MXPA97003508A - Analogos de insulina acilados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo de la diabetes. Más particularmente, la invención se refiere a un análogo de insulina monomérico en donde la cadena A es la secuencia que ocurre naturalmente de la cadena A de insulina de humano y la cadena B se modifica ya sea en la posición B28 y B29 o ambas. El análogo es monoacilado en la N-terminación de la cadena A o la cadena B o en la lisina. Los análogos de insulina acilados tienen una duración extendida de acción.

Description

ANÁLOGOS DE INSULINA ACILADOS La presente invención se refiere al campo de la diabetes. En forma más particular, la invención se refiere a análogos de insulina acilados con una duración de acción extendida. La disponibilidad de la terapia de reemplazo de insulina ha prevenido la mortalidad y morbosidad de complicaciones agudas en la diabetes mellitus. Sin embargo, las complicaciones diabéticas crónicas siguen siendo un problema de salud principal debido al desarreglo metabólico persistente, surgiendo principalmente del pobre control de glucosa en la sangre. Los resultados que surgen del Ensayo de Control y Complicaciones de la Diabetes (DCCT) indican que una disminución de 1% en Hb Ale está en correlación con más de 35% de mejoramiento en la incidencia de la retinopatía. A fin de lograr una glicemia normal, la terapia se debe designar para igualar tan estrechamente como sea posible, el patrón de la secreción de insulina endógena en individuos normales. La demanda fisiológica diaria para la insulina varía y se puede separar en dos fases: (a) la fase absorbente requiere una impulsión o ritmo de Ref. 24629 insulina para disponer de la oleada de glucosa sanguínea relacionada con la comida, y (b) la fase pos absorbente requiere una cantidad sostenida de insulina para regular la salida de glucosa hepática para mantener la glucosa en la sangre rápidamente óptima . Por consiguiente, la terapia efectiva involucra el uso combinado de dos tipos de insulina exógena: una insulina de la hora de la comida que actúa rápidamente y una insulina básica que actúa durante mucho tiempo. Para lograr un tiempo de acción básico que actúa durante mucho tiempo, la insulina se formula actualmente bajo condiciones que favorecen la formación de una conformación de hexámero en un estado insoluble, cristalino. Estas formulaciones que actúan durante mucho tiempo son Ultralente, Lente, y semi-Lente. Sin embargo, la insolubilidad de las preparaciones que actúan durante mucho tiempo, actuales se ha mostrado que causa problemas con relación a la inconsistencia en la respuesta a la dosis así como también la impredictabilidad en el tiempo de acción. Además, una de las preparaciones de insulina que actúan durante mucho tiempo, actualmente disponibles, carne de res ultralente, es in unogénica. La presencia de anticuerpos que resultan de la inmunogenisidad de la carne de res Ultralente altera la farmacocinética de las insulinas que actúan rápidamente. Mientras que el tiempo de acción de la formulación Ultralente insoluble hace una insulina básica una vez al día, convenientemente, muchos médicos actualmente prefieren utilizar una insulina de tiempo de acción intermedio, una formulación de insulina-protamina comúnmente referida como insulin-NPH. La insulin-NPH se utiliza dos veces diariamente como un insulina básica debido a que es comparativamente más fácil de ajustar la dosis óptima con un fármaco de tiempo de acción más corto. Como un resultado, las insulinas que actúan en tiempo intermedio dan cuentan de 70% de los EU, 64% de los Japoneses, 45% de Europeos y un total de 55% del mercado de insulina de ámbito mundial. Sin embargo tanto la insulin-NPH insoluble y la insulina Ultralente insoluble son formulaciones de suspensión. De esta manera, las formulaciones son inherentemente menos predecibles que las formulaciones solubles y dan por resultado menos que el control adecuado de glucosa sanguínea y una mayor susceptibilidad a los episodios hipoglicémicos que amenazan la vida. Por consiguiente, permanece una necesidad por una insulina básica que actúa durante mucho tiempo, soluble a fin de lograr una terapia de reemplazo de insulina, intensiva, exitosa. La presente invención proporciona análogos de insulina acilados que se puede formular para proporcionar terapia de insulina básica, soluble. La acilación de la insulina de puerco, de res o de humano se describe por Muranishi y Kiso, en la solicitud de patente japonesa No. 1-254,699. Los siguientes compuestos se describen de manera especifica: insulina de B29-Ne-palmitol (el grupo e-amino se acila) , insulina de Bl-N-palmitol (el grupo a-amino N terminal de la cadena B se acila) , e insulina de Bl, B29-N", Ne-dipalmitoilo (tanto el grupo e-amino y el grupo a-amino N-terminal son acilados) . Muranishi y Kiso describen que la insulina acilada posee un perfil biológico similar a la insulina; pero falla para proporcionar las dosis, rutas de administración, u otras condiciones del modelo in vivo para permitir a un experto en la técnica evaluar la actividad o duración de la acción de la insulina acilada. De manera similar, Hashimoto y colaboradores, en Pharmaceutical Research 6: 171-176 (1989), describen la insulina de Bl-Na-palmitoilo (el grupo a-amino N terminal se acila) , e insulina de Bl, B29,Na, Ne-dipalmitoilo (tanto los grupos e-amino y los grupos a-amino N-terminales se acilan) . Hashimoto y colaboradores estudiaron el efecto hipoglicémico de la insulina de Bl-Na-palmitoilo y la insulina de Bl, B29, Na,Ne-dipamitoilo en ratas macho a 25 U/mL, una dosis extremadamente alta. En estas dosis, la Figura 5 demuestra muy baja actividad cuando se administra de manera intravenosa. Cuando se administra de manera intramuscular, únicamente un efecto hipoglicémico corto de insulina de Bl-N-palmitoilo y un efecto insignificante de insulina de Bl, B29-N", Ne-dipalmitoilo se describieron en la Figura 6. Además de los reportes in vivo por Muranishi y Kiso y Hashimoto y colaboradores, Walder y colaboradores, en la solicitud PCT WO 92/01476, describen que la vida media de las proteínas y péptidos se puede extender in vivo mediante al enlazar químicamente la proteina con un grupo apolar, específicamente un derivado de ácido graso. El ácido graso proporciona un grupo de puente entre la proteina y albúmina. Walder y colaboradores contin an para describir que el grupo apolar es restringido de manera preferente a un único sitio o sitios en la proteina y ejemplifican el enlace de los residuos de cisteina de hemoglobina. La referencia en general describe derivados de ácido graso de insulina. Sin embargo, los derivados sin ácido graso de insulina no se describen o ejemplifican de manera especifica, y no se describen datos para indicar que se retiene la actividad biológica de los derivados de ácido graso de insulina. Se ha descubierto que la acilación selectiva de un grupo libre de amino de un anólogo de insulina monomérico proporciona actividad de insulina básica, efectiva. Los análogos de insulina sin acilar descritos en la presente se designan para proporcionar un comienzo o ataque rápido de acción y una evacuación rápida. Estos análogos son conocidos en la técnica como análogos de insulina monoméricos. La capacidad para modificar tales análogos para proporcionar actividad básica no es menos esperado. La presente invención proporciona un análogo de insulina monoacilado, que produce en el uso una duración de acción extendida. Los análogos se pueden preparar en formulaciones solubles ofreciendo de esta manera ventajas sobre la terapia de insulina básica, actual. Los presentes análogos también poseen una posibilidad de predicción excelente en la respuesta a la dosis, excelente posibilidad de predicción en el tiempo de acción, carece de un pico distinto en el perfil del tiempo de acción, y son idealmente adecuados para la preparación de formulaciones de mezcla que comprenden un análogo de insulina y un análogo de insulina acilado.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un análogo de insulina monoacilado de la Fórmula: IDEN. DE LA SEC. NO : 1 Xaa ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 adecuadamente unido al través a la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde: Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

N0:1 (cadena A de insulina) es Gly; o Gly acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO: 2 es Phe, Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. N0:2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys o Pro; Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO: 2 (cadena B de insulina) es Phe; o Phe acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO:l es Gly, Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Lys o Pro; Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val, Ala; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:l es Gly, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Phe y Xaa en la posición 29 de la IDEN.

DE LA SEC. NO: 2 es Pro; y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Lys, Pro; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 1 es Gly, y Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Phe. La invención además proporciona un método para tratar la hiperglicemia al administrar a un paciente en necesidad del mismo, una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de un análogo de insulina acilado de la invención en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. También descritas y reclamadas están las formulaciones farmacéuticas, parenterales, que comprenden un análogo de insulina acilado de la presente invención conjuntamente con uno o más conservadores, agentes de isotinicidad o amortiguadores farmacéuticamente aceptables. Todas las abreviaciones de aminoácidos utilizadas en esta descripción son aquellas aceptadas por la Oficina de patentes y Marcas comerciales Norteamericana como se expone en 37 C.F.R. S 1.822 (B) (2) . El término "unido al través" significa la formación de enlaces de disulfuro entre residuos de cisteina. Una insulina de humano o análogo de insulina adecuadamente unida al través contiene tres puentes de disulfuro. El primer puente de disulfuro se forma entre los residuos de cisteina en las posiciones 6 y 11 de la cadena A. El segundo puente de disulfuro une los residuos de cisteina en la posición 7 de la cadena A a la cisteina en la posición 7 de la cadena B. El tercer puente de disulfuro une la cisteina en la posición 20 de la cadena A a la cisteina en la posición 19 de la cadena B. Los términos "Gly acilado", "Phe acilado" y "Lys acilado" se refiere a Gly, Phe o Lys acilados con un ácido graso de 6 a 21 átomos de carbono. El término "grupo de acilación" se refiere al ácido graso químicamente enlazado al grupo a-amino o grupo e-amino del análogo de insulina. Los grupos amino libres en las posiciones Al y Bl son grupos a-amino. El grupo amino libre de Lys en la posición B28 o B29 es un grupo e-amino. El término "acilación" significa la introducción de grupos acilo covalentemente enlazados a un grupo amino libre de la proteina. El término "acilación selectiva" significa la acilación preferencial del (los) grupo (s) e-amino sobre los grupos a-amino.

El término "ácido graso" significa un ácido graso de 6 a 21 átomos de carbono, saturado o insaturado. Los ácidos grasos preferidos están saturados e incluyen ácido miristico (14 átomos de carbono), ácido pentadecilico (15 átomos de carbono), ácido palmitico (16 átomos de carbono), ácido heptadecilico (17 átomos de carbono) y ácido esteárico (18 átomos de carbono) . En forma más preferente, el ácido graso es ácido palmitico. Los compuestos de la presente invención representan análogos de insulina monoacilados . Los análogos de se acilan en un grupo a-amino o grupo e-amino con un ácido graso de 6 a 21 átomos de carbono. De manera preferente los análogos son monoacilados en el grupo e-amino de Usina. El término "éster de ácido graso activado" significa un ácido graso que se ha activado utilizando técnicas generales descritas en Methods of Enzymology, 25, 494-499 (1972) y Lapidot y colaboradores en J. of Lipid Res. 8_: 142-145 (1967) . El éster de ácido graso activado incluye derivados de agentes de acilación, comúnmente empleados tales como hidroxibenzotriazida (HOBT) , N-hidroxisuccinimida y derivados de los mismos. El éster activado preferido es palmitato de N-succinimidilo. El término "soluble" indica que una cantidad suficiente de éster está presente en la fase liquida para acilar el análogo de insulina. De manera preferente, 1 a 2 equivalentes molares de éster activado por mol de análogo están en la fase liquida . El término "análogo de insulina monomérico" o "análogo de insulina" como se utiliza en la presente, es un análogo de insulina que actúa rápidamente que se inclina menos a la dimerización o autoasociación. El análogo de insulina monomérico es la insulina de humano en donde Pro en la posición B28 está sustituido con Asp, Lys, Leu, Val o Ala, y Lys en la posición B29 es Lisina o Prolina. Los análogos de insulina monoméricos se describen en Chance y colaboradores, solicitud de patente norteamericana número 07/388,201 (número de solicitud EPO 383 472), y Brange y colaboradores, solicitud EPO 214 826. Un experto en la técnica reconocerla que son posibles otras modificaciones al análogo de insulina monomérica y son ampliamente aceptados en la técnica. Estas modificaciones incluyen el reemplazo del residuo de Histidina en la posición B10 con ácido aspártico; el reemplazo del residuo de fenilalanina en la posición Bl con ácido aspártico; el reemplazo del residuo de treonina en la posición B30 con Alanina; el reemplazo del residuo de serina en la posición B9 con ácido Aspártico; la supresión de aminoácidos en la posición Bl solo o en combinación con una supresión en la posición B2; y la supresión de Treonina de la posición B30. El término "condiciones básicas" como se utiliza en la presente se refiere a la basicidad de la reacción. Para acilar selectivamente un análogo de insulina en el grupo e-amino, la reacción se debe llevar a cabo con sustancialmente todos los grupos amino libres, desprotonados . En un solvente o co-solvente acuoso, las condiciones básicas significan que la reacción se lleva a cabo en un pH mayor que 9.0. En un solvente orgánico, la reacción se lleva a cabo en la presencia de una base con equivalente de basicidad a un pKa mayor que o igual a 10.75 en agua. La IDEN. DE LA SEC. NO : 1 se refiere a la primera secuencia expuesta en el listado de secuencias y significa un análogo de la insulina de humano cadena A con la secuencia: Xaa lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 en donde Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO:l (cadena A de insulina) es Gly; o Gly acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO: 2 es Phe, Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val o Ala, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys o Pro. La IDEN. DE LA SEC. NO : 2 se refiere a la segunda secuencia expuesta en el listado de secuencias y significa un análogo de la cadena B de insulina de humano con la secuencia: Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 en donde : Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC.

NO: 2 (cadena B de insulina) es Phe; o Phe acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:l es Gly, Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. N0:2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys o Pro; Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. N0:2 es Asp, Lys, Leu, Val, Ala; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. N0:1 (cadena A de insulina) es Gly, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 (cadena B de insulina) es Phe, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Pro; y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys, Pro; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:l (cadena A de insulina) es Gly, y Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 (cadena B de insulina) es Phe. Como se observó anteriormente, la presente invención proporciona un análogo de insulina monoacilado de la fórmula: IDEN. DE LA SEC. NO:l apropiadamente unido al través de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El residuo de aminoácido preferido en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 1 (cadena A de insulina) es Gly. La fenilalanina es el aminoácido preferido en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. N0:2 (cadena B de insulina) . El residuo de aminoácido preferido en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Asp; o Lys acilado cuando el residuo de aminoácido en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. N0:2 es Pro. El residuo de aminoácido preferido en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys; o Pro cuando el residuo de aminoácido en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO: 2 es Lys acilado. En términos bioquímicos normales conocidos para el artífice experto, el análogo preferido es insulina de humano LysB28ProB29 monoacilada. Los análogos de insulina acilados, más preferidos son monoacilados con un ácido graso de 8 a 18 átomos de carbono, en forma preferente un ácido graso de 14 a 16 átomos de carbono. Los ácidos grasos preferidos por lo tanto incluyen octanoilo (8 átomos de carbono), nonanoilo (9 átomos de carbono), decanoilo (10 átomos de carbono), undecanoilo (11 átomos de carbono), lauroilo (12 átomos de carbono), tridecanoilo (13 átomos de carbono), miristoilo (14 átomos de carbono), pentadecanoilo (15 átomos de carbono), palmitoilo (16 átomos de carbono). De esta manera, los compuestos preferidos de la presente invención incluyen insulina de humano de B29-Ne-AspB28-palmitoilo (B28 es Asp; B29 es Lys acilado) , insulina de humano B28-Ne-palmitoil-LisB28ProB29 (B28 es Lis acilado; B29 es Pro) , insulina de humano de B28-Ne-octanoil-LisB28ProB29, insulina de humano B28-NE-decanoil-LysB28ProB29, insulina de humano B28-N8-miristoil-Liss28ProB29, e insulina de humano B28-N8-undecanoil-LysB28ProB29. La acilación de los grupos amino libres de proteínas, que incluyen insulina, es conocida en la técnica. Los métodos generales de la acilación se exponen en Methods of Enzymology, 25: 494-499 (1972) e incluyen el uso de esteres activados, haluros de ácido o anhídridos de ácido. El uso de esteres activados, en particular esteres de N-hidroxisuccinimida, o ácidos grasos es un medio particularmente ventajoso de acilación de un aminoácido libre con un ácido graso. Lapidot y colaboradores, J. of Lipid Res. 8_: 142-145 (1967) . Lapidot y colaboradores describe la preparación de esteres de N-hidroxisuccinimida y su uso en la preparación de N-lauroil-glicina, N-lauroil-L-serina, y ácido N-lauroil-L-glutámico. Para acilar selectivamente el grupo e-amino, se pueden utilizar diversos grupos protectores para bloquear el grupo a-amino durante el acoplamiento. La selección de un grupo protector adecuado es conocido para un experto en la técnica e incluye p-metoxibenzoxicarbonil ( pZ) . En forma preferente, el grupo e-amino se asila en una síntesis de un paso sin el uso de grupos amonoprotectores . La acilación se lleva a cabo al hacer reaccionar el éster de ácido graso activado con el grupo e-amino de la proteina bajo condiciones básicas en un solvente polar. La basicidad de la reacción debe ser suficiente para desprotonar todos los grupos amino libres del análogo de insulina. Bajo condiciones débilmente básicas, todos los grupos amino libres no están desprotonados y resulta la acilación preferencial de los grupos a-amino o N-terminales . En un solvente o co-solvente acuoso, las condiciones básicas significa que la reacción se lleva a cabo a un pH mayor que 9.0. Debido a que la degradación de la proteina da por resultado un intervalo de pH que excede 12.0, el pH de la mezcla de reacción es en forma preferente 10.0 a 11.5, y en forma más preferente 10.5. La medida del pH de la reacción de la mezcla de reacción en un solvente orgánico y acuoso mezclado es el pH del solvente acuoso antes del mezclado.

En un solvente no acuoso, la acilación selectiva del grupo e-amino se lleva a cabo en la presencia de una base con equivalente de basicidad a un pKa mayor que o igual a 10.75 en agua a fin de desprotonar suficientemente el (los) grupo (s) e-amino. Esto es, la base debe ser al menos tan fuerte como la trietilamina . En forma preferente, la base es tetrametilguanidina, diisopropiletilamina, o hidróxido de tetrabutilamonio . El uso de una base más débil da por resultado la acilación de los grupos a-amino. La selección del solvente no es critica y dependiente mayormente de la solubilidad del análogo de insulina y el éster de ácido graso. El solvente puede ser completamente orgánico. En general los solventes orgánicos aceptables incluyen DMSO, DMF y similares. El solvente acuoso y las mezclas de solventes acuosos y orgánicos también son operables. La selección de los solventes polares se limita únicamente por la solubilidad de los reactivos. Los solventes preferidos son DMSO; DMF; acetonitrilo y agua; acetona y agua; etanol y agua; alcohol isopropilico y agua; alcohol isopropilico, etanol y agua; y etanol, propanol y agua. En forma preferente, el solvente es acetonitrilo y agua; en forma más preferente acetonitrilo al 50%. Un experto en la técnica reconocerla que otros solventes polares también son operables. En general, se prefiere que el éster de ácido graso, activado esté en exceso polar. En forma más preferente, la reacción se lleva a cabo con 1 a 4 equivalentes molares, en forma más preferente 1 a 2 equivalentes molares, del éster. Un experto en la técnica reconocerla que en muy altos niveles de éster activado, el producto bis- o tri-acilado será producido en cantidad significante. La temperatura de la reacción no es critica. La reacción se lleva a cabo entre 20 a 40 grados Celcius y en general se completa en 15 minutos a 24 horas. Después de la acilación, el producto se purifica mediante métodos normales tales como cromatografía de fase inversa o hidrofóbica. Después, el producto se recupera mediante métodos normales tales como secado por congelación o cristalización. Los análogos de insulina monoméricos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de técnicas de síntesis de péptido, reconocidas que incluyen métodos clásicos (solución) , métodos de fase sólida, métodos semisintéticos, y métodos de ADN recombinante, más recientes. Por ejemplo, Chance y colaboradores, solicitud de patente norteamericana número 07/388,201, número de publicación EPO 383 472, y Brange y colaboradores, EPO 214 826, describen la preparación de diversos análogos de insulina y se incorporan en la presente por referencia. Las cadenas A y B de los análogos de insulina de la presente invención también se pueden preparar por medio de una molécula del precursor similar a la proinsulina que utiliza técnicas de ADN recombinante. Ver Frank y colaboradores, Peptides : Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds . D. Rich y E. Gross (1981) que se incorpora en la presente por referencia. El siguiente ejemplo se proporciona solamente para ilustrar adicionalmente la invención. El alcance de la invención no se construye como que simplemente consiste del siguiente ejemplo.

Ej emplo 1 Acilación de Insulina de Humano Lis B28 pPro B29 Utilizando Palmitato de N-Succinimidilo en Acetonitrilo y Agua Los cristales de insulina de humano LisB28ProB29 (2.22 g) se disolvieron en 100 L de solución de ácido bórico 50 mM a pH 2.5. El pH de la solución se volvió a ajustar a 2.5 utilizando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales fueron completamente disueltos por la inspección visual. Una solución de éster activado (Palmitato de N-Succinimidilo) se preparó al adicionar 270 mg del éster activado sólido a 27 mL de acetonitrilo precalentado a aproximadamente 50°C, y agitar dé manera vigorosa hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución por inspección visual. El pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10.22 mediante la adición de NaOH al 10%, y la solución se dejó agitar a 4°C durante 15 minutos. Se adicionó acetonitrilo (73 mL) a la solución ajustada de pH, seguido por la solución de éster activado, previamente preparada. La reacción se dejó proceder a 4°C durante 85 minutos, y se enfrió rápidamente al adicionar ácido acético 1 N (600 mL) , dando por resultado un pH de 2.35. El rendimiento de la reacción calculado como la cantidad de insulina de humano de B28-N8-Palmitoilo LisB2?ProB29 en la reacción enfriada rápidamente dividida por la cantidad inicial de insulina de humano de LysB28ProB29 fué 72.5%.

Ejemplo 2 Insulina de humano C (B28) LysB29ProB29 Se disolvieron cristales de insulina de humano Lys(B28), Pro(B29) (KPB) (2.0 g) en 200 mL de amortiguador de ácido bórico 50 mM a pH 2.5. El pH de la solución se volvió a ajustar a 2.5 utilizando HCl al 10%, y la solución se agitó hasta que los cristales se disolvieron completamente mediante la inspección visual. Una solución de éster activado (éster de 1-octanoil-N-hidroxisuccinimida) se preparó al adicionar 175 mg del éster activado sólido a 25.62 L de acetonitrilo, y se agitó vigorosamente hasta que todas las partículas de éster activado estuvieron en solución mediante la inspección visual. El pH de la solución de KPB se ajustó a aproximadamente 10.4 mediante la adición de NaOH al 10% y la solución se dejó agitar a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Se adicionó acetonitrilo (176 mL) a la solución de KPB del pH ajustado, seguido por la adición de la solución de éster activado previamente preparada. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 90 minutos, y se enfrió rápidamente al adicionar 5.5 mL de HCl al 10% (2.75% v/v) y tres volúmenes (1200 mL) de dH20 frió, dando por resultado a un pH final de 2.70. El rendimiento de la reacción, calculado como la cantidad de LysB29 (C8) KPB en la reacción enfriada rápidamente dividida por la cantidad inicial de BHI, fué 75.5%. Esta solución se dividió en dos alícuotas de 800 L para la purificación mediante la cromatografía hidrofóbica (SP20SS) . La cromatografía en columna se siguió mediante la ultrafiltración y la liofilización. Como se observó previamente, los análogos de insulina acilados de la presente invención son efectivos en el tratamiento de la hiperglicemia al administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de un análogo de insulina monoacilado. Como se utilizó en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a aquella cantidad de uno o más análogos acilados de la presente invención necesaria para disminuir o mantener los niveles de azúcar en la sangre ya sea terapéuticamente o profilácticamente. Esta cantidad típicamente puede variar de aproximadamente 10 unidades o más por dia (o aproximadamente 0.3 a aproximadamente 2 mg suponiendo aproximadamente 29 unidades por mg) . Sin embargo, se debe entender que la cantidad del (los) análogo (s) aciládo(s) realmente administrados será determinada por el médico en vista de las circunstancias pertinentes que incluyen la condición a ser tratada (es decir la causa de la hiperglicemia) el análogo particular a ser administrado, la ruta parenteral de administración seleccionada, la edad, el peso y respuesta del paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente. Por lo tanto, los intervalos de dosis anteriores no se proponen para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los análogos de insulina acilados de la invención se administran a un paciente en necesidad de los mismos (es decir, un paciente que sufre de hiperglicemia) por medio de composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva de al menos un análogo de insulina monoacilado en combinación con uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Para estos propósitos, las composiciones farmacéuticas se pueden formular típicamente para contener aproximadamente 100 unidades por mL o concentraciones similares que contienen una cantidad efectiva del (los) análogo (s) acilado (s). Estas composiciones son típicamente, aunque no necesariamente, parenterales en su naturaleza y se pueden preparar por cualquiera de una variedad de técnicas utilizando excipientes o portadores convencionales para productos parenterales que son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) la cual se incorpora en la presente por referencia. Por ejemplo, las formas de dosis para la administración parenteral se pueden preparar al suspender o disolver la cantidad deseada de al menos un análogo de insulina monoacilado en un vehículo liquido no tóxico, adecuado para la inyección tal como un medio acuoso y al esterilizar la suspensión o solución. De manera alternativa, una cantidad medida del compuesto se puede colocar en un frasquito; y el frasquito y sus contenidos se esterilizan y se sellan. Un frasquito o vehículo acompañante se puede proporcionar para propósitos de mezclado antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral emplean diluyentes, excipientes y portadores tales como agua y solventes orgánicos miscibles en agua tales como glicerina, aceite de ajonjolí, aceite de cacahuate, propilenglicol acuoso, N, -N-dimetilformamida y similares. Ejemplos de tales composiciones farmacéuticas incluyen soluciones salinas, acuosas, isotonicas, estériles del análogo de insulina monoacilado que se puede amortiguar con un amortiguador farmacéuticamente aceptable y que son libres de pirógeno. Adicionalmente, la formulación farmacéutica parenteral puede contener conservadores tales como meta-cresol u otros agentes para ajustar el pH del producto final tal como hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Los análogos de insulina acilados de la presente invención, también se pueden formular como mezclas. Las formulaciones de la mezcla comprenden insulina no acilada o análogo de insulina, y un análogo de insulina acilado. La relación de la insulina o análogo de insulina para el análogo acilado es de 1:99 a 99:1 en una base en peso. En forma preferente, la relación es de 75:25 a 25:75; en forma más preferente de 40:60 a 60:40; y aun en forma más preferente, 50:50. Las formulaciones de la mezcla se prepararon al mezclar los volúmenes deseados de los componentes en un diluyente de formulación parenteral, normal. Los diluyentes normales incluyen un agente de isotonicidad, zinc, un amortiguador fisiológicamente tolerado y un conservador. El amortiguador fisiológicamente tolerado es en forma preferente un amortiguador de fosfato, similar al fosfato de sodio dibásico. Otros amortiguadores fisiológicamente tolerados incluyen TRIS o acetato de sodio. La selección y concentración del amortiguador es conocida en la técnica. Los conservadores farmacéuticamente aceptables incluyen fenol, m-cresol, resorcinol y metil parabeno. Las formulaciones de la mezcla de la presente invención son particularmente ventajosas debido a que tanto el análogo de insulina o insulina que actúa relativamente rápido y el análogo de insulina monoacilado son solubles en la formulación. Proporcionando de esta manera una duración que se puede predecir del perfil de acción. El siguiente ejemplo de formulación es ilustrativo únicamente y no se propone para limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

Formulación 1 Una formulación parenteral se puede preparar como sigue: Cantidad Fenol 30 mM Glicerina 16 mg/mL Insulina de humano LysB28ProB29 Acilada 100 U Zinc 0.7 % Acetato de sodio 3.8 mg/mL La solución de los ingredientes anteriores se administra por inyección a un sujeto en necesidad del tratamiento. Para demostrar la eficacia de los compuestos de la presente invención, la insulina de humano LysB28ProB29 de B28-N8-Palmitoilo se probó en un modelo de perro consciente. Los experimentos se condujeron en perros pachones o sabuesos macho y hembra, adultos (1-2 años de edad), conscientes, en ayuno durante la noche, que pesan 8-15 kg. Al menos diez dias antes del estudio, los animales se anestesiaron con isoflurano, y se hizo una venostomia en la región inguinal izquierda o derecha. Los catéteres de Silastic se insertaron en la arteria femoral y en la vena femoral caudal, próxima y se aseguraron con 4-0 sutura de seda. Los extremos libres de los catéteres se pasaron subcutáneamente a la parte de atrás utilizando una aguja trocar. Los catéteres luego se rellenaron con una solución de glicerol/heparina (3:1, v/v; concentración de heparina final de 250 KlU/ml) , y los extremos libres se anudaron y se colocaron en una bolsa subcutánea para dejar completar el cierre de la piel. Se administró Keflex tanto pre-operativamente (20 mg/kg, IV y 20 mg/kg, I.M.) y pos-operativamente (250 mg, p.o. una vez al dia durante siete dias) para prevenir infecciones. Se administró Torbugesic (1.5 mg/,g, I.M.) pos-operativamente para controlar el dolor. Se extrajo sangre justo antes del dia de estudio para determinar la salud del animal. Únicamente se utilizaron animales con hematocritos arriba de 38% y la cuenta de leucocitos abajo de 16,000/mm3. La tarde después del experimento, los extremos libres de los catéteres se exteriorizaron de la bolsa subcutánea a través de una incisión pequeña hecha bajo anestesia local (lidocaina al 2%), y el perro se acomodó o sujetó con un montaje de chaqueta y collar de sistema de atadura o maniota.

La mañana del experimento, los contenidos del catéter arterial se aspiraron (únicamente la linea arterial se utilizó en estos estudios), el catéter se inundó con una solución salina, y una linea de extensión (protegida por una atadura o maniota de acero inoxidable) se unió al catéter. El perro se colocó en una jaula metabólica, y la linea de extensión del catéter y la atadura o maniota se unió a un sistema eslabón giratorio para dejar al perro moverse libremente alrededor de la jaula. Después de un periodo de descanso de 15 minutos (45 minutos, controles), se extrajo sangre (2-3.5 mi) para la determinación de la concentración de glucosa en el plasma. Una segunda muestra de linea de referencia se extrajo 15 minutos después (0 tiempo) . La sustancia de prueba (solución salina amortiguada con fosfato o 10.5 mmoles/kg de insulina de humano LysB28ProB29 de B28-Nß-Palmitoilo; esta dosis es el equivalente molar de 1.75 U/kg de insulina de humano) se administró de manera subcutánea en la vértebra dorsal del cuello. Las muestras de sangre arterial (2-3.5 mi) luego se tomaron al menos cada 30 minutos durante las próximas dos (controles) a seis (insulina de humano LysB28ProB29 de B28-NE-Palmitoilo) horas. Las muestras se colectaron en tubos de colección de sangre al vacio que contienen EDTA de disodio e inmediatamente se colocaron en hielo. Las muestras se centrifugaron, y el plasma resultante se transfirieron a tubos de prueba de polipropilenglicol y se almacenaron en hielo y se refrigeraron durante la duración del estudio. En la conclusión del experimento, el animal se anestesió (isoflurano) ; el catéter se inundó con solución salina nueva y se rellenó con la mezcla de glicerol/heparina; el extremo libre del catéter se anudó y se colocó de manera subcutánea como se describe recientemente; y el antibiótico se administró (300 mg Keflex, I.M.). Las concentraciones de glucosa en el plasma se determinaron el dia del estudio utilizando un método de glucosa oxidasa en un analizador de glucosa Beckman. Los valores se listaron como el promedio ± el error normal del promedio (SEM) . La concentración de glucosa en el plasma no cambió de manera significante de la linea de referencia durante el periodo de observación de dos horas después de la inyección de solución salina amortiguada con fosfato (Tabla 1). Durante el mismo periodo de tiempo, la administración subcutánea de insulina de humano LysB28ProB29 de B28-Ne-Palmitoilo dio por resultado una disminución del 15% (17 mg/dl) en la concentración de glucosa en el plasma. La concentración de glucosa en el plasma en el animal tratado con insulina de humano LysB28ProB2s de B28-N6-Palmitoilo continúa cayendo gradualmente durante las próximas cuatro horas, cayendo a un nivel de flucosa de 41 mg/dl inferior a linea de referencia (disminución del 35%) seis horas después de la inyección. Se establece en la literatura que las concentraciones de glucosa en el plasma en el perro normal no caen de manera significante aun después de una semana de ayuno. La disminución en la glucosa observada en este estudio fué debido a la administración de insulina de humano LysB28ProB29 de B28-Ne-Palmitoilo, demostrando de esta manera la actividad similar a la insulina de este compuesto.

Tabla 1. Las concentraciones de glucosa en el plasma después de la inyección subcutánea de solución salina amortiguada con fosfato (controles) o insulina de humano LysB28ProB29 de B28-N8-Palmitoilo. insulina de humano Control (n=5) Ly; 3B28proB29 de Tiempo (minutos; (mg/dL) B28-N8-Palmitoilo (n= =1) (mg/dL) -15 114±3 116 0 112±3 116 30 117+4 114 60 114+3 107 90 115+3 102 120 117+5 99 150 101 180 100 210 100 240 98 270 87 300 82 330 79 360 75 LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Baker y colaboradores (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Análogos de Insulina Acilados (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: Eli Lilly and Company División de Patentes/SPC (B) CALLE: Lilly Corporate Center (C) CIUDAD: Indianapolis (D) ESTADO: IN (E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 46285 (v) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Diskette, 3.50 pg, 1.4 Mb almacenamiento (B) COMPUTADORA: Macintosh (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: Macintosh (D) PROGRAMA: Microsoft Word (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Steven P. Caltrider (B) NUMERO DE REGISTRO: 36467 (C) NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO : X9720 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (317) 276-0757 (B) TELEFAX: (317) 277-1917 (C) TELEX: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE LA IDEN. NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio Variable (B) UBICACIÓN: 1 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: (D) OTRA INFORMACIÓN: "Xaa en la posición 1 de la SEC. DE LA IDEN. NO : 1 es Gly: o Gly acilado cuando Xaa en la posición 1 de la SEC. DE LA IDEN. NO:2 es Phe, Xaa en la posición 28 de la SEC. DE LA IDEN. NO : 2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, y Xaa en la posición 29 de la SEC. DE LA IDEN. NO:2 es Lys o Pro." (ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDEN. DE LA SEC. NO:l: Xaa lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser leu Tyr Gln 1 5 10 15 Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (3) INFORMACIÓN PARA IDEN. DE LA SEC. NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio Variable (B) UBICACIÓN: 1 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: (C) OTRA INFORMACIÓN: "Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Phe; o Phe acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 1 es Gly, Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Lys o Pro". (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio Variable (B) UBICACIÓN: 28 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: (D) OTRA INFORMACIÓN: "Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Asp, Lys, Leu, Val, Ala; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:l es Gly, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 se Phe, y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Pro. " (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio Variable (B) UBICACIÓN: 29 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: (D) OTRA INFORMACIÓN: "Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Lys, Pro; o Lys acilado cuando Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Asp, Lys, Leu, Val, o Ala, Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:l es Gly, y Xaa en la posición 1 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Phe . " (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDEN. DE LA SEC. NO : 2 : Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr 20 25 30 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES 1. Un análogo de insulina monoacilado de la fórmula: IDEN. DE LA SEC. NO : 1 apropiadamente unida al través a la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El análogo de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Lys acilado y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Pro. 3. Un análogo de insulina acilado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el grupo de acilación es un ácido graso de 6 a 17 átomos de carbono. 4. Un análogo de insulina acilado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el grupo de acilación es un ácido graso de 13 a 17 átomos de carbono. 5. Insulina de humano LysB28ProB29 de B28-N8-palmitoilo . 6. Insulina de humano LysB28ProB29 de B28-N8-miristoilo. 7. Una formulación farmacéutica parenteral, caracterizada porque comprende un análogo de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 conjuntamente con uno o más conservadores, agentes de isotonicidad, o amortiguadores farmacéuticamente aceptables. 8. Una formulación farmacéutica parenteral, caracterizada porque comprende una mezcla de insulina o un análogo de insulina y un análogo de insulina acilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la relación en peso de los dos componentes es aproximadamente 1-99:99-1. 9. Una formulación farmacéutica parenteral de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la mezcla es insulina de humano LysB28proB29 e insuiina ¿ humano LysB28ProB29 B28-N8-acilada . 10. Un método para tratar un paciente que sufre de hiperglicemia, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva del análogo de insulina acilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 11. Un proceso para preparar una formulación farmacéutica parenteral, caracterizado porque comprende mezclar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un agente de isotonicidad, y un amortiguador fisiológicamente tolerado . 12. Un análogo de insulina acilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso en el tratamiento de diabetes mellitus . 13. Un análogo de insulina acilado sustancialmente como se describe anteriormente en la presente con referencia a cualquiera de los ejemplos . REIVINDICACIONES ENMENDADAS [recibidas por la Oficina Internacional el 03 de Mayo de 1996 (03.05.96); reivindicaciones originales 2-4, 7, 8, 10, 12 y 13 enmendadas; reivindicaciones restantes sin cambio (2 páginas) ]

1. Un análogo de insulina monoacilado de la fórmula: IDEN. DE LA SEC. NO : 1 apropiadamente unida al través a la IDEN. DE LA SEC. NO:2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El análogo de insulina monoacilado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Xaa en la posición 28 de la IDEN. DE LA SEC. NO:2 es Lys acilado y Xaa en la posición 29 de la IDEN. DE LA SEC. NO : 2 es Pro.

3. Un análogo de insulina monoacilado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el grupo de acilación es un ácido graso de 6 a 17 átomos de carbono.

4. Un análogo de insulina monoacilado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el grupo de acilación es un ácido graso de 13 a 17 átomos de carbono.

5 . Insulina de humano LysB28ProB29 de B28-Ne palmitoilo .

6. Insulina de humano LysB28ProB29 de B28-N8-miristoilo.

7. Una formulación farmacéutica parenteral, caracterizada porque comprende un análogo de insulina monoacilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 conjuntamente con uno o más conservadores, agentes de isotonicidad, o amortiguadores farmacéuticamente aceptables.

8. Una formulación farmacéutica parenteral, caracterizada porque comprende una mezcla de insulina o un análogo de insulina y un análogo de insulina monoacilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la relación en peso de los dos componentes es aproximadamente 1-99:99-1.

9. Una formulación farmacéutica parenteral de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la mezcla es insulina de humano LysB28ProB29 e insulina de humano LysB28ProB29 B28-N8-acilada.

10. Un método para tratar un paciente que sufre de hiperglicemia, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva del análogo de insulina monoacilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Un proceso para preparar una formulación farmacéutica parenteral, caracterizado porque comprende mezclar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un agente de isotonicidad, y un amortiguador fisiológicamente tolerado.

12. Un análogo de insulina monoacilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso en el tratamiento de diabetes mellitus .

13. Un análogo de insulina monoacilado sustancialmente como se describe anteriormente en la presente con referencia a cualquiera de los ej emplos . RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la diabetes. Más particularmente, la invención se refiere a un análogo de insulina monomérico en donde la cadena A es la secuencia que ocurre naturalmente de la cadena A de insulina de humano y la cadena B se modifica ya sea en la posición B28 y B29 o ambas. El análogo es monoacilado en la N-terminación de la cadena A o la cadena B o en la lisina. Los análogos de insulina acilados tienen una duración extendida de acción. DECLARACIÓN BAJO EL ARTICULO 19 El reporte de Búsqueda Internacional para la solicitud titulada se envió el 12 de Marzo de 1996. De acuerdo con el Articulo 19 del Tratado de Cooperación en Materia de Patentes, el solicitante propone con la presente reemplazar las hojas (páginas 23 y 24) por las páginas 23 y 24 de la Solicitud Internacional como se presentó originalmente. Las reivindicaciones han sido enmendadas para aclarar que los análogos de insulina de la presente invención son monoacilados. El soporte para la enmienda se encuentra por toda la especificación y en particular en la página 4, lineas 4-6. De acuerdo con el Articulo 19(2), las enmiendas no van más allá de la descripción de la solicitud internacinoal como se presentó. El solicitante requiere respetuosamente la entrada de las hojas de sustitución para las páginas 23 y 24 de la solicitud internacional como se presentó originalmente.