MXPA97003506A - Acilacion selectiva de grupos epsilon-amino - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la acilación de proteínas. Más particularmente, la invención se refiere a un proceso de un solo paso para acilar selectivamente el grupo E-amino libre de la insulina, análogo de la insulina o proinsulina en presencia de un grupo (alfa)-amino libre.

Description

ACILACION SELECTIVA DE GRUPOS EPSILON-AMINO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la acilación de proteínas. Más particularmente, la invención se refiere a un proceso de un paso para acilar selectivamente el grupo e-amino de la proinsulina, la insulina o un análogo de insulina en presencia de un grupo a-amino libre. La acilación de los grupos amino es uno de los medios más comunes empleados para modificar químicamente las proteínas. Los métodos generales de acilación se describen en Methods of Enzimology, 25: 494-499 (1972) e incluyen el uso de éster activados, haluros de ácido, o anhídridos de ácido. El uso de esteres activados, en particular de esteres de N-hidroxisuccinimida de ácidos grasos es un medio particularmente ventajoso de acilación de un aminoácido libre con un ácido graso. Lapidot y colaboradores, J. of Lipid Res, 8_: 142-145 (1967) . Lapidot y colaboradores describe la preparación de esteres de N-hidroxisuccinimida y su uso en la preparación de N-lauroil-glicina, N-lauroil-L-serina, y N-lauroil-L-ácido glutámico. Estudios anteriores de acilación selectivamente de grupos amino de insulina se REF: 24610 describen en Lindsay y colaboradores, en Biochem. J. 121 : 737-745 (1971) . Lindsay y colaboradores, describe la reactividad de la insulina con acetato de N-succinimidilo a concentración de reactivo baja y pH casi neutro como se producen dos productos onosustituidos, PheB1-acetil-insulina y GlyA1-acetil-insulina. A pH 8.5, la cantidad de PheB1-acetil-insulina producida es disminuida y LysB29-acetil-insulina es también producida. De este modo, Lindsay y colaboradores, concluyen a pH 6.9 el orden de la reactividad es Glicina (Al) «Fenilalanina (Bl) >>Lisina (B29) y a pH 8.5 Glicina (Al) >Fenilalanina«Lisina (B29) . Id. Lindsay y colaboradores, Patente Norteamericana 3,869,437, describe la acilación del aminoácido B1 con un grupo acilo que contiene hasta siete átomos de carbono y opcionalmente bloquea el grupo A1- y/o B29-amino con un grupo acilo con hasta cuatro átomos de carbono. Los esteres de N-hidroxisuccinimida se describen como agentes de acilación particularmente ventajosos. Con el fin de producir el máximo rendimiento de insulina acilada al grupo B^amino, la proporción de agentes de acilación es relativamente baja (una a no más de dos equivalentes molares de agentes de acilación) .

Además, el rendimiento máximo del producto B1- onosustituido es producido a un pH de o aproximado a pH 7. A pH 8.5 a 9.0 el redimiendo del producto B1 acilado, deseado, deriva considerablemente en favor de sustitución adicional en las posiciones A1 y B29. D.G. S yth, en la Patente Norteamericana 3,868,356 y Smyth y colaboradores, en la Patente Norteamericana 3,868,357 describen los derivados de insulina N-acilados, O-sustituidos en los cuales al menos uno de los grupos aminoácidos A1, B1 o B29-amino es convertido a un grupo aminobloqueado . La acilación se lleva a cabo con un exceso relativamente pequeño de agente de acilación, por ejemplo, desde 2 hasta 3 moles por grupo amino a un pH neutro o ligeramente alcalino, por ejemplo 7-8. La reacción gana un alto rendimiento con la formación derivado di-sustituido a partir de la reacción de los grupos A1- y B^amino. En presencia de agente de acilación en exceso, por ejemplo, hasta 10 molar, la reacción deriva adicionalmente en el grupo B29-amino para formar el derivado tri-sustituido . Para acilar selectivamente la insulina, Muranishi y Kiso, en la Solicitud de Patente Japonesa 1*254,699, describen una síntesis de cinco pasos para la preparación de derivados de insulina de ácido graso. Paso uno, el éster de ácido graso activado es preparado; paso dos, los grupos amino de insulina son protegidos con p-metoxi-benzoxicarbonilazid-a (pM2) ; paso tres, la insulina-pMZ se hace reacción con el éster de ácido graso; paso cuatro, la insulina acilada es desprotegida; y paso cinco, la insulina acilada es aislada y purificada. Más notablemente, la acilación selectiva de un grupo amino se logra únicamente mediante la utilización del grupo pMZ de bloqueo para proteger los otros grupos amino. Utilizando esta metodología, Muranishi y Kiso preparan los siguientes compuestos: LysB29-palmitoil-insulina (el grupo e-amino es acilado) , el grupo PheB1-palmitoil-insulina (el grupo -amino N-terminal de la cadena B es acilado), y PheB1, Lys829-dipalmitoil-insulina (tanto el grupo e-amino y a-amino N-terminal son acilados) . De manera similar, Hashimoto y colaboradores, en Pharmaceutical Research <ó \ 171-176 (1989), enseñan una síntesis de cuatro pasos para preparar N-palmitoil-insulina. La síntesis incluye la protección y la desprotección del grupo A^glicina N-terminal y el grupo e-amino de B29-lisina, con pMZ . Bajo las condiciones descritas en la referencia, los dos productos principales acilados son preparados.

B'-mono-palmitoil-insulina y B1, B29-dipalmitoil-insulina . Por lo tanto, antes de la presente invención, la acilación selectiva del grupo B29-N*-amino de la insulina se llevó a cabo mediante la protección y subsecuentemente la desprotección de los grupos a-amino. La presente invención proporciona una síntesis selectiva de un paso para la acilación del grupo e-amino de proinsulina, insulina, o análogos de insulina. Es verdaderamente sorprendente que la invención es capaz de acilar selectivamente el grupo e-amino en un proceso de un paso con alto rendimiento. De este modo, la invención elimina la necesidad de proteger y subsecuentemente de desproteger otros grupos amino de la proteína. La invención proporciona medios eficientes y menos caros para la preparación de derivados de insulina acilados e-amino. La presente invención proporciona un proceso de acilación selectiva de proinsulina, insulina o un análogos de insulina que tiene grupos de e-amino libre y un grupo a-amino libre con un ácido graso, el cual comprende la reacción del grupo e-amino con un proceso de ácido graso activado, soluble, bajo condiciones básicas en un solvente polar.

Todas las abreviaturas de aminoácidos utilizadas en esta descripción son aquéllas aceptadas por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos, como se describe en 37 C.F.R. 3 1.822(B) (2) . Como se notó anteriormente, la presente invención proporciona una acilación de un paso, altamente selectiva, del grupo e-amino de proix?sulJ.na, insulina o un análogo de insulina. La invención especifica las condiciones que acilan prefer-entemente el grupo e-amino sobre los grupos a-amino. Generalmente, el grupo a-amino monoaailado es producido con menos de 5% de rendimiento. El término "insulina" como se usa en la presente, significa insulina humana, insulina porcina, o insulina bovina. La insulina posee tres grupos amino libre: B^fenilalanina, Ax-glicina, y B29-lisina. Los grupos amino libres en las posiciones A1 y B1 son los grupos a-amino. El grupo amino libre en la posición B29 es un grupo e-amino. El término "proinsulina" como se usa en la presente, es una proteína adecuadamente reticulada de la fórmula: B - C - A en donde : A es la cadena A de insulina o un derivado funcional de la misma; B es la cadena B de insulina o un derivado funcional de la misma, que tiene un grupo e-amino; y C es el péptido de conexión de proinsulina. Preferentemente, la proinsulina es la cadena A de la insulina humana, la cadena B de la insulina humana, y C es el péptido natural de conexión. Cuando la proinsulina es la secuencia natural, la proinsulin-a posee tres grupos amino libres: B^fenilalanina (grupo a-amino) , C4-lisina (grupo ß-amino) y B29-lisina (grupo e-amino) . El término "análogo de insulina" como se usa en la presente, es una proteína adecuadamente reticulada de la fórmula: A -B en donde : A es un derivado funcional de la cadena A de la insulina; y B es un derivado funcional de la cadena B de la insulina, que tiene un grupo e-amino.

Los análogos de insulina preferidos incluyen insulina en donde: el residuo de aminoácido en la posición B28 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala; el residuo de aminoácido en la posición B29 es Lys o Pro; el residuo de aminoácido en la posición B10 es His o Asp; el residuo de aminoácido en la posición Bl es Phe, Asp, o solo suprimido o en combinación con una supresión del residuo en la posición B2; el residuo de aminoácido en la posición B30 es Thr, Ala, o suprimido; y el residuo de aminoácido en la posición B9 es Ser o Asp; con la condición de que ya sea en la posición B28 o B29 es Lys.

En los términos bioquímicos estándares, conocidos para el experto ordinario, los análogos de insulina preferidos son LysB28ProB29-insulina humana (B28 es Lys; B29 es Pro) ; AspB28-insulina humana, (B28 es Asp); AspB1-insulina humana, ArgB31, B32-insulina humana, AspB10-insulina humana, ArgA0-insulina humana, AspB1, GluB13-insulina humana, AlaB2b-insulina humana, des (B30) -insulina humana, y Gly?21-insulina humana. El término "acilación" significa la introducción de uno o más grupos acilo unidos covalentemente a los grupos amino libre de la proteína . El término "acilación selectiva" significa la acilación preferencial del grupo o grupos e-amino sobre los grupos a-amino. De manera general, la acilación selectiva da como resultado una proporción de la cantidad de producto del grupo e-amino monoacilado al producto del grupo a-amino monoacilado mayor de aproximadamente 5. Preferentemente, la proporción es mayor que aproximadamente 10, y más preferentemente mayor que aproximadamente 50. El término "ácido graso" significa • un ácido graso saturado o insaturado de 6 a 21 átomos de carbono. El término "éster de ácido graso activado" significa un ácido graso el cual ha sido activado utilizando técnicas generales descritas en Methods of Enzimology, 25, 494-499 (1972) y Lapidot y colaboradores, en J. of Lipid Res, 8_: 142-145 (1967) . Los ácidos grasos preferidos son saturados e incluyen ácido mirístico (de 14 átomos de carbono) , ácido pentadecílico (de 15 átomos de carbono) , ácido palmítico (de 16 átomos de carbono), ácido heptadecílico (de 17 átomos de carbono) , y ácido esteárico (de 18 átomos de carbono) . Más preferentemente, el ácido graso es ácido palmítico. El éster de ácido graso incluye los derivados de agentes tales como hidroxibenzotriazida (HOBT) , N-hidroxisuccinimida y derivados de los mismos. La actividad preferida del éster es palmitato de N-succini idilo . El término "soluble" indica que una cantidad suficiente de éster está presente en la fase líquida para acilar la insulina, el análogo de insulina o proinsulina. Preferentemente, están aproximadamente 1 a 4 equivalentes molares de éter activado por mole de insulina, en la fase líquida. El término "condiciones básicas" como se usa en la presente, se refiere a la alcalinidad de la reacción. La reacción debe llevarse a cabo con todos los grupos amino libre sustancialmente desprotonados . En una mezcla de solvente acuoso o de solvente semiacuoso las condiciones básicas o alcalinas significan que la reacción se lleva a cabo a un pH mayor de 9.0. En un solvente orgánico no acuoso, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base con equivalente de alquilinidad a pKa mayor o igual a 10.75 en agua. El término "reticulación" significa la formación del enlace disulfuro entre los residuos cisteina. Una reticulación adecuada de proinsulina-, insulina o análogo de insulina contiene tres puentes disulfuro. El primer puente disulfuro est formado entre los residuos de cisteina en las posiciones 6 y 11 de la cadena A. El segundo puente disulfuro enlaza los residuos de cisteina en la posición 7 de la cadena A a la cisteina en la posición 7 de la cadena B. El tercer puente disulfuro enlaza la cisteina en la posición 20 de la cadena A a la cisteina en la posición 19 de la cadena B. Antes de la presente invención, un experto en la técnica acila selectivamente el grupo e-amino mediante el uso de un grupo protector en una síntesis de pasos múltiples. Muranishi y Kiso, Solicitud de Patente Japonesa 1-254,699, describen una síntesis de cinco pasos para la preparación de derivados de insulina acilados. Likewise, Hashimoto y colaboradores, en Pharmaceutical Research 6 : 171-176 (1989), enseñan una síntesis de cuatro pasos para la preparación de N-palmitoil-insulina . Para acilar selectivamente la insulina, ambas referencias enseñan el uso del grupo protector pMZ . La presente invención produce con una síntesis de un paso, una proinsulina, insulina o análogo de insulina Ne-acilada con un alto rendimiento. La reacción permite la preparación de proteína-s N8-aciladas sin el uso de grupos protectores amino. La acilación se lleva a cabo mediante la reacción de un éster de ácido graso activado con el grupo e-amino de la proteina bajo condiciones alcalinas en un solvente polar. Bajo condiciones ligeramente alcalinas, se da como resultado todos los grupos amino liixes no desprotonados, y aciJ.acJ.on significativa de los grupos amino N-terminal. En una mezcla de solvente acuoso o de solvente seiaiacuoso, condiciones alcalinas significan que la reacción se lleva a cabo a un pH mayor de 9.0. Debido a que la degradación de la proteína da como resultado a un pH en el intervalo que excede de 12.0 el pH de la mezcla de reacción es preferentemente pH 9.5 a 11.5, y más preferentemente 10.5. La medición del pH de la mezcla de reacción en una mezcla de solvente orgánico y acuoso es el pH de la fase acuosa antes de la mezcla. Los datos en la Tabla 1 demuestran el efecto de la alcalinidad de la reacción sobre la selectividad de la reacción. Los datos presentados en la Tabla 1 fueron generados con insulina humana acilada con dos equivalentes molares de palmitato de N-succinimidilo en CH3CN/agua al 50%.

Tabla 1: Efectos del pH sobre la acilación de insulina La Tabla 1 demuestra que la acilación del grupo e-amino es dependiente de la alcalinidad de la reacción. A un pH mayor que 9.0, la reacción acilada selectivamente del grupo e-amino de B29-lisina. En un solvente no acuoso, la reacción se lleva a cabo en presencia de una base con alcalinidad equivalente a un pKa mayor o igual a 10.75 en agua, con el fin de desprotonar suficientemente el grupo (s) e-amino. Es decir, la base debe de ser al menos tan fuerte como la trietilamina. Preferentemente, la base es tetrametilguanidina (TMG) , diisopropiletilamina, o hidróxido de tetrabutilamonio . La elección del solvente polar es dependiente largamente de la solubilidad de la proinsulina, insulina o análogo de insulina y del éter de ácido graso. Más significativamente, el solvente puede ser orgánico totalmente. Los solventes orgánicos generalmente aceptables, incluyen DMSO, dimetilformamida y similares. El solvente acuoso y las mezclas acuosos y orgánicos son también operables-La selección de solventes polares están limitadas únicamente por la solubilidad de los reactivos. Los solventes preferidos y los sistemas de solventes son DMSO; DMF; acetonitrilo y agua; acetona y agua, etanol y agua, alcohol isopropílico y agua; alcohol isopropílico, etanol y agua; etanol, propanol y agua. Preferentemente, el solvente es acetonitrilo y agua; más preferentemente acetonitrilo al 50%. Alguien de experiencia en la técnica podría reconocer que son también operables otros solventes polares. La proporción de los reactivos no es critica. En general se prefiere que el éster de ácido gra-so activado esté en exceso molar. Preferentemente, la reacción se lleva a cabo con 1 a 4 equivalentes molares, más pre erentemente de 1 a 2 equivalentes molares, del éster. No obstante, alguien de experiencia en la técnica podría reconocer que a niveles muy altos de éster activado, será producido el producto bis- o tris-acilado en una cantidad significativa . La temperatura de la reacción no es critica. La reacción se lleva a cabo a entre 0 a 40 grados Celsius, y se completa en general en 15 minutos a 24 horas. Después de la acilación, la reacción se apaga y el producto se purifica mediante métodos estándares tales como cromatografía de fase inversa o hidrofóbica. Después de esto, el producto se recupera mediante métodos estándares tales como liofilización o cristalización. La proinsulina, la insulina y los análogos de insulina se pueden preparar con cualquiera de una variedad de técnicas de síntesis de péptidos reconocidas, incluyendo los métodos clásicos (solución), métodos en fase sólida, métodos se isintéticos, y los métodos de ADN recombinante más recientes. Por ejemplo, Chance y colaboradores, Solicitud de Patente Norteamericana número 07/388,201, No. de Publicación EPO 383 472, Brange y colaboradores., EPO 214 826 y Balagaje y colaboradores, Patente Norteamericana U.S. 5,304,473 describen la preparación de diversos análogos de insulina y proínsulina, y se incorporan por referencia en la presente. Las cadenas A y B de los análogos de insulina de la presente invención pueden también ser preparados vía una molécula precursora similar a la pro-insulina utilizando técnica de ADN recombinantés . Ver Frank y colaboradores, Peptides: Synt es±s-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept . Symp., Eds . D. Rich and E. Gross (1981) la cual se incorpora por referencia en la presente. Los siguientes ejemplos se proporcionan meramente para ilustrar adicionalmente la invención. Se considera que la clase de invención no es meramente consistente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Acilación de insulina utilizando Palmitato de N- Succinimidilo en DMSO Se disolvieron cristales de Insulina Humana Biosintética (BHI) (71.9 mg) en 6.58 mi de DMSO. La solución se agitó a temperatura ambiente hasta que los cristales se disolvieron completamente mediante inspección visual. Se preparó una solución del éster activada (palmitato de N-succinimidilo) mediante la adición de 20 mg de éster activado sólido, a 2 mi de DMSO y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución mediante inspección visual. A ese tiempo se agrego 1, 1, 3, 3-tetrametilguanidina (26.8 µl) a 5 mi de la solución de BHI, seguido por DMSO (94.4 mi) y la solución de éster activado se prepara previamente (400 µl) . La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente (20 a 25°C) por aproximadamente 60 minutos. Se retiró una mezcla después de 15 minutos, se diluyó a la 20a. parte con ácido acético 1N y se analizó mediante cromatografía líquida de alta presión (HPCL) . El rendimiento de la reacción se calculó como la cantidad de B29-Ne-palmitoil-insulina humana en la muestra apagada dividida por la cantidad inicial de BHI, fue 67.1%.

Ejemplo 2 Acilación de insulina utilizando Palmitato de N- succinimidilo en acetonitrilo y agua Se disolvieron cristales de Insulina Humana Biosintética (BHI) (199.5 g) en 20 1 de ácido bórico 50 mM a pH 2.5 El pH de la solución se reajustó a 2.5 utilizando HC1 al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se disolvieron completamente mediante inspección visual. Una muestra de material inicial fue retirado, y la absorbancia se midió a 276 nm y fue de 10.55. Se preparó una solución de éster activado (Palmitado de N-succinimidilo) mediante la adición de 24 g de éster activado sólido a 2.4 1 de acetonitrilo precalentado aproximadamente 50°C y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución por inspección visual. A este tiempo, el pH de la solución de BHI se ajustó aproximadamente a 10.22 mediante la adición de NaOH al 10%. Se agregó acetonitrilo (18 1) a la solución de BHI con el pH ajustado. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente (20 a 25°C) por 110 minutos, luego se apagó mediante la adición de agua (123 1) y ajustable al pH de la solución diluida resultante a 2.01 utilizando HC1 al 10% y NaOH al 10%. El redimiendo de reacción calculado como la cantidad de B29-N8-palmitoil-insulina humana en la reacción apagada, dividido por la cantidad inicial de BHI fue de 73%.

Ejemplo 3 Acil,ación de LysB28ProB29--insulina humana útil izando Palmi .tato de N-succinimidilo en acetonitrilo y agua Se disolvieron cristales de LysB28ProB29-insulina humana (2.22 g) en 100 mi de solución de ácido bórico 50 mM en pH 2.5. El pH de la solución se reajustó al 2.5 utilizando HC1 al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se disolvieron completamente mediante inspección visual. Una solución del éster activado (Palmitado de N-succinimidilo) se preparó mediante la adición de 270 mg del éster activado sólido a 27 mi de acetonitrilo precalentado a aproximadamente 50°C, y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución mediante inspección visual. El pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10.22 mediante la adición de NaOH al 10%, y la solución se dejó en agitación a 4°C por 15 minutos. Se agregó acetonitrilo (73 mi) a la solución al pH ajustado, seguido por la solución de éster activada preparada previamente. La reacción se dejó proceder a 4°C por 85 minutos, y luego se apagó mediante la adición de ácido acético 1N (600 mi), dando como resultado un pH de 2.85. El rendimiento de reacción calculado como la cantidad de B28-Ne-Palimotoil-LysB28ProB 9-insulina humana en la reacción apagada dividido por la cantidad inicial de LysB28Pro329-insulina humana fue de 72.5%.

Ejemplo 4 Acilación de BHI utilizando palmitato de N- succinimidilo en acetonitrilo y agua Se disolvieron cristales de Insulina Humana Biosintética (BHI) (3 g) en 300 mi de solución de ácido bórico 50 mM a pH 2.5. El pH de la solución se reajustó como fue necesario a 2.5 utilizando HC1 al 10% y la solución se apagó hasta que los cristales se disolvieron completamente mediante inspección visual. Se preparó la solución del éster activado (Palmitato de N-succinimidilo) mediante la adición de 400 mg del éster activado sólido a 40 mi de acetonitrilo y agitación vigorosa. A ese tiempo, el pH de la solución de cristales de BHI se ajustó a aproximadamente 10.2 mediante la adición de NaOH al 10%. Se agregó luego acetonitrilo (240 mi) a la solución de BHI seguido por la solución de éster activada previamente preparada. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente (20 a 25°C) por aproximadamente 90 minutos, luego de se apagó mediante la adición de agua (1800 mi) y se ajustó al pH de la solución diluida resultante a aproximadamente 2.5 utilizando HC1 al 10%. El rendimiento de la reacción, calculado como la cantidad de B29-Ne-palmítoil-insulina humana en la reacción dividida por la cantidad inicial de BHI fue de 75.7%.

Ejemplo 5 Acilación de Proinsulina con palmitado de N- succinimidilo en acetonitrilo y agua Una solución acuosa de Proinsulina Humana (HPI) (28.2 mg/ml) se diluyó con ácido bórico 50 mM hasta un volumen final de 100 mi a 16.2 mg/ml de HPI.

La solución de éster activado se preparó concurrentemente mediante la disolución de 150 mg de palmitato de N-succinimidilo en 15 mi de acetonitrilo (ACN) con agitación rápida. El pH de la solución de HPI se ajustó luego a 10.2 con NaOH al 10% seguido por la adición de 88 mi de ACN. La reacción se inició mediante la reacción de 12 mi de la solución de éster activado (un exceso molar de 2x sobre HPI) . El volumen de reacción final fue de 200 mi, 8 mg/ml de HPI en solución acuosa al 50% de ACN. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente (20 a 25°C) por aproximadamente 60 minutos, luego se apagó mediante la adición de un volumen equivalente (200 mi) de glicina 50 mM, pH 10.0. Las proporciones exactas de las especies acilada en e-amino a la especie aciladas en a-amino fueron luego calculadas, la suma de todas las especies aciladas en e-amino dentro del cromatograma representaron 87-90% del área total, mientras que la suma de todas las sustancias relacionadas (las cuales podrían incluir presumiblemente cualquier especie acilada en a-amino) representaron < 7% del área total, para cualquier punto de tiempo dado.

Ejemplo 6 Acilación de ArgB31, ArgB32-insulina humana con el éster de hexanoil-N-hidroxi-succinimida Se disolvió ArgB31, ArgB32-insulina humana (1.3 mg) en 200 µl de amortiguador (ácido 3- [ciclohexilamino]-l-propansulfónico) 200 mM a pH 10.4.

El éster de hexanoil-N-hidroxi-succinimida (0.3 µMoles) disuelto en N, N-dimetilformamida (DMF) se agregó luego y se agitó en solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (20° a 25°C) por aproximadamente cuatro horas, luego se apagó mediante el ajuste del pH aproximadamente a 2.5 utilizando HC1 0.1 N. Se retiraron las partículas gelatinosas mediante el paso de la mezcla a través de un filtro de 0.45 mieras antes del análisis de HPLC. La separación del producto del título del material inicial se logró en una columna de HPLC analítica, de fase inversa C4. El rendimiento de reacción calculado como la " cantada de B29-Ne-hexanoil-ArgB31, ArB32-insulina humana en la reacción apagada, dividido por la cantidad inicial de ArgB31, ArgB32-insulina humana fue de 69.4%.

Ej emplo 7 Acilación de LeuB2S insulina humana con palmitato de N- succinimidilo en DMSO Se disolvió la LeuB26-insulina humana (1.0 mg) en 1 mi de sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 95%, trietilamina 5% (TEA) . El palmitato de N-succinimidilo (0.7 µmoles) disuelto en N,N-dimetilformamida (DMF) fue luego agregado y se agitó en solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (20° a 25°C) por aproximadamente noventa minutos, luego se apagó mediante la dilución de la muestra a 0.2 mg/ml con HCl a 0.1 N. Las partículas gelatinosas se retiraron mediante el paso de la mezcla a través de un filtro de 0.45 mieras antes del análisis de HPLC. La separación del producto del título de material inicial se logró en una columna de HPCL analítica de fase inversa de C4. El rendimiento de la reacción calculado como la cantada de Ne-palmitoil-LeuB26-insulina humana en la reacción apagada, dividido por la cantidad inicial de LeuB2o-insulina humana fue 36.4%.

Ejemplo 8 Acilación de insulina humana utilizando palmitato de N-succinidilo en dimetiisulfóxido (DMSO) Se preparó una solución de insulina mediante la disolución de Cristales de Insulina Humana Biosintética (1 g, 0.17 mmol) completamente en 20 mi de DMSO a temperatura ambiente. Al mismo tiempo, se preparó una solución del éster activado mediante la disolución de palmitato de N-succinimidilo (0.0817 g, 0.23 mmol) en 3 mi de DMSO a 50°C. A la solución de insulina a la cual se agitó vigorosamente, se agregó primeramente 1 , 1, 3, 3-tetrametilguanidina (0.432 mi, 3.4 mmol) y luego la solución del éster activo.

Después de 30 minutos, la reacción se apagó con 120 mi de HC1 0.05 M previamente enfriado a 0°C . El pH de la mezcla fue de aproximadamente 1.8. El análisis de la mezcla apagada mediante HPLC de fase inversa mostró que la B29-Ne-palmitoil-insulina representó el 72.2% de la proteína total eluida, y representó el 95% de toda la insulina mono-acilada .

La mezcla de reacción completa se cargó sobre una columna de fase inversa preparativa Vydac c4 (5x25 cm) respectivamente equilibrada con una mezcla de solvente 0.1% de ácido trifluoroacético, 20% de acetonitrilo en agua. Después de la carga, la columna se cargó primeramente en 500 mi del mismo solvente, y luego se desarrolló a una velocidad de flujo de 4 ml/minutos y con un sistema de solvente que consistía de 0.1% de ácido trifluoroacético, acetonitrilo y agua, en donde la concentración de acetonitrilo se incrementó desde 20 a 80% en 9 1. La B29-Ne-palmitoil-insluna eluida en este sistema de solvente compuesto de aproximadamente 53% de acetonitrilo. Después de la eliminación del solvente mediante liofilización el rendimiento de la Ne-palmitoil-insulina fue de 414 mg (0.0684 mmol) o 40.2% con base en el material inicial.

Ejemplo 9 Acilación de LysB23ProB29-insulina humana con éster de 1-octanoil-N-hidroxisuccinimida Se disolvieron cristales de Lys (B28) , Pro (B29) -insulina humana (KPB) (2.0 g) con 200 mi de amortiguador de ácido bórico 50 mM a pH 2.5. El pH de la solución se reajustó a 2.5 utilizando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales estuvieron completamente disueltos, mediante inspección visual. Una solución del éster activado (éster de 1-octanoil-N-hidroxisuccinimida) se preparó mediante la adición de 175 mg del éster activado sólido a 25.62 mi de acetonitrilo y agitación vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución mediante inspección visual. el pH de la solución de KPB se ajustó a aproximadamente 10.4 mediante la adición de NaOH al 10%, y la solución se dejó en agitación a temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos. Se agregó acetonitrilo (175 mi) a la solución de KPB con pH ajustado, seguido por la adición de éster activado previamente preparada. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente por 90 minutos, y se apagó mediante la adición de 5.5 mi de HCl al 10% (2.75% v/v) y tres volúmenes (1,200 mi) de dH20 fría, dando como resultado un pH final de 2.70. El rendimiento de la reacción, calculado como la cantidad de LysB29 (C8) KPB en la reacción apagada dividido por la cantidad inicial de BHI fue de 75.5%. Esta solución se dividió en dos alícuotas de 800 mi para la purificación mediante cromatografía hidrofóbica (SP20SS) . La cromatografía en columna fue seguida por ultrafiltración y liofilización.

Los datos en la tabla 2 demuestran la acilación selectiva de la insulina, los análogos de insulina y la proinsulina. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente con esteres de N-hidroxi-succinimida del ácido graso. En la tabla siguiente, TMG y TEA representan tetrametilguanidina y trietilamina respectivamente. ND indica que no estuvieron disponibles datos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la acilación selectiva de proinsulina, insulina, o un análogo de insulina, que tiene un grupo e-amino libre y un grupo a-amino libre con un ácido graso, caracterizado el proceso porque comprende el hacer reaccionar el grupo e-amino con un éster de ácido graso activado, soluble, bajo condiciones alcalinas en un solvente polar.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína es insulina humana, un análogo de insulina, o LysB 8ProB29-insulina humana.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidroxisuccinimida de ácido graso de 6 a 18 átomos de carbono.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidrosuccinimida de un ácido graso de 14 a 18 átomos de carbono.

5. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el éster de ácido graso activado es un éster de N-hidroxisuccinimída del ácido palmítico.

6. Un proceso para acilar selectivamente la proinsulina, la insulina o un análogo de insulina, que tiene un grupo e-amino libre y un grupo a-amino libre con un ácido graso, caracterizado el proceso porque comprende el hacer reaccionar el grupo e-amino con éster de ácido graso activado, soluble, en un solvente semiacuoso a un pH de aproximadamente 9.0 a 12.0.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína es insulina humana, un análogo de insulina, o LysB28ProB29-insulina humana.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el pH es de aproximadamente 9.5 a aproximadamente 10.5.

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el solvente semiacuoso es acetonitrilo y agua.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el solvente es acetonitrilo al 50%.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el éster de ácido graso es palmitato de N-succinimidilo, octanoato de N-succinimidilo, o miristato de N-succinimidilo.