DE69535031T2

DE69535031T2 - Selektive Acylierung von Epsilon-Aminogruppen in Insulin

Info

Publication number: DE69535031T2
Application number: DE69535031T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Clayton Indianapolis Baker; Victor John Indianapolis Chen; Aidas Vladas Indianapolis Kriauciunas; Brian Allen Indianapolis Moser; Jose Michael Greenwood Hanquier; Robert Theodore Sedona Shuman
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2015-11-15
Also published as: CZ287731B6; HU217585B; JPH10509176A; CZ145697A3; NZ297256A; ES2264124T3; PT712862E; TR199501421A2; SI0712862T1; HK1014007A1; BR9509652A; CN1171742A; ATE328902T1; DK0712862T3; CA2205061A1; AU720820B2; IL115972A0; RU2155773C2; AU7885498A; EP1227107A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Acylierung von Proteinen. Sie betrifft insbesondere ein Einstufenverfahren zur selektiven Acylierung der ε-Aminogruppe von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinanalogon in Gegenwart einer freien α-Aminogruppe.
Die Acylierung von Aminogruppen ist eines der herkömmlichsten Verfahren zur chemischen Modifizierung von Proteinen. Allgemeine Verfahren zur Acylierung werden beispielsweise in Methods of Enzymology 25: 494 bis 499 (1972) beschrieben und beinhalten die Anwendung aktivierter Ester, Säurehalogeniden oder Säureanhydriden. Die Verwendung aktivierter Ester, insbesondere von N-Hydroxysuccinimidestern von Fettsäuren, ist ein besonders günstiges Mittel zur Acylierung einer freien Aminosäure mit einer Fettsäure, wozu auf Lapidot et al., J. of Lipid Res. 8: 142 bis 145 (1967) hingewiesen wird. Hierin wird die Herstellung von N-Hydroxysuccinimidestern und deren Verwendung zur Herstellung von N-Lauroylglycin, N-Lauroyl-L-serin und N-Lauroyl-L-glutaminsäure beschrieben.
Frühe Studien einer selektiven Acylierung der Aminogruppen von Insulin werden unter anderem beschrieben in Lindsay et al., Biochem. J. 121: 737 bis 745 (1971). Beschrieben wird darin die Reaktivität von Insulin mit N-Succinimidylacetat bei niedrigen Konzentrationen an Reagenz und nahe einem neutralen pH unter Bildung von zwei monosubstituierten Produkten, nämlich Phe^B1-Acetylinsulin und Gly^A1-Acetylinsulin. Bei einem pH von 8,5 erniedrigt sich die Menge an gebildetem Phe^B1-Acetylinsulin, wobei auch Lys^B29-Acetylinsulin gebildet wird. Lindsay et al. sind daher zu dem Schluss gekommen, dass bei pH 6,9 die Reaktivitätsordnung Glycin(A1)~Phenylalanin(B1)>>Lysin(B29) und bei pH 8,5 Glycin(A1)>Phenylalanin~Lysin(B29) ist.
Lindsay et al. beschreiben in US 3 869 437 B die Acylierung der B¹-Aminosäure mit einer Acylgruppe, welche bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält, und eine optionale Blockierung der A¹- und/oder B²⁹-Aminogruppe mit einer Acylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen. N-Hydroxysuccinimidester werden darin als besonders geeignete Acylierungsmittel beschrieben. Zur Bildung einer maximalen Ausbeute an Insulin, das an der B¹-Aminogruppe acyliert ist, ist der Anteil an Acylierungsmittel relativ niedrig und entspricht einem und nicht mehr als zwei mol Äquivalenten an Acylierungsmittel. Eine maximale Ausbeute an monosubstituiertem B¹-Produkt wird bei einem pH von oder um etwa pH 7 gebildet. Bei einem pH von 8,5 bis 9,0 fällt die Ausbeute des gewünschten B¹-Acylierungsprodukts stark ab zugunsten einer zusätzlichen Substitution an den Positionen A¹ und B²⁹.
Von D.G. Smyth werden in US 3 868 356 B und von Smyth et al. in US 3 868 357 B N-acylierte, O-substituierte Insulinderivate beschrieben, bei denen wenigstens eine der Aminosäuregruppen A¹, B¹ oder B²⁹ zu einer blockierten Aminogruppe umgewandelt ist. Die Acylierung wird mit einem relativ geringen Überschuss an Acylierungsmittel durchgeführt, beispielsweise mit 2 bis 3 mol pro Aminogruppe, bei einem neutralen oder schwach alkalischen pH, beispielsweise einem pH von 7 bis 8. Die Reaktion verläuft in sehr hoher Ausbeute unter Bildung des disubstituierten Derivats, das sich durch die Reaktion der A¹- und B¹-Aminogruppen ergibt. In Gegenwart eines Überschusses an Acylierungsmittel, beispielsweise bis zu 10 mol, kommt es ferner auch zu einer Reaktion der B²⁹-Aminogruppe unter Bildung des trisubstituierten Derivats.
Zur selektiven Acylierung von Insulin beschreiben Muranishi und Kiso in JP 1-254 699 A eine fünfstufige Synthese zur Herstellung von Fettsäureinsulinderivaten. Diese Synthese besteht in der Her stellung des aktivierten Fettsäureesters in der ersten Stufe, einem Schutz der Aminogruppen von Insulin mit p-Methoxybenzoxycarbonylazid (pMZ) in der zweiten Stufe, der Umsetzung von Insulin-pMZ mit dem Fettsäureester in der dritten Stufe, der Schutzgruppenabspaltung vom acylierten Insulin in der vierten Stufe und der Isolierung und Reinigung des acylierten Insulins in der fünften Stufe. Dabei ist besonders darauf hinzuweisen, dass eine selektive Acylierung einer Aminogruppe nur durch Verwendung der Blockierungsgruppe pMZ zum Schutz der anderen Aminogruppen erreicht wird. Unter Anwendung dieser Methodologie werden von Muranishi und Kiso die folgenden Verbindungen hergestellt: LysB²⁹-Palmitoylinsulin (die ε-Aminogruppe ist acyliert), Phe^B1-Palmitoylinsulin (die N-terminale α-Aminogruppe der B-Kette ist acyliert) und Phe^B1Lys^B29-Dipalmitoylinsulin (es sind sowohl die ε-Aminogruppe als auch die N-terminale α-Aminogruppe acyliert).
Ähnlich beschreiben Hashimoto et al., Pharmaceutical Research 6: 171 bis 176 (1989) eine vierstufige Synthese zur Herstellung von N-Palmitolylinsulin. Diese Synthese beinhaltet einen Schutz und eine Schutzgruppenabspaltung des N-terminalen A¹-Glycins und der ε-Aminogruppe von B²⁹-Lysin mit pMZ. Unter den darin beschriebenen Bedingungen werden zwei wichtige Acylierungsprodukte hergestellt, nämlich B¹,B²⁹-Dipalmitoylinsulin.
Demnach wurde vor der vorliegenden Erfindung die selektive Acylierung der B²⁹-N^ε-Aminogruppe von Insulin durchgeführt durch einen Schutz und eine anschließende Abspaltung der α-Aminogruppen.
Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung eine selektive einstufige Synthese zur Acylierung der ε-Aminogruppe von Proinsulin, Insulin und Insulinanaloga bereitgestellt. Dabei ist ziemlich überraschend, dass die Erfindung befähigt ist zur selektiven Acylierung der ε-Aminogruppe in einem einstufigen Verfahren in hoher Ausbeute. Durch die Erfindung wird somit die Notwendigkeit eliminiert, andere Aminogruppen des Proteins zu schützen und die Schutzgruppen dann abzuspalten. Die Erfindung liefert daher ein effizienteres und weniger aufwändiges Verfahren zur Herstellung von ε-Aminoacylinsulinderivaten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur selektiven Acylierung von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinalalogon mit einer freien ε-Aminogruppe und einer freien α-Aminogruppe unter Verwendung einer Fettsäure durch Umsetzung der ε-Aminogruppe mit einem löslichen aktivierten Fettsäureester unter basischen Bedingungen in einem polaren Lösemittel.
Die Abkürzungen für alle Aminosäuren, wie sie vorliegend verwendet werden, entsprechen denen, wie sie vom US Patent- und Markenamt akzeptiert und in 37 C.F.R. § 1.822(B)(2) angegeben sind.
Wie bereits erwähnt, sorgt die vorliegende Erfindung für eine hoch selektive einstufige Acylierung der ε-Aminogruppe von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinanalogon. Dabei werden auch Bedingungen beschrieben, bei denen sich eine bevorzugte Acylierung der ε-Aminogruppe gegenüber der α-Aminogruppen ergibt. Im Allgemeinen wird hierbei die monoacylierte α-Aminogruppe in einer Ausbeute von unter 5% erzeugt.
Unter einem Insulin wird hierin Humaninsulin, Schweineinsulin oder Rinderinsulin verstanden. Insulin besitzt drei freie Aminogruppen, nämlich B¹-Phenylalanin, A¹-Glycin und B²⁹-Lysin. Die freien Aminogruppen an den Positionen A¹ und B¹ sind α-Aminogruppen. Die freie Aminogruppe an der Position B29 ist eine ε-Aminogruppe.
Unter einem Proinsulin wird hierin ein geeignet vernetztes Protein der folgenden Formel verstanden B-C-A worin
A für die A-Kette von Insulin oder einem funktionalen Derivat hiervon steht,
B für die B-Kette von Insulin oder einem funktionalen Derivat hiervon steht, das eine ε-Aminogruppe aufweist, und
C für das Verbindungspeptid von Proinsulin steht.
Das Proinsulin ist vorzugsweise die A-Kette von Humaninsulin oder die B-Kette von Humaninsulin, wobei C das natürliche Verbindungspeptid ist. Ist das Proinsulin die natürliche Sequenz, dann verfügt dieses Proinsulin über drei freie Aminogruppen, nämlich B¹-Phenylalanin, (α-Aminogruppe), C⁶⁴-Lysin (ε-Aminogruppe) und B²⁹-Lysin (ε-Aminogruppe).
Unter einem Insulinanalogon wird hierin ein geeignet vernetztes Protein der folgenden Formel verstanden A-B worin
A für ein funktionales Derivat der A-Kette von Insulin steht und
B für ein funktionales Derivat der B-Kette von Insulin steht, das eine ε-Aminogruppe aufweist.
Zu bevorzugten Insulinanaloga gehören Insulin, worin
der Aminosäurerest an der Position B²⁸ für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht,
der Aminosäurerest an der Position B²⁹ für Lys oder Pro steht,
der Aminosäurerest an der Position B¹⁰ für His oder Asp steht,
der Aminosäurerest an der Position B¹ für Phe oder Asp steht oder allein oder in Kombination mit einer Deletion des Rests an der Position B² deletiert ist,
der Aminosäurerest an der Position B³⁰ für Thr oder Ala steht oder deletiert ist und
der Aminosäurerest an der Position B⁹ für Ser oder Asp steht,
mit der Maßgabe, dass entweder die Position B²⁸ oder die Position B²⁹ für Lys steht.
Gemäß der dem Fachmann bekannten biochemischen Standards sind die bevorzugten Insulinanaloga Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin (B²⁸ ist Lys und B²⁹ ist Pro), Asp^B28-Humaninsulin (B²⁸ ist Asp), Asp^B1-Humaninsulin, Arg^B31,^B32-Humaninsulin, Asp^B10-Humaninsulin, Arg^A0-Humaninsulin, Asp^B1,Glu^B13-Humaninsulin, Ala^B26-Humaninsulin, Des(B30)-Humaninsulin und Gly^A21-Humaninsulin.
Unter einer Acylierung wird die Einführung einer oder mehrerer Acylgruppen verstanden, die an die freien Aminogruppen des Proteins kovalent gebunden sind.
Unter einer selektiven Acylierung wird die präferentielle Acylierung der ε-Aminogruppe(n) gegenüber der α-Aminogruppen verstanden. Im Allgemeinen führt die selektive Acylierung zu einem Verhältnis der Menge an monoacyliertem ε-Aminogruppenprodukt zum monoacylierten α-Aminogruppenprodukt von über etwa 5. Vorzugsweise ist dieses Verhältnis größer als etwa 10 und am bevorzugtesten größer als etwa 50.
Unter einer Fettsäure wird eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₂₁-Fettsäure verstanden. Unter einem aktivierten Fettsäureester versteht man eine Fettsäure, welche unter Anwendung der allgemeinen Techniken aktiviert worden ist, wie sie beschrieben werden in Methods of Enzymology 25, 494 bis 499 (1972) und in Lapidot et al., J. of Lipid Res. 8: 142 bis 145 (1967). Die bevorzugten Fettsäuren sind gesättigte Fettsäuren und umfassen Myristinsäure (C₁₄), Pentadecylsäure (C₁₅), Palmitinsäure (C₁₆), Heptadecylsäure (C₁₇) und Stearinsäure (C₁₈). Die am stärksten bevorzugte Fettsäure ist Palmitinsäure. Zu aktivierten Fettsäureestern gehören Derivate von Agenzien, wie Hydroxybenzotriazid (HOBT), N-Nydroxysuccinimid und Derivate hiervon. Der bevorzugte aktivierte Ester ist N-Succinimidylpalmitat.
Unter löslich ist zu verstehen, dass eine solche Menge an Ester in der flüssigen Phase vorhanden ist, dass sich eine Acylierung von Insulin, Insulinanalogon oder Proinsulin ergibt. Vorzugsweise befinden sich etwa 1 bis 4 mol Äquivalent an aktiviertem Ester pro Mol an Insulin in der flüssigen Phase.
Unter basischen Bedingungen wird hierin die Basizität der Reaktion verstanden. Die Reaktion muss durchgeführt werden unter einer praktischen Deprotonierung aller freien Aminogruppen. In einem wässrigen Lösemittel oder semiwässrigen Lösemittelgemisch ist unter basischen Bedingungen zu verstehen, dass die Reaktion bei einem pH von über 9,0 durchgeführt wird. In einem nichtwässrigen organischen Lösemittel wird die Reaktion in Anwesenheit einer Base mit einem Basizitätsäquivalent bis zu einem pK_a-Wert durchgeführt, der größer oder gleich ist wie 10,75 in Wasser.
Unter einer Vernetzung wird die Bildung von Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten verstanden. Ein geeignet und sauber vernetztes Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon enthält drei Disulfidbrücken. Die erste Disulfidbrücke wird zwischen den Cysteinresten an den Positionen 6 und 11 der A-Kette gebildet. Die zweite Disulfidbrücke bindet die Cysteinreste an der Position 7 der A-Kette an das Cystein an der Position 7 der B-Kette. Die dritte Disulfidbrücke bindet das Cystein an der Position 20 der A-Kette an das Cystein an der Position 19 der B-Kette.
Vor der vorliegenden Erfindung erfolgte vom Fachmann eine selektive Acylierung der ε-Aminogruppe durch Verwendung einer Schutzgruppe in einer vielstufigen Synthese. Muranishi und Kiso beschreiben in JP 1-254 699 A eine fünfstufige Synthese zur Herstellung acylierter Insulinderivate. Ähnlich beschreiben Hashimoto et al., in Pharmaceutical Research 6: 171 bis 176 (1989) eine vierstufige Synthese zur Herstellung von N-Palmitoylinsulin. Zur selektiven Acylierung des Insulin lehren beide Dokumente die Anwendung der Schutzgruppe pMZ.
Durch die vorliegende Erfindung kann man nun N^ε-acyliertes Proinsulin, Insulin oder ein Insulinanalogon in hoher Ausbeute nach einer einstufigen Synthese herstellen. Dabei ermöglicht diese Umsetzung die Herstellung von N^ε-acylierten Proteinen ohne Anwendung von Aminoschutzgruppen. Durchgeführt wird diese Acylierung durch Umsetzung eines aktivierten Fettsäureesters mit der ε-Aminogruppe des Proteins unter basischen Bedingungen in einem polaren Lösemittel. Unter schwach basischen Bedingungen werden nicht alle freien Aminogruppen deprotoniert und kommt es zu einer signifikanten Acylierung der N-terminalen Aminogruppen. In einem wässrigen Lösemittel oder semiwässrigen Lösemittelgemisch wird unter basischen Bedingungen verstanden, dass die Umsetzung bei einem pH von über 9,0 durchgeführt wird. Infolge eines Proteinabbaus bei einem pH-Bereich von über 12,0 soll der pH des Reaktionsgemisches vorzugsweise 9,5 bis 11,5 und insbesondere 10,5 betragen. Die Messung des pH- Werts des Reaktionsgemisches in einem Gemisch aus einem organischen und einem wässrigen Lösemittel ist der pH-Wert der wässrigen Phase vor der Vermischung.
Die Daten der folgenden Tabelle zeigen den Einfluss der Basizität der Reaktion auf die Selektivität der Reaktion. Die Daten der Tabelle 1 wurden mit Humaninsulin, das mit 2 mol Äquivalent N-Succinimidylpalmitat acyliert ist in 50% CH₃CN/Wasser generiert. Tabelle 1: Einfluss des pH-Werts auf die Acylierung von Insulin
Die obige Tabelle 1 zeigt, dass die Acylierung der ε-Aminogruppe abhängig ist von der Basizität der Reaktion. Bei einem pH-Wert von größer als 9,0 kommt es bei der Umsetzung zu einer selektiven Acylierung der ε-Aminogruppe von B29-Lysin.
In einem nichtwässrigen Lösemittel wird die Umsetzung durchgeführt in Gegenwart einer Base mit einem Basizitätsäquivalent bis zu einem pK_a-Wert, der größer oder gleich ist als 10,75 in Wasser, sodass es zu einer ausreichenden Deprotonierung der ε-Aminogruppe(n) kommt. Dies bedeutet, dass die Base wenigstens so stark sein muss wie Triethylamin. Vorzugsweise ist die Base Tetramethylguanidin (TMG), Diisopropylethylamin oder Tetrabutylammoniumhydroxid.
Die Wahl des polaren Lösemittels ist weitgehend abhängig von der Löslichkeit des Proinsulins, Insulins oder Insulinanalogons und des Fettsäureesters. Am besten ist das Lösemittel insgesamt organisch. Zu allgemein akzeptablen organischen Lösemitteln gehören DMSO, DMF und dergleichen. Wässrige Lösemittel und Gemische aus wässrigen und organischen Lösemitteln sind ebenfalls geeignet. Die Selektion der polaren Lösemittel wird lediglich durch die Solubilität der Reagenzien begrenzt. Bevorzugte Lösemittel und Lösemittelsysteme sind DMSO, DMF, Acetonitril und Wasser, Aceton und Wasser, Ethanol und Wasser, Isopropylalkohol und Wasser, Isopropylalkohol, Ethanol und Wasser sowie Ethanol, Propanol und Wasser, bevorzugt ist das Lösemittel Actonitril und Wasser, wobei 50%iges Acetonitril am meisten bevorzugt ist. Dem Fachmann ist ferner geläufig, dass auch andere polare Lösemittel verwendet werden können.
Das Verhältnis der Reaktanten ist nicht kritisch. Im Allgemeinen ist bevorzugt, dass der aktivierte Fettsäureester in molarem Überschuss vorhanden ist. Die Umsetzung wird vorzugsweise mit 1 bis 4 mol Äquivalent und vorzugsweise mit 1 bis 2 mol Äquivalent des Esters durchgeführt. Dabei ist dem Fachmann ebenfalls geläufig, dass bei sehr hohen Mengen an aktiviertem Ester bisacyliertes oder triacyliertes Produkt in signifikanter Menge gebildet werden.
Die Temperatur des Reaktionsgemisches ist nicht kritisch. Die Umsetzung wird bei Temperaturen zwischen 0°C und 40°C durchgeführt und ist im Allgemeinen innerhalb von 15 min bis 24 h beendet.
Nach erfolgter Acylierung wird die Reaktion gestoppt und das erhaltene Produkt durch übliche Verfahren gereinigt, wie durch Umkehrphasenchromatographie oder hydrophober Chromatographie. Sodann wird das Produkt durch übliche Verfahren gewonnen, wie durch Gefriertrocknung oder Kristallisation.
Proinsulin, Insulin und Insulinanaloga lassen sich durch eine Reihe anerkannter Peptidsynthesetechniken herstellen, nämlich unter anderem durch klassische Verfahren in Lösung, Festphasenverfahren, semisynthetischem Verfahren und seit Kurzem auch durch rekombinante DNA-Verfahren. So wird beispielsweise von Chance et al. in US 07 388 201 A , EP 0 383 472 A , von Brange et al. in EP 0 214 826 A und von Belagaje et al. in US 5 304 473 B die Herstellung verschiedener Analoga von Proinsulin und Insulin beschrieben, wobei diese Dokumente hierdurch durch deren Bezugnahme eingeführt sind. Die Ketten A und B der Insulinanaloga der vorliegenden Erfindung lassen sich auch herstellen über ein zu Proinsulin ähnliches Vorläufermolekül unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, wozu hingewiesen wird auf Frank et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp. 1981 von D. Rich und E. Gross.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Daher soll der Schutzumfang der Erfindung nicht so verstanden werden, dass er lediglich auf den folgenden Beispielen beruht.
Beispiel 1
Acylierung von Insulin unter Verwendung von N-Succinimidylpalmitat in DMSO
Biosynthetisch hergestellte Humaninsulinkristalle (BHI) (71,9 mg) werden in 6,58 ml DMSO gelöst. Die Lösung wird solange bei Raumtemperatur gerührt, bis die Kristalle als Ergebnis einer visuellen Betrachtung vollständig aufgelöst sind. Die Herstellung einer Lösung des aktivierten Esters (N-Succinimidylpalmitat) erfolgt durch Zugabe von 20 mg des festen aktivierten Esters zu 2 ml DMSO und solange kräftige Rührung, bis die aktivierten Esterteilchen gemäß einer visuellen Inspektion insgesamt in Lösung gegangen sind. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt eine Zugabe von 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (26,8 μl) zu 5 ml der BHI-Lösung und dann von DMSO (94,4 ml) und der zuvor hergestellten aktivierten Esterlösung (400 μl). Dabei lässt man die Umsetzung während etwa 60 min bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) ablaufen. Nach 15 min wird eine Probe gezogen, mit 1 N Essigsäure auf das 20fache verdünnt und durch HPLC analysiert. Die Reaktionsausbeute wird berechnet als die Menge an B29-N^ε-Palmitoylhumaninsulin in der gestoppten Probe dividiert durch die Anfangsmenge an BHI und beträgt 67,1%.
Beispiel 2
Acylierung von Insulin unter Verwendung von N-Succinimidylpalmitat in Acetonitril und Wasser
Biosynthetisch hergestellte Humaninsulinkristalle (BHI) (199,5 g) werden in 20 l 50 mM Borsäurelösung bei pH 2,5 gelöst. Sodann wird der pH-Wert der Lösung unter Verwendung von 10%iger HCl erneut auf 2,5 eingestellt und die Lösung solange gerührt, bis die Kristalle gemäß einer visuellen Inspektion vollständig gelöst sind. Es wird eine Probe des Ausgangsmaterials gezogen und deren Absorption bei 276 nm als 10,55 gemessen. Hierauf wird eine Lösung des aktivierten Esters (N-Succinimidylpalmitat) hergestellt durch Zugabe von 24 g des festen aktivierten Esters zu 2,4 l Acetonitril, das vorher auf etwa 50°C erwärmt worden ist, und durch so langes kräftiges Rühren bis alle aktivierten Esterteilchen gemäß einer visuellen Inspektion in Lösung gegangen sind. Zu diesem Zeitpunkt wird der pH der BHI-Lösung eingestellt auf etwa 10,22 durch Zusatz von 10%igem NaOH. Die auf den erwähnten pH-Wert eingestellte BHI-Lösung wird hierauf mit Acetonitril (18 l) versetzt. Man lässt die Reaktion bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) während 10 min laufen, worauf sie durch Zusatz von Wasser (123 l) gestoppt und der pH-Wert der erhaltenen verdünnten Lösung mit 10%iger HCl und 10%igem NaOH auf 2,01 eingestellt wird. Die Ausbeute der Umsetzung durch Berechnung der Menge an B29-N^ε-Palmitoylhumaninsulin in der gestoppten Reaktion dividiert durch die Ausgangsmenge an BHI beträgt 73%.
Beispiel 3
Acylierung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin unter Verwendung von N-Succinimidylpalmitat in Acetonitril und Wasser
Man löst Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinkristalle (2,22 g) in 100 ml einer 50 mM Borsäurelösung mit einem pH-Wert von 2,5. Hierauf wird der pH der Lösung unter Verwendung von 10%iger HCl erneut auf 2,5 eingestellt und die Lösung solange gerührt, bis die Kristalle gemäß einer visuellen Inspektion vollständig gelöst sind. Sodann erfolgt die Herstellung einer Lösung an aktiviertem Ester (N-Succinimidylpalmitat) durch Zugabe von 270 mg des festen aktivierten Esters zu 27 ml Acetonitril, das vorher auf etwa 50°C erwärmt worden ist, und durch solange kräftige Rührung, bis die aktivierten Esterteilchen in der Lösung gemäß einer visuellen Inspektion insgesamt gelöst sind. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zusatz von 10%igem NaOH auf etwa 10,22 eingestellt, wobei die Lösung 15 min bei 4°C gerührt wird. Die auf den erwähnten pH-Wert eingestellte Lösung wird zuerst mit Acetonitril (73 ml) versetzt, worauf die vorher hergestellte aktivierte Esterlösung zugegeben wird. Man lässt die Reaktion während 85 min bei 4°C laufen und stoppt sie dann durch Zugabe von 1 N Essigsäure (600 ml), wodurch sich ein pH-Wert von 2,85 ergibt. Die Reaktionsausbeute liegt entsprechend einer Berechnung der Menge an B²⁸-N^ε-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in der gestoppten Reaktion dividiert durch die Ausgangsmenge an Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin bei 72,5%.
Beispiel 4
Acylierung von BHI unter Verwendung von N-Succinimidylpalmitat in Acetonitril und Wasser
Biosynthetisch hergestellte Humaninsulinkristalle (BHI) (3 g) werden in 300 ml einer 50 mM Borsäurelösung mit einem pH von 2,5 gelöst. Sodann wird der pH-Wert der Lösung erforderlichenfalls erneut auf 2,5 unter Verwendung von 10%iger HCl eingestellt und die Lösung solange gerührt, bis die Kristalle gemäß einer visuellen Inspektion vollständig in Lösung gegangen sind. Hierauf erfolgt die Herstellung einer Lösung an aktiviertem Ester (N-Succinimidylpalmitat) durch Zugabe von 400 mg des festen aktivierten Esters zu 40 ml Acetonitril und kräftiges Rühren. Zu diesem Zeitpunkt wird der pH der BHI-Kristalllösung durch Zusatz von 10% NaOH auf etwa 10,2 eingestellt. Hierauf versetzt man die BHI-Lösung mit Acetonitril (240 ml) und dann mit der zuvor hergestellten aktivierten Esterlösung. Man lässt die Reaktion etwa 90 min bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) laufen und stoppt diese dann durch Zusatz von Wasser (1800 ml) und Einstellung des pH-Werts der erhaltenen verdünnten Lösung mittels 10%iger HCl auf etwa 2,5. Die Reaktionsausbeute, welche aus der Menge an B29-N^ε-Palmitoylhumaninsulin in der Reaktion dividiert durch die Ausgangsmange an BHI berechnet wird, beträgt 75,7%.
Beispiel 5
Acylierung von Proinsulin mit N-Succinimidylpalmitat in Acetonitril und Wasser
Eine wässrige Lösung von Humaninsulin (HPI) (28,2) mg/ml) wird mit 50 mM Borsäure auf ein Endvolumen von 100 ml bei 16,2 mg/ml HPI verdünnt. Parallel dazu erfolgt die Herstellung der aktivierten Esterlösung durch Auflösung von 150 mg N-Succinimidylpalmitat in 15 ml Acetonitril (ACN) unter starker Rührung. Sodann wird der pH-Wert der HPI-Lösung mit 10%igem NaOH und anschließende Zugabe von 88 ml ACN auf 10,2 eingestellt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 12 ml aktivierter Esterlösung (2 × molarer Überschuss gegenüber HPI) initiiert. Das Endvolumen der Reaktion beträgt 200 ml entsprechend 8 mg/ml HPI in 50%igem wässrigem ACN. Man lässt die Reaktion etwa 60 min bei Raumtemperatur (20–25°C) laufen und stoppt diese dann durch Zugabe eines äquivalenten Volumens (200 ml) an 50 mM Glycin bei einem pH-Wert von 10,0.
Die genauen Verhältnisse aus den ε-aminoacylierten Komponenten zu den α-aminoacylierten Komponenten werden nicht berechnet, wobei die Summe aller ε-aminoacylierten Komponenten im Chromatogramm aber 87 bis 90% der Gesamtfläche ausmacht, während die Summe aller verwandten Substanzen, welche wahrscheinlich auch α-aminoacylierte Komponenten einschließen, einem Wert von < 7% der Gesamtfläche entspricht, und zwar zu jedem gegebenen Zeitpunkt.
Beispiel 6
Acylierung von Arg^B31,Arg^B32-Humaninsulin mit Hexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
Man löst Arg^B31,Arg^B32-Humaninsulin (1,3 mg) in 200 μl 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure als Puffer mit einem pH-Wert von 10,4. Hierauf versetzt man das Ganze mit Hexanoyl-N-hydroxysuccinimidester (0,3 μM) als Lösung in N,N-Dimethylformamid (DMF) und rührt das Ganze in die Lösung ein. Das Reaktionsgemisch wird etwa 4 h bei Umgebungstemperatur (20 bis 25°C) gerührt, worauf die Reaktion durch Einstellung des pH-Werts auf etwa 2,5 unter Verwendung von 0,1 N HCl gestoppt wird. Die gelatinösen Teilchen werden vor einer HPLC-Analyse entfernt, indem das Gemisch durch einen Filter von 0,45 μ geschickt wird. Die Abtrennung des Titelprodukts vom Ausgangsmaterial erfolgt auf einer analytischen HPLC-Säule mit C₄-Umkehrphase. Die Reaktionsausbeute liegt entsprechend einer Berechnung der Menge an B29-N^ε-Hexanoyl-Arg^B31,Arg^B32-Humaninsulin in der gestoppten Reaktion dividiert durch die Ausgangsmenge an Arg^B31,Arg^B32-Humaninsulin bei 69,4%.
Beispiel 7
Acylierung von Leu^B26-Humaninsulin mit N-Succinimidylpalmitat in DMSO
Man löst Leu^B26-Humaninsulin (1,0 mg) in 1 ml in 95% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 5% Triethylamin (TEA). Sodann wird diese Lösung mit einer Lösung von N-Succinimidylpalmitat (0,7 μM) in N,N-Dimethylformamid (DMF) versetzt und in die obige Lösung eingerührt. Das Reaktionsgemisch wird etwa 90 min bei Umgebungstemperatur (20 bis 25°C gerührt und die Reaktion dann durch Verdünnung der Probe auf 0,2 mg/ml mit 0,1 N HCl gestoppt. Die gelatinösen Teilchen werden vor einer HPLC-Analyse entfernt, indem das Gemisch durch einen Filter von 0,45 μ geschickt wird. Die Abtrennung des Titelprodukts vom Ausgangsmaterial erfolgt auf einer analytischen HPLC-Säule mit C₄-Umkehrphase. Die Reak tionsausbeute liegt entsprechend einer Berechnung der Menge an N^ε-Palmitoyl-Leu^B26-Humaninsulin in der gestoppten Reaktion dividiert durch die Ausgangsmenge an Leu^B26-Humaninsulin bei 36,4%.
Beispiel 8
Acylierung von Humaninsulin unter Verwendung von N-Succinimidylpalmitat in Dimethylsulfoxid (DMSO)
Zur Herstellung einer Lösung von Insulin werden biosynthetisch hergestellte Humaninsulinkristalle (1 g, 0,17 mmol) vollständig in 20 ml DMSO bei Raumtemperatur gelöst. Gleichzeitig erfolgt die Herstellung einer Lösung von aktiviertem Ester durch Lösung von N-Succinimidylpalmitat (0,0817 g, 0,23 mmol) in 3 ml DMSO bei 50°C. Die Ausgangslösung wird unter kräftiger Rührung zuerst mit 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (0,432 ml, 3,4 mmol) und dann mit der ganzen Lösung an aktivierten Ester versetzt. Nach 30 min wird die Reaktion mit 120 ml an 0,05 M HCl gestoppt, wobei vorher auf 0°C abgekühlt wird. Der pH des Gemisches beträgt etwa 1,8. Eine Analyse des gestoppten Gemisches durch HPLC mit Umkehrphase zeigt, dass das B²⁹-N^ε-Palmitoylinsulin 72,2% des gesamten eluierten Proteins ausmacht und 95% des gesamten monoacylierten Insulins repräsentiert.
Das gesamte Reaktionsgemisch wird auf eine präparative C₄-Säule (5 × 25 cm) von Vydac gegeben, die vorher mit einem Lösemittelgemisch äquilibriert worden ist, das 0,1% Trifluoressigsäure und 20%iges Acetonitril in Wasser enthält. Nach der Beladung wird die Säule zuerst mit 500 ml des gleichen Lösemittels gewaschen und dann bei einer Fließrate von 4 ml/min und mit einem Lösemittelsystem entwickelt, das aus 0,1% Trifluoressigsäure, Acetonitril und Wasser besteht, wobei sich die Konzentration an Acetonitril von 20% auf 80% in 9 l erhöht. Hierauf wird das B²⁹-N^ε-Palmitoylinsulin in diesem Lösemittelsystem eluiert, das sich aus etwa 53% Acetonitril zusammensetzt. Nach Entfernung des Lösemittels durch Lyophilisation ergibt sich eine Ausbeute an N^ε-Palmitoylinsulin von 414 mg (0,0684 mmol) oder von 40,2% auf das Ausgangsmaterial bezogen.
Beispiel 9
Acylierung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin mit 1-Octanoyl-N-hydroxysuccinimidester
Man löst Lys(B28), Pro(B29)-Humaninsulinkristalle (KPB) (2,0 g) in 200 ml 50 mM Borsäure als Puffer bei einem pH von 2,5. Hierauf wird der pH-Wert der Lösung mittels 10%iger HCl erneut auf 2,5 eingestellt und die Lösung solange gerührt, bis die Kristalle gemäß einer visuellen Inspektion vollständig in Lösung gegangen sind. Es wird eine Lösung an aktiviertem Ester (1-Octanoyl-N-hydroxysuccinimidester) hergestellt durch Zugabe von 175 mg des festen aktivierten Esters zu 25,62 ml Acetonitril und solange kräftige Rührung, bis alle aktivierten Esterteilchen gemäß einer visuellen Inspektion aufgelöst sind. Hierauf stellt man die KPB-Lösung durch Zugabe von 10%igem NaOH auf einen pH-Wert von 10,4 ein und rührt die Lösung etwa 5 min bei Umgebungstemperatur. Sodann versetzt man die bezüglich ihres pH-Werts eingestellte KPB-Lösung mit Acetonitril (176 ml) unter anschließender Zugabe der zuvor hergestellten aktivierten Esterlösung. Man lässt die Reaktion 90 min bei Umgebungstemperatur laufen und stoppt diese dann durch Zusatz von 5,5 ml einer 10%igen HCl (2,75% V/V) und von drei Volumina (1200 ml) an kaltem dH₂O, sodass sich ein pH-Endwert von 2,70 ergibt. Die Reaktionsausbeute, welche berechnet wird als die Menge an LysB29(C8)KPB in der gestoppten Reaktion dividiert durch die Anfangsmenge an HHI, beträgt 75,5%. Diese Lösung wird in 2 Teilmengen von jeweils 800 ml aufgeteilt und dann durch hydrophobe Chromatographie (SP20SS) gereinigt. Anschließend erfolgt eine Ultrafiltration und Lyophilisation.
Die in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Daten zeigen die selektive Acylierung von Insulin, Insulinanaloga und Proinsulin. Die Versuche werden bei Raumtemperatur mit N-Hydroxysuccinimidestern der Fettsäure durchgeführt. Die in der folgenden Tabelle enthaltenen Abkürzungen TMG und TEA bedeuten Tetramethylguanidin und Triethylamin. Die Abkürzung NG (nicht geprüft) bedeutet, dass hierfür keine Daten verfügbar sind. Tabelle 2

Claims

Verfahren zur selektiven Acylierung einer freien ε-Aminogruppe von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinanalogon, das auch eine freie α-Aminogruppe besitzt, unter Durchführung der selektiven Acylierung in einem polaren Lösemittel und unter basischen Bedingungen, wobei die basischen Bedingungen aus einem pH-Wert von größer als 9,0 bestehen, falls das polare Lösemittel ein wässriges oder semiwässriges organisches Lösemittel ist, oder unter Durchfuhrung der selektiven Acylierung in Anwesenheit einer Base mit einer Basizität äquivalent einem pK_a-Wert von größer oder gleich 10,75 in Wasser, falls das polare Lösemittel ein nicht wässriges organisches Lösemittel ist, worin das Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon selektiv mit einem löslichen aktivierten Fettsäureester acyliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon humanes Insulin oder humanes Lys^B28Pro^B29-Insulin ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der lösliche aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester einer C₆-C₁₈-Fettsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der lösliche aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester einer C₁₄-C₁₈-Fettsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der lösliche aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester von Pahnitinsäure ist.
Verfahren zur selektiven Acylierung von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinanalogon, das eine freie ε-Aminogruppe und eine freie α-Aminogruppe besitzt, mit einer Fetsäure, durch Umsetzung der ε-Aminogruppe mit einem löslichen aktivierten Fettsäureester bei einem pH-Wert von 9,0 oder darüber in einem polaren Lösemittel.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Proinsulin, Insulin oder Insulinanalogon humanes Insulin oder humanes Lys^B28Pro^B29-Insulin ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, worin der aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester einer C₆-C₁₈-Fettsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin der aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester einer C₁₄-C₁₈-Fettsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin der aktivierte Fettsäureester ein N-Hydroxysuccinimidester von Palmitinsäure ist.
Verfahren zur selektiven Acylierung von Proinsulin, Insulin oder einem Insulinanalogon, das eine freie ε-Aminogruppe und eine freie α-Aminogruppe besitzt, mit einer Fettsäure, durch Umsetzung der ε-Aminogruppe mit einem löslichen aktivierten Fettsäureester in einem semiwässrigen Lösemittel bei einem pH-Wert von 9,0 bis 12,0.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Protein humanes Insulin, ein Insulinanalogon oder humanes Lys^B28Pro^B29-Insulin ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin der pH-Wert 9,5 bis 10,5 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das semiwässrige Lösemittel Acetonitril und Wasser ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin das Lösemittel 50%iges Acetonitril ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, worin der Fettsäureester N-Succinimidylpalmitat, N-Succinimidyloctanoat oder N-Succinimidyhnyristat ist.