ES2344448T3 - Proceso para preparar compuestos de insulina. - Google Patents
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Abstract
Proceso para preparar un compuesto de insulina donde a) en una mezcla reactiva conteniendo al menos aproximadamente un 55%, preferiblemente al menos aproximadamente un 60%, más preferido al menos un 70%, de agua (peso/peso), un precursor de insulina está sujeto a una escisión enzimática y, después de eso, b) el producto intermedio se acopla con un compuesto nucleófilo en la mezcla reactiva usada para la reacción de escisión enzimática con la condición de que la composición de la mezcla reactiva ha sido modificada de modo que el contenido de agua en la mezcla reactiva está en el rango de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% de agua (peso/peso), preferiblemente en el rango de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% de agua (peso/peso), y c), si se desea, eliminando el/los grupo(s) de protección, y donde ningún aislamiento del producto intermedio se realiza entre la fase de escisión (a) y la fase de acoplamiento (b).
Description
Proceso para preparar compuestos de
insulina.
La presente invención se refiere a un proceso
mejorado para la conversión de un precursor de insulina en un
compuesto de insulina, opcionalmente vía un éster de insulina.
La insulina es una hormona pancreática implicada
en la regulación de concentraciones de glucosa en sangre. Por
ejemplo, la insulina humana, porcina, y bovina, análogos de insulina
e insulinas mezcladas se dan a pacientes con diabetes mellitus
insulino-dependiente para controlar sus
concentraciones de glucosa en sangre.
La insulina porcina y bovina normalmente se
prepara a partir de glándulas del páncreas. Insulina humana se
puede, semisintéticamente, preparar a partir de insulina porcina.
Alternativamente, la insulina humana, al igual que muchos análogos
de insulina, se pueden preparar por ingeniería genética. Por
ingeniería genética, que, por ejemplo, puede ser realizada en
bacterias o en levadura, un precursor de insulina se prepara que,
después de eso, debe ser convertido en el producto deseado. Esta
conversión puede ser realizada en formas diferentes.
Una posibilidad es la denominada
transpeptidación donde una escisión peptídica y un acoplamiento
peptídico se desarrolla consecutivamente en la misma mezcla
reactiva, en las mismas condiciones de reacción, véase, por ejemplo,
la patente estadounidense nº. 4,343,898 (Novo Industri).
Otra posibilidad es, en la primera fase,
disociar el precursor de insulina, véase, por ejemplo,
Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 (1978), 799,
después de eso, para aislar el producto intermedio y, después,
ejecutar el acoplamiento deseado en otra mezcla reactiva que la
usada en la primera fase, véase, por ejemplo, Nature 280 (1979),
412.
Según EP 87,238, una reacción de la
transpeptidación se realiza en un sistema de solvente comprendiendo
entre aproximadamente el 75% y el 97% (vol/vol) de al menos un
solvente mezclable de reacción no acuoso incluyendo al menos
aproximadamente un 50% (vol/vol) de
butano-1,4-diol.
Según US 4,579,820, el proceso de la
transpeptidación se realiza usando una enzima carboxipeptidasa de la
serina L-específica, por ejemplo carboxipeptidasa
Y.
Según US 4,601,979 (Nordisk
Insulinlaboratorium), la transpeptidación o solamente el
acoplamiento peptídico se realiza en un medio de reacción acuoso
sustancialmente libre de solvente orgánico.
Según WO 83/00504 (Nordisk Insulinlaboratorium),
un producto porcino fue tratado con carboxipeptidasa A, el producto
de des-alanina-B30 insulina
resultante fue suspendido en un alcohol inferior, y esta suspensión
fue mezclada con una solución de un éster de
L-treonina y tripsina. En todos los ejemplos
específicos, el producto de
des-alanina-B30 insulina fue
aislado, bien por liofilización o por precipitación.
La reivindicación 1 en EP 264,250 se refiere a
un proceso para la conversión de un precursor de insulina humana en
insulina humana, donde dicho precursor se trata con tripsina o
carboxipeptidasa B en un medio acuoso conteniendo un primer ión
metálico seleccionado entre 60 metales y un segundo ión metálico
seleccionado entre 6 metales. En J. Mol. Recognition 3 (1990),
181-186, se describe diferentes métodos para
preparar compuestos de insulina incluyendo una escisión enzimática
seguida de reacción del producto intermedio con un nucleófilo. El
producto intermedio de la reacción de escisión tiene que ser
aislado.
El objetivo de esta invención es superar o
mejorar al menos algunas desventajas del estado de la técnica. Por
lo tanto, no todos los objetos más detallados mencionados a
continuación pueden ser completamente superados o mejorados.
El término "aminoácido" como se utiliza en
este caso, se refiere a aminoácidos que pueden ser codificados por
secuencias de nucleótidos. Análogamente, esto se aplica al término
residuo de aminoácidos que es un aminoácido del cual hidroxi se ha
eliminado de un grupo de carboxi y/o hidrógeno se ha eliminado de un
grupo amino.
De manera similar, los términos péptido y
residuo peptídico consisten en residuos de aminoácidos.
Preferiblemente, el péptido no contiene más de 10 residuos de
aminoácidos.
El término amida de aminoácido, como se utiliza
en este caso, se refiere a un aminoácido con un grupo C carboxamida
terminal opcionalmente sustituido.
El término amida peptídica, como se utiliza en
este caso, se refiere a un péptido con un grupo C carboxamida
terminal opcionalmente sustituido.
El término "precursor de insulina", como se
utiliza en este caso, se refiere a un polipéptido que consiste en
dos cadenas peptídicas (correspondientes a las cadenas A y B de
insulina y, de ahora en adelante, ha designado las cadenas A y B)
que, de manera similar con insulina, se conectan entre sí vía dos
puentes disulfuro (de un residuo de cisteína (Cys) a otro residuo de
cisteína) entre las dos cadenas peptídicas y donde, como en la
insulina, hay un puente disulfuro de un residuo de cisteína en la
cadena A a otro residuo de cisteína en la cadena A. En este
precursor de insulina hay, al menos, una lisina o un residuo de
arginina en la cadena B. Opcionalmente, en este precursor de
insulina, las cadenas A y B se conectan entre sí vía una tercera
cadena peptídica (correspondiente al péptido de conexión en
insulina) entre el extremo C terminal de la cadena B y el extremo N
terminal de la cadena A. En caso de que las cadenas A y B se
conecten entre sí vía esta tercera cadena peptídica, la lisina está
presente en el extremo C terminal de este tercer péptido.
Opcionalmente, en este precursor de insulina, una cuarta cadena
peptídica puede ser conectada al extremo N terminal de la cadena B.
En caso de que esta cuarta cadena peptídica se conecte al extremo N
terminal de la cadena B, la lisina está presente en el extremo C
terminal de esta cuarta cadena peptídica. Además, en este precursor
de insulina, hay una identidad de los residuos de aminoácidos de al
menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, más preferido al
menos un 90%, y aún más preferido al menos un 95%, en comparación
con la insulina humana, con la condición de que las terceras y
cuartas cadenas peptídicas no deben ser tenidas en cuentas para este
cálculo. En insulina humana, hay puentes disulfuro entre Cys^{A6}
y Cys^{A11}, entre Cys^{A7} y Cys^{B7}, y entre Cys^{A20} y
Cys^{B19} y hay lisina en la posición B29.
El término "éster de aminoácido", como se
utiliza en este caso, se refiere a un aminoácido que lleva un grupo
de protección carboxi C terminal y, opcionalmente, un grupo de
protección hidroxi.
El término "éster peptídico", como se
utiliza en este caso, se refiere a un péptido donde al menos el
grupo carboxi C terminal lleva un grupo de protección carboxi.
Opcionalmente, cualquier grupo hidroxi está protegido y,
opcionalmente, el grupo \varepsilon-amino de
cualquier residuo de lisina es derivatizado, preferiblemente con un
grupo hidrofóbico, por ejemplo un grupo acilo que tiene al menos 10
átomos de carbono. Preferiblemente, el éster peptídico no contiene
más de 10 residuos de aminoácidos.
El término compuesto nucleófilo, como se utiliza
en este caso, se refiere a un éster de aminoácido, una amida de
aminoácido, un péptido, un éster peptídico, y una amida peptídica.
En cualquiera de estos ésteres de aminoácidos, las amidas de
aminoácidos, péptidos, ésteres peptídicos, y amidas peptídicas, el
grupo amino en cualquier grupo de lisina es, opcionalmente,
derivatizado, preferiblemente con un grupo hidrofóbico, por ejemplo,
un grupo acilo que tiene al menos 10 átomos de carbono.
El término "compuesto de insulina", como se
utiliza en este caso, se refiere a insulina de cualquier especie tal
como insulina porcina, insulina bovina, e insulina humana y sales
derivadas tales como sales de zinc, y sales de protamina. Además, el
término "compuesto de insulina", como se utiliza en este caso,
se refiere a qué podría brevemente ser designado "análogos de
insulina". Análogos de insulina, como se utiliza en este caso, se
refiere a compuestos de insulina donde uno o más de los residuos de
aminoácidos han sido intercambiados por otro residuo de aminoácido
y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos han sido
delecionados y/o de los cuales uno o más residuos de aminoácidos han
sido añadidos, a condición que dicho análogo de insulina tenga una
actividad insulínica suficiente. Ejemplos de análogos de insulina se
describen en las siguientes patentes y equivalentes de las mismas:
US 5,618,913; EP 254,516; EP 280,534; US 5,750,497; y US 6,011,007.
Ejemplos de análogos de insulina específicos son la insulina aspart
(es decir, insulina [Asp^{B28}] humana), insulina lispro (es
decir, insulina [Lys^{B28}, Pro^{B29}] humana), y insulina
glargina (es decir, insulina [Gly^{A21}, Arg^{B31}, Arg^{B32}]
humana). El término "análogo de insulina", como se utiliza en
este caso también abarca lo que podría ser designado derivados
insulínicos, es decir, compuestos que un trabajador experto en la
técnica generalmente consideraría derivados de insulina, véase
libros de texto generales, por ejemplo, insulina con un sustituyente
no presente en la molécula progenitora de insulina. Ejemplos de
derivados insulínicos son insulinas o análogos de insulina con un
grupo carboxamida opcionalmente sustituido. También compuestos que
pueden ser considerados tanto como un derivado insulínico como un
análogo de insulina aquí están cubiertos por el término análogo de
insulina. Ejemplos de compuestos de este tipo se describen en las
siguientes patentes y equivalentes de las mismas: US 5,750,497 y US
6,011,007. Por lo tanto, otro ejemplo de un análogo de insulina
específico es insulina (es decir, insulina
des-Thr^{B30} humana y Lys^{B29} tetradecanoil).
Los compuestos de insulina detemir preparados por esta invención
tienen una actividad antidiabética suficientemente alta para ser
usada para tratar pacientes diabéticos. La actividad antidiabética
puede ser determinada usando el denominado ensayo libre de células
de la grasa.
El término valor de pH, como se utiliza en este
caso, se refiere al valor medido con un medidor de pH por inmersión
de un electrodo de vidrio de la combinación de calomelanos conectado
al medidor de pH directamente en la solución, cuyo valor de pH debe
ser medido. El medidor de pH se calibra con un tampón estándar
acuoso.
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO.: 1 es la fracción peptídica
Glu-(Glu-Ala)_{3}-Pro-Lys-;
SEC ID NO.: 2 es la fracción peptídica
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-;
y SEC ID nº.: 3 es la fracción peptídica
Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr.
\newpage
La presente invención se refiere a un proceso
para preparar compuestos de insulina. Estos compuestos de insulina
pueden ser usados como medicamentos. En una forma de realización
preferida de esta invención, se preparan compuestos de insulina que
tienen treonina (Thr) en el extremo C terminal de la cadena B.
Cualquier trabajador experto en la técnica, por
ejemplo, un médico, es capaz de determinar qué dosificaciones de los
compuestos de insulina se debe administrar a un paciente diabético,
y cuándo.
La materia prima para el proceso de esta
invención es un precursor de insulina que está sujeto tanto a una
escisión peptídica como un acoplamiento peptídico a condiciones que
favorecen ambas reacciones pero donde ningún aislamiento del
producto intermedio se lleva a cabo. En otras palabras, el precursor
de insulina está sujeto a una escisión peptídica y el resultante
producto, es decir, el intermedio, está sujeto a un acoplamiento
peptídico. Las condiciones que favorecen una escisión peptídica no
son idénticas a las condiciones que favorecen un acoplamiento
peptídico. Por lo tanto, en la primera fase de esta invención, es
decir, la fase de escisión o la reacción de escisión, las
condiciones de reacción en la mezcla reactiva se eligen para
favorecer la escisión peptídica y, en la segunda fase de esta
invención, es decir, la fase de acoplamiento o la reacción de
acoplamiento, las condiciones de reacción en la mezcla reactiva se
alteran para favorecer el acoplamiento peptídico.
En una forma de realización de esta invención,
el precursor de insulina, en la primera fase, se disuelve en un
medio predominantemente acuoso y se añade la enzima usada para
escisión. Esta mezcla reactiva puede ser libre o sustancialmente
libre de solvente orgánico. Alternativamente, la mezcla reactiva
puede contener una cantidad determinada de solvente orgánico que
puede asegurar una solubilidad apropiada del precursor de insulina.
No obstante, se desea no usar tanto solvente orgánico que tiene una
influencia indeseada en la escisión enzimática. En la primera fase
del proceso de esta invención, los parámetros de la reacción tal
como valor de pH, temperatura, y tiempo, se eligen de modo que son
favorables para escisión en el/los residuo(s) de lisina o
residuo(s) de arginina.
Cuando la reacción de escisión se ha llevado a
cabo a un grado determinado deseado, un compuesto nucleófilo y un
solvente orgánico se mezcla con la mezcla reactiva (sin aislamiento
precedente del producto intermedio), de modo que el acoplamiento del
compuesto nucleófilo al residuo de lisina o residuo de arginina del
producto intermedio deseado se lleva a cabo. En esta fase, los
parámetros de la reacción se establecen para ser favorables a la
reacción de acoplamiento. En una forma de realización preferida de
esta invención, el compuesto nucleófilo es un éster de aminoácido,
por ejemplo un éster de treonina, o un éster peptídico.
Después de eso, el/los grupo(s) de
protección puede(n), si se desea, ser eliminado(s) del
compuesto resultante.
Comparado con la reacción de transpeptidación
conocida, las ventajas obtenidas por el proceso de esta invención es
un tiempo de reacción total más corto con la misma cantidad de
enzima y un rendimiento similar o más alto. Comparado con una
reacción en dos etapas con escisión en un medio acuoso, aislamiento
del producto intermedio, y acoplamiento en una mezcla de solvente
orgánico y agua, las ventajas obtenidas por el proceso de esta
invención es un tiempo de reacción total más corto, el uso de una
cantidad inferior de enzima, y un flujo del proceso más fácil.
Más precisamente, esta invención se refiere a
las siguientes formas de realización:
\vskip1.000000\baselineskip
Como resulta de la reivindicación 1, primero una
escisión peptídica se lleva a cabo y, después de eso, una reacción
de acoplamiento se lleva a cabo.
Brevemente, la reacción de escisión (es decir,
la escisión enzimática) se realiza de la siguiente manera:
- La escisión enzimática del precursor de insulina (es decir, la escisión peptídica) se lleva a cabo en una mezcla reactiva conteniendo al menos aproximadamente un 55%, preferiblemente al menos aproximadamente un 60%, más preferido al menos un 70%, de agua (peso/peso).
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida de esta
invención, la concentración del precursor de insulina en la mezcla
reactiva donde la escisión enzimática se lleva a cabo es al menos un
2%, preferiblemente en el rango de aproximadamente un 5 a
aproximadamente un 10% (peso/vol).
La reacción de escisión se realiza en un medio
neutro o alcalino, preferiblemente con un valor de pH en el rango de
aproximadamente 6 a aproximadamente 11, más preferido en el rango de
aproximadamente 8 a aproximadamente 10.
En una forma de realización preferida de esta
invención las cantidades de enzima comparadas con la cantidad de
precursor de insulina está en el rango de aproximadamente un 0,05 a
aproximadamente un 5% (peso/peso), preferiblemente de
aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 2%.
La enzima tríptica no es material para la
práctica de esta invención. La tripsina es una enzima caracterizada
adecuadamente disponible en alta pureza, sobre todo de origen bovino
o porcino. De origen microbiano, la proteasa I de Acromobacter
lyticus (de ahora en adelante designada ALP) puede ser obtenida.
Además, la forma de enzima, si es una enzima nativa o una enzima
activa inmovilizada o un derivado enzimático, no es material para la
práctica de esta invención. Si se desea dividir en el extremo C
terminal de arginina, se puede usar tripsina y si se desea dividir
en el extremo C terminal de lisina, se puede usar bien tripsina o
ALP. Para la división en el extremo terminal C de lisina, se
prefiere ALP.
Como ejemplos de derivados de enzima activos se
puede mencionar tripsina acetilada, tripsina succinilada, tripsina
tratada de glutaraldehído, y derivados de tripsina inmovilizada o de
ALP.
Si se usa una tripsina inmovilizada o un ALP, se
suspende en la mezcla reactiva o puede ser envasada en una
columna.
En gran parte, la acción de la enzima se
controla por una interrelación de agua y contenido de solvente, el
valor de pH, y la temperatura de la reacción. Aumentar la
concentración de solvente orgánico en la mezcla reactiva y disminuir
el valor de pH alrededor de neutro cambia la reacción enzimática
usual de la escisión hacia el acoplamiento. Reducir la temperatura
reduce la velocidad de reacción, pero puede también reducir la
formación de subproducto y la desnaturalización enzimática.
En una forma de realización preferida de esta
invención, el precursor de insulina se disuelve en un medio acuoso
con una concentración de iones de acetato en el rango de
aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM, preferiblemente en el
rango de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM. Por
ejemplo, sodio, potasio, acetato amónico o acetato amónico de
trietilo pueden ser usados.
Según una forma de realización de esta
invención, el precursor de insulina (siendo un péptido) puede ser
ilustrado por la siguiente fórmula general I:
donde Z_{n} y Z_{m},
independientes entre sí, representan dos fracciones peptídicas cada
una conteniendo n y m residuos de aminoácidos, respectivamente,
R^{1} representa un residuo peptídico, dicho residuo peptídico
contiene opcionalmente un residuo de lisina o residuo de arginina,
R^{2} representa un residuo de aminoácido o un residuo peptídico,
R^{3} representa un residuo peptídico, dicho residuo peptídico
contiene opcionalmente un residuo de lisina o residuo de arginina,
R^{4} representa un residuo de lisina o residuo de arginina o un
residuo peptídico, dicho residuo peptídico contiene un residuo de
lisina o residuo de arginina, o R^{1} y R^{4} son juntos un
residuo peptídico conteniendo un residuo de lisina o residuo de
arginina, las dos líneas verticales indican los enlaces de disulfuro
entre los dos residuos de cisteína y, además, hay un enlace de
disulfuro entre dos residuos de cisteína presentes en R^{1} y en
Z_{n}.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, los residuos de aminoácidos
presentes en el precursor de insulina de fórmula I son los que
pueden ser codificados por las secuencias de nucleótidos.
Según una forma de realización preferida de esta
invención, se usa un precursor de insulina, donde el número de
residuos de aminoácidos en R^{1} y R^{4} juntos está en el rango
de aproximadamente 8 a aproximadamente 50. En otra forma de
realización preferida de esta invención, Z_{n} contiene 12
residuos de aminoácidos. En otra forma de realización preferida de
esta invención, Z_{m} contiene 11 residuos de aminoácidos. En otra
forma de realización preferida de esta invención, R^{2} contiene 1
residuo de aminoácidos, por ejemplo, Asn o Gly. En otra forma de
realización preferida de esta invención, R^{3} contiene 6 residuos
de aminoácidos.
En una forma de realización preferida de esta
invención, el precursor de insulina es un precursor de cadena única,
es decir, un compuesto de fórmula I donde R^{1} y R^{4} juntos
son un residuo peptídico conteniendo un residuo de lisina o residuo
de arginina. Por lo tanto, preferiblemente, el precursor de insulina
no es insulina mamífera tal como insulina porcina, insulina de
conejo, insulina de perro o insulina de ballena.
Según otra forma de realización de esta
invención, el precursor de insulina de fórmula I contiene los mismos
residuos de aminoácidos en las posiciones A1 a A21 y en las
posiciones B1 a B29 como están presentes en insulina humana en las
mismas posiciones.
Según otra forma de realización de esta
invención, el precursor de insulina de fórmula I contiene los mismos
residuos de aminoácidos en las posiciones A1 a A21 y en las
posiciones B1 a B29 con la condición de que el residuo de aminoácido
B28 sea Asp.
Según otra forma de realización de esta
invención, el precursor de insulina de fórmula I contiene los mismos
residuos de aminoácidos en las posiciones A1 a A21 y en las
posiciones B1 a B29 como están presentes en insulina humana en las
mismas posiciones con la condición de que el residuo de aminoácido
B28 sea Lys y el residuo de aminoácido B29 sea Pro.
Según otra forma de realización de esta
invención, el precursor de insulina de fórmula I contiene los mismos
residuos de aminoácidos en las posiciones A1 a A21 y en las
posiciones B1 a B29 como están presentes en insulina humana en las
mismas posiciones con la condición de que el residuo de aminoácido
A21 sea Gly y los residuos de aminoácidos B31 y B32 ambos sean
Arg.
Ejemplos de precursores de insulina específicos
que pueden ser usados en el proceso de esta invención son
proinsulina humana; proinsulina de mono; proinsulina [Ala^{31},
Lys^{32}]-des(33-63)
porcina; insulina porcina; proinsulina
[Asp^{28}]-des(30-65)
humana que se extiende de forma N-terminal con
Glu-(Glu-Ala)_{3}-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 1); y proinsulina [Asp^{28}, Met^{30}, Trp^{31},
Lys^{32}]-des(33- 65) humana que se
extiende de forma N-terminal con
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 2).
Los precursores de insulina de fórmula I pueden
ser preparados como se describe en o análogamente como se describe
en las solicitudes internacionales que tienen números de publicación
WO 01/49742, WO 01/49870, WO 01/079250, y WO 02/079254, cuyo
contenido por la presente se incorpora por referencia.
El producto intermedio deseado (es decir, el
producto de escisión deseado) corresponde al precursor de insulina
donde al menos un residuo de lisina o residuo de arginina ha sido
dividido para formar una fracción de lisilo o fracción de arginilo,
respectivamente. Además, en el producto intermedio deseado, las
cadenas A y B que se conectan entre sí vía dos puentes disulfuro no
se conectan entre sí vía una cadena peptídica entre el extremo C
terminal de la cadena B y el extremo N terminal de la cadena A. En
una forma de realización preferida de esta invención, el número de
residuos de aminoácidos presente en el producto intermedio deseado
está en el rango de aproximadamente 48 a aproximadamente 52,
preferiblemente en el rango de aproximadamente 49 a aproximadamente
51, aún más preferido 50. En otra forma de realización preferida de
esta invención, no hay más de 4, preferiblemente no más de 3, más
preferido no más de 2, y aún más preferido no más de 1, de los
residuos de aminoácidos presentes en el producto intermedio deseado
que no están presentes en la posición correspondiente en la insulina
humana.
Según una forma de realización de esta
invención, el producto intermedio deseado (el producto de escisión
deseado) puede ser ilustrado por la fórmula general II
donde Z_{n} y Z_{m},
independientes entre sí, representan dos fracciones peptídicas cada
una conteniendo n y m residuos de aminoácidos, respectivamente,
R'^{1} representa un residuo peptídico, R'^{2} representa un
residuo de aminoácido o un residuo peptídico, R'^{3} representa un
residuo peptídico, R'^{4} representa lisina o arginina o un
residuo peptídico conteniendo un residuo de lisina o residuo de
arginina en el extremo C terminal, las dos líneas verticales indican
el enlace de disulfuro entre los dos residuos de cisteína y, además,
hay un enlace de disulfuro entre dos residuos de cisteína presentes
en R'^{1} y en
Z_{n}.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida de esta
invención, R'^{1} es los residuos de aminoácidos A1 a través de A6
en insulina humana en este orden en el que, opcionalmente, uno o dos
de los residuos de aminoácidos han sido intercambiados por otro
residuo de aminoácidos o donde un o dos de los residuos de
aminoácidos no están presentes. En otra forma de realización
preferida de esta invención, R'^{2} es -Asn o -Gly. En otra forma
de realización preferida de esta invención, R'^{3} es los residuos
de aminoácidos B1 a B6 en insulina humana en este orden en el que,
opcionalmente, uno o dos de los residuos de aminoácidos han sido
intercambiados por otro residuo de aminoácidos o donde uno o dos de
los residuos de aminoácidos no están presentes. En otra forma de
realización preferida de esta invención, R'^{4} es los residuos de
aminoácidos B20 a B29 en insulina humana en este orden, los residuos
de aminoácidos B20 a B29 en insulina humana en este orden con la
condición de que tiene Asp en B28 y Lys en B29, y los residuos de
aminoácidos B20 a B28 en insulina humana en este orden con la
condición de que tiene Lys en B28, en cada uno de los cuales,
opcionalmente, uno o dos de los residuos de aminoácidos han sido
intercambiados por otro residuo de aminoácidos o donde uno o dos de
los residuos de aminoácidos no están presentes o una parte de
cualquiera de estos residuos peptídicos que dejan fuera uno o más
residuos de aminoácidos consecutivos del extremo C terminal del
mismo. En otra forma de realización preferida de esta invención,
Z_{n} es los residuos de aminoácidos A8 a A19 en insulina humana
en este orden en el que, opcionalmente, uno o dos de los residuos de
aminoácidos han sido intercambiados por otro residuo de aminoácidos
o donde uno o dos de los residuos de aminoácidos no están presentes.
En otra forma de realización preferida de esta invención, Z_{m} es
los residuos de aminoácidos B8 a B18 en insulina humana en este
orden en el que, opcionalmente, uno o dos de los residuos de
aminoácidos han sido intercambiados por otro residuo de aminoácidos
o donde uno o dos de los residuos de aminoácidos no están
presentes.
\newpage
Durante la reacción de la escisión y la reacción
de acoplamiento, la temperatura de la reacción está en el rango del
punto de congelación de la mezcla reactiva a aproximadamente 50ºC.
La temperatura preferida está en el rango de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 25ºC.
Brevemente, la reacción de acoplamiento
se realiza de la siguiente manera:
- Cuando al menos aproximadamente un 25%, preferiblemente al menos un 50%, más preferido al menos un 75%, preferiblemente al menos un 85%, más preferido al menos un 95%, del precursor de insulina ha sido dividido al producto intermedio deseado, por un lado, el compuesto nucleófilo y, por otro lado, el solvente orgánico se mezcla con la mezcla reactiva en la que la escisión se llevó a cabo para obtener condiciones de reacción que son convenientes o favorables a la fase de acoplamiento. El porcentaje de (conversión de) escisión se basa en el equilibrio posible en la mezcla reactiva usada para escisión. Normalmente, del principio de la reacción de escisión enzimática y hasta que un periodo temporal determinado haya decaído, el rendimiento del producto intermedio deseado, es decir, el producto de escisión deseado, aumenta y alcanza una concentración máxima.
- Después de eso, la concentración del producto de escisión deseado puede decrecer.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida de esta
invención, ningunos componentes se eliminan de la mezcla reactiva
que resulta de la reacción de escisión antes de que la reacción de
acoplamiento se lleve a cabo. Una forma sencilla de hacerlo es,
después de la reacción de escisión, añadir el compuesto nucleófilo y
una cantidad suficiente de solvente orgánico. De esta manera, por
ejemplo, la enzima usada en la fase de escisión también se usa en la
fase del acoplamiento.
El proceso de esta invención también cubre
reacciones de acoplamiento en una mezcla reactiva que además del
producto intermedio deseado contiene una pequeña cantidad de
precursor de insulina parcialmente dividido y/o precursor de
insulina no reaccionado.
En otra forma de realización preferida de esta
invención, el compuesto nucleófilo es una amida de aminoácido o una
amida peptídica donde el grupo de carboxamida no es sustituido o es
mono o disustituido con un grupo alquilo con no más de 16 átomos de
carbono el/los grupo(s) de alquilo que, junto con el átomo de
nitrógeno contiguo, puede formar un anillo o el grupo carboxamida es
mono o disustituido con un grupo arilo. Se prefieren los
sustituyentes alifáticos. Ejemplos de grupos de carboxamida
sustituida son N.N-dimetilcarboxamida,
N,N-dietilcarboxamida, y
N-hexilcarboxamida.
En una forma de realización preferida de esta
invención, el compuesto de nucleótidos es un éster de aminoácidos
donde el grupo carboxilo está protegido y cualquier grupo de hidroxi
está opcionalmente protegido. En otra forma de realización preferida
de esta invención, el compuesto de nucleótidos es un éster de
treonina donde el grupo de carboxilo está protegido y,
opcionalmente; el grupo hidroxi está protegido. Por lo tanto, un
éster de L-treonina puede ser ilustrado por la
siguiente fórmula general IIIa:
donde R^{6} representa un grupo
de protección de carboxilo, y R^{5} representa hidrógeno o un
grupo de protección de hidróxilo. Para hacerlo más claro, un éster
de treonina puede ser ilustrado por la fórmula general
CH_{3}-CH(OR^{5})-CH(NH_{2})COOR^{6},
donde R^{6} y R^{5} son como se ha mencionado
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos compuestos nucleófilos son compuestos
conocidos y los compuestos de nucleófilos restantes pueden ser
preparados en analogía con la preparación de compuestos conocidos o
en analogía con métodos conocidos.
Los compuestos nucleófilos pueden ser empleados
en forma de la base libre o sales derivadas solubles tales como
clorhidratos, acetatos, propionatos, y butiratos.
Cuando la reacción de acoplamiento comienza, es
deseable que un exceso sustancial de compuesto nucleófilo esté
presente en la solución de la mezcla de reacción de acoplamiento,
con la proporción molar entre el compuesto nucleófilo y el producto
intermedio deseado preferiblemente excediendo aproximadamente 5:1.
Cuando la reacción de acoplamiento comienza, la concentración del
compuesto nucleófilo en la mezcla reactiva debería preferiblemente
exceder 0,1 molar, el límite superior de la concentración siendo la
solubilidad del mismo.
Para obtener un 60% de rendimiento considerado
aquí como un aspecto importante para la práctica de esta invención,
la temperatura de la reacción, contenido de agua y valor de pH son
interrelacionados dentro de los rangos descritos.
\newpage
Los solventes orgánicos adecuados para la
práctica de esta invención son solventes polares que son mezclables
con agua y preferiblemente de tal manera que son capaces de contener
allí dentro concentraciones altas del producto intermedio deseado
(por ejemplo de fórmula II) y el compuesto nucleófilo. Ejemplos de
solventes orgánicos adecuados son solventes apróticos, tales como
N,N-dimetilformamida,
N,N-dimetilacetamida,
N-metilpirrolidona-2, y
dimetilsulfóxido, y solventes próticos, tales como ácido acético,
etanol, metanol, 2-propanol,
1-propanol, butanol y
1,4-butanodiol. Dioxano, acetona, tetrahidrofurano,
formamida, y acetonitrilo también pueden ser usados e incluso un
éster de aminoácidos usado como el compuesto nucleófilo puede,
completamente o parcialmente, ser usado como el solvente orgánico.
La naturaleza del solvente afecta al sistema en su conjunto, e
interrelaciones adecuadas para un solvente productivo de altos
rendimientos no se pueden aplicar con un solvente diferente. Los
resultados de rendimiento mejores se han obtenido con solventes
apróticos, y solventes apróticos son más preferidos para la práctica
de esta invención.
Obviamente, cuando se calcula o determina el
contenido de agua en la mezcla reactiva, el compuesto nucleófilo se
considera un solvente orgánico.
La adición de un ácido, tal como ácido
clorhídrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, o ácido
butírico, o de una base, tal como piridina, TRIS,
N-metilmorfolina, trietilamina, o
N-etilmorfolina, es opcional. Se incluyen en la
mezcla reactiva para producir un valor de pH adecuado. Aunque ácidos
o bases minerales pueden ser usados en la práctica de esta
invención, ácidos y bases orgánicos se prefieren, particularmente
estos identificados por encima. Ácidos orgánicos son más
preferidos.
Cuando la reacción de acoplamiento comienza, la
proporción del peso entre tripsina o ALP (calculado como tripsina
cristalina o ALP o una cantidad de tripsina o derivado de ALP
correspondiente a los mismos) y el producto intermedio deseado en la
mezcla reactiva está preferiblemente en el rango de aproximadamente
1:1000 a aproximadamente 1:10, más preferido en el rango de
aproximadamente 1:200 a aproximadamente 1:50.
En algunos casos, la enzima añadida en la fase
de escisión es suficiente para realizar la reacción de acoplamiento
y, en tal caso, no hay ninguna necesidad para añadir otra cantidad
de enzima durante la fase de acoplamiento. En otros casos, puede ser
deseable añadir una cantidad adicional de enzima durante la fase de
acoplamiento.
En vista de que concentraciones altas del
producto intermedio deseado y de compuesto nucleófilo en solución
promueven altos índices de conversión, selección de solvente es
diagonal hacia estos solventes en el que los reactivos son muy
solubles. La solubilidad del compuesto nucleófilo en particular es
importante, porque este reactivo debería estar presente en
concentración alta. Cuando la reacción de acoplamiento comienza, la
proporción molar del compuesto nucleófilo al producto intermedio
deseado debería preferiblemente exceder 5:1, preferiblemente exceder
50:1. Cuando la reacción de acoplamiento comienza, la concentración
del compuesto nucleófilo en la mezcla reactiva debería
preferiblemente ser al menos 0,1 molar.
En una forma de realización preferida de esta
invención, se usa un compuesto nucleófilo que tiene grupo(s)
de protección carboxi que pueden ser eliminados del compuesto
resultante de la insulina en condiciones, que no causan alteraciones
irreversibles sustanciales en la molécula de insulina. Como ejemplos
de tales grupos de protección de carboxílo se puede mencionar
alquilo inferior, por ejemplo, metilo, etilo, y terc-butilo,
grupos bencilo sustituido tal como p-metoxibencilo,
difenilmetilo, y 2,4,6-trimetilbencilo, y grupos de
la fórmula general
-CH_{2}-CH_{2}-SO_{2}R^{7},
donde R^{7} representa alquilo inferior, tal como metilo, etilo,
propilo, y n-butilo.
Grupos de protección de hidróxilo adecuados son
los que pueden ser eliminados en condiciones que no causan
alteración irreversible sustancial en la molécula de insulina. Como
un ejemplo de tal grupo se puede mencionar terc-butilo.
Otros grupos de protección normalmente usados se
describen por Wunch: Metoden der Organischen Chemie
(Houben-Weyl), vol. XV/1, editor: Eugen Muller,
Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.
Según una forma de realización de esta
invención, el proceso de esta invención resultará en un compuesto de
la fórmula general IV:
donde Z_{n} y Z_{m},
independientes entre sí, representan dos fracciones peptídicas cada
una conteniendo n y m residuos de aminoácidos, respectivamente,
R'^{1} representa un residuo peptídico, R'^{2} representa un
residuo de aminoácidos o un residuo peptídico, R'^{3} representa
un residuo peptídico, R'^{4} es como se ha mencionado
anteriormente, y R'^{6} es un aminoácido llevando un grupo de
protección de carboxi o un residuo peptídico, opcionalmente llevando
un grupo de protección de
carboxi.
\vskip1.000000\baselineskip
Cualquier grupo de protección de carboxi (por
ejemplo, R^{6}) y cualquier grupo de protección de hidroxi (por
ejemplo, R^{5}) presente en unos compuestos de insulina puede ser
eliminado por métodos conocidos o métodos conocidos per se.
En caso de que el grupo de protección de carboxi sea metilo, etilo,
o un grupo de la fórmula general
-CH_{2}-CH_{2}-SO_{2}R^{7},
donde R^{7} es tal como se ha definido anteriormente, dicho grupo
de protección puede ser eliminado a condiciones básicas suaves en un
medio acuoso, preferiblemente a un valor de pH en el rango de
aproximadamente 8 a aproximadamente 12, por ejemplo, a
aproximadamente 9,5. Como la base pueden ser usadas bases fuertes,
por ejemplo, una amina terciaria, por ejemplo trietilamina,
hidróxidos de metales alcalinos tal como hidróxido sódico o
hidróxidos de metales alcalinotérreos tal como calcio, o hidróxido
de magnesio. En caso de que el grupo de protección de carboxi sea
terc-butilo, bencilo sustituido tal como
p-metoxibencilo o
2,4,6-trimetilbencilo, o difenilmetilo, dicho grupo
puede ser eliminado por acidólisis, preferiblemente con ácido
trifluoroacético. El ácido trifluoroacético puede ser no acuoso o
puede contener un poco de agua, o puede ser diluido con un solvente
orgánico, tal como diclorometano. En caso de que el grupo de
protección de hidroxi (por ejemplo, R^{5}) sea terc-butilo,
dicho grupo puede ser eliminado por acidólisis, véase más
arriba.
Preferiblemente, los compuestos de insulina
preparados no tienen grupo de protección de hidroxi.
En una forma de realización preferida de esta
invención, el proceso de esta invención convierte el precursor de
insulina (por ejemplo, de fórmula I) en un compuesto de insulina
(por ejemplo, fórmula IV), con un grupo de protección de carboxi en
el residuo de aminoácido C terminal en la cadena B que, después,
puede ser desbloqueado para formar un compuesto de insulina que no
tiene grupo de protección de carboxi.
Cuando se selecciona las condiciones de reacción
según la explicación anterior y se considera los resultados
obtenidos en los siguientes ejemplos es posible obtener un
rendimiento de compuesto de insulina que es superior a un 60%, e
incluso superior a un 80%, y en ciertas condiciones preferidas
superior a un 90%.
Por el proceso de esta invención, compuestos de
insulina de una pureza aceptable pueden ser obtenidos y ser
purificados más, si se desea, para fin terapéutico.
Más específicamente, insulina aspart puede, por
ejemplo, ser preparado por escisión enzimática con ALP de un
precursor de insulina tal como
[Asp^{28}]-des(30-65)
proinsulina humana que se extiende de forma
N-terminal con
Glu-(Glu-Ala)_{3}-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 1) y acoplamiento con un compuesto nucleófilo tal como
éster metílico de L-treonina, seguida de
hidrólisis.
Insulina lispro puede, por ejemplo, ser
preparada por escisión enzimática con tripsina de un precursor tal
como insulina porcina y acoplamiento con un compuesto nucleófilo tal
como
Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
(SEC ID nº.: 3).
Insulina glargina puede, por ejemplo, ser
preparada por escisión enzimática con ALP de un precursor de
insulina tal como proinsulina
[Gly^{86}]-des(30-65)
humana y acoplamiento con un compuesto nucleófilo tal como
Thr-Arg-Arg-OMe,
seguida de hidrólisis.
Abreviaturas usadas aquí están de acuerdo con
sus reglas aprobadas (1974) por el IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclature, véase Collected
Tentative Rules & Recommendations of the Commission on
Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, segunda edición,
Maryland 1975.
La mención aquí de una referencia no es admisión
de que constituya técnica anterior.
Aquí, la palabra "comprender" debe
interpretarse en sentido amplio "incluir", "contener" o
"entender" (véase, las pautas EPO C 4.13).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, no por limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
200 mg de proinsulina [Ala^{31},
Lys^{32}]-des(33-63)
porcina fueron suspendidos en 1,35 ml de agua y el valor de pH fue
ajustado a 9 con 10 \mul de trietilamina. Una mezcla de 375 \mul
de N,N-dimetilacetamida y 460 \mul de agua fueron
añadidos con un poco de agitación y a la solución resultante fueron
añadidos 315 \mul de 5,4 mg/ml de solución acuosa de proteasa
específica de lisilo de Achromobacter lyticus (EC 3.4.21.50)
(designado aquí ALP). El valor de pH fue ajustado a 9,8 con 20
\mul de trietilamina y la solución de la reacción fue dejada
durante 1 hora a 23ºC. La solución de la reacción fue acidificada
por adición de 70 \mul de 4 N de ácido clorhídrico y enfriada en
un baño de hielo. Una solución de 300 mg de éster metílico de
L-treonina en 4,85 ml de
N,N-dimetilacetamida fue añadida y el valor de pH
fue ajustado a 6,5 por adición de 450 \mul de 4 N de ácido
clorhídrico. La solución de la reacción fue dejada durante 4 horas a
23ºC después de las cuales la reacción fue detenida por adición de
ácido clorhídrico a un valor de pH < 3. Por análisis de HPLC en
fase inversa en una columna de sílice C18 de 4 mm x 250 mm 5 \mum
con un eluyente de agua-etanol conteniendo 0,125 M
de sulfato de amonio ajustado a un valor de pH 4, un rendimiento de
la conversión de un 86% a éster metílico de insulina humana fue
encontrado después de un tiempo de reacción total de 5 horas.
\newpage
Para comparación, una conversión de una fase fue
realizada:
- 100 mg de [proinsulina Ala^{31}, Lys^{32}]-des(33-63) porcina fueron suspendidos en una mezcla de 887 \mul de agua y 175 \mul de N,N-dimetilacetamida. 150 mg de éster metílico de L-treonina fue disuelto en 2,265 ml de N,N-dimetilacetamida y fue lentamente añadido a la mezcla enfriada con hielo. El valor de pH fue ajustado a 6,5 con 340 \mul de ácido acético y 158 \mul de 5,4 mg/ml de solución acuosa de ALP fueron añadidos. La reacción de conversión fue seguida de análisis RP-HPLC de muestras acidificadas. Después de 5 horas, un 53% de conversión a éster metílico de insulina humana fue encontrado y después de 24 horas la conversión alcanzó un máximo de un 87%.
El éster metílico de insulina humana aislado fue
convertido en insulina humana por disolución en agua a un valor de
pH de 10 a una concentración de 10 mg/ml. La reacción fue terminada
después de 24 horas ajustando el valor de pH a 5,2 con 1 N de ácido
clorhídrico y la insulina humana precipitada fue aislada por
centrifugado y purificada por cromatografía líquida de alto
rendimiento de fase inversa.
En el mismo tiempo de reacción, es decir, 5
horas, el rendimiento por el proceso de esta invención, comparado
con el proceso conocido per se, fue mejorado con un 62%. Los
dos procesos obtuvieron casi el mismo rendimiento, si el tiempo de
reacción de la conversión de una fase conocida per se fue
extendida casi 5 veces, comparado con el tiempo de reacción para el
proceso de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
200 mg de insulina porcina fueron suspendidos en
1,37 ml de agua y una mezcla de 294 \mul de
N-metil-2-pirrolidona
y 326 \mul de agua fueron añadidos con un poco de agitación. El
valor de pH fue ajustado a 9,0 con 10 \mul 2 N de hidróxido sódico
y a la solución resultante fueron añadidos 315 \mul de 5,4 mg/ml
de solución acuosa de ALP. El valor de pH fue ajustado a 9,8 con 12
\mul 2 N de hidróxido sódico y la solución de la reacción fue
dejada durante 4 horas a 23ºC. La solución de la reacción fue
acidificada por adición de 70 \mul de 4 N de ácido clorhídrico y
enfriada en un baño de hielo. Una solución de 300 mg de éster
metílico de L-treonina en 4,4 ml de
N-metil-2-pirrolidona
fue acidificada con 500 \mul de 4 N de ácido clorhídrico. La
solución de insulina fue lentamente añadida y el valor de pH fue
ajustado a 6,5 con 50 \mul 2 N de ácido clorhídrico. La solución
de la reacción fue dejada durante 4 horas a 23ºC después de las
cuales la reacción fue detenida por adición de ácido clorhídrico a
un valor de pH < 3. Por análisis de HPLC de fase inversa en una
columna de sílice C18 4mm x 250 mm 5 \muM con un eluyente de
agua-etanol conteniendo 0,125 M de sulfato de amonio
ajustado a un valor de pH 4, un rendimiento de la conversión de un
86% a éster metílico de la insulina humana fue encontrado después de
un tiempo de reacción total de 8 horas.
Para comparación, una conversión de una fase fue
realizada:
- 100 mg de insulina porcina fueron suspendidos en una mezcla de 848 \mul de agua y 147 \mul de N-metil-2-pirrolidona. 150 mg de éster metílico de L-treonina fueron disueltos en 2,2 ml de N-metil-2-pirrolidona y fueron lentamente añadidos a la mezcla enfriada con hielo. El valor de pH fue ajustado a 6,5 con 300 \mul de ácido acético y 158 \mul de una solución acuosa 5,4 mg/ml de ALP fueron añadidos. La solución de la reacción fue dejada a 23ºC y la reacción de la conversión fue seguida de análisis RP-HPLC de muestras acidificadas. Después de 8 horas, la conversión fue encontrada a un 54% y después de 48 horas un máximo de la conversión de un 86% a éster metílico de la insulina humana fue alcanzado.
El éster metílico de insulina humana aislada
puede ser convertido en insulina humana por hidrólisis alcalina.
En el mismo tiempo de reacción, es decir, 8
horas, el rendimiento por el proceso de esta invención fue mejorado
con 59%, comparado con el proceso conocido per se. Los dos
procesos obtuvieron el mismo rendimiento, si el tiempo de reacción
de la conversión de una fase conocida per se fuera extendida
6 veces, comparado con el tiempo de reacción para el proceso de esta
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
200 mg de proinsulina
[Asp^{28}]-des(30-65)
humana, extendida de forma N-terminal con el
péptido
Glu-(Glu-Ala)_{3}-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 1), fueron suspendidos en 1,35 ml de agua. Una mezcla
de 350 \mul de N,N-dimetilformamida y 425 \mul
de agua fue añadida con un poco de agitación y el valor de pH fue
ajustado a 9 con 45 \mul de trietilamina. A la solución resultante
fueron añadidos 200 \mul de una 8,5 mg/ml solución acuosa de ALP y
el valor de pH fue ajustado a 9,8 con 20 \mul de trietilamina. La
solución de la reacción fue dejada durante 1 hora a 23ºC. La
solución de la reacción fue acidificada por adición de 70 \mul 4 N
de ácido clorhídrico y enfriada en un baño de hielo. Una solución de
300 mg de éster metílico de L-treonina en 4,95 ml
de N,N-dimetilformamida fueron añadidos y el valor
de pH fue ajustado a 6,5 por adición de 470 \mul 4 N de ácido
clorhídrico. La solución de la reacción fue dejada durante 4 horas a
23ºC después de las cuales la reacción fue detenida por adición de
ácido clorhídrico a un valor de pH < 3. Por Análisis de HPLC de
fase inversa en una columna de sílice C18 de 4mm x 250 mm 5 \muM
con un eluyente de etanol-agua conteniendo 0,125 M
de sulfato de amonio ajustado a un valor de pH 4, un rendimiento de
la conversión de un 87% para éster metílico de insulina
[AspB28]-humana fue encontrado después de un tiempo
de reacción total de 5 horas.
Para comparación, una conversión de una fase fue
realizada:
- 90 mg de proinsulina [Asp^{28}]-des(30-65) humana, extendidos de forma N-terminal con el péptido Glu-(Glu-Ala)_{3}-Pro-Lys- (SEC ID nº.: 1), fueron suspendidos en una mezcla de 887 \mul de agua y 175 \mul de N,N-dimetilformamida. 150 mg de éster metílico de L-treonina fue disuelto en 2,13 ml de N,N-dimetilformamida y fue lentamente añadido a la mezcla enfriada con hielo. El valor de pH fue ajustado a 6,5 con 250 \mul de ácido acético y 118 \mul de una 8,5 mg/ml solución acuosa de ALP fueron añadidos. La reacción de la conversión fue seguida de análisis RP-HPLC de muestras acidificadas. Después de 5 horas, la conversión fue encontrada al 47% y después de 24 horas la conversión a éster metílico de insulina [Asp^{B28}]-humana ha alcanzado un máximo de un 81%.
El éster metílico de la insulina aislada puede
ser convertido a [Asp^{B28}]-humano insulina por
hidrólisis alcalina.
En el mismo tiempo de reacción, es decir, 5
horas, el rendimiento por el proceso de esta invención fue casi
doblado, comparado con el proceso conocido per se.
Rendimientos comparables fueron obtenidos por los dos procesos, si
el tiempo de reacción de la conversión de una fase conocida per
se fue extendida casi 5 veces, comparado con el tiempo de
reacción para el proceso de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
1,5 g de precursor de insulina aspart
[Asp^{28}, Met^{30}, Trp^{31},
Lys^{32}]-des(33-65)
proinsulina humana, extendido de forma N-terminal
con el péptido
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 2) fueron suspendidos en 3,5 g de agua. Con un poco de
agitación y a temperatura ambiente, el precursor fue disuelto
añadiendo gradualmente 4M de hidróxido sódico a un valor de pH de
10,67. 3,7 g de una solución de etanol de un 45% (peso/peso) en agua
fueron añadidos. 1,5 ml de 5,8 mg/ml de solución acuosa de ALP
fueron añadidos y la mezcla fue dejada reaccionar durante 2 horas.
El valor de pH fue ajustado a 4,7 por adición de 4 N de ácido
clorhídrico. 2,025 g de éster etílico de L-treonina
fue disuelto en 16,2 ml de etanol y la solución fue añadida a una
temperatura máxima de 15ºC. El valor de pH fue ajustado a 6,5 con 4
N de ácido clorhídrico. La temperatura fue ajustada a temperatura
ambiente y la mezcla reactiva fue dejada durante 20 horas a esta
temperatura. Por análisis de HPLC de fase inversa en una columna de
sílice C18 de 4 mm x 250 mm 5 \mum con un eluyente de
acetonitrilo-agua conteniendo 200mM de sulfato de
sodio ajustado a un valor de pH de 3,6, un rendimiento de la
conversión del 89,1% de éster etílico de insulina aspart fue
encontrado después de 1 hora de tiempo de reacción y después de 20
horas de tiempo de reacción, fue encontrado un rendimiento de la
conversión del 90,5%.
El éster etílico de insulina aspart aislado
puede ser convertido a insulina aspart por hidrólisis alcalina.
\vskip1.000000\baselineskip
10,9 g de precursor de insulina aspart
proinsulina [Asp^{28}, Met^{30}, Trp^{31},
Lys^{32}]-des(33-65)
humana, se extendió de forma N-terminal con el
péptido
Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-
(SEC ID nº.: 2) fueron suspendidos en 49,3 g de agua. Con un poco de
agitación y a temperatura ambiente, el precursor fue disuelto
añadiendo gradualmente 37,6 g de una mezcla conteniendo 0,36 M de
hidróxido sódico, 0,27 M de acetato sódico y un 36% de
N-metil-2-pirrolidona.
El valor de pH fue ajustado a 9,7 con 9,2 ml 0,5 M de hidróxido
sódico. 7,1 mL de 7,1 mg/mL de solución acuosa de ALP fueron
añadidos, y la mezcla fue dejada reaccionar durante 5 horas. El
valor de pH se mantuvo constante a 9,7 por añadir más 0,5 M de
hidróxido sódico en todas partes de la reacción. La mezcla reactiva
fue enfriada a 5ºC y el valor de pH fue ajustado a 5,7 por adición
de 2,73 g de 4 N de ácido clorhídrico. 14,02 g de éster etílico de
L-treonina fueron añadidos y el valor de pH fue
ajustado a 6,0 con 4 N de ácido clorhídrico. 344 g de (4ºC) de
N-metil-2-pirrolidona
fría fueron añadidos. La temperatura fue ajustada a 22ºC y el valor
de pH ajustado a 6,5 con 4 N de ácido clorhídrico. La mezcla
reactiva fue dejada durante 9 horas a esta temperatura. Por Análisis
de HPLC de fase inversa en una columna de sílice C18 4 mm x 250 mm 5
\mum con un eluyente acetonitrilo-agua conteniendo
200 mM de sulfato de sodio ajustado a un valor de pH de 3,6, un
rendimiento de la conversión del 87,5% a éster etílico de insulina
aspart fue encontrado después de un tiempo de reacción total de 14
horas.
El éster etílico de insulina aspart aislada
puede ser convertido a insulina aspart por hidrólisis alcalina.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u
omisiones.
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<400> 3
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Claims (13)
1. Proceso para preparar un compuesto de
insulina donde a) en una mezcla reactiva conteniendo al menos
aproximadamente un 55%, preferiblemente al menos aproximadamente un
60%, más preferido al menos un 70%, de agua (peso/peso), un
precursor de insulina está sujeto a una escisión enzimática y,
después de eso, b) el producto intermedio se acopla con un compuesto
nucleófilo en la mezcla reactiva usada para la reacción de escisión
enzimática con la condición de que la composición de la mezcla
reactiva ha sido modificada de modo que el contenido de agua en la
mezcla reactiva está en el rango de aproximadamente un 10% a
aproximadamente un 50% de agua (peso/peso), preferiblemente en el
rango de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% de agua
(peso/peso), y c), si se desea, eliminando el/los grupo(s) de
protección, y donde ningún aislamiento del producto intermedio se
realiza entre la fase de escisión (a) y la fase de acoplamiento
(b).
2. Proceso, según la reivindicación 1, donde la
enzima usada para la fase de escisión también está presente en la
fase de acoplamiento.
3. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde, antes de iniciar la reacción de
acoplamiento, al menos aproximadamente un 25%, preferiblemente al
menos un 50%, más preferido al menos un 75%, preferiblemente al
menos un 85%, más preferido al menos un 95%, del precursor de
insulina se escinde al producto intermedio.
4. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la enzima usada para la escisión
enzimática es tripsina o una proteasa específica de lisilo,
preferiblemente proteasa I de Achromobacter lyticus.
5. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el compuesto nucleófilo es un
éster de aminoácido.
6. Proceso, según la reivindicación precedente,
donde el compuesto nucleófilo es un éster de treonina.
7. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 2
reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es una amida de
aminoácido.
8. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 3
reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es un péptido.
9. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 4
reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es un éster
peptídico.
10. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, excepto las últimas 5
reivindicaciones, donde el compuesto nucleófilo es una amida
peptídica.
11. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, incluyendo la fase de eliminar el/los
grupo(s) de protección del compuesto de insulina.
12. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el compuesto de insulina
resultante tiene treonina en la posición B30.
13. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el compuesto resultante es
insulina humana, insulina aspart, insulina lispro, insulina
glargina, o insulina detemir.
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