ES2264124T3 - Acilacion selectiva de grupos epsilon-amino de insulina. - Google Patents

Acilacion selectiva de grupos epsilon-amino de insulina.

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ES2264124T3 ES95308167T ES95308167T ES2264124T3 ES 2264124 T3 ES2264124 T3 ES 2264124T3 ES 95308167 T ES95308167 T ES 95308167T ES 95308167 T ES95308167 T ES 95308167T ES 2264124 T3 ES2264124 T3 ES 2264124T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA ACILACION DE PROTEINAS. MAS PARTICULARMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO DE UN SOLO PASO PARA ACILAR SELECTIVAMENTE EL GRUPO DE EPSILON-AMINO LIBRE DE LA INSULINA, DE UN ANALOGO DE LA INSULINA O DE LA PROINSULINA EN LA PRESENCIA DE UN GRUPO DE ALFA-AMINO LIBRE.

Description

Acilación selectiva de grupos \epsilon-amino de insulina.
La presente invención se refiere a la acilación de proteínas. Más en particular, la invención se refiere a un procedimiento en una etapa para acilar selectivamente el grupo \epsilon-amino de la proinsulina, insulina o un análogo de insulina en presencia de un grupo \alpha-amino libre.
La acilación de grupos amino es uno de los medios más comunes usados para modificar las proteínas químicamente. Se exponen procedimientos generales de acilación en Methods of Enzymology, 25: 494-499 (1972) e incluyen el uso de ésteres activados, haluros de ácido o anhídridos de ácido. El uso de ésteres activados, en particular de ésteres de N-hidroxisuccinimida de ácidos grasos, es un medio particularmente ventajoso de acilación de un aminoácido libre con un ácido graso. Lapidot y col., J. of Lipid Res. 8: 142-145 (1967). Lapidot y col. describen la preparación de ésteres de N-hidroxisuccinimida y su uso para preparar N-lauroil-glicina, N-lauroil-L-serina y ácido N-lauroil-L-glutámico.
En Biochem. J. 121: 737-745 (1971) Lindsay y col. describen estudios previos de acilación selectiva de grupos amino de la insulina. Lindsay y col. describen la reactividad de la insulina con acetato de N-succinimidilo con una concentración baja de reactivo y a pH casi neutro para producir dos productos monosustituidos, Phe^{B1}-acetil-insulina y Gly^{A1}-acetil-insulina. A pH 8,5, se reduce la cantidad de Phe^{B1}-acetil-insulina producida y también se produce Lys^{B29}-acetil-insulina. Así, Lindsay y col., concluyen que a pH 6,9 el orden de reactividad es Glicina (A1) \approx Fenilalanina (B1) >> Lisina (B29) y a pH 8,5 Glicina (A1) > Fenilalanina \approx Lisina (B29). Ídem.
Lindsay y col., patente de EE.UU. 3.869.437, describen la acilación del aminoácido B^{1} con un grupo acilo que contiene hasta siete carbonos y que opcionalmente bloquea el grupo A^{1}- y/o B^{29}-amino con un grupo acilo con hasta cuatro carbonos. Se describen los ésteres de N-hidroxisuccinimida como agentes de acilación particularmente ventajosos. Con el fin de producir el rendimiento máximo de insulina acilada en el grupo B^{1}-amino, la proporción de agente de acilación es relativamente baja (de uno a no más de dos equivalentes molares de agente de acilación). Además, el rendimiento máximo de producto B^{1} monosustituido se produce a un pH de o aproximadamente cerca de pH 7. A pH 8,5 a 9,0, el rendimiento del producto B^{1} acilado deseado disminuye considerablemente en favor de la sustitución adicional en las posiciones A^{1} y B^{29}.
D.G. Smyth, en la patente de EE.UU. 3.868.356, y Smyth y col., en la patente de EE.UU. 3.868.357 describen derivados de insulina N-acilados, O-sustituidos, en los que al menos uno de los grupos amino de los aminoácidos A^{1}, B^{1} o B^{29} se convierte en un grupo amino bloqueado. La acilación se lleva a cabo con un exceso relativamente pequeño de agente de acilación, p. ej., de 2 a 3 moles por grupo amino a un pH neutro o ligeramente alcalino, p. ej., 7-8. La reacción se desarrolla con rendimiento muy alto con la formación del derivado disustituido que resulta de la reacción de los grupos amino de A^{1} y B^{1}. En presencia de exceso de agente de acilación, p. ej., hasta 10 molar, la reacción se desarrolla además en el grupo amino de B^{29} para formar el derivado trisustituido.
Para acilar selectivamente la insulina, Muranishi y Kiso, en la solicitud de patente japonesa 1-254.699, describen una síntesis en cinco etapas para preparar derivados de insulina con ácidos grasos. En la etapa uno, se prepara el éster del ácido graso activado; en la etapa dos, los grupos amino de la insulina se protegen con p-metoxi-benzoxi-carbonilazida (pMZ); en la etapa tres, la insulina-pMz se hace reaccionar con el éster de ácido graso; en la etapa cuatro, la insulina acilada se desprotege; y en la etapa cinco, la insulina acilada se aisla y purifica. Más concretamente, la acilación selectiva de un grupo amino sólo se logra usando el grupo de bloqueo pMZ para proteger los otros grupos amino. Usando esta metodología, Muranishi y Kiso preparan los siguientes compuestos: Lys^{B29}-palmitol-insulina (se acila el grupo \epsilon-amino), Phe^{B1}-palmitol-insulina (se acila el grupo \alpha-amino N-terminal de la cadena B), y Phe^{B1},Lys^{B29}-dipalmitol-insulina (se acila tanto el grupo \epsilon-amino como el \alpha-amino N-terminal).
De la misma forma, Hashimoto y col. en Pharmaceutical Research 6: 171-176 (1989), enseñan una síntesis en cuatro etapas para preparar N-palmitoil-insulina. La síntesis incluye proteger y desproteger la A^{1}-glicina N-terminal y el grupo \epsilon-amino de la lisina B^{29}, con pMZ. Con las condiciones descritas en la referencia, se preparan dos productos acilados mayoritarios, B^{1}-mono-palmitoil-insulina y B^{1}, B^{29}-dipalmitoil-insulina.
Por lo tanto, antes de la presente invención, la acilación selectiva del grupo B^{29}-N^{\epsilon}-amino de la insulina se llevaba a cabo mediante protección y posterior desprotección de los grupos \alpha-amino.
La presente invención proporciona una síntesis selectiva en una etapa para acilar el grupo \epsilon-amino de la proinsulina, insulina y análogos de insulina. Es bastante sorprendente que la invención puede acilar selectivamente el grupo \epsilon-amino en un procedimiento en una etapa con un rendimiento alto. Por lo tanto, la invención elimina la necesidad de proteger y posteriormente desproteger los otros grupos amino de la proteína. La invención proporciona medios más eficaces y más baratos para preparar derivados de insulina acilados en \epsilon-amino.
La presente invención proporciona un procedimiento para acilar selectivamente la proinsulina, insulina o un análogo de insulina que tengan un grupo \epsilon-amino libre y un grupo \alpha-amino libre, con un ácido graso, que comprende hacer reaccionar el grupo \epsilon-amino con un éster de ácido graso activado soluble en condiciones básicas en un disolvente polar.
Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta descripción son las aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas de Estados Unidos, como se expone en el título 37 del C.F.R. apartado 1.822 (B) (2).
Como se ha indicado antes, la presente invención proporciona una acilación muy selectiva, en una etapa, del grupo \epsilon-amino de la proinsulina, insulina o un análogo de insulina. La invención especifica las condiciones que acilan con preferencia el grupo \epsilon-amino frente a los grupos \alpha-amino. En general, el grupo \alpha-amino monoacilado se produce con menos de 5% de rendimiento.
El término "insulina" tal como se usa en el presente documento significa la insulina humana, insulina porcina, o insulina de ganado. La insulina tiene tres grupos amino libres: B^{1}-Fenilalanina, A^{1}-Glicina y B^{29}-Lisina. Los grupos amino libres de las posiciones A^{1} y B^{1} son grupos \alpha-amino. El grupo amino libre de la posición B^{29} es un grupo \epsilon-amino.
El término "proinsulina" tal como se usa en el presente documento es una proteína reticulada de forma adecuada de fórmula:
B - C - A
en la que:
A es la cadena A de la insulina o un derivado funcional de la misma;
B es la cadena B de la insulina o un derivado funcional de la misma que tiene un grupo \epsilon-amino; y
C es el péptido conector de la proinsulina.
Preferiblemente, la proinsulina es la cadena A de la insulina humana, la cadena B de la insulina humana, y C es el péptido conector natural. Cuando la proinsulina es la secuencia natural, la proinsulina tiene tres grupos amino libres: B^{1}-Fenilalanina (grupo \alpha-amino) , C^{64}-Lisina (grupo \epsilon-amino) y B^{29}-Lisina (grupo \epsilon-amino).
La expresión "análogo de insulina" tal como se usa en el presente documento es una proteína reticulada de forma adecuada de fórmula:
A - B
en la que
A es un derivado funcional de la cadena A de la insulina; y
B es un derivado funcional de la cadena B de la insulina que tiene un grupo \epsilon-amino.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de insulina preferidos incluyen insulinas en las que:
el resto aminoácido en la posición B^{28} es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala;
el resto aminoácido en la posición B^{29} es Lys o Pro;
el resto aminoácido en la posición B^{10} es His o Asp;
el resto aminoácido en la posición B^{1} es Phe, Asp, o se ha eliminado solo o combinado con la eliminación del resto en la posición B^{2};
el resto aminoácido en la posición B^{30} es Thr, Ala, o eliminado; y
el resto aminoácido en la posición B^{9} es Ser o Asp; con la condición de que cualquiera de las posiciones B^{28} o B^{29} sea Lys.
En términos bioquímicos habituales conocidos por el experto en la técnica, los análogos de insulina preferidos son: Lys^{B28}Pro^{S29}-insulina humana (B^{28} es Lys; B^{29} es Pro); Asp^{B28}-insulina humana (B^{28} es Asp); Asp^{B1}-insulina humana, Arg^{B31,B32}-insulina humana, Asp^{B10}-insulina humana, Arg^{A0}-insulina humana, Asp^{B1},Glu^{B13}-insulina humana, Ala^{B26}-insulina humana, des(B30)-insulina humana, y Gly^{A21}-insulina humana.
El término "acilar" significa la introducción de uno o más grupos acilo unidos de forma covalente a los grupos amino libres de la proteína.
La expresión "acilación selectiva" significa la acilación preferente del grupo o grupos \epsilon-amino frente a los grupos \alpha-amino. En general, la acilación selectiva da como resultado una proporción de la cantidad de producto con el grupo \epsilon-amino monoacilado al producto con el grupo \alpha-amino monoacilado mayor de aproximadamente 5. Preferiblemente, la relación es mayor que aproximadamente 10, y más preferiblemente mayor que aproximadamente 50.
La expresión "ácido graso" significa un ácido graso C_{6}-C_{21} saturado o insaturado. La expresión "éster de ácido graso activado" significa un ácido graso que se ha activado usando las técnicas generales descritas en Methods of Enzymology, 25: 494-499 (1972) y Lapidot y col., J. of Lipid Res. 8: 142-145 (1967). Los ácidos grasos preferidos son saturados e incluyen el ácido mirístico (C_{14}), ácido pentadecílico (C_{15}), ácido palmítico (C_{16}), ácido heptadecílico (C_{17}) y ácido esteárico (C_{18}). Más preferiblemente, el ácido graso es el ácido palmítico. El éster de ácido graso activado incluye derivados de agentes tales como hidroxibenzotriazida (HOBT), N-hidroxisuccinimida y derivados de los mismos. El éster activado preferido es el palmitato de N-succinimidilo.
El término "soluble" indica que está presente una cantidad de éster suficiente en la fase líquida para acilar la insulina, análogo de insulina o proinsulina. Preferiblemente, hay aproximadamente de 1 a 4 equivalentes molares de éster activado por mol de insulina en la fase líquida.
La expresión "condiciones básicas" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la basicidad de la reacción. La reacción se debe llevar a cabo con todos los grupos amino libres sustancialmente desprotonados. En un disolvente acuoso o mezcla de disolventes semiacuosa, condiciones básicas significa que la reacción se lleva a cabo a pH mayor que 9,0. En un disolvente orgánico no acuoso, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base con una basicidad equivalente a un pK_{a} mayor o igual que 10,75 en agua.
El término "reticulado" significa la formación de enlaces disulfuro entre los restos de cisteína. Una proinsulina, insulina o análogo de insulina reticulada de forma adecuada contiene tres puentes disulfuro. El primero puente disulfuro se forma entre los restos de cisteína en las posiciones 6 y 11 de la cadena A. El segundo puente disulfuro une los restos de cisteína en la posición 7 de la cadena A con la cisteína en la posición 7 de la cadena B. El tercer puente disulfuro une la cisteína en la posición 20 de la cadena A con la cisteína en la posición 19 de la cadena B.
Antes de la presente invención, el experto en la técnica acilaba selectivamente el grupo \epsilon-amino usando un grupo protector en una síntesis en múltiples etapas. Muranishi y Kiso, en la solicitud de patente japonesa 1-254.699, describen una síntesis en cinco etapas para preparar derivados de insulina acilada. De la misma forma, Hashimoto y col, en Pharmaceutical Research 6: 171-176 (1989), enseña una síntesis en cuatro etapas para preparar N-palmitoil-insulina. Para acilar la insulina selectivamente, ambas referencias enseñan el uso del grupo protector pMZ.
La presente invención produce una proinsulina, insulina o análogo de insulina N^{\epsilon}-acilada con un rendimiento alto, en una síntesis de una etapa. La reacción permite preparar proteínas N^{\epsilon}-aciladas sin usar grupos protectores de amino. La acilación se lleva a cabo haciendo reaccionar un éster de ácido graso activado con el grupo \epsilon-amino de la proteína en condiciones básicas en un disolvente polar. En condiciones básicas débiles, no todos los grupos amino libres están desprotonados y se produce la acilación significativa de los grupos amino N-terminales. En un disolvente acuoso o mezcla de disolventes semiacuosa, condiciones básicas significa que la reacción se lleva a cabo a pH mayor que 9,0. Debido a que la degradación de la proteína se produce en un intervalo de pH superior a 12,0, el pH de la mezcla de reacción es preferiblemente pH 9,5 a 11,5, y más preferiblemente 10,5. La medición del pH de la mezcla de reacción en un disolvente orgánico y acuoso mezclados es el pH de la fase acuosa antes de mezclar.
Los datos en la Tabla 1 demuestran el efecto de la basicidad de la reacción en la selectividad de la reacción. Los datos presentados en la Tabla 1 se generaron con insulina humana acilada con dos equivalentes molares de palmitato de N-succinimidilo en CH_{3}CN/agua al 50%.
TABLA 1 Efectos del pH en la acilación de la insulina
Cantidad relativa de producto
Productos de reacción pH 8,2 pH 9,5 pH 10,2
Insulina humana 85,2% 12,5% 1,6%
A1 y B1 monoacilados 8,1% 0,3% 0,4%
B29 monoacilado 5,2% 70,2% 79,6%
Bis-acilado 0,7% 16,7% 17,7%
Relación de B29 monoacilado a A1 y B1 monoacilados 0,64 234 199
La Tabla 1 demuestra que la acilación del grupo \epsilon-amino depende de la basicidad de la reacción. A un pH mayor que 9,0, la reacción acila selectivamente el grupo \epsilon-amino de la lisina B29.
En un disolvente no acuoso, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base con una basicidad equivalente a un pK_{a} mayor o igual que 10,75 en agua con el fin de desprotonar suficientemente el o los grupos \epsilon-amino. Es decir, la base tiene que ser al menos tan fuerte como la trietilamina. Preferiblemente, la base es tetrametilguanidina (TMG), diisopropiletilamina o hidróxido de tetrabutilamonio.
La elección del disolvente polar depende en gran medida de la solubilidad de la proinsulina, insulina o un análogo de insulina y el éster de ácido graso. De forma más significativa, el disolvente debe ser completamente orgánico. Los disolventes orgánicos aceptables en general incluyen DMSO, DMF y similares. El disolvente acuoso y las mezclas de disolventes acuosos y orgánicos también funcionan. La selección de los disolventes polares está limitada sólo por la solubilidad de los reactivos. Los disolventes y sistemas de disolventes preferidos son DMSO; DMF; acetonitrilo y agua; acetona y agua; etanol y agua; alcohol isopropílico y agua; alcohol isopropílico, etanol y agua; y etanol, propanol y agua. Preferiblemente, el disolvente es acetonitrilo y agua; más preferiblemente acetonitrilo al 50%. Un experto en la técnica reconocerá que también funcionarán otros disolventes polares.
La proporción de los reactivos no es crítica. En general, se prefiere que el éster de ácido graso activado esté en exceso molar. Preferiblemente la reacción se lleva a cabo con 1 a 4 equivalentes molares, más preferiblemente 1 a 2 equivalentes molares del éster. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que con niveles muy altos del éster activado, se producirán productos bis o triacilados en cantidad significativa.
La temperatura de la reacción no es crítica. La reacción se lleva a cabo entre 0 y 40 grados Celsius y en general se completa en 15 minutos a 24 horas.
Después de la acilación, la reacción se inactiva y el producto se purifica por procedimientos estándar tales como cromatografía en fase inversa o hidrófoba. Después, el producto se recupera por procedimientos estándar tales como liofilización o cristalización.
La proinsulina, insulina o análogos de insulina se pueden preparar por cualquiera de una variedad de técnicas de síntesis de péptidos reconocidas que incluyen los procedimientos clásicos (en solución), procedimientos en fase sólida, procedimientos semisintéticos, y los procedimientos de ADN recombinante más recientes. Por ejemplo, Chance y col., solicitud de patente de EE.UU. número 07/388.201, publicación EPO número 383472, Brange y col., EPO 214826, y Belagaje y col., patente de EE.UU. 5.304.473, describen la preparación de diferentes proinsulinas y análogos de insulina y se incorporan en el presente documento por referencia. Las cadenas A y B de los análogos de insulina de la presente invención también se pueden preparar mediante una molécula precursora de tipo proinsulina usando técnicas de ADN recombinante. Véase, Frank y col., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds, D. Rich and E. Gross (1981).
Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente para ilustrar más la invención. No se debe considerar que el alcance de la invención consiste simplemente en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Acilación de la insulina usando palmitato de N-succinimidilo en DMSO
Se disolvieron cristales de insulina humana biosintética (BHI) (71,9 mg) en 6,58 ml de DMSO. La solución se agitó a temperatura ambiente hasta que los cristales se habían disuelto completamente por inspección visual. Se preparó una solución del éster activado (palmitato de N-succinimidilo) por adición de 20 mg del éster activado sólido a 2 ml de DMSO y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estaban en solución por inspección visual. En ese momento se añadió 1,1,3,3-tetrametilguanidina (26,8 \mul) a 5 ml de la solución de BHI, seguido de DMSO (94,4 ml) y la solución de éster activado preparada previamente (400 \mul). La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante aproximadamente 60 minutos. Se sacó una muestra después de 15 minutos, se diluyó 20 veces con ácido acético 1 N y se analizó por HPLC. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de B29-N^{e}-palmitoil-insulina humana en la muestra inactivada dividido entre la cantidad inicial de BHI era 67,1%.
Ejemplo 2
Acilación de la insulina usando palmitato de N-succinimidilo en acetonitrilo y agua
Se disolvieron cristales de insulina humana biosintética (BHI) (199,5 g) en 20 litros de solución de ácido bórico 50 mM a pH 2,5. El pH de la solución se volvió a ajustar a 2,5 usando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se habían disuelto completamente por inspección visual. Se sacó una muestra del material de partida, y la absorbancia medida a 276 nm era 10,55. Se preparó una solución del éster activado (palmitato de N-succinimidilo) por adición de 24 g del éster activado sólido a 2,4 litros de acetonitrilo previamente calentado a aproximadamente 50ºC y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estaban en solución por inspección visual. En ese momento el pH de la solución de BHI se ajustó a aproximadamente 10,22 por adición de NaOH al 10%. Se añadió acetonitrilo (18 litros) a la solución de BHI de pH ajustado. La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante 110 minutos, después se inactivo por adición de agua (123 litros) y ajuste de pH de la solución diluida resultante a 2,01 usando HCl al 10% y NaOH al 10%. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de B29-N^{\epsilon}-palmitoil-insulina humana en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de BHI era 73%.
Ejemplo 3
Acilación de la Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana usando palmitato de N-succinimidilo en acetonitrilo y agua
Se disolvieron cristales de Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana (2,22 g) en 100 ml de solución de ácido bórico 50 mM a pH 2,5. El pH de la solución se volvió a ajustar a 2,5 usando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se habían disuelto completamente por inspección visual. Se preparó una solución del éster activado (palmitato de N-succinimidilo) por adición de 270 g del éster activado sólido a 27 ml de acetonitrilo previamente calentado a aproximadamente 50ºC y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estaban en solución por inspección visual. El pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10,22 por adición de NaOH al 10% y la solución se dejó agitar a 4ºC durante 15 minutos. Se añadió acetonitrilo (73 ml) a la solución de pH ajustado, seguido de la solución del éster activado preparada previamente. La reacción se dejó avanzar a 4ºC durante 85 minutos, y se inactivo por adición de ácido acético 1 N (600 ml), que dio como resultado un pH de 2,85. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de B29-N^{e}-palmitoil-Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana era 72,5%.
Ejemplo 4
Acilación de BHI usando palmitato de N-succinimidilo en acetonitrilo y agua
Se disolvieron cristales de insulina humana (BHI) (3 g) en 300 ml de solución de ácido bórico 50 mM a pH 2,5. El pH de la solución se volvió a ajustar, según fuera necesario, a 2,5 usando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se habían disuelto completamente por inspección visual. Se preparó una solución del éster activado (palmitato de N-succinimidilo) por adición de 400 mg del éster activado sólido a 40 ml de acetonitrilo y agitación vigorosa. En ese momento el pH de la solución de cristales de BHI se ajustó a aproximadamente 10,2 por adición de NaOH al 10%. Después se añadió acetonitrilo (240 ml) a la solución de BHI seguido de la solución del éster activado preparada previamente. La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante 90 minutos, después se inactivo por adición de agua (1800 ml) y ajuste del pH de la solución diluida resultante a aproximadamente 2,5 usando HCl al 10%. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de B29-N^{\epsilon}-palmitoil-insulina humana en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de BHI era 75,7%.
Ejemplo 5
Acilación de la proinsulina con palmitato de N-succinimidilo en acetonitrilo y agua
Se diluyó solución acuosa de proinsulina humana (HPI) (28,2 mg/ml) con ácido bórico 50 mM hasta un volumen final de 100 ml de HPI 16,2 mg/ml. La solución de éster activado se preparó simultáneamente disolviendo 150 mg de palmitato de N-succinimidilo en 15 ml de acetonitrilo (ACN) con agitación rápida. El pH de la solución de HPI después se ajustó a 10,2 con NaOH al 10% seguido de la adición de 88 ml de ACN. La reacción se inició por adición de 12 ml de solución del éster activado (un exceso molar de 2x frente a la HPI). El volumen de reacción final era 200 ml, HPI 8 mg/ml en ACN acuoso al 50%. La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante aproximadamente 60 minutos, y después se inactivo por adición de un volumen equivalente (200 ml) de glicina
50 mM, pH 10,0.
Las proporciones exactas de especies aciladas en el \epsilon-amino a especies aciladas en el \alpha-amino no se calcularon, la suma de todas las especies aciladas en el \epsilon-amino en el cromatograma representaba el 87-90% del área total, mientras que la suma de todas las sustancias relacionadas (que se supone que incluye todas las sustancias aciladas en el
\alpha-amino) representaba < 7% del área total, para cualquier punto de tiempo dado.
Ejemplo 6
Acilación de la Arg^{B31}, Arg^{B32}-insulina humana con éster de hexanoilo de la N-hidroxisuccinimida
Se disolvió Arg^{B31}, Arg^{B32}-insulina humana (1,3 mg) en 200 \mul de tampón (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico) 200 mM a pH 10,4. Después se añadió éster de hexanoilo de la N-hidroxisuccinimida (0,3 \mumoles) disuelto en N,N-dimetilformamida (DMF) y se agitó en la solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (20 a 25ºC) durante aproximadamente cuatro horas, y después se inactivo por ajuste del pH a aproximadamente 2,5 usando HCl 0,1 N. Se separaron las partículas gelatinosas pasando la mezcla por un filtro de 0,45 micrómetros antes del análisis por HPLC. La separación del producto del título del material de partida se logró en una columna de HPLC analítica de fase inversa C_{4}. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de B29-N^{\epsilon}-hexanoil-Arg^{B31}, Arg^{B32}-Insulina humana en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de Arg^{B31}, Arg^{B32}-Insulina humana era 69,4%.
\newpage
Ejemplo 7
Acilación de la Leu^{B26}-Insulina humana con palmitato de N-succinimidilo en DMSO
Se disolvió Leu^{B26}-Insulina humana (1,0 mg) en 1 ml de dimetilsulfóxido al 95% (DMSO), trietilamina al 5% (TEA). Después se añadió palmitato de N-succinimidilo (0,7 \mumoles) disuelto en N,N-dimetilformamida (DMF) y se agitó en la solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (20º a 25ºC) durante aproximadamente 90 minutos, después se inactivo por dilución de la muestra a 0,2 mg/ml con HCl 0,1 N. Se separaron las partículas gelatinosas pasando la mezcla por un filtro de 45 micrómetros antes del análisis por HPLC. La separación del producto del título del material de partida se logró en una columna de HPLC analítica de fase inversa C_{4}. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de N^{e}-palmitoil-Leu^{B26}-Insulina humana en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de Leu^{B26}-Insulina humana era 36,4%.
Ejemplo 8
Acilación de la insulina usando palmitato de N-succinimidilo en dimetilsulfóxido
Se preparó una solución de insulina disolviendo cristales de insulina humana biosintética (1 g, 0,17 mmol) completamente en 20 ml de DMSO a temperatura ambiente. Al mismo tiempo se preparó una solución del éster activado disolviendo palmitato de N-succinimidilo (0,0817 g, 0,23 mmol) en 3 ml de DMSO a 50ºC. A la solución de insulina que se agitó vigorosamente, se añadió primero 1,1,3,3-tetrametilguanidina (0,432 ml, 3,4 mmol) y después la solución entera del éster activado. Después de 30 minutos, la reacción se inactivo con 120 ml de HCl 0,05 M previamente enfriado a 0ºC. El pH de la mezcla era aproximadamente 1,8. El análisis de la mezcla inactivada por HPLC de fase inversa mostró que la B29-N^{\epsilon}-palmitoil-insulina representaba 72,2% de la proteína total eluida, y representaba 95% de toda la insulina monoacilada.
La mezcla de reacción entera se cargó en una columna de fase inversa preparativa C_{4} Vydac (5 x 25 cm) previamente equilibrada con una mezcla de disolventes que contenía ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo en agua al 20%. Después de la carga, la columna se lavó primero con 500 ml del mismo disolvente, después se desarrolló con un caudal de 4 ml/minutos y con un sistema de disolvente que consistía en ácido trifluoroacético al 0,1%, acetonitrilo y agua, en el que la concentración de acetonitrilo aumentaba de 20 a 80% en 9 litros. La B29-N^{\epsilon}-palmitoil-insulina eluyó en este sistema de disolvente compuesto de aproximadamente 53% de acetonitrilo. Después de separar el disolvente por liofilización el rendimiento de la N^{\epsilon}-palmitoil-insulina era 414 mg (0,0684 mmol) o 40,2% basado en el material de partida.
Ejemplo 9
Acilación de la Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana con éster de 1-octanoilo de la N-hidroxisuccinimida
Se disolvieron cristales de Lys(B28), Pro(B29)-Insulina humana (KPB) (2,0 g) en 200 ml de tampón de ácido bórico 50 mM a pH 2,5. El pH de la solución se volvió a ajustar a 2,5 usando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se habían disuelto completamente por inspección visual. Se preparó una solución del éster activado (éster de 1-octanoilo de la N-hidroxisuccinimida) por adición de 175 g del éster activado sólido a 25,62 ml de acetonitrilo, y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estaban en solución por inspección visual. El pH de la solución de KPB se ajustó a aproximadamente 10,4 por adición de NaOH al 10% y la solución se dejó agitar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Se añadió acetonitrilo (176 ml) a la solución de KPB de pH ajustado, seguido de la adición de la solución del éster activado preparada previamente. La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 90 minutos, y se inactivo por adición de 5,5 ml de HCl al 10% (2,75% en v/v) y tres volúmenes (1200 ml) de dH_{2}O fría, que dio como resultado un pH final de 2,70. El rendimiento de la reacción, calculado como la cantidad de LysB29(C8)KPB en la reacción inactivada dividido entre la cantidad inicial de BHI, era 75,5%. Esta solución se dividió en dos partes alícuotas de 800 ml por purificación por cromatografía hidrófoba (SP20SS). A la cromatografía en columna le siguió la ultrafiltración y liofilización.
Los datos en la Tabla 2 demuestran la acilación selectiva de la insulina, análogos de insulina y proinsulina. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente con ésteres de N-hidroxi-succinimida del ácido graso. En la siguiente tabla, TMG y TEA representan tetrametilguanidina y trietilamina respectivamente. ND indica que no hay datos disponibles.
1

Claims (16)

1. Un procedimiento para acilar selectivamente un grupo \epsilon-amino libre de la proinsulina, insulina o un análogo de insulina que también tienen un grupo \alpha-amino libre, que comprende llevar a cabo la acilación selectiva en un disolvente polar y en condiciones básicas, en el que las condiciones básicas son un pH mayor que 9,0 si el disolvente polar es un disolvente orgánico acuoso o semiacuoso, o si el disolvente polar es un disolvente orgánico no acuoso, la acilación selectiva se lleva a cabo en presencia de una base con una basicidad equivalente a un pK_{a} mayor o igual que 10,75 en agua, en el que la proinsulina, insulina o análogo de insulina se acilan selectivamente con un éster de ácido graso activado soluble.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proinsulina, insulina o análogo de insulina es la insulina humana o la Lys^{B29}Pro^{B29}-Insulina humana.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el éster de ácido graso activado soluble es un éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido graso C_{6} a C_{18}.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el éster de ácido graso activado soluble es el éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido graso C_{14} a C_{18}.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el éster de ácido graso activado soluble es un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido palmítico.
6. Un procedimiento para acilar selectivamente la proinsulina, insulina o un análogo de insulina que tienen un grupo \epsilon-amino libre y un grupo \alpha-amino libre con un ácido graso, que comprende hacer reaccionar el grupo \epsilon-amino con un éster de ácido graso activado soluble a un pH de 9,0 o mayor en un disolvente polar.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la proinsulina, insulina o análogo de insulina es la insulina humana o la Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana.
8. El procedimiento de la reivindicación 6 o reivindicación 7, en el que el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido graso C_{6} a C_{18}.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido graso C_{14} a C_{18}.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido palmítico.
11. Un procedimiento para acilar selectivamente la proinsulina, insulina o un análogo de insulina que tienen un grupo \epsilon-amino libre y un grupo \alpha-amino libre con un ácido graso, que comprende hacer reaccionar el grupo \epsilon-amino con un éster de ácido graso activado soluble en un disolvente semiacuoso a un pH de 9,0 a 12,0.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la proteína es la insulina humana, un análogo de insulina o Lys^{B28}Pro^{B29}-Insulina humana.
13. El procedimiento de la reivindicación 11 o reivindicación 12, en el que el pH es de 9,5 a 10,5.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el disolvente semiacuoso es acetonitrilo y agua.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el disolvente es acetonitrilo al 50%.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el éster de ácido graso es palmitato de N-succinimidilo, octanoato de N-succinimidilo o miristato de N-succinimidilo.
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