンジル、ジフェニルメチル、及び2,4,6-トリメチルベンジルのような置換ベンジル基、及び一般式−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＳＯ_２Ｒ^７（Ｒ^７はメチル、エチル、プロピル、及びn-ブチルのような低級アルキルを示す）の基を挙げることができる。

適当なヒドロキシル保護基は、インスリン分子に実質的な不可逆的変化を生じない条件下で除き得るものである。このような基の例としてtert-ブチルを挙げることができる。

更に、通常用いられる保護基は、文献[Wunch: Metoden der Organishen Chemie (Houben-Weyl), Vol. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974]に記載されている。

本発明の１態様によると、本発明方法は、一般式ＩＶの化合物を生じる。

式中、Ｚ_ｎ及びＺ_ｍは、互いに独立して、それぞれｎ個及びｍ個のアミノ酸残基を有する２個のペプチド部分をそれぞれ示し、Ｒ’^１はペプチド残基を示し、Ｒ’^２はアミノ酸基又はペプチド残基を示し、Ｒ’^３はペプチド残基を示し、Ｒ’^４は上述した通りであり、Ｒ’⁶はカルボキシル保護基を有するアミノ酸又は場合によりカルボキシル保護基を有するペプチド残基である。

インスリン化合物に存在するカルボキシル保護基（例えば、Ｒ^８）及び任意のヒドロキシ保護基（例えば、Ｒ^５）は既知の方法又はそれ自体既知の方法によって除くことができる。カルボキシル保護基がメチル、エチル、又は一般式−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＳＯ_２Ｒ^７（Ｒ^７は上記の通りである）の基である場合、該保護基は水性媒体中で温和な塩基性条件下、好ましくは約８〜約１２の範囲内のｐＨ値で、例えば約９．５で除くことができる。塩基として用い得るのは、強塩基、例えば第３級アミン、例えばトリエチルアミン、水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属の水酸化物、水酸化カルシウム、又はマグネシウムのようなアルカリ土類金属の水酸化物である。カルボキシ保護基がtert-ブチル、置換ベンジル、例えばp-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメチルベンジル、又はジフェニルメチルである場合、この基はアシドリシス(acidolysis)で、好ましくはトリフルオロ酢酸で除くことができる。トリフルオロ酢酸は非水性であることができ、水を含むことができ、又はジクロロメタンのような有機溶媒で希釈できる。ヒドロキシ保護基（例えばＲ^５）がtert-ブチルである場合、この基は上述したようにアシドリシスで除くことができる。
製造されたインスリン化合物はヒドロキシ保護基を有しないことが好ましい。

本発明の好ましい態様では、本発明方法はインスリン前駆体（例えば、式Ｉ）を、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基にカルボキシル保護基を有するインスリン化合物（例えば式ＩＶ）に変換し、これは次いで脱ブロックしてカルボキシ保護基を有しないインスリン化合物を形成する。

反応条件を上記の説明に基づいて選択し、次の例で得られる結果を考慮すると、６０％より高い、及び８０％よりも高い、及び一定の好ましい条件下では９０％より高いインスリン化合物の収量を得ることが可能である。

本発明方法により、許容できる純度のインスリン化合物が得られ、所望により、治療目的で更に精製できる。

特に、例えば、インスリンaspartは、Ｇｌｕ−（Ｇｌｕ−Ａｌａ）_３−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．１）でＮ末端延長された［Ａｓｐ²⁸］−デス（３０−６５）ヒトプロインスリンのようなインスリン前駆体のＡＬＰでの酵素開裂及びＬ−スレオニンメチルエステルのような求核化合物によるカップリング、それに続く加水分解によって製造できる。

例えば、インスリンlisproは、ブタインスリンのような前駆体のトリプシンでの酵素開裂及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列表Ｎｏ．３）のような求核化合物でのカップリングによって製造できる。

例えば、インスリンglarginは、［Ｇｌｙ⁶⁶］−デス（３０−６５）ヒトプロインスリンのようなインスリン前駆体のＡＬＰでの酵素開裂及びＴｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＭｅのような求核化合物でのカップリング、それに続く加水分解によって製造できる。

ここで用いた略号は、バイオケミカル命名に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会が承認（１９７４）したルールによるものである。［Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd edition, Maryland 1975参照]。
ここにおける引用文献の指摘は先行技術を構成することを承認するものではない。
ここにおける「包含する」の語は広く「含む」、「含有する」又は「包容する」と解すべきである（ＥＰＯガイドラインＣ４．１３参照）

次に挙げる例は、説明のために示すもので限定するものではない。
例１
２００ｍｇの［Ａｌａ³¹，Ｌｙｓ³²］−デス（３３−６３）ブタプロインスリンを１．３５ｍｌの水中に懸濁し、１０μｌのトリエチルアミンでｐＨ値を９に調整した。３７５μlのN,N-ジメチルアセトアミド及び４６０μlの水の混合物を僅かに攪拌して加え、生成溶液に３１５μｌのAchromobacter lyticus lysyl特異性プロテアーゼ(EC3.4.21.50)（ここでＡＬＰと称する）の５．４ｍｇ／ｍｌ水性溶液を加えた。２０μｌトリエチルアミンでｐＨ値を９．８に調整し、反応溶液を２３℃で１時間放置した。反応溶液を７０μｌの４Ｎ塩酸の添加で酸性化し、氷浴で冷却した。４．８５mlのN,N-ジメチルアセタミド中３００mgのL-スレオニンメチルエステルの溶液を加え、４５０μlの４Ｎ塩酸の添加でｐＨ値を６．５に調整した。反応溶液を２３℃で４時間放置した後、塩酸の添加によりｐＨ値を＜３にして反応を停止した。ｐＨ値４に調整した０．１２５Ｍ硫酸アンモニウムを含むエタノール−水溶出液での４mmｘ２５０mm５μmＣ１８シリカカラム上での逆相(reversed phase)ＨＰＬＣ分析によってヒトインスリンメチルエステルに対し８６％の変換収率が５時間の全反応時間の後に見出された。

比較のために、１工程変換を行った。
１００ｍｇの［Ａｌａ³¹，Ｌｙｓ³²］−デス（３３−６３）ブタプロインスリンを８８７μlの水及び１７５μｌのN,N-ジメチルアセトアミドの混合物中に懸濁した。１５０mgのL-スレオニンメチルエステルを２．２６５mlのN,N-ジメチルアセトアミド中に溶解し、氷冷混合物に徐々に添加した。３４０μlの酢酸でｐＨ値を６．５に調整し、１５８μlの５．４mg/mlＡＬＰ水溶液を加えた。変換反応の後、酸性化試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。５時間後、ヒトインスリンメチルエステルへの５３％変換が見出され、２４時間後に変換は８７％の最大値に達した。

単離したヒトインスリンメチルエステルは、１０mg/mlの濃度でｐＨ値が１０で水中に溶解してヒトインスリンに変換した。反応は１Ｎ塩酸でｐＨ値を５．２に調整して２４時間後に停止し、沈殿したヒトインスリンは遠心分離で単離し、逆相高速液体クロマトグラフィによって精製した。

同一反応時間、即ち、５時間で本発明方法による収率は、それ自体既知の方法と比較して６２％改良された。本発明方法の反応時間と比較して、それ自体既知の１工程変換の反応時間をほぼ５倍に延長すると、両方法はほぼ同一の収率を得た。

例２
２００mgのブタインスリンを１．３７mlの水に懸濁し、２９４μlのN-メチル-2-ピロリドン及び３２６μlの水の混合物を僅かに攪拌して添加した。１０μlの２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ値を９．０に調整し、生成溶液にＡＬＰの５．４mg/ml水溶液を３１５μl加えた。１２μlの２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ値を９．８に調整し、反応溶液を２３℃で４時間放置した。反応溶液は７０μlの４Ｎ塩酸を添加して酸性化し、氷浴で冷却した。４．４mlのＮ−メチル-2-ピロリドン中の３００mgのL-スレオニンメチルエステルの溶液を５００μlの４Ｎ塩酸で酸性化した。インスリン溶液を徐々に添加し、５０μlの２Ｎ塩酸でｐＨ値を６．５に調整した。反応溶液を２３℃に４時間放置した後、塩酸を添加してｐＨ値を＜３にして反応を停止した。ｐＨ値を４に調整した０．１２５Ｍ硫酸アンモニウムを含むエタノール−水溶出液による４mm×２５０mm５μmＣ１８シリカカラムでの逆相ＨＰＬＣ分析によって、ヒトインスリンメチルエステルに対する８６％の変換率が８時間の全反応時間後に見出された。

比較のために、１工程変換を行った。
１００mgブタインスリンを８４８μlの水及び１４７μlのＮ−メチル-2-ピロリドンの混合物に懸濁した。１５０mgのL-スレオニンメチルエステルを２．２mlのＮ−メチル-2-ピロリドンに溶解し、氷冷混合物に徐々に添加した。３００μlの酢酸でｐＨ値を６．５に調整し、ＡＬＰの５．４mg/ml水性溶液の１５８μlを加えた。反応溶液を２３℃に放置し、変換反応後に酸性化試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。８時間後、変換が５４％であることが見出され、４８時間後にヒトインスリンメチルエステルに対する８６％の最高変換に達した。

単離したヒトインスリンメチルエステルはアルカリ性加水分解によってヒトインスリンに変換できた。
同一の変換時間、即ち８時間で、本発明方法の収量は、それ自体既知の方法に比較して５９％改良された。両者の方法は、本発明方法の反応時間に比べてそれ自体既知の１工程変換の反応時間を８倍に延長すると同一の収量が得られた。

例３
２００mgのペプチドＧｌｕ−（Ｇｌｕ−Ａｌａ）_３−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．１）でＮ末端延長した［Ａｓｐ²⁸］−デス（３０−６５）ヒトプロインスリンを、１．３５mlの水に懸濁した。３５０μlのＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド及び４２５μlの水の混合物を僅かに攪拌しながら加え、４５μlのトリエチルアミンでｐＨ値を９に調整した。生成溶液にＡＬＰの８．５mg/ml水性溶液の２００μlを加え、２０μlのトリエチルアミンでｐＨ値を９．８に調整した。反応溶液を２３℃に１時間放置した。反応溶液を７０μlの４Ｎ塩酸を添加して酸性化し、氷浴中で冷却した。４．９５mlのＮ，Ｎ−ジメチルフォルマミド中３００mgのL-スレオニンメチルエステルの溶液を添加し、４７０μl４Ｎ塩酸の添加でｐＨ値を６．５に調整した。反応溶液を２３℃で４時間放置した後、塩酸を加えてｐＨ値を＜３にして反応を停止した。ｐＨ値を４に調整した０．１２５Ｍ硫酸アンモニウムを含むエタノール−水溶出液の４mm×２５０mm５μmＣ１８シリカカラムでの逆相ＨＰＬＣ分析によって、［Ａｓｐ^B28］−ヒトインスリンメチルエステルに対して８７％の変換収量が５時間の全反応時間の後に見出された。

比較のために、1工程変換を行った。
９０mgのペプチドＧｌｕ−（Ｇｌｕ−Ａｌａ）_３−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．１）でＮ末端延長した［Ａｓｐ²⁸］−デス（３０−６５）ヒトプロインスリンを、８８７μlの水及び１７５μlのＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドの混合物に懸濁した。１５０mgのL-スレオニンメチルエステルを２．１３mlのＮ，Ｎ−ジメチルフォルマミドに溶解し、氷冷却した混合物に徐々に添加した。２５０μl酢酸でｐＨ値を６．５に調節し、ＡＬＰの８．５mg/ml水性溶液を加えた。変換反応後に酸性化試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。５時間後に変換は４７％であることを見出し、２４時間後に［Ａｓｐ^B28］−ヒトインスリンメチルエステルへの変換が最高の８１％に達した。

単離したインスリンメチルエステルはアルカリ性加水分解によって［Ａｓｐ^B28］−ヒトインスリンに変換できた。

同一の反応時間、即ち５時間後に、それ自体既知の方法に比較すると、本発明方法による収量はほぼ２倍であった。それ自体既知の一工程変換の反応時間を本発明方法の反応時間と比較してほぼ５倍に延長すると、両者の方法で同等の収量が得られた。

例４
ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．２）でＮ−末端延長した、インスリンaspart前駆体［Ａｓｐ²⁸，Ｍｅｔ³⁰，Ｔｒｐ³¹，Ｌｙｓ³²］−デス（３３−６５）ヒトプロインスリンの１．５gを３．５gの水に懸濁した。僅かに攪拌しながら周囲温度で、４Ｍ水酸化ナトリウムを徐々に添加してｐＨ値を１０．６７とし、前駆体を溶解した。水中エタノールの４５％（重量／重量）溶液の３．７gを添加した。ＡＬＰの５．８mg/ml水性溶液の１．５mlを加え、混合物を２時間放置して反応させた。４Ｎ塩酸を添加してｐＨ値を４．７に調整した。２．０２５gのＬ−スレオニンエチルエステルを１６．２mlのエタノールに溶解し、溶液を最高温度１５℃で添加した。４Ｎ塩酸でｐＨ値を６．５に調節した。温度は周囲温度に調整し、この温度で２０時間この反応混合物を放置した。ｐＨ値を３．６に調整した２００ｍＭ硫酸ナトリウムを含むアセトニトリル−水溶出液の４mm×２５０mm５μmＣ１８シリカカラムでの逆相ＨＰＬＣ分析によって、１時間の反応時間後に８９．１％インスリンaspartの変換収量が見出され、２０時間の反応時間後に９０．５％の変換収量が見出された。
単離したインスリンaspartエチルエステルはアルカリ性加水分解によってインスリンaspartに変換することができた。

例５
ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列表Ｎｏ．２）でＮ−末端延長した、インスリンaspart前駆体［Ａｓｐ²⁸，Ｍｅｔ³⁰，Ｔｒｐ³¹，Ｌｙｓ³²］−デス（３３−６５）ヒトプロインスリンの１０．９gを４９．３gの水に懸濁した。僅かに攪拌しながら周囲温度で、０．３６Ｍ水酸化ナトリウム、０．２７Ｍ酢酸ナトリウム及び３６％Ｎ−メチル-2-ピロリドンを含む混合物から３７．６gを徐々に添加して前駆体を溶解した。９．２mlの０．５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ値を９．７に調整した。ＡＬＰの７．１mg/ml水性溶液の７．１mLを添加し、混合物を5時間放置して反応させた。反応の間に０．５Ｍ水酸化ナトリウムを更に加えてｐＨ値を９．７の一定に保った。反応混合物を5℃に冷却し、２．７３gの４Ｎ塩酸を添加してｐＨ値を５．７に調節した。１４．０２ｇのL-スレオニンエチルエステルを加え、４Ｎ塩酸でｐＨ値を６．０に調節した。３４４gの冷（４℃）Ｎ−メチル-2-ピロリドンを加えた。温度を２２℃に調節し、４Ｎ塩酸でｐＨ値を６．５に調節した。反応混合物をこの温度で９時間放置した。ｐＨ値を３．６に調整した２００ｍＭ硫酸ナトリウムを含むアセトニトリル−水溶出液の４mm×２５０mm５μmＣ１８シリカカラムでの逆相ＨＰＬＣ分析によって、１４時間の全反応時間後にインスリンaspartエチルエステルへの８７．５％の変換収量を見出した。

単離したインスリンaspartエチルエステルは、アルカリ性加水分解でインスリンaspartに変換することができた。

Claims

ａ）少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％の水(重量／重量)を含む反応混合物中においてインスリン前駆体を酵素開裂に付し、及びその後、反応混合物から中間体生成物を単離することなく、
ｂ）水が約１０％〜約５０％（重量／重量）の範囲、好ましくは水が約２０％〜約４０％（重量／重量）の範囲の水含量を有する反応混合物中において、該中間体生成物を求核化合物とカップリングさせ、かつ
ｃ）所望により保護基を除く
インスリン化合物の製造方法。
ａ）少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％の水(重量／重量)を含む反応混合物中においてインスリン前駆体を酵素開裂に付し、及びその後、
ｂ）反応混合物中の水含量を水が約１０％〜約５０％（重量／重量）の範囲、好ましくは水が約２０％〜約４０％（重量／重量）の範囲であるように反応混合物の組成を変更することを条件として、酵素開裂に用いた反応混合物中において該中間体生成物を求核化合物とカップリングさせ、かつ
ｃ）所望により保護基を除く
インスリン化合物の製造方法。
該開裂工程とカップリング工程の間で中間体生成物の単離を行わない請求項２に記載の方法。
該開裂工程に用いた酵素が該カップリング工程にも存在する請求項２に記載の方法。
カップリング反応が開始する前に、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも９５％のインスリン前駆体が中間体生成物に開裂される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
酵素開裂に用いられる酵素がトリプシン又はリシル特異性プロテアーゼ、好ましくはアクロモバクターリティカスプロテアーゼIである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がアミノ酸エステルである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がスレオニンエステルである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がアミノ酸アミドである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がペプチドである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がペプチドエステルである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
該求核化合物がペプチドアミドである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
該インスリン化合物から保護基を除く工程を含む請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
生成インスリン化合物がＢ３０位置にスレオニンを有する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
生成化合物がヒトインスリン、インスリンaspart、インスリンlispro、インスリンglargin、又はインスリンdetermirである請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で製造されたインスリン化合物。
ここに記載された新規な特徴又は特徴の組合せ。