CZ287731B6 - Protein selective acylation process - Google Patents

Protein selective acylation process Download PDF

Info

Publication number
CZ287731B6
CZ287731B6 CZ19971456A CZ145697A CZ287731B6 CZ 287731 B6 CZ287731 B6 CZ 287731B6 CZ 19971456 A CZ19971456 A CZ 19971456A CZ 145697 A CZ145697 A CZ 145697A CZ 287731 B6 CZ287731 B6 CZ 287731B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
insulin
fatty acid
amino
ester
amino group
Prior art date
Application number
CZ19971456A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ145697A3 (en
Inventor
Jeffrey Clayton Baker
Victor John Chen
Jose Michael Hanquier
Aidas Vladas Kriauciunas
Brian Allen Moser
Robert Theodore Shuman
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of CZ145697A3 publication Critical patent/CZ145697A3/cs
Publication of CZ287731B6 publication Critical patent/CZ287731B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká způsobu selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou.
Dosavadní stav techniky
Acylace aminoskupin je jedním z nejběžnějších opatření, používaných k chemické modifikaci proteinů. Obecně jsou způsoby acylace popsány v Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499 (1972), a zahrnují použití aktivovaných esterů, halogenidů nebo anhydridů kyselin. Použití aktivovaných esterů, zvláště N-hydroxysukcinimidesterů mastných kyselin, je zvláště vhodným způsobem acylace volné aminokyseliny mastnou kyselinou. Lapidot a kol. (Lapidot a kol. J. of Lipid Res., 8, str. 142 až 145 (1967)) popisuje způsob přípravy N-lauroylglycinu, N-lauroyl-Lserinu a N-lauroyl-L-glutamové kyseliny.
Dřívější studie selektivní acylace aminoskupin inzulínu popsal Lindsay a kol. v Biochem. J., 121, str. 737 až 745 (1971). Landsay a kol. popisuje reaktivitu inzulínu s N-sukcinimidylacetátem při nízké koncentraci a téměř neutrální hodnotě pH, přičemž se produkují dva monosubstituované produkty, PheB1-acetylinzulin a GlyA1-acetylinzulin. Při hodnotě pH 8,5 se množství produkovaného PheB1-acetylinzulinu snižuje a produkuje se také LysB29-acetylinzulin. Lindsay a kol. usuzují, že při hodnotě pH 6,9 je sled reaktivity glycin (Al) = fenylalanin (Bl) » lysin (B29) a při hodnotě pH 8,5 glycin (Al) > fenylalanin (Bl) ~ lysin (B29). Id.
Lindsay a kol. (americký patentový spis číslo 3 869437) popisují acylaci B1 aminokyseliny s acylovou skupinou, obsahující až 7 atomů uhlíku, a popřípadě s blokováním A1 a/nebo B29aminoskupiny acylovou skupinou s až 4 atomy uhlíku. Jakožto obzvláště výhodná acylační činidla se popisují N-hydroxysukcinimidestery. K získání maximálního výtěžku inzulínu, acylovaného na Β'-aminoskupině, je podíl acylačního činidla poměrně nízký (jeden až ne více než dva molámí ekvivalenty acylačního činidla). Kromě toho maximální výtěžek monosubstituovaného B’-produktu se získá při hodnotě pH 7 nebo blízko této hodnoty. Při hodnotě pH 8,5 až 9,0 klesá výtěžek žádaného B'-produktu značně ve prospěch přídavné substituce v poloze A a B .
D. G. Smyth (americký patentový spis číslo 3 868356) a D. G. Smyth a kol. (americký patentový spis číslo 3 868357) popisují N-acylované, O-substituované deriváty inzulínu, ve kterých alespoň jedna aminoskupina A1, B1 nebo C29 se převádí na blokovanou aminoskupinu. Acylace se provádí s poměrně malým nadbytkem acylačního činidla, například s 2 nebo 3 mol na aminoskupinu při neutrální reakci nebo při mírně alkalické hodnotě pH, například při hodnotě pH 7 až 8. Reakce vede k velmi vysokým výtěžkům za vytvoření disubstituovaného derivátu, vznikajícího reakcí Α'-aminoskupiny a Β'-aminoskupiny. V přítomnosti nadbytku acylačního činidla, například 10 molámího množství, probíhá reakce přídavně na B29-aminoskupině za vzniku trisubstituovaného derivátu.
Pro selektivní acylaci inzulínu popisuje Muranishi a Kiso (japonská zveřejněná přihláška vynálezu 1-254699) pětistupňový způsob přípravy derivátů inzulínu s mastnou kyselinou. V prvním stupni se připravuje aktivovaný ester mastné kyseliny, ve druhém stupni se chrání aminoskupiny inzulínu p-methoxybenzoxykarbonylazidem (pMZ), ve třetím stupni se inzulinpMZ nechává reagovat s esterem mastné kyseliny, ve čtvrtém stupni se z acylovaného inzulínu odstraňují chránící skupiny, v pátém stupni se acylovaný inzulín izoluje a čistí. Nejpozoruhodnější je, že se selektivní acylace jedné aminoskupiny dosahuje toliko použitím
-1 CZ 287731 B6 p-methoxybenzoxykarbonylazidem (pMZ) blokovaných skupin k chránění ostatních aminoskupin. Použitím tohoto způsobu Muranishi a Kiso připravili tyto sloučeniny: LysB21~ palmitoylinzulin (ε-aminoskupina je acylována), PheB1-palmitoylinzulin (N-koncová a-aminoskupina B řetězce je acylována) a PheB1-palmitoylinzulin (jak ε-aminoskupina, tak N-koncová 5 a -aminoskupina B řetězce je acylována).
Podobně Hashimoto a kol. v Pharmaceutical Research 6, str. 171 až 176 (1989), popisují čtyřstupňový způsob přípravy N-palmitoylinzulinu. Syntéza zahrnuje chránění N-koncového Α’-glycinu a ε-aminoskupiny BB29-lysinu p-methoxybenzoxykarbonylazidem a odstranění ío chránících skupin. Za mírných podmínek se připravují dva hlavní acylované produkty, B^monopalmitoylinzulin a B1, B29-dipalmitoylinzulin.
Dosud se tedy prováděla selektivní acylace B29-Ne-aminoskupiny inzulínu za chránění a-aminoskupin a za následného odstraňování těchto chránících skupin. Vynález odstraňuje nevýhodnou 15 nutnost zavádění a odstraňování chránících skupin.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinu, který spočívá v tom, že se nechává reagovat εaminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za bázických podmínek v polárním rozpouštědle.
Podle výhodného provedení tohoto způsobu proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo LysB28ProB29-lidský inzulín.
Podle jiného výhodného provedení způsobu aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydro30 xysukcinimidester mastné kyseliny s 6 až 18 atomy uhlíku, nebo N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny se 14 až 18 atomy uhlíku. Obzvláště výhodné je, pokud aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester palmitové kyseliny.
Výhodné provedení způsobu podle tohoto vynálezu spočívá ve způsobu selektivní acylace 35 proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, kdy se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny v semivodném rozpouštědle při hodnotě pH 9,0 až 12,0.
Je obzvláště výhodné, pokud pitom proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo LysB28ProB29-lidský inzulín, a/nebo pokud hodnota pH je od 9,5 do 10,5.
Podle jiného výhodného provedení semivodným rozpouštědlem je směs acetonitrilu a vody, účelně 50% acetonitril.
Při výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu esterem mastné kyseliny je N-sukcinimidylpalmitát, N-sukcinimidyloktanoát nebo N-sukcinimidylmyristát.
Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu.
Vynález tedy poskytuje jednostupňový způsob selektivní acylace ε-aminoskupin proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Je naprosto překvapující, že vynález umožňuje selektivně acylovat ve vysokém výtěžku proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, obsahující volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou tím, že se nechává reagovat
-2CZ 287731 B6 ε-aminokyselina s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle.
S překvapením se zjistilo, že způsobem podle vynálezu lze jednostupňově acylovat ε-aminoskupiny proizulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Je zcela překvapivé, že způsob podle vynálezu umožňuje acylaci ε-aminoskupiny jednostupňově a ve vysokém výtěžku. Při způsobu podle vynálezu odpadá potřeba zavádět a následně odstraňovat chránící skupiny na další aminoskupiny proteinu. Vynález tedy umožňuje účinněji a levněji připravovat na ε-aminoskupině acylované inzulínové deriváty.
Všechny zde používané zkratky aminokyselin jsou v souhlase s ustanovením 37 C.F.R. § 1.822(B) (2) Úřadu pro patenty a obchodní známky Spojených států amerických.
Jak shora uvedeno, týká se vynález vysoce selektivního jednostupňového způsobu acylace ε-aminoskupiny proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Vynález popisuje podmínky pro zvýhodnění acylace ε-aminoskupiny před acylaci α-aminoskupiny. Obecně se monoacylovaná α-aminoskupina vytváří v méně než 5% výtěžku.
Výrazem „inzulín“ se vždy míní lidský inzulín, vepřový inzulín, nebo hovězí inzulín. Inzulín má tři volné aminoskupiny: B*-fenylalanin, Α'-glycin a B29-lysin. Volné aminoskupiny v poloze A1 a B1 jsou α-aminoskupiny. Volná aminoskupina v poloze B29 je ε-aminoskupina.
Výrazem „proinzulin“ se míní zesítěný protein obecného vzorce
B-C-A kde znamená
A A řetězec inzulínu nebo jeho funkčního derivátu,
B B řetězec inzulínu nebo jeho funkčního derivátu, mající ε-aminoskupinu, a
C spojující peptid proinzulinu.
S výhodou je proinzulinem A řetězec lidského inzulínu, B řetězec lidského inzulínu a C je přírodní spojující peptid. Jestliže má proinzulin přírodní sekvenci, má proinzulin tři volné aminokyseliny Β'-fenylalanin (α-aminoskupina), C^-lysin (ε-aminoskupina) a B29-lysin (ε-aminoskupina).
Výrazem „inzulínový analog“ se míní zesítěný protein obecného vzorce
A-B kde znamená
A funkční derivát řetězce inzulínu A,
B funkční derivát řetězce inuzlinu B, mající ε-aminoskupinu.
Výhodné inzulínové analogy zahrnují inzulín, přičemž:
aminokyselinový zbytek v poloze B28 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala;
aminokyselinový zbytek v poloze B29 je lys nebo Pro;
-3CZ 287731 B6 aminokyselinový zbytek v poloze B10 je His nebo Asp;
aminokyselinový zbytek v poloze B1 je Phe, Asp, nebo je vypuštěn samotný nebo v kombinaci s vypuštěním zbytku v poloze B“;
aminokyselinový zbytek v poloze B30 je Thr, Ala, neboje vypuštěn, a
28 aminokyselinový zbytek v poloze B je Ser nebo Asp, za podmínky, že buď v poloze B nebo vpolozeB29jeLys.
Podle standardní biochemické terminologie, známé pracovníkům v oboru, jsou výhodnými analogy inzulínu LysB28ProB29-lidský inzulín (B28 je Lys, B29 je Pro); AspB28-lidský inzulín (B28 je Asp); AspB1-lidský inzulín; ArgB31' B32—lidský inzulín; AspB10-lidský inzulín; ArgA0-lidský inzulín; Asp ’GluB13-lidský inzulín; AlaB26-lidský inzulín; des B30-lidský inzulín; a GlyA21lidský inzulín.
Výrazem „acylace“ se míní zavádění alespoň jedné acylové skupiny kovalentně vázané na aminoskupiny proteinu.
Výrazem „selektivní acylace“ se míní přednostní acylace alespoň jedné ε-aminoskupiny před acylací alespoň jedné α-aminoskupiny. Obecně vede selektivní acylace k poměru množství monoacylované ε-aminoskupiny k monoacylované α-aminoskupině většímu než přibližně 5, s výhodou je tento poměr větší než 10 a především větší než přibližně 50.
Výrazem „aminokyselina“ se míní nasycená nebo nenasycená mastná kyselina s 6 až 21 atomy uhlíku. Výrazem „aktivovaný ester aminokyseliny“ se míní mastná kyselina, aktivovaná obecně známým způsobem (například Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499, 1972 a Lapidot a kol., J. of Lipid Res. 8, str. 142 až 145, 1967. Výhodnými jsou nasycené mastné kyseliny a příkladně se uvádějí kyselina myristová (14 atomů uhlíku), pentadecylová (15 atomů uhlíku), palmitová (16 atomů uhlíku), heptadecylová (17 atomů uhlíku) a stearová kyselina (18 atomů uhlíku). Nejvýhodnější mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Jakožto aktivované estery mastné kyseliny se uvádějí deriváty činidel, jako je například hydroxybenzotriazid (HOBT), N-hydroxysukcinimid a jeho deriváty. Výhodným aktivovaným esterem je N-sukcinimidylpalmitát.
Výrazem „rozpustný“, se míní, že je dostatečné množství esteru v kapalné fázi k acylaci inzulínu, inzulínového analogu nebo proinzulinu. S výhodou obsahuje kapalná fáze přibližně 1 až 4 molámí ekvivalenty aktivovaného esteru na 1 mol inzulínu.
Výrazem „zásadité podmínky“, se míní, že je reakční prostředí zásadité. Reakce se musí provádět se všemi volnými aminoskupinami, v podstatě deprotonovanými. V případě vodného rozpouštědla nebo semivodného rozpouštědla se zásaditými podmínkami míní, že se reakce provádí za hodnoty pH větší než 9,0. V nevodném organickém rozpouštědle se reakce provádí v přítomnosti zásady s ekvivalentem zásaditosti pKa větším nebo rovném 10,75 ve vodě.
Výrazem „zesítěný“, se míní vytvoření disulfidických můstků mezi cysteinovými zbytky. Vhodně zesítěný proinzulin, inzulín, nebo inzulínový analog obsahuje tři disulfidické můstky. První disulfidický můstek se vytváří mezi cysteinovými zbytky v poloze 6 a 11 A-řetězce. Druhý disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 7 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 20 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 19 B-řetězce.
Až dosud pracovníci v oboru acylovali selektivně ε-aminoskupinu za použití chránících skupin několikastupňovým procesem. Muranishi a Kiso (japonská zveřejněná přihláška vynálezu 1-254699) popsali pětistupňový způsob přípravy acylovaných derivátů inzulínu. Hashimoto a kol.
-4CZ 287731 B6 (Pharmaceutical Research 6, str. 171 až 176, 1989) popsali čtyřstupňový způsob přípravy N-palmitoylinzulinu. V obou případech se v těchto několikastupňových způsobech používá pMZ chránící skupiny.
Podle vynálezu se produkuje Νε-acylovaný proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog ve vysokém výtěžku jednostupňovým způsobem. Reakce umožňuje přípravu Νε-acylovaných proteinů bez použití skupin, chránících aminoskupinu. Acylace se provádí reakcí aktivovaného esteru mastné kyseliny s ε-aminoskupinou proteinu za mírně zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle. Za mírně kyselých podmínek nejsou všechny aminoskupiny deprotonovány, což vede k výrazně acylaci N-koncových aminoskupin. Ve vodném rozpouštědle nebo v semivodné rozpouštědlové směsi znamenají mírně alkalické podmínky, že se reakce provádí při hodnotě pH větší než 9,0. Protože k degradaci proteinů dochází při hodnotě pH nad 12, je hodnota pH reakční směsi s výhodou 9,5 až 11,5 a především 10,5. Měření hodnoty pH reakční směsi ve směsném organickém a vodném rozpouštědle se provádí tak, že se měří hodnota pH vodné fáze před smíšením.
Hodnoty pH v tabulce I dokládají vliv zásaditosti reakční směsi na selektivitu reakce. Hodnoty v tabulce I jsou získány s lidským inzulínem, acylovaným dvěma molámími ekvivalenty N-sukcinimidylpalmitátu v systému 50 % akrylonitrilu/voda.
Tabulka I
Vliv hodnoty pH na acylaci inzulínu (procenta jsou míněna hmotnostně)
Relativní množství produktu při
pH 8,2 pH 9,5 pH 10,2
Reakční produkty
lidský inzulín 85,2 % 12,5 % 1,6%
monoacylovaný Al a B1 8,1 % 0,3 % 0,4%
monoacylovaný B29 5,2% 70,2 % 79,6 %
bis acylovaný 0,7% 16,7 % 17,7 %
poměr monoacylovaného B29 k monoacylovanému Al a B1 0,64 234 199
Tabulka I dokládá, že acylace ε-aminoskupiny závisí na zásaditosti prostředí. Při hodnotě pH větší než 9,0 se při reakci selektivně acyluje ε-aminoskupina B29-lysinu.
V nevodném rozpouštědle se reakce provádí v přítomnosti zásady s ekvivalentem zásaditosti k hodnotě pHa větší nebo rovné 10,75 ve vodě k zajištění dostatečné deprotonizace alespoň jedné ε-aminoskupiny. To znamená, že zásada musí být alespoň tak silná jako triethylamin. S výhodou se jako zásady používá tetramethylguanidinu (TMG), diizopropylethylaminu nebo tetrabutylamoniumhydroxidu.
Volba polárního rozpouštědla závisí ve velké míře na rozpustnosti proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu a esteru mastné kyseliny. Nejvýhodněji má být rozpouštědlo plně organické. Jakožto příklady obecně přijatelných organických rozpouštědel se uvádějí dimethylsulfoxid a dimethylformamid. Jsou také použitelná vodná rozpouštědla a směsi vodných a organických rozpouštědel. Volba rozpouštědla je omezena toliko rozpustností reakčních složek. Výhodnými rozpouštědly a rozpouštědlovými systémy jsou dimethylsulfoxid; dimethylformamid; acetonitril a voda; izopropylalkohol, ethanol a voda; a ethanol, propanol a voda. Výhodným rozpouštědlem je acetonitril a voda; nejvýhodnějším rozpouštědlem je 50% acetonitril. Pracovníkovi v oboru je jasné, jakých jiných polárních rozpouštědel může použít.
-5CZ 287731 B6
Poměr reakčních složek nemá rozhodující význam. Obecně je výhodné, aby byl aktivovaný ester mastné kyseliny v molámím nadbytku. S výhodou se reakce provádí s 1 až 4 molámími ekvivalenty a především s 1 až 2 molámími ekvivalenty esteru. Pracovníkům v oboru je však jasné, že se při velmi vysokých koncentracích esteru ve významném množství budou produkovatbisacylované nebo triacylované produkty.
Rovněž teplota reakční směsi nemá rozhodující význam. Reakce se provádí při teplotě 0 až 40 °C a obecně je ukončena za 15 minut až 24 hodin.
Po acylaci se reakce ukončí a produkt se čistí o sobě známými způsoby, například reverzní fázovou nebo hydrofobní chromatografií. Pak se produkt izoluje o sobě známými způsoby, například vymražovacím sušením nebo krystal izací.
Proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog se může připravit jakýmkoliv známým způsobem přípravy peptidu včetně klasických způsobů (v roztoku), způsobů s pevnou fází, semisyntetickými způsoby a nejnověji rekombinantními DNA způsoby. Například Chance akol. (americká přihláška vynálezu číslo 07(388201), evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo ΕΡ0 383472, EP 0 214826), Belagaje a kol. (americký patentový spis číslo 5 304473), popisují způsoby přípravy různých proinzulinů a inzulínových analogů. Řetězce A a B inzulínových analogů podle vynálezu se také mohou připravovat rekombinantními DNA technikami za použití proinzulinovité prekurzorové molekuly (Frank a kol., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proč. Seventh Am. Pept. Symp. vyd. D. Rich a E. Gross, 1981).
Následující příklady praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak jej však neomezují. Procenta a díly jsou míněny hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Acylace inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu
Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (71,9 mg) se rozpustí v 6,58 ml dimethylsulfoxidu. Roztok se míchá při teplotě místnosti tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 20 mg pevného aktivovaného esteru do 2 ml dimethylsulfoxidu a intenzivním mícháním až do dokonalého rozpuštění na pohled. V této chvíli se přidá 1,1,3-3-tetramethylguanidin (26,8 μΐ) do 5 ml BHI roztoku, načež se přidá dimethylsulfoxid (94,4 ml) a předem připravený roztok aktivovaného esteru (400 μΐ). Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 60 minut. Po 15 minutách se odebere vzorek, zředí se 20násobně IN kyselinou octovou a analyzuje se chromatografií HPLC. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství Β29-Νεpalmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 67,1 %.
Příklad 2
Acylace inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody
Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (199,5 g) se rozpustí ve 20 litrech 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Odebere se vzorek výchozí látky a naměřená absorbance při 276 nm je 10,55. Připraví
-6CZ 287731 B6 se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 24 g pevného aktivovaného esteru do 2,4 1 acetonitrilu, předehřátého na teplotu přibližně 50 °C a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku BHI nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného. Do roztoku BHI s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (18 litrů). Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 110 minut. Reakce se ukončí přidáním vody (123 1) a nastavením hodnoty pH získaného zředěného roztoku na 2,01 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29-Ne-palmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 73 % teorie.
Příklad 3
Acylace Lys ' Pro -inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody
Krystaly LysB28ProB29-inzulinu (2,22 g) se rozpustí ve 100 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 270 mg pevného aktivovaného esteru do 27 ml acetonitrilu, předehřátého na teplotu přibližně 50 °C a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě 4 °C po dobu 15 minut. Do předem připraveného roztoku aktivovaného esteru s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (73 ml). Směs se nechá reagovat při teplotě 4 °C po dobu 85 minut. Reakce se ukončí přidáním IN kyseliny octové (600 ml), přičemž se hodnota pH upraví na 2,85. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B28-Ne-palnutoyl Lys “ Pro ' -inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím LysB28ProB29-inzulinu, je 72,5 % teorie.
Příklad 4
Acylace BHI za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody
Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (3 g) se rozpustí ve 300 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se popřípadě znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 400 mg pevného aktivovaného esteru do 40 ml acetonitrilu a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku krystalů BHI nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného. Do roztoku BHI s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (240 ml) a předem připravený roztok aktivovaného esteru. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 90 minut. Reakce se ukončí přidáním vody (180 ml) a nastavením hodnoty pH získaného zředěného roztoku na 2,01 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29-Ne-palmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 75,7 % teorie.
Příklad 5
Acylace proinzulinu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody
Vodný roztok lidského proinzulinu (HPI) (28,2 mg/ml) se zředí 50 mM roztokem kyseliny borité na konečný objem 100 ml při obsahu HPI 16,2 mg/ml. Současně se připraví roztok aktivovaného
-7CZ 287731 B6 esteru rozpuštěním 150 mg N-sukcinimidylpalmitátu v 15 ml acetonitrilu (ACN) za rychlého míchání. Hodnota pH roztoku HPI se nastaví na 10,2 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a přidá se 88 ml acetonitrilu. Reakce se iniciuje přidáním 12 ml roztoku aktivovaného esteru (dvojnásobný molámí nadbytek se zřetelem na HPI). Konečný objem reakční směsi je 200 ml, při obsahu HPI 8 mg/ml v 50% vodném ACN. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 60 minut. Reakce se ukončí přidáním ekvivalentního objemu (200 ml) 50 mM glycinu o hodnotě pH 10,0.
Přesný poměr ε-amino acylovaného produktu k α-amino acylovanému produktu se nevypočítává, přičemž suma všech ε-amino acylovaných produktů v chromatogramu je vypočtena jako 87 až 90 % celkové plochy, zatímco suma všech příbuzných látek (zahrnujících podle předpokladu veškeré α-amino acylované produkty) je vypočtena jako < 7 % celkové plochy pro každý daný časový bod.
Příklad 6
Acylace ArgB31ArgB32-inzulinu za použití hexanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru
Lidský ArgB31ArgB32-inzulin (1,3 mg) se rozpustí ve 200 μΐ 200 mM 3-[cyklohexylamino]-lpropansulfonové kyseliny jakožto pufru o hodnotě pH 10,4. Hexanoyl-N-hydroxysukcinimidester (0,3 pmol) se rozpustí v Ν,Ν-dimethylformamidu a přidá se za míchání do roztoku. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně čtyř hodin a reakce se ukončí nastavením hodnoty pH na přibližně 2,5 přidáním IN kyseliny chlorovodíkové. Gelovité částice se odstraní vedením směsi filtrem s 0,45 mikrometrovými otvory před analýzou chromatografií HPLC. Oddělení žádaného produktu se dosáhne na C4 reverzním fázovém analytickém HPLC sloupci. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29Νε-hexanoyl ArgB31ArgB32-inzulinu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím ArgB31ArgB 2-inzulinu, je 69,4 % teorie.
Příklad 7
Acylace LeuB26-lidského inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu
Lidský LeuB26-inzulin (1,0 mg) se rozpustí v 1 ml směsi 95 % dimethylsulfoxidu (DMSO), 5 % triethylaminu (TEA). Přidá se N-sukcinimidylpalmitát (0,7 pmol), rozpuštěný v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF), za míchání. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 90 minut. Reakce se ukončí zředěním na 0,2 mg(ml 0,lN kyselinou chlorovodíkovou. Gelovité částice se odstraní vedením směsi filtrem s 0,45 mikrometrovými otvory před analýzou chromatografií HPLC. Oddělení žádaného produktu se dosáhne na C4 reverzním fázovém analytickém HPLC sloupci. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství Νεpalmitoyl Leu -lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množství Leu inzulínu, je 36,4 % teorie.
Příklad 8
Acylace lidského inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu
Roztok inzulínu se připraví rozpuštěním krystalů biosyntetického lidského inzulínu (1 g, 0,17 mmol) dokonale ve 20 ml dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti. Současně se připraví roztok aktivovaného esteru rozpuštěním N-sukcinimidylpalmitátu (0,0817 g, 0,23 mmol) ve 3 ml dimethylsulfoxidu o teplotě 50 °C. Do intenzivně míchaného roztoku inzulínu se přidá 1,1,3-3tetramethylguanidin (0,432 ml, 3,4 mmol) a veškerý roztok aktivního esteru. Po 30 minutách se
-8CZ 287731 B6 reakce ukončí 120 ml 0,05M kyseliny chlorovodíkové, předem ochlazené na teplotu 0 °C. Hodnota pH reakční směsi je přibližně 1,8. Analýza reakční směsi reverzní fázovou chromatografií HPLC dokládá, že obsah B29-Ne-palmitoylinzulinu je 72,2 % se zřetelem na protein a představuje 95 % monoacylovaného inzulínu jako celku.
Veškerá reakční směs se vnese na preparativní reverzní fázový sloupec Vydac C4 (5 x 25 ml), předem vyvážený rozpouštědlovou směsí, obsahující 0,1% trifluoroctové kyseliny, 20% akrylonitrilu ve vodě. Po vnesení se sloupec nejdříve promyje 500 ml téhož rozpouštědla a vyvine se za rychlosti průtoku 4ml/min rozpouštědlovým systémem, obsahujícím 0,1% trifluoroctové kyseliny, acetonitril a vodu, přičemž koncentrace acetonitrilu vzrůstá z 20 na 80 % při obsahu 9 litrů. B29-Ne-Palmitoylinzulin se eluuje tímto rozpouštědlovým systémem, obsahujícím přibližně 53 % acetonitrilu. Po odstranění rozpouštědla lyofilizací je výtěžek Νεpalmitoylinzulinu 414 mg (0,0684 mmol) nebo 40,2 %, vztaženo na výchozí látku.
Příklad 9
B28 B29
Acylace Lys Pro -lidského inzulínu za použití 1-oktanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru
Krystaly LysB28 ProB29-lidského inzulínu (KPB) (2 g) se rozpustí ve 200 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (1-oktanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru) přidáním 175 mg pevného aktivovaného esteru do 25,62 ml acetonitrilu a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku KPB nastaví na přibližně 10,4 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě okolí po dobu 5 minut. Acetonitril (176 ml) se přidá do roztoku KPB s předem upravenou hodnotou pH, načež se přidá předem připravený roztok aktivovaného esteru. Směs se nechá reagovat při teplotě okolí po dobu 90 minut. Reakce se ukončí přidáním 5,5 ml 10% kyseliny chlorovodíkové (objemově 2,75%) a tří objemů (1 200 ml) studené H2O, přičemž konečná hodnota pH je 2,70. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství LysB29(C8) KPB v reakční směsi, dělené počátečním množstvím HBI, je 75,5 % teorie. Tento roztok se rozdělí na dva 800 ml podíly pro čištění hydrofibní chromatografií (SP20SS). Po sloupcové chromatografií se provádí ultrafiltrace a lyofilizace.
Hodnoty v tabulce II dokládají selektivní acylaci inzulínu, inzulínových analogů a proinzulinu. Pokusy se prováděly při teplotě místnosti s H-hydroxysukcinimidestery mastné kyseliny. V následující tabulce znamená zkratka TMG tetramethylguanidin a TEA triethylamin. DN znamená, že hodnoty nejsou dostupné.
Průmyslová využitelnost
Jednostupňový způsob selektivní acylace ε-aminoskupin proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, majícího volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, při kterém se nechává reagovat ε-aminoskupina s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, vyznačující se tím, že se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za bazických podmínek v polárním rozpouštědle.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo Lys Pro -lidský inzulín.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny s 6 až 18 atomy uhlíku.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny se 14 až 18 atomy uhlíku.
  5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester palmitové kyseliny.
  6. 6. Způsob selektivní acylace proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny v semivodném rozpouštědle při hodnotě pH 9,0 až 12,0.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo LysB28ProB29-lidský inzulín.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že hodnota pH je od 9,5 do 10,5.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že semivodným rozpouštědlem je směs acetonitrilu a vody.
  10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je 50% acetonitril.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že esterem mastné kyseliny je Nsukcinimidylpalmitát, N-sukcinimidyloktanoát nebo N-sukcinimidylmyristát.
CZ19971456A 1994-11-17 1995-11-14 Protein selective acylation process CZ287731B6 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/341,231 US5646242A (en) 1994-11-17 1994-11-17 Selective acylation of epsilon-amino groups
PCT/US1995/014872 WO1996015803A1 (en) 1994-11-17 1995-11-14 SELECTIVE ACYLATION OF ε-AMINO GROUPS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ145697A3 CZ145697A3 (en) 1997-12-17
CZ287731B6 true CZ287731B6 (en) 2001-01-17

Family

ID=23336740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19971456A CZ287731B6 (en) 1994-11-17 1995-11-14 Protein selective acylation process

Country Status (28)

Country Link
US (2) US5646242A (cs)
EP (2) EP0712862B1 (cs)
JP (1) JP4312828B2 (cs)
CN (1) CN1171742A (cs)
AR (1) AR003915A1 (cs)
AT (1) ATE328902T1 (cs)
AU (2) AU691066B2 (cs)
BR (1) BR9509652A (cs)
CA (1) CA2205061A1 (cs)
CO (1) CO4520285A1 (cs)
CZ (1) CZ287731B6 (cs)
DE (1) DE69535031T2 (cs)
DK (1) DK0712862T3 (cs)
ES (1) ES2264124T3 (cs)
HK (1) HK1014007A1 (cs)
HU (2) HU9903007D0 (cs)
IL (1) IL115972A (cs)
IN (1) IN179820B (cs)
NO (1) NO972185L (cs)
NZ (1) NZ297256A (cs)
PL (1) PL320556A1 (cs)
PT (1) PT712862E (cs)
RU (1) RU2155773C2 (cs)
SI (1) SI0712862T1 (cs)
TR (1) TR199501421A2 (cs)
WO (1) WO1996015803A1 (cs)
YU (1) YU71495A (cs)
ZA (1) ZA959680B (cs)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9316895D0 (en) 1993-08-13 1993-09-29 Guy S And St Thomas Hospitals Hepatoselective insulin analogues
US6869930B1 (en) * 1993-09-17 2005-03-22 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US6251856B1 (en) 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US5631347A (en) * 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
US6451970B1 (en) * 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
US5905140A (en) * 1996-07-11 1999-05-18 Novo Nordisk A/S, Novo Alle Selective acylation method
EP0938502B1 (en) * 1996-07-11 2004-10-06 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
KR20010024556A (ko) * 1997-10-24 2001-03-26 피터 지. 스트링거 불용성 인슐린 조성물
US6444641B1 (en) 1997-10-24 2002-09-03 Eli Lilly Company Fatty acid-acylated insulin analogs
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US6451974B1 (en) 1999-03-17 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Method of acylating peptides and novel acylating agents
US7181349B1 (en) 1999-05-27 2007-02-20 Cecil Yip Identification of compounds for modulating dimeric receptors
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
AU2001254621A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-20 K.U. Leuven R And D Critical illness neuropathy
US7316999B2 (en) 2000-06-02 2008-01-08 Novo Nordisk A/S Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
WO2002051428A1 (fr) * 2000-12-25 2002-07-04 Shiseido Company, Ltd. Composition de parfum stimulant le systeme sympathique
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7595172B2 (en) * 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
JP2005503141A (ja) * 2001-07-24 2005-02-03 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ アシル化ポリペプチドを作出するための方法
RU2004105155A (ru) * 2001-07-24 2005-04-20 Ново Нордиск А/С (DK) Способ получения ацилированных полипептидов
US20030082671A1 (en) * 2001-07-24 2003-05-01 Thomas Hoeg-Jensen Method for making acylated polypeptides
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6913903B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
ATE446971T1 (de) 2001-09-07 2009-11-15 Biocon Ltd Verfahren zur synthese von insulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und proinsulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und verfahren zu deren synthese
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030199445A1 (en) * 2002-02-07 2003-10-23 Knudsen Lotte Bjerre Use of GLP-1 compound for treatment of critically ill patients
US7273921B2 (en) 2002-09-25 2007-09-25 Novo Nordisk A/S Method for producing acylated peptides
RU2345062C2 (ru) * 2002-09-25 2009-01-27 Ново Нордиск А/С Способ ацилирования пептидов
WO2005012347A2 (en) * 2003-08-05 2005-02-10 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
WO2005047508A1 (en) 2003-11-14 2005-05-26 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
UA91512C2 (ru) * 2004-07-19 2010-08-10 Биокон Лимитед Коньюгати олигомеров инсулина, их композиция (варианты) и применение
JP5366546B2 (ja) 2005-08-16 2013-12-11 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
JP4808785B2 (ja) * 2005-12-28 2011-11-02 ノボ・ノルデイスク・エー／エス インスリン組成物および組成物の製造方法
ES2387955T3 (es) * 2006-02-27 2012-10-04 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
US8927015B2 (en) * 2006-04-12 2015-01-06 Emisphere Technologies, Inc. Formulations for delivering insulin
ES2542146T3 (es) 2006-07-31 2015-07-31 Novo Nordisk A/S Insulinas extendidas PEGiladas.
MX2009002999A (es) 2006-09-22 2009-04-01 Novo Nordisk As Analogos de insulina resistentes a proteasa.
WO2008037735A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides
EP2152245B1 (en) 2007-04-30 2015-12-02 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
US9034818B2 (en) 2007-06-13 2015-05-19 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations comprising an insulin derivative
UA114700C2 (uk) 2007-10-16 2017-07-25 Біокон Лімітед Тверда фармацевтична форма для перорального застосування та процес її виготовлення
WO2009112583A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
AU2009226910B2 (en) 2008-03-18 2014-02-06 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
ES2561208T3 (es) 2008-09-12 2016-02-25 Novo Nordisk A/S Método de acilación de un péptido o una proteína
AU2009309623B9 (en) * 2008-10-30 2014-10-02 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
UA102888C2 (ru) * 2009-02-20 2013-08-27 Іпсен Фарма С.А.С. Аналоги нейропептида y с заменой на пролин в положении 34
AU2010323117B2 (en) 2009-11-25 2015-09-03 Capsugel Belgium Nv Mucosal delivery compositions comprising a peptide complexed with a crown comppound and/or a counter ion
JP6049625B2 (ja) 2010-10-27 2016-12-21 ノヴォ ノルディスク アー／エス 様々な注射間隔を用いて施されるインスリン注射を使用する、真性糖尿病の治療
MX2014012096A (es) 2012-04-11 2014-11-21 Novo Nordisk As Formulaciones de insulina.
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
BR112016007166A2 (pt) 2013-10-07 2017-09-12 Novo Nordisk As derivado de um análogo de insulina
FR3013049B1 (fr) 2013-11-14 2015-11-13 You-Ping Chan Analogue de l'insuline glargine
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
CN104558097A (zh) * 2014-05-20 2015-04-29 广东东阳光药业有限公司 肽的酰化方法
CN105111305B (zh) * 2015-10-10 2018-12-14 山东阿华生物药业有限公司 酰化胰岛素的色谱纯化方法
CN105440125B (zh) * 2015-11-25 2019-09-24 华润昂德生物药业有限公司 地特胰岛素或其类似物的制备方法
EP3452587B1 (en) 2016-05-05 2021-09-08 Codexis, Inc. Penicillin-g acylases
EP3534962B1 (en) 2016-11-07 2020-08-19 Novo Nordisk A/S Dchbs-active esters of peg compounds and their use
PL3821905T3 (pl) 2016-12-16 2022-12-27 Novo Nordisk A/S Kompozycje farmaceutyczne zawierające insulinę
CN107602437A (zh) * 2017-08-09 2018-01-19 上海昂德生物科技有限公司 活化酯的制备方法
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
CN116874585B (zh) * 2023-09-06 2023-12-15 杭州湃肽生化科技有限公司 一种地特胰岛素的合成方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1468831A (fr) * 1965-10-05 1967-02-10 Roussel Uclaf Procédé de préparation de nouveaux composés polypeptidiques et produits en résultant
DE1902865A1 (de) * 1968-02-01 1969-09-11 American Home Prod Substituierte Insulin-Derivate,Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen
US3591574A (en) * 1968-05-29 1971-07-06 American Home Prod Tri-n-phenylglycyl derivatives of insulin
US3528960A (en) * 1968-10-07 1970-09-15 Lilly Co Eli N-carboxyaroyl insulins
US3823125A (en) * 1969-10-14 1974-07-09 American Home Prod N-aminoacyl-substituted insulins
US3752798A (en) * 1969-12-02 1973-08-14 G Amird Tris-na1,nb1,nepsilonb29 - (3-x-3-oxo - 1-y-prop-1-en-1-yl)(ndelta-(4-z-6-r-pyrimidin - 2 - yl) ornithine b22)-insulins and their preparation
US3950517A (en) * 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
US3869437A (en) * 1970-05-08 1975-03-04 Nat Res Dev Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin
GB1381273A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
GB1381274A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3864325A (en) * 1971-11-18 1975-02-04 Nat Res Dev (N{HU Al{b , N{HU Bl{b , N{HU B29{B , carbamoyl)-(O{HU A14{B , O{HU B16{B , O{HU B26{B aryl) insulin derivatives
BE791949A (fr) * 1971-11-27 1973-05-28 Schering Ag Derives d'insuline, leur preparation et leur utilisation
US3755569A (en) * 1972-07-25 1973-08-28 American Home Prod Acyl substituted insulins
DE2252157C3 (de) * 1972-10-25 1976-03-18 Hoechst Ag Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten
NL7314766A (cs) * 1972-10-31 1974-05-02
DE2253327A1 (de) * 1972-10-31 1974-05-09 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
DE2428412A1 (de) * 1974-06-12 1976-01-15 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
DE2439296A1 (de) * 1974-08-16 1976-02-26 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
GB1492997A (en) * 1976-07-21 1977-11-23 Nat Res Dev Insulin derivatives
US4218539A (en) * 1978-03-24 1980-08-19 Weltman Joel K Enzyme conjugates and method of preparation and use
PH25772A (en) * 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
PT93057B (pt) * 1989-02-09 1995-12-29 Lilly Co Eli Processo para a preparacao de analogos da insulina
AU8091091A (en) * 1990-07-26 1992-02-18 University Of Iowa Research Foundation, The Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule
US5304473A (en) * 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
ATE204882T1 (de) * 1993-09-17 2001-09-15 Novo Nordisk As Acyliertes insulin
DE4437604A1 (de) * 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
US5905140A (en) 1996-07-11 1999-05-18 Novo Nordisk A/S, Novo Alle Selective acylation method

Also Published As

Publication number Publication date
AU4237296A (en) 1996-06-17
AU691066B2 (en) 1998-05-07
BR9509652A (pt) 1997-09-16
NZ297256A (en) 2000-01-28
ZA959680B (en) 1997-05-14
JP4312828B2 (ja) 2009-08-12
EP0712862B1 (en) 2006-06-07
EP0712862A3 (en) 1998-03-04
US5646242A (en) 1997-07-08
MX9703506A (es) 1997-07-31
IN179820B (cs) 1997-12-13
PT712862E (pt) 2006-08-31
AR003915A1 (es) 1998-09-30
HUT77737A (hu) 1998-07-28
HU217585B (hu) 2000-02-28
IL115972A0 (en) 1996-01-31
DK0712862T3 (da) 2006-09-25
YU71495A (sh) 1998-09-18
SI0712862T1 (sl) 2006-10-31
CA2205061A1 (en) 1996-05-30
ATE328902T1 (de) 2006-06-15
HU9903007D0 (en) 1999-11-29
TR199501421A2 (tr) 1996-06-21
CN1171742A (zh) 1998-01-28
NO972185D0 (no) 1997-05-13
DE69535031D1 (de) 2006-07-20
HK1014007A1 (en) 1999-09-17
USRE37971E1 (en) 2003-01-28
WO1996015803A1 (en) 1996-05-30
EP1227107A1 (en) 2002-07-31
JPH10509176A (ja) 1998-09-08
ES2264124T3 (es) 2006-12-16
AU7885498A (en) 1998-11-05
CZ145697A3 (en) 1997-12-17
DE69535031T2 (de) 2006-12-28
NO972185L (no) 1997-05-13
CO4520285A1 (es) 1997-10-15
RU2155773C2 (ru) 2000-09-10
EP0712862A2 (en) 1996-05-22
AU720820B2 (en) 2000-06-15
IL115972A (en) 2000-09-28
PL320556A1 (en) 1997-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ287731B6 (en) Protein selective acylation process
EP0747390B1 (en) Reducing gelation of a fatty acid acylated protein using a citrate buffer
RU2171261C2 (ru) Липофильные производные пептидных гормонов
RU2164520C2 (ru) Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета
US6869930B1 (en) Acylated insulin
AU711282B2 (en) Acylated insulin analogs
US5986048A (en) Process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges
US20020045731A1 (en) Peptide derivatives
CS259536B2 (en) Method of insulin&#39;s new derivatives production
CZ283356B6 (cs) Způsob čištění inzulinu a/nebo inzulinových derivátů chromatografií
US20040242460A1 (en) Stabilized acylated insulin formulations
MXPA97003506A (en) Selective acilacion of epsilon-am groups
Brandenburg Insulin-structure, function, design
Bullesbach et al. Preparation and properties of. alpha.-and. epsilon.-amino-protected porcine relaxin derivatives
Brandenburg et al. Crosslinked insulins: preparation, properties, and applications
KR920005659B1 (ko) 인슐린 유도체의 제조방법
MXPA97003508A (en) Insulin analogs axila
Brandenburg et al. PREPARATION OF INSULINS WITH MODIFIED N-TERMINALS BY SEMI-SYNTHESIS AND CHEMICAL MODIFICATION OF THE NATIVE HORMONE

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19951114