CN1589328A - 制备胰岛素化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

转化胰岛素前体为胰岛素化合物的优选方式是在水性介质中进行酶促肽裂解，然后无需除去所生成的中间产物，加入氨基酸酯或肽酯和有机溶剂，以便发生所需的偶联。

Description

制备胰岛素化合物的方法
本发明涉及改进了的转化胰岛素前体成为胰岛素化合物的方法，可选地经由胰岛素酯进行转化。
发明背景
胰岛素是一种胰腺激素，参与血糖浓度的调节。例如，可向胰岛素依赖型糖尿病患者给以人、猪与牛的胰岛素、胰岛素类似物和混合胰岛素，以控制他们的血糖浓度。
猪和牛的胰岛素通常是从胰腺制备的。人胰岛素可以从猪胰岛素借助半合成方式制备。作为替代选择，人胰岛素以及很多胰岛素类似物可以借助遗传工程制备。遗传工程例如可以在细菌或酵母中进行，先制备胰岛素前体，然后转化为所需产物。这种转化作用可以按不同方式进行。
一种可能性是所谓的转肽基作用，其中在相同的反应条件下，在相同的反应混合物中连续发生肽的裂解和肽的偶联，例如参见美国专利No.4,343,898(Novo Industri)。
另一种可能性是第一步裂解胰岛素前体，例如参见Hoppe-Seyler′s Z.Physio1.Chem.359(1978)，799，然后分离中间产物，再在不同于第一步所用的另一反应混合物中进行所需的偶联，例如参见Nature 280(1979)，412。
按照EP87,238，在一种溶剂系统中进行转肽基作用反应，该系统包含约75％至97％(vol/vol)的至少一种非水性反应混溶性溶剂，其中包括至少约50％(vol/vol)丁-1，4-二醇。
按照US4,579,820，使用L-特异性丝氨酸羧肽酶进行转肽基作用过程，例如羧肽酶Y。
按照US4,601,979(Nordisk Insulin Laboratorium)，在基本上不含有机溶剂的水性反应介质中进行转肽基作用或者仅仅肽偶联。
按照WO83/00504(Nordisk Insulin Laboratorium)，将猪产物用羧肽酶A处理，将所得脱丙氨酸-B30胰岛素产物悬浮在低级醇中，将该悬液与L-苏氨酸与胰蛋白酶的溶液混合。在全部具体实施例中，借助冷冻干燥或沉淀法分离脱丙氨酸-B30胰岛素产物。
本发明的目的是克服或改善现有技术中的至少一些缺点。因此，不是所有下面提到的详细目的都可以被完全克服或改善。
定义
本文所用的术语“氨基酸”表示可以被核苷酸序列编码的氨基酸。类似地，这适用于术语氨基酸残基，它是已经从羧基中除去羟基和/或已经从氨基中除去氢的氨基酸。
类似地，术语肽和肽残基由氨基酸残基组成。优选地，肽含有不多于10个氨基酸残基。
本文所用的术语氨基酸酰胺表示具有可选被取代的C末端酰胺基团的氨基酸。
本文所用的术语肽酰胺表示具有可选被取代的C末端酰胺基团的肽。
本文所用的术语“胰岛素前体”表示由两条肽链(相当于胰岛素的A和B链，以下称为A和B链)组成的多肽，它们与胰岛素相似，彼此经由两条肽链之间的两个二硫桥(从一个半胱氨酸(Cys)残基到另一个半胱氨酸残基)连接，其中象胰岛素一样，存在从A链中一个半胱氨酸残基到A链中另一个半胱氨酸残基之间的二硫桥。在这种胰岛素前体中，在B链中存在至少一个赖氨酸或精氨酸残基。可选地，在这种胰岛素前体中，A和B链彼此经由B链C末端与A链N末端之间的第三肽链(相当于胰岛素中的连接肽)连接。在A和B链彼此经由这条第三肽链连接的情况下，在这条第三肽链C末端存在赖氨酸。可选地，在这种胰岛素前体中，可以在B链N末端连接第四肽链。在这条第四肽链连接于B链N末端的情况下，在这条第四肽链C末端存在赖氨酸。此外，在这种胰岛素前体中，与人胰岛素相比，氨基酸残基的同一性为至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，进而更优选至少95％，其条件是这种计算忽略第三和第四肽链。在人胰岛素中，在CysA6与CysA11之间、CysA7与CysB7之间和CysA20与CysB19之间存在二硫桥，在B29位存在赖氨酸。
本文所用的术语“氨基酸酯”表示携带C末端羧基保护基团和可选的羟基保护基团的氨基酸。
本文所用的术语“肽酯”表示其中至少C末端羧基携带羧基保护基团的肽。可选地，任何羟基也被保护，可选地，任何赖氨酸残基的ε-氨基也被衍生，优选被疏水性基团衍生，例如具有至少10个碳原子的酰基。优选地，肽酯含有不多于10个氨基酸残基。
本文所用的术语亲核化合物表示氨基酸酯、氨基酸酰胺、肽、肽酯和肽酰胺。在任何这些氨基酸酯、氨基酸酰胺、肽、肽酯和肽酰胺中，任何赖氨酸中的氨基都可选地被衍生，优选被疏水性基团衍生，例如具有至少10个碳原子的酰基。
本文所用的术语“胰岛素化合物”表示来自任何物种的胰岛素，例如猪胰岛素、牛胰岛素和人胰岛素，以及它们的盐，例如锌盐和鱼精蛋白盐。此外，本文所用的术语“胰岛素化合物”表示能够简称为“胰岛素类似物”的那些。本文所用的胰岛素类似物表示这样的胰岛素化合物，其中一个或多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基置换，和/或一个或多个氨基酸残基已经从中缺失，和/或一个或多个氨基酸残基已经被加入其中，只要所述胰岛素类似物具有足够的胰岛素活性即可。胰岛素类似物的实例描述在下列专利及其同族文献中：US5,618,913、EP254,516、EP280,534、US5,750,497和US6,011,007。具体胰岛素类似物的实例有天冬氨胰岛素(即[AspB28]人胰岛素)、赖氨酸脯氨酸胰岛素(即[LysB28，ProB29]人胰岛素)和甘氨酸精氨酸胰岛素(即[GlyA21，ArgB31，ArgB32]人胰岛素)。本文所用的术语“胰岛素类似物”也涵盖能够称为胰岛素衍生物的那些，也就是将被本领域技术人员公认为胰岛素衍生物的化合物，参见一般的教科书，例如具有不存在于母体胰岛素分子中的取代基的胰岛素。胰岛素衍生物的实例有具有可选被取代的酰胺基团的胰岛素或胰岛素类似物。能够被视为胰岛素衍生物和胰岛素类似物的化合物在本文中也涵盖在术语胰岛素类似物的范围内。这类化合物的实例描述在下列专利及其同族中：US5,750,497和US6,011,007。因此，具体胰岛素类似物的进一步实例有地特胰岛素(即脱ThrB30人胰岛素γLysB29十四烷酰)。由本发明所制备的胰岛素化合物具有足够高的抗糖尿病活性，可用于治疗糖尿病患者。利用所谓的游离脂肪细胞测定法能够测定抗糖尿病活性。
本文所用的术语pH值表示利用pH计通过将与pH计连接的甘汞组合玻璃电极直接浸入待测量pH的溶剂中所测量的数值。pH计经过标准缓冲水溶液的校正。
附图的简要说明
SEQ ID NO.：1是肽部分Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-；SEQ ID NO.：2是肽部分Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-；SEQ ID NO.：3是肽部分Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr。
本发明的简要说明
本发明涉及制备胰岛素化合物的方法。这些胰岛素化合物可以用作药物。在优选的本发明实施方式中，制备了在B链C末端具有苏氨酸(Thr)的胰岛素化合物。
任何本领域技术人员，例如医师，都能够确定何时对糖尿病患者给以多少剂量的胰岛素化合物。
本发明方法的原料是胰岛素前体，使其进行肽裂解和肽偶联，条件有利于这两种反应，但是其中不进行中间产物的分离。换句话说，使胰岛素前体进行肽裂解，使所得产物、即中间体进行肽偶联。有利于肽裂解的条件不同于有利于肽偶联的条件。因此，在本发明的第一步，即裂解步骤或裂解反应中，选择反应混合物中的反应条件，使之有利于肽裂解，在本发明的第二步中，即偶联步骤或偶联反应，改变反应混合物中的反应条件，使之有利于肽偶联。
在一种本发明实施方式中，在第一步中将胰岛素前体溶于主要为水性的介质，加入用于裂解的酶。这种反应混合物可以不含或基本上不含有机溶剂。作为替代选择，反应混合物可以含有一定量有机溶剂，这可以确保胰岛素前体有适当溶解性。不过，所需要的是不大量使用这类有机溶剂，因为它对酶裂解具有所不需要的影响。在本发明方法的第一步中，选择反应参数，例如pH值、温度和时间，使之有利于在赖氨酸残基或精氨酸残基处的裂解。
当裂解反应已经发生到某一所需程度，将亲核化合物和有机溶剂与反应混合物混合(没有预先分离中间产物)，以便发生亲核化合物与所需中间产物的赖氨酸或精氨酸残基之间的偶联。在这一步中，设置反应参数，以便有利于偶联反应。在优选的本发明实施方式中，亲核化合物是氨基酸酯，例如苏氨酸酯，或者肽酯。
然后，如果需要的话，可以从所得化合物中除去保护基团。
与已知的转肽基作用反应相比，本发明方法的优点是总在酶的用量相同、收率相似或更高的情况下反应时间更短。与在水性介质中裂解、分离中间产物和在有机溶剂与水的混合物中偶联的双罐反应相比，本发明方法的优点是总反应时间更短，酶的用量更低，方法流程更容易。
更明确地，本发明涉及下列实施方式。
本发明的详细说明
正如权利要求1所述，首先发生肽裂解，然后发生偶联反应。
简而言之，裂解反应(即酶促裂解)是如下进行的：在反应混合物中发生胰岛素前体的酶促裂解(即肽裂解)，该反应混合物含有至少约55％、优选至少约60％、更优选至少70％的水(重量/重量)。
在优选的本发明实施方式中，胰岛素前体在发生酶促裂解的反应混合物中的浓度为至少2％，优选在约5至约10％(重量/体积)的范围内。
裂解反应是在中性或碱性介质中进行的，pH值优选地在约6至约11的范围内，更优选在约8至约10的范围内。
在优选的本发明实施方式中，酶量与胰岛素前体量之比在大约0.05至大约5％(重量/重量)的范围内，优选大约0.1至大约2％。
胰蛋白酶不是实施本发明的关键。胰蛋白酶是一种已得到充分鉴别的酶，可以高纯度获得，主要是牛或猪来源。从微生物来源能够得到水解无色杆菌(Acromobacter lyticus)蛋白酶I(以下称为ALP)。而且，酶的形式也不是实施本发明的关键，无论它是天然的酶还是活性固定化酶或酶衍生物均可。如果需要在精氨酸C末端裂解，那么可以使用胰蛋白酶，如果需要在赖氨酸C末端裂解，那么可以使用胰蛋白酶或ALP。就裂解赖氨酸C末端而言，ALP是优选的。
作为活性酶衍生物的实例，可以提到乙酰化胰蛋白酶、琥珀酰化胰蛋白酶、经过戊二醛处理的胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶或ALP衍生物。
如果使用固定化胰蛋白酶或ALP，那么将其悬浮在反应混合物中，或者可以装上柱。
在很大程度上，酶的作用受到水与溶剂成分的相互关系、pH值和反应温度的控制。增加反应混合物中有机溶剂的浓度和降低pH值至接近中性，可以使通常的酶反应从裂解偏向偶联。降低温度会降低反应速率，但是也可能减少副产物的生成和酶的变性。
在优选的本发明实施方式中，将胰岛素前体溶于水性介质，该介质中乙酸根离子浓度在约5mM至约500mM的范围内，优选在约20mM至约200mM的范围内。例如，可以使用钠、钾、铵的乙酸盐或乙酸三乙基铵。
按照一种本发明实施方式，胰岛素前体(是一种肽)可以由如下通式I表示：
Figure A0282296200091
其中Zn和Zm彼此独立地代表两个肽部分，各自分别含有n个和m个氨基酸残基，R1代表肽残基，该肽残基可选地含有赖氨酸或精氨酸残基，R2代表氨基酸残基或肽残基，R3代表肽残基，该肽残基可选地含有赖氨酸或精氨酸残基，R4代表赖氨酸或精氨酸残基或者含有赖氨酸或精氨酸残基的肽残基，或者R1和R4一起是肽残基，含有赖氨酸或精氨酸残基，两条垂直的线表示两个半胱氨酸残基之间的二硫键，此外，在R1和Zn中存在的两个半胱氨酸残基之间有二硫键。
优选地，式I胰岛素前体中的氨基酸残基是能够被核苷酸序列编码的那些。
按照优选的本发明实施方式，使用这样一种胰岛素前体，其中R1和R4中氨基酸残基的数量一共在约8至约50的范围内。在另一种优选的本发明实施方式中，Zn含有12个氨基酸残基。在另一种优选的本发明实施方式中，Zm含有11个氨基酸残基。在另一种优选的本发明实施方式中，R2含有1个氨基酸残基，例如Asn或Gly。在另一种优选的本发明实施方式中，R3含有6个氨基酸残基。
在优选的本发明实施方式中，胰岛素前体是一种单链前体，也就是这样一种式I化合物，其中R1和R4一起是含有赖氨酸或精氨酸残基的肽残基。因此，优选地，胰岛素前体不是哺乳动物的胰岛素，例如猪胰岛素、兔胰岛素、狗胰岛素或鲸胰岛素。
按照另一种本发明实施方式，式I胰岛素前体在A1至A21位和B1至B29位含有与人胰岛素内相同位置处的氨基酸残基相同的残基。
按照另一种本发明实施方式，式I胰岛素前体在A1至A21位和B1至B29位含有相同的氨基酸残基，其条件是B28氨基酸残基是Asp。
按照另一种本发明实施方式，式I胰岛素前体在A1至A21位和B1至B29位含有与人胰岛素内相同位置处的氨基酸残基相同的残基，其条件是B28氨基酸残基是Lys，B29氨基酸残基是Pro。
按照另一种本发明实施方式，式I胰岛素前体在A1至A21位和B1至B29位含有与人胰岛素内相同位置处的氨基酸残基相同的残基，其条件是A21氨基酸残基是Gly，B31和B32氨基酸残基都是Arg。
可以用在本发明方法中的具体胰岛素前体的实例有人胰岛素原；猴胰岛素原；[Ala31，Lys32]-des(33-63)猪胰岛素原；猪胰岛素；在N-末端延伸了Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(SEQ ID NO.：1)的[Asp28]-des(30-65)人胰岛素原；和在N-末端延伸了Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQ ID NO.：2)的[Asp28，Met30，Trp31，Lys32]-des(33-65)人胰岛素原。
式I胰岛素前体可以如公开号为WO01/49742、WO01/49870、WO01/079250和WO02/079254的国际申请所述或者类似于所述加以制备，其内容结合在此作为参考。
所需中间产物(即所需的裂解产物)相当于这样的胰岛素前体，其中至少一个赖氨酸或精氨酸残基已经被裂解，分别生成赖氨酰或精氨酰部分。此外，在所需的中间产物中，彼此经由两个二硫桥连接的A和B链并不经由B链C末端与A链N末端之间的肽链而彼此连接。在优选的本发明实施方式中，所需中间产物中氨基酸残基的数量在约48至约52的范围内，优选在约49至约51的范围内，更优选为50。在另一种优选的本发明实施方式中，在所需中间产物中存在、而在人胰岛素中相应位置处并不存在的氨基酸残基不多于4个、优选不多于3个、更优选不多于2个、进而更优选不多于1个。
按照一种本发明实施方式，所需中间产物(所需裂解产物)可以如通式II所述：
Figure A0282296200111
其中Zn和Zm彼此独立地代表两个肽部分，各自分别含有n个和m个氨基酸残基，R’1代表肽残基，R’2代表氨基酸残基或肽残基，R’3代表肽残基，R’4代表赖氨酸或精氨酸或者在C末端含有赖氨酸或精氨酸残基的肽残基，两条垂直的线表示两个半胱氨酸残基之间的二硫键，此外，在R’1和Zn中存在的两个半胱氨酸残基之间有二硫键。
在优选的本发明实施方式中，R’1是按顺序排列的人胰岛素中的氨基酸残基A1至A6，其中可选地，一个或两个氨基酸残基已经被置换为另一种氨基酸残基，或者其中一个或两个氨基酸残基不存在。在另一种优选的本发明实施方式中，R’2是-Asn或-Gly。在另一种优选的本发明实施方式中，R’3是按顺序排列的人胰岛素中的氨基酸残基B1至B6，其中可选地，一个或两个氨基酸残基已经被置换为另一种氨基酸残基，或者其中一个或两个氨基酸残基不存在。在另一种优选的本发明实施方式中，R’4是按顺序排列的人胰岛素中的氨基酸残基B20至B29，按顺序排列的人胰岛素中氨基酸残基B20至B29满足这样的条件，它在B28具有Asp，在B29具有Lys，按顺序排列的人胰岛素中氨基酸残基B20至B28满足这样的条件，它在B28具有Lys，其中各自可选地，一个或两个氨基酸残基已经被置换为另一种氨基酸残基，或者其中一个或两个氨基酸残基不存在，或者任意这些肽残基的一部分从其C末端丧失了一个或多个连续的氨基酸残基。在另一种优选的本发明实施方式中，Zn是按顺序排列的人胰岛素中氨基酸残基A8至A19，其中可选地，一个或两个氨基酸残基已经被置换为另一种氨基酸残基，或者其中一个或两个氨基酸残基不存在。在另一种优选的本发明实施方式中，Zm是按顺序排列的人胰岛素中氨基酸残基B8至B18，其中可选地，一个或两个氨基酸残基已经被置换为另一种氨基酸残基，或者其中一个或两个氨基酸残基不存在。
在裂解反应和偶联反应期间，反应温度处于反应混合物冷冻点至约50℃的范围内。优选的温度在约0℃至约25℃的范围内。
简而言之，偶联反应是如下进行的：若至少约25％、优选至少50％、更优选至少75％、优选至少85％、更优选至少95％的胰岛素前体已经裂解为所需中间产物，则一方面将亲核化合物、另一方面将有机溶剂与发生裂解的反应混合物相混合，以便获得适宜于或有利于偶联步骤的反应条件。裂解(转化)的百分比基于用于裂解的反应混合物中可能的平衡而言。通常，从酶裂解反应开始直至经过一段时间，所需中间产物、即所需裂解产物的收率增加，并且达到最大浓度。然后，所需裂解产物的浓度可能降低。
在优选的本发明实施方式中，在偶联反应发生之前不从裂解反应所得反应混合物中除去任何组分。为此，一种简单的方式是在裂解反应之后，加入亲核化合物和足量有机溶剂。按照这种方式，例如用在裂解步骤中的酶也是用在偶联步骤中的。
本发明的方法还涵盖在这样一种反应混合物中的偶联反应，其中，除了所需中间产物以外，还含有少量部分裂解的胰岛素前体和/或未反应的胰岛素前体。
在另一种优选的本发明实施方式中，亲核化合物是氨基酸酰胺或肽酰胺，其中酰胺基团没有被取代，或者被不多于16个碳原子的烷基单取代或二取代，该烷基与相邻的氮原子一起可以构成一个环，或者酰胺基团被芳基单取代或二取代。脂族取代基是优选的。取代的酰胺基团的实例有N，N-二甲基酰胺、N，N-二乙基酰胺和N-己基酰胺。
在优选的本发明实施方式中，核苷酸化合物是氨基酸酯，其中羧基是被保护的，任意羟基可选地是被保护的。在进一步优选的本发明实施方式中，核苷酸化合物是苏氨酸酯，其中羧基是被保护的，并且可选地羟基是被保护的。因此，L-苏氨酸酯可以如下式IIIa所述：
Thr(R5)-OR6               (IIIa)
其中R6代表羧基保护基团，R5代表氢或羟基保护基团。为了清楚起见，苏氨酸酯可以如通式CH3-CH(OR5)-CH(NH2)COOR6所述，其中R6和R5是如上所述的。
有些亲核化合物是已知的化合物，其余亲核化合物可以类似于已知化合物的制备或者类似于已知方法加以制备。
亲核化合物可以采用游离碱的形式或其可溶性盐的形式，例如盐酸盐、乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。
在偶联反应开始时，可取的是在偶联反应混合物溶液中存在实质性过量的亲核化合物，亲核化合物与所需中间产物之间的摩尔比优选地超过约5∶1。在偶联反应开始时，亲核化合物在反应混合物中的浓度应当优选地超过0.1摩尔浓度，浓度上限是它的溶解度。
为了达到60％收率这一被视为实施本发明的重要方面，使反应温度、水分和pH值在所述范围内相互关联。
适合于实施本发明的有机溶剂是极性溶剂，它们与水是可混溶的，优选地能够在其中含有高浓度的所需中间产物(例如式II)和亲核化合物。适合的有机溶剂的实例有非质子溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮-2和二甲基亚砜，以及质子溶剂，例如乙酸、乙醇、甲醇、2-丙醇、1-丙醇、丁醇和1，4-丁二醇。还可以使用二噁烷、丙酮、四氢呋喃、甲酰胺和乙腈，甚至用作亲核化合物的氨基酸酯也能完全或部分地充当有机溶剂。溶剂的属性在总体上的确影响系统，适用于一种高收率溶剂的相互关联性可能不适用于另一种不同的溶剂。利用非质子溶剂已经获得最佳的收率结果，非质子溶剂是实施本发明所最优选的。
显然，在计算或测定反应混合物中的水分时，亲核化合物被视为有机溶剂。
酸或碱的加入是可选的，酸例如有盐酸、甲酸、乙酸、丙酸或丁酸，碱例如有吡啶、TRIS、N-甲基吗啉、三乙胺或N-乙基吗啉。在反应混合物中包括它们，可以带来适合的pH值。尽管无机酸或碱可以用于实施本发明，不过有机酸和碱是优选的，特别是上面提到的那些。有机酸是最优选的。
在偶联反应开始时，反应混合物中胰蛋白酶或ALP(以结晶性胰蛋白酶或ALP或者相当于它们的胰蛋白酶或ALP衍生物的量计算)与所需中间产物之间的重量比优选地在约1∶1000至约1∶10的范围内，更优选在约1∶200至约1∶50的范围内。
在有些情况下，在裂解步骤中所加入的酶足以进行偶联反应，在这类情况下，没有必要在偶联步骤中加入额外量的酶。在其他情况下，可能需要在偶联步骤期间加入额外量的酶。
由于溶液中高浓度的所需中间产物和亲核化合物可促进高转化率，因此溶剂的选择偏向于反应物易溶于其中的那些溶剂。亲核化合物的溶解度是特别重要的，因为该反应物应当以高浓度存在。在偶联反应开始时，亲核化合物与所需中间产物的摩尔比应当优选地超过5∶1，优选超过50∶1。在偶联反应开始时，亲核化合物在反应混合物中的浓度应当优选为至少0.1摩尔浓度。
在优选的本发明实施方式中，使用具有羧基保护基团的亲核化合物，该保护基团能够在不会导致胰岛素分子发生实质性不可逆改变的条件下从所得胰岛素化合物中被除去。作为这类羧基保护基团的实例，可以提到低级烷基，例如甲基、乙基和叔丁基，取代的苄基，例如对-甲氧基苄基、二苯基甲基和2，4，6-三甲基苄基，和通式为-CH2-CH2-SO2R7的基团，其中R7代表低级烷基，例如甲基、乙基、丙基和正丁基。
适合的羟基保护基团是能够在不会导致胰岛素分子发生实质性不可逆改变的条件下被除去的那些。作为这种基团的实例，可以提到叔丁基。
另外常用的保护基团描述于Wunch：Metoden der OrganischenChemie(Houben-Weyl)，Vol.XV/1，editor：Eugen Muller，GeorgThieme Verlag，Stuttgart 1974。
按照一种本发明实施方式，本发明的方法将生成通式IV化合物：
其中Zn和Zm彼此独立地代表两个肽部分，各自分别含有n个和m个氨基酸残基，R’1代表肽残基，R’2代表氨基酸残基或肽残基，R’3代表肽残基，R’4是如上所述的，R’6是携带羧基保护基团的氨基酸或可选地携带羧基保护基团的肽残基。
胰岛素化合物中的任意羧基保护基团(例如R6)和任意羟基保护基团(例如R5)都能够借助已知方法或本身已知的方法被除去。在羧基保护基团是甲基、乙基或通式-CH2-CH2-SO2R7基团的情况下，其中R7是如上所定义的，所述保护基团可以这样除去，即在微碱性条件下，在水性介质中，pH值优选地在约8至约12的范围内，例如约9.5。作为碱，可以使用强碱，例如叔胺碱，例如三乙胺，碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠，或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钙或氢氧化镁。在羧基保护基团是叔丁基、取代的苄基(例如对-甲氧基苄基或2，4，6-三甲基苄基)或二苯基甲基的情况下，所述基团可以借助酸解作用除去，优选地利用三氟乙酸进行。三氟乙酸可以是无水的或者可以含有一些水，或者可以是用有机溶剂例如二氯甲烷稀释的。在羟基保护基团(例如R5)是叔丁基的情况下，所述基团可以借助酸解作用除去，见上。
优选地，所制备的胰岛素化合物没有羟基保护基团。
在优选的本发明实施方式中，本发明的方法转化胰岛素前体(例如式I)为胰岛素化合物(例如式IV)，后者在B链C末端氨基酸残基中具有羧基保护基团，然后可以被去保护，生成没有羧基保护基团的胰岛素化合物。
在按照上述解释并考虑下列实施例所得结果而选择反应条件时，胰岛素化合物的收率有可能高于60％，甚至高于80％，在某些优选的条件下可高于90％。
借助本发明的方法，能够获得可接受纯度的胰岛素化合物，并且如果需要的话出于治疗目的加以进一步纯化。
更具体而言，例如，天冬氨胰岛素可以这样制备，用ALP酶促裂解胰岛素前体，例如在N-末端延伸了Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(SEQID NO.：1)的[Asp28]-des(30-65)人胰岛素原，再与亲核化合物、例如L-苏氨酸甲酯偶联，继之以水解。
赖氨酸脯氨酸胰岛素例如可以这样制备，用胰蛋白酶裂解前体，例如猪胰岛素，再与亲核化合物例如Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr(SEQ ID NO.：3)偶联。
甘氨酸精氨酸胰岛素例如可以这样制备，用ALP酶促裂解胰岛素前体，例如[Gly86]-des(30-65)人胰岛素原，再与亲核化合物例如Thr-Arg-Arg-OMe偶联，继之以水解。
本文所用缩写符合IUPAC-IUB生物化学命名委员会批准的规则(1974)，参见Collected Tentative Rules & Recommendations of theCommission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB，2nd edition，Maryland 1975。
本文对参考文献的引用并不承认它构成现有技术。
本文中的术语“包含”被广泛地解释为表示“包括”、“含有”或“涵盖”(参见EPO指南C4.13)。
下列实施例仅供例证，而非限制。
实施例1
将200mg[Ala31，Lys32]-des(33-63)猪胰岛素原悬浮在1.35ml水中，用10μl三乙胺调节pH值至9。加入375μl N，N-二甲基乙酰胺与460μl水的混合物，同时轻微搅拌，向所得溶液加入315μl 5.4mg/ml水解无色杆菌赖氨酰特异性蛋白酶(EC3.4.21.50)(下称ALP)的水溶液。用20μl三乙胺调节pH值至9.8，将反应溶液在23℃下放置1小时。加入70μl 4N盐酸使反应溶液酸化，在冰浴中冷却。加入300mg L-苏氨酸甲酯的4.85ml N，N-二甲基乙酰胺溶液，加入450μl 4N盐酸调节pH值至6.5。将反应溶液在23℃下放置4小时，然后加入盐酸至pH值＜3，终止反应。在4mm×250mm 5μm C18硅胶柱上进行反相HPLC分析，用调至pH4的含有0.125M硫酸铵的乙醇-水洗脱，在5小时总反应时间后发现人胰岛素甲酯的转化率为86％。
还进行一步转化，供对比：
将100mg[Ala31，Lys32]-des(33-63)猪胰岛素原悬浮在887μl水与175μl N，N-二甲基乙酰胺的混合物中。将150mg L-苏氨酸甲酯溶于2.265ml N，N-二甲基乙酰胺，缓慢加入到冰冷却的混合物中。用340μl乙酸调节pH值至6.5，加入158μl 5.4mg/ml ALP水溶液。对酸化样本进行RP-HPLC分析来监测转化反应。5小时后，发现人胰岛素甲酯的转化率为53％，24小时后转化率达到最大87％。
为了将所分离的人胰岛素甲酯转化为人胰岛素，将其溶于水，pH值为10，浓度为10mg/ml。24小时后通过用1N盐酸调节pH至5.2来终止反应，离心分离所沉淀的人胰岛素，经过反相高效液相色谱纯化。
在相同的反应时间下，即5小时，与本身已知的方法相比，本发明方法的收率提高了62％。如果与本发明方法的反应时间相比将该已知的一步转化法的反应时间延长几乎5倍，则这两种方法达到几乎相同的收率。
实施例2
将200mg猪胰岛素悬浮在1.37ml水中，加入294μl N-甲基-2-吡咯烷酮与326μl水的混合物，同时轻微搅拌。用10μl 2N氢氧化钠调节pH值至9.0，向所得溶液加入315μl 5.4mg/ml ALP水溶液。用12μl2N氢氧化钠调节pH值至9.8，将反应溶液在23℃下放置4小时。加入70μl 4N盐酸使反应溶液酸化，在冰浴中冷却。将300mg L-苏氨酸甲酯的4.4ml N-甲基-2-吡咯烷酮溶液用500μl 4N盐酸酸化。缓慢加入胰岛素溶液，用50μl 2N盐酸调节pH值至6.5。将反应溶液在23℃下放置4小时，然后加入盐酸至pH值＜3来终止反应。在4mm×250mm5μm C18硅胶柱上进行反相HPLC分析，用调至pH4的含有0.125M硫酸铵的乙醇-水洗脱，在8小时总反应时间后发现人胰岛素甲酯的转化率为86％。
还进行一步转化，供对比：
将100mg猪胰岛素悬浮在848μl水与147μl N-甲基-2-吡咯烷酮的混合物中。将150mg L-苏氨酸甲酯溶于2.2ml N-甲基-2-吡咯烷酮，缓慢加入到冰冷却的混合物中。用300μl乙酸调节pH值至6.5，加入158μl5.4mg/ml ALP水溶液。将反应溶液放置在23℃下，借助酸化样本的RP-HPLC分析来监测转化反应。8小时后，发现人胰岛素甲酯的转化率为54％，48小时后人胰岛素甲酯的转化率达到最大86％。
借助碱水解可以将所分离的人胰岛素甲酯转化为人胰岛素。
在相同的反应时间下，即8小时，与本身已知的方法相比，本发明方法的收率提高了59％。如果与本发明方法的反应时间相比将该本身已知的一步转化反应时间延长6倍，则这两种方法达到相同的收率。
实施例3
将200mg在N-末端延伸有肽Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(SEQ IDNO.：1)的[Asp28]-des(30-65)人胰岛素原悬浮在1.35ml水中，加入350μlN，N-二甲基甲酰胺与425μl水的混合物，同时轻微搅拌，用45μl三乙胺调节pH值至9。向所得溶液加入200μl 8.5mg/ml ALP水溶液，用20μl三乙胺调节pH值至9.8。将反应溶液在23℃下放置1小时。加入70μl 4N盐酸使反应溶液酸化，在冰浴中冷却。加入300mg L-苏氨酸甲酯的4.95ml N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入470μl 4N盐酸调节pH值至6.5。将反应溶液在23℃下放置4小时，然后加入盐酸至pH值＜3来终止反应。在4mm×250mm 5μm C18硅胶柱上进行反相HPLC分析，用调至pH4的含有0.125M硫酸铵的乙醇-水洗脱，在5小时总反应时间后发现转化为[AspB28]-人胰岛素甲酯的转化率为87％。
还进行一步转化，供对比：
将90mg在N-末端延伸有肽Glu-(Glu-Ala)3-Pro-Lys-(SEQ IDNO.：1)的[Asp28]-des(30-65)人胰岛素原悬浮在887μl水与175μl N，N-二甲基甲酰胺的混合物中。将150mg L-苏氨酸甲酯溶于2.13ml N，N-二甲基甲酰胺，缓慢加入到冰冷却的混合物中。用250μl乙酸调节pH值至6.5，加入118μl 8.5mg/ml ALP水溶液。借助酸化样本的RP-HPLC分析来监测转化反应。5小时后，发现[AspB28]人胰岛素甲酯的转化率为47％，24小时后转化为[AspB28]人胰岛素甲酯的转化率达到最大81％。
借助碱水解可以将所分离的胰岛素甲酯转化为[AspB28]人胰岛素。
在相同的反应时间下，即5小时，与本身已知的方法相比，本发明方法的收率几乎加倍。如果与本发明方法的反应时间相比将该本身已知的一步转化反应时间延长近5倍，则这两种方法达到相当的收率。
实施例4
将1.5g在N-末端延伸有肽Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQ IDNO.：2)的[Asp28，Met30，Trp31，Lys32]-des(33-65)人胰岛素原悬浮在3.5g水中。在轻微搅拌和环境温度下，逐渐加入4M氢氧化钠至pH值为10.67，使前体溶解。加入3.7g 45％(重量/重量)乙醇水溶液。加入1.5ml 5.8mg/ml ALP水溶液，使混合物反应2小时。加入4N盐酸调节pH值至4.7。将2.025g L-苏氨酸乙酯溶于16.2ml乙醇，在最大温度为15℃下加入该溶液。用4N盐酸调节pH值至6.5。调节温度至环境温度，将反应混合物在该温度下放置20小时。在4mm×250mm5μm C18硅胶柱上进行反相HPLC分析，用调至pH3.6的含有200mM硫酸钠的乙腈-水洗脱，在1小时反应时间后发现天冬氨胰岛素乙酯的转化率为89.1％，在20小时反应时间后发现转化率为90.5％。
借助碱水解可以将所分离的天冬氨胰岛素乙酯转化为天冬氨胰岛素。
实施例5
将10.9g在N-末端延伸有肽Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys-(SEQ IDNO.：2)的[Asp28，Met30，Trp31，Lys32]-des(33-65)人胰岛素原悬浮在49.3g水中。在轻微搅拌和环境温度下，逐渐加入37.6g含有0.36M氢氧化钠、0.27M乙酸钠和36％N-甲基-2-吡咯烷酮的混合物，使前体溶解。用9.2ml 0.5M氢氧化钠调节pH值至9.7。加入7.1ml 7.1mg/ml ALP水溶液，使混合物反应5小时。在反应中加入更多的0.5M氢氧化钠，使pH值保持恒定在9.7。将反应混合物冷却至5℃，加入2.73g 4N盐酸而调节pH值至5.7。加入14.02g L-苏氨酸乙酯，用4N盐酸调节pH值至6.0。加入344g冷(4℃)的N-甲基-2-吡咯烷酮。将温度调至22℃，用4N盐酸调节pH值至6.5。将反应混合物在该温度下放置9小时。在4mm×250mm 5μm C18硅胶柱上进行反相HPLC分析，用调至pH3.6的含有200mM硫酸钠的乙腈-水洗脱，在14小时总反应时间后发现转化为天冬氨胰岛素乙酯的转化率为87.5％。
借助碱水解可以将所分离的天冬氨胰岛素乙酯转化为天冬氨胰岛素。
                       序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>制备胰岛素化合物的方法
<130>6325.204-WO
<160>3
<170>Patentrn version 3.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>肽
<400>1
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lys
1               5
<210>2
<211>6
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>肽
<400>2
Glu Glu Gly Glu Pro Lys
1               5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>肽
<400>3
Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
1               5

Claims (17)

1、一种制备胰岛素化合物的方法，其中a)在含有至少约55％、优选至少约60％、更优选至少70％水(重量/重量)的反应混合物中，使胰岛素前体进行酶促裂解，然后无需从反应混合物中分离中间产物，b)在水分含量范围从约10％至约50％水(重量/重量)、优选约20％至约40％水(重量/重量)的反应混合物中，使所述中间产物与亲核化合物偶联，和c)如果需要的话，除去保护基团。
2、一种制备胰岛素化合物的方法，其中a)在含有至少约55％、优选至少约60％、更优选至少70％水(重量/重量)的反应混合物中，使胰岛素前体进行酶促裂解，然后，b)在用于酶促裂解反应的反应混合物中，使中间产物与亲核化合物偶联，其条件是该反应混合物的组成已被修改，以便反应混合物中的水分含量范围是从约10％至约50％水(重量/重量)，优选约20％至约40％水(重量/重量)，和c)如果需要的话，除去保护基团。
3、根据权利要求2的方法，其中在裂解步骤与偶联步骤之间没有进行中间产物的分离。
4、根据权利要求2的方法，其中用于裂解步骤的酶也存在于偶联步骤中。
5、根据在先权利要求中任意一项的方法，其中在开始偶联反应之前，至少约25％、优选至少50％、更优选至少75％、优选至少85％、更优选至少95％的胰岛素前体被裂解为中间产物。
6、根据在先权利要求中任意一项的方法，其中用于酶促裂解的酶是胰蛋白酶或赖氨酰特异性蛋白酶，优选水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶I。
7、根据在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是氨基酸酯。
8、根据在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是苏氨酸酯。
9、根据后2项除外的在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是氨基酸酰胺。
10、根据后3项除外的在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是肽。
11、根据后4项除外的在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是肽酯。
12、根据后5项除外的在先权利要求中任意一项的方法，其中亲核化合物是肽酰胺。
13、根据在先权利要求中任意一项的方法，包括从胰岛素化合物中除去保护基团的步骤。
14、根据前述权利要求中任意一项的方法，其中所得胰岛素化合物在B30位具有苏氨酸。
15、根据前述权利要求中任意一项的方法，其中所得化合物是人胰岛素、天冬氨胰岛素、赖氨酸脯氨酸胰岛素、甘氨酸精氨酸胰岛素或地特胰岛素。
16、由根据上述权利要求中任意一项的方法所制备的胰岛素化合物。
17、如本文所述的任意新颖的特征或特征的组合。
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