CZ287731B6

CZ287731B6 - Protein selective acylation process

Info

Publication number: CZ287731B6
Application number: CZ19971456A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey Clayton Baker; Victor John Chen; Jose Michael Hanquier; Aidas Vladas Kriauciunas; Brian Allen Moser; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 2001-01-17
Also published as: AR003915A1; DE69535031D1; WO1996015803A1; NO972185L; JPH10509176A; NZ297256A; RU2155773C2; AU720820B2; USRE37971E1; HK1014007A1; DE69535031T2; JP4312828B2; EP0712862A2; ZA959680B; HU9903007D0; EP1227107A1; EP0712862A3; CN1171742A; BR9509652A; IL115972A0

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou.

Dosavadní stav techniky

Acylace aminoskupin je jedním z nejběžnějších opatření, používaných k chemické modifikaci proteinů. Obecně jsou způsoby acylace popsány v Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499 (1972), a zahrnují použití aktivovaných esterů, halogenidů nebo anhydridů kyselin. Použití aktivovaných esterů, zvláště N-hydroxysukcinimidesterů mastných kyselin, je zvláště vhodným způsobem acylace volné aminokyseliny mastnou kyselinou. Lapidot a kol. (Lapidot a kol. J. of Lipid Res., 8, str. 142 až 145 (1967)) popisuje způsob přípravy N-lauroylglycinu, N-lauroyl-Lserinu a N-lauroyl-L-glutamové kyseliny.

Dřívější studie selektivní acylace aminoskupin inzulínu popsal Lindsay a kol. v Biochem. J., 121, str. 737 až 745 (1971). Landsay a kol. popisuje reaktivitu inzulínu s N-sukcinimidylacetátem při nízké koncentraci a téměř neutrální hodnotě pH, přičemž se produkují dva monosubstituované produkty, Phe^B1-acetylinzulin a Gly^A1-acetylinzulin. Při hodnotě pH 8,5 se množství produkovaného Phe^B1-acetylinzulinu snižuje a produkuje se také Lys^B29-acetylinzulin. Lindsay a kol. usuzují, že při hodnotě pH 6,9 je sled reaktivity glycin (Al) = fenylalanin (Bl) » lysin (B29) a při hodnotě pH 8,5 glycin (Al) > fenylalanin (Bl) ~ lysin (B29). Id.

Lindsay a kol. (americký patentový spis číslo 3 869437) popisují acylaci B¹ aminokyseliny s acylovou skupinou, obsahující až 7 atomů uhlíku, a popřípadě s blokováním A¹ a/nebo B²⁹aminoskupiny acylovou skupinou s až 4 atomy uhlíku. Jakožto obzvláště výhodná acylační činidla se popisují N-hydroxysukcinimidestery. K získání maximálního výtěžku inzulínu, acylovaného na Β'-aminoskupině, je podíl acylačního činidla poměrně nízký (jeden až ne více než dva molámí ekvivalenty acylačního činidla). Kromě toho maximální výtěžek monosubstituovaného B’-produktu se získá při hodnotě pH 7 nebo blízko této hodnoty. Při hodnotě pH 8,5 až 9,0 klesá výtěžek žádaného B'-produktu značně ve prospěch přídavné substituce v poloze A a B .

D. G. Smyth (americký patentový spis číslo 3 868356) a D. G. Smyth a kol. (americký patentový spis číslo 3 868357) popisují N-acylované, O-substituované deriváty inzulínu, ve kterých alespoň jedna aminoskupina A¹, B¹ nebo C²⁹ se převádí na blokovanou aminoskupinu. Acylace se provádí s poměrně malým nadbytkem acylačního činidla, například s 2 nebo 3 mol na aminoskupinu při neutrální reakci nebo při mírně alkalické hodnotě pH, například při hodnotě pH 7 až 8. Reakce vede k velmi vysokým výtěžkům za vytvoření disubstituovaného derivátu, vznikajícího reakcí Α'-aminoskupiny a Β'-aminoskupiny. V přítomnosti nadbytku acylačního činidla, například 10 molámího množství, probíhá reakce přídavně na B²⁹-aminoskupině za vzniku trisubstituovaného derivátu.

Pro selektivní acylaci inzulínu popisuje Muranishi a Kiso (japonská zveřejněná přihláška vynálezu 1-254699) pětistupňový způsob přípravy derivátů inzulínu s mastnou kyselinou. V prvním stupni se připravuje aktivovaný ester mastné kyseliny, ve druhém stupni se chrání aminoskupiny inzulínu p-methoxybenzoxykarbonylazidem (pMZ), ve třetím stupni se inzulinpMZ nechává reagovat s esterem mastné kyseliny, ve čtvrtém stupni se z acylovaného inzulínu odstraňují chránící skupiny, v pátém stupni se acylovaný inzulín izoluje a čistí. Nejpozoruhodnější je, že se selektivní acylace jedné aminoskupiny dosahuje toliko použitím

-1 CZ 287731 B6 p-methoxybenzoxykarbonylazidem (pMZ) blokovaných skupin k chránění ostatních aminoskupin. Použitím tohoto způsobu Muranishi a Kiso připravili tyto sloučeniny: Lys^B21~ palmitoylinzulin (ε-aminoskupina je acylována), Phe^B1-palmitoylinzulin (N-koncová a-aminoskupina B řetězce je acylována) a Phe^B1-palmitoylinzulin (jak ε-aminoskupina, tak N-koncová 5 a -aminoskupina B řetězce je acylována).

Podobně Hashimoto a kol. v Pharmaceutical Research 6, str. 171 až 176 (1989), popisují čtyřstupňový způsob přípravy N-palmitoylinzulinu. Syntéza zahrnuje chránění N-koncového Α’-glycinu a ε-aminoskupiny B^B29-lysinu p-methoxybenzoxykarbonylazidem a odstranění ío chránících skupin. Za mírných podmínek se připravují dva hlavní acylované produkty, B^monopalmitoylinzulin a B¹, B²⁹-dipalmitoylinzulin.

Dosud se tedy prováděla selektivní acylace B²⁹-Ne-aminoskupiny inzulínu za chránění a-aminoskupin a za následného odstraňování těchto chránících skupin. Vynález odstraňuje nevýhodnou 15 nutnost zavádění a odstraňování chránících skupin.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinu, který spočívá v tom, že se nechává reagovat εaminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za bázických podmínek v polárním rozpouštědle.

Podle výhodného provedení tohoto způsobu proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín.

Podle jiného výhodného provedení způsobu aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydro30 xysukcinimidester mastné kyseliny s 6 až 18 atomy uhlíku, nebo N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny se 14 až 18 atomy uhlíku. Obzvláště výhodné je, pokud aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester palmitové kyseliny.

Výhodné provedení způsobu podle tohoto vynálezu spočívá ve způsobu selektivní acylace 35 proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, kdy se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny v semivodném rozpouštědle při hodnotě pH 9,0 až 12,0.

Je obzvláště výhodné, pokud pitom proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín, a/nebo pokud hodnota pH je od 9,5 do 10,5.

Podle jiného výhodného provedení semivodným rozpouštědlem je směs acetonitrilu a vody, účelně 50% acetonitril.

Při výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu esterem mastné kyseliny je N-sukcinimidylpalmitát, N-sukcinimidyloktanoát nebo N-sukcinimidylmyristát.

Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu.

Vynález tedy poskytuje jednostupňový způsob selektivní acylace ε-aminoskupin proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Je naprosto překvapující, že vynález umožňuje selektivně acylovat ve vysokém výtěžku proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog, obsahující volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou tím, že se nechává reagovat

-2CZ 287731 B6 ε-aminokyselina s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle.

S překvapením se zjistilo, že způsobem podle vynálezu lze jednostupňově acylovat ε-aminoskupiny proizulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Je zcela překvapivé, že způsob podle vynálezu umožňuje acylaci ε-aminoskupiny jednostupňově a ve vysokém výtěžku. Při způsobu podle vynálezu odpadá potřeba zavádět a následně odstraňovat chránící skupiny na další aminoskupiny proteinu. Vynález tedy umožňuje účinněji a levněji připravovat na ε-aminoskupině acylované inzulínové deriváty.

Všechny zde používané zkratky aminokyselin jsou v souhlase s ustanovením 37 C.F.R. § 1.822(B) (2) Úřadu pro patenty a obchodní známky Spojených států amerických.

Jak shora uvedeno, týká se vynález vysoce selektivního jednostupňového způsobu acylace ε-aminoskupiny proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu. Vynález popisuje podmínky pro zvýhodnění acylace ε-aminoskupiny před acylaci α-aminoskupiny. Obecně se monoacylovaná α-aminoskupina vytváří v méně než 5% výtěžku.

Výrazem „inzulín“ se vždy míní lidský inzulín, vepřový inzulín, nebo hovězí inzulín. Inzulín má tři volné aminoskupiny: B*-fenylalanin, Α'-glycin a B²⁹-lysin. Volné aminoskupiny v poloze A¹a B¹ jsou α-aminoskupiny. Volná aminoskupina v poloze B²⁹ je ε-aminoskupina.

Výrazem „proinzulin“ se míní zesítěný protein obecného vzorce

B-C-A kde znamená

A A řetězec inzulínu nebo jeho funkčního derivátu,

B B řetězec inzulínu nebo jeho funkčního derivátu, mající ε-aminoskupinu, a

C spojující peptid proinzulinu.

S výhodou je proinzulinem A řetězec lidského inzulínu, B řetězec lidského inzulínu a C je přírodní spojující peptid. Jestliže má proinzulin přírodní sekvenci, má proinzulin tři volné aminokyseliny Β'-fenylalanin (α-aminoskupina), C^-lysin (ε-aminoskupina) a B²⁹-lysin (ε-aminoskupina).

Výrazem „inzulínový analog“ se míní zesítěný protein obecného vzorce

A-B kde znamená

A funkční derivát řetězce inzulínu A,

B funkční derivát řetězce inuzlinu B, mající ε-aminoskupinu.

Výhodné inzulínové analogy zahrnují inzulín, přičemž:

aminokyselinový zbytek v poloze B²⁸ je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala;

aminokyselinový zbytek v poloze B²⁹ je lys nebo Pro;

-3CZ 287731 B6 aminokyselinový zbytek v poloze B¹⁰ je His nebo Asp;

aminokyselinový zbytek v poloze B¹ je Phe, Asp, nebo je vypuštěn samotný nebo v kombinaci s vypuštěním zbytku v poloze B“;

aminokyselinový zbytek v poloze B³⁰ je Thr, Ala, neboje vypuštěn, a

28 aminokyselinový zbytek v poloze B je Ser nebo Asp, za podmínky, že buď v poloze B nebo vpolozeB²⁹jeLys.

Podle standardní biochemické terminologie, známé pracovníkům v oboru, jsou výhodnými analogy inzulínu Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín (B²⁸ je Lys, B²⁹ je Pro); Asp^B28-lidský inzulín (B²⁸je Asp); Asp^B1-lidský inzulín; Arg^B31' ^B32—lidský inzulín; Asp^B10-lidský inzulín; Arg^A0-lidský inzulín; Asp ’Glu^B13-lidský inzulín; Ala^B26-lidský inzulín; des B³⁰-lidský inzulín; a Gly^A21lidský inzulín.

Výrazem „acylace“ se míní zavádění alespoň jedné acylové skupiny kovalentně vázané na aminoskupiny proteinu.

Výrazem „selektivní acylace“ se míní přednostní acylace alespoň jedné ε-aminoskupiny před acylací alespoň jedné α-aminoskupiny. Obecně vede selektivní acylace k poměru množství monoacylované ε-aminoskupiny k monoacylované α-aminoskupině většímu než přibližně 5, s výhodou je tento poměr větší než 10 a především větší než přibližně 50.

Výrazem „aminokyselina“ se míní nasycená nebo nenasycená mastná kyselina s 6 až 21 atomy uhlíku. Výrazem „aktivovaný ester aminokyseliny“ se míní mastná kyselina, aktivovaná obecně známým způsobem (například Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499, 1972 a Lapidot a kol., J. of Lipid Res. 8, str. 142 až 145, 1967. Výhodnými jsou nasycené mastné kyseliny a příkladně se uvádějí kyselina myristová (14 atomů uhlíku), pentadecylová (15 atomů uhlíku), palmitová (16 atomů uhlíku), heptadecylová (17 atomů uhlíku) a stearová kyselina (18 atomů uhlíku). Nejvýhodnější mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Jakožto aktivované estery mastné kyseliny se uvádějí deriváty činidel, jako je například hydroxybenzotriazid (HOBT), N-hydroxysukcinimid a jeho deriváty. Výhodným aktivovaným esterem je N-sukcinimidylpalmitát.

Výrazem „rozpustný“, se míní, že je dostatečné množství esteru v kapalné fázi k acylaci inzulínu, inzulínového analogu nebo proinzulinu. S výhodou obsahuje kapalná fáze přibližně 1 až 4 molámí ekvivalenty aktivovaného esteru na 1 mol inzulínu.

Výrazem „zásadité podmínky“, se míní, že je reakční prostředí zásadité. Reakce se musí provádět se všemi volnými aminoskupinami, v podstatě deprotonovanými. V případě vodného rozpouštědla nebo semivodného rozpouštědla se zásaditými podmínkami míní, že se reakce provádí za hodnoty pH větší než 9,0. V nevodném organickém rozpouštědle se reakce provádí v přítomnosti zásady s ekvivalentem zásaditosti pK_a větším nebo rovném 10,75 ve vodě.

Výrazem „zesítěný“, se míní vytvoření disulfidických můstků mezi cysteinovými zbytky. Vhodně zesítěný proinzulin, inzulín, nebo inzulínový analog obsahuje tři disulfidické můstky. První disulfidický můstek se vytváří mezi cysteinovými zbytky v poloze 6 a 11 A-řetězce. Druhý disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 7 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 20 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 19 B-řetězce.

Až dosud pracovníci v oboru acylovali selektivně ε-aminoskupinu za použití chránících skupin několikastupňovým procesem. Muranishi a Kiso (japonská zveřejněná přihláška vynálezu 1-254699) popsali pětistupňový způsob přípravy acylovaných derivátů inzulínu. Hashimoto a kol.

-4CZ 287731 B6 (Pharmaceutical Research 6, str. 171 až 176, 1989) popsali čtyřstupňový způsob přípravy N-palmitoylinzulinu. V obou případech se v těchto několikastupňových způsobech používá pMZ chránící skupiny.

Podle vynálezu se produkuje Νε-acylovaný proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog ve vysokém výtěžku jednostupňovým způsobem. Reakce umožňuje přípravu Νε-acylovaných proteinů bez použití skupin, chránících aminoskupinu. Acylace se provádí reakcí aktivovaného esteru mastné kyseliny s ε-aminoskupinou proteinu za mírně zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle. Za mírně kyselých podmínek nejsou všechny aminoskupiny deprotonovány, což vede k výrazně acylaci N-koncových aminoskupin. Ve vodném rozpouštědle nebo v semivodné rozpouštědlové směsi znamenají mírně alkalické podmínky, že se reakce provádí při hodnotě pH větší než 9,0. Protože k degradaci proteinů dochází při hodnotě pH nad 12, je hodnota pH reakční směsi s výhodou 9,5 až 11,5 a především 10,5. Měření hodnoty pH reakční směsi ve směsném organickém a vodném rozpouštědle se provádí tak, že se měří hodnota pH vodné fáze před smíšením.

Hodnoty pH v tabulce I dokládají vliv zásaditosti reakční směsi na selektivitu reakce. Hodnoty v tabulce I jsou získány s lidským inzulínem, acylovaným dvěma molámími ekvivalenty N-sukcinimidylpalmitátu v systému 50 % akrylonitrilu/voda.

Tabulka I

Vliv hodnoty pH na acylaci inzulínu (procenta jsou míněna hmotnostně)

	Relativní množství produktu při
pH 8,2	pH 9,5	pH 10,2
Reakční produkty
lidský inzulín	85,2 %	12,5 %	1,6%
monoacylovaný Al a B1	8,1 %	0,3 %	0,4%
monoacylovaný B29	5,2%	70,2 %	79,6 %
bis acylovaný	0,7%	16,7 %	17,7 %

poměr monoacylovaného B29 k monoacylovanému Al a B1	0,64	234	199

Tabulka I dokládá, že acylace ε-aminoskupiny závisí na zásaditosti prostředí. Při hodnotě pH větší než 9,0 se při reakci selektivně acyluje ε-aminoskupina B29-lysinu.

V nevodném rozpouštědle se reakce provádí v přítomnosti zásady s ekvivalentem zásaditosti k hodnotě pH_a větší nebo rovné 10,75 ve vodě k zajištění dostatečné deprotonizace alespoň jedné ε-aminoskupiny. To znamená, že zásada musí být alespoň tak silná jako triethylamin. S výhodou se jako zásady používá tetramethylguanidinu (TMG), diizopropylethylaminu nebo tetrabutylamoniumhydroxidu.

Volba polárního rozpouštědla závisí ve velké míře na rozpustnosti proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu a esteru mastné kyseliny. Nejvýhodněji má být rozpouštědlo plně organické. Jakožto příklady obecně přijatelných organických rozpouštědel se uvádějí dimethylsulfoxid a dimethylformamid. Jsou také použitelná vodná rozpouštědla a směsi vodných a organických rozpouštědel. Volba rozpouštědla je omezena toliko rozpustností reakčních složek. Výhodnými rozpouštědly a rozpouštědlovými systémy jsou dimethylsulfoxid; dimethylformamid; acetonitril a voda; izopropylalkohol, ethanol a voda; a ethanol, propanol a voda. Výhodným rozpouštědlem je acetonitril a voda; nejvýhodnějším rozpouštědlem je 50% acetonitril. Pracovníkovi v oboru je jasné, jakých jiných polárních rozpouštědel může použít.

-5CZ 287731 B6

Poměr reakčních složek nemá rozhodující význam. Obecně je výhodné, aby byl aktivovaný ester mastné kyseliny v molámím nadbytku. S výhodou se reakce provádí s 1 až 4 molámími ekvivalenty a především s 1 až 2 molámími ekvivalenty esteru. Pracovníkům v oboru je však jasné, že se při velmi vysokých koncentracích esteru ve významném množství budou produkovatbisacylované nebo triacylované produkty.

Rovněž teplota reakční směsi nemá rozhodující význam. Reakce se provádí při teplotě 0 až 40 °C a obecně je ukončena za 15 minut až 24 hodin.

Po acylaci se reakce ukončí a produkt se čistí o sobě známými způsoby, například reverzní fázovou nebo hydrofobní chromatografií. Pak se produkt izoluje o sobě známými způsoby, například vymražovacím sušením nebo krystal izací.

Proinzulin, inzulín nebo inzulínový analog se může připravit jakýmkoliv známým způsobem přípravy peptidu včetně klasických způsobů (v roztoku), způsobů s pevnou fází, semisyntetickými způsoby a nejnověji rekombinantními DNA způsoby. Například Chance akol. (americká přihláška vynálezu číslo 07(388201), evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo ΕΡ0 383472, EP 0 214826), Belagaje a kol. (americký patentový spis číslo 5 304473), popisují způsoby přípravy různých proinzulinů a inzulínových analogů. Řetězce A a B inzulínových analogů podle vynálezu se také mohou připravovat rekombinantními DNA technikami za použití proinzulinovité prekurzorové molekuly (Frank a kol., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proč. Seventh Am. Pept. Symp. vyd. D. Rich a E. Gross, 1981).

Následující příklady praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak jej však neomezují. Procenta a díly jsou míněny hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Acylace inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu

Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (71,9 mg) se rozpustí v 6,58 ml dimethylsulfoxidu. Roztok se míchá při teplotě místnosti tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 20 mg pevného aktivovaného esteru do 2 ml dimethylsulfoxidu a intenzivním mícháním až do dokonalého rozpuštění na pohled. V této chvíli se přidá 1,1,3-3-tetramethylguanidin (26,8 μΐ) do 5 ml BHI roztoku, načež se přidá dimethylsulfoxid (94,4 ml) a předem připravený roztok aktivovaného esteru (400 μΐ). Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 60 minut. Po 15 minutách se odebere vzorek, zředí se 20násobně IN kyselinou octovou a analyzuje se chromatografií HPLC. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství Β29-Νεpalmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 67,1 %.

Příklad 2

Acylace inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody

Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (199,5 g) se rozpustí ve 20 litrech 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Odebere se vzorek výchozí látky a naměřená absorbance při 276 nm je 10,55. Připraví

-6CZ 287731 B6 se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 24 g pevného aktivovaného esteru do 2,4 1 acetonitrilu, předehřátého na teplotu přibližně 50 °C a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku BHI nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného. Do roztoku BHI s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (18 litrů). Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 110 minut. Reakce se ukončí přidáním vody (123 1) a nastavením hodnoty pH získaného zředěného roztoku na 2,01 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29-Ne-palmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 73 % teorie.

Příklad 3

Acylace Lys ' Pro -inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody

Krystaly Lys^B28Pro^B29-inzulinu (2,22 g) se rozpustí ve 100 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 270 mg pevného aktivovaného esteru do 27 ml acetonitrilu, předehřátého na teplotu přibližně 50 °C a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě 4 °C po dobu 15 minut. Do předem připraveného roztoku aktivovaného esteru s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (73 ml). Směs se nechá reagovat při teplotě 4 °C po dobu 85 minut. Reakce se ukončí přidáním IN kyseliny octové (600 ml), přičemž se hodnota pH upraví na 2,85. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B28-Ne-palnutoyl Lys “ Pro ' -inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím Lys^B28Pro^B29-inzulinu, je 72,5 % teorie.

Příklad 4

Acylace BHI za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody

Krystaly biosyntetického lidského inzulínu (BHI) (3 g) se rozpustí ve 300 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se popřípadě znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 400 mg pevného aktivovaného esteru do 40 ml acetonitrilu a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku krystalů BHI nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného. Do roztoku BHI s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (240 ml) a předem připravený roztok aktivovaného esteru. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 90 minut. Reakce se ukončí přidáním vody (180 ml) a nastavením hodnoty pH získaného zředěného roztoku na 2,01 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29-Ne-palmitoyl lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím BHI, je 75,7 % teorie.

Příklad 5

Acylace proinzulinu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody

Vodný roztok lidského proinzulinu (HPI) (28,2 mg/ml) se zředí 50 mM roztokem kyseliny borité na konečný objem 100 ml při obsahu HPI 16,2 mg/ml. Současně se připraví roztok aktivovaného

-7CZ 287731 B6 esteru rozpuštěním 150 mg N-sukcinimidylpalmitátu v 15 ml acetonitrilu (ACN) za rychlého míchání. Hodnota pH roztoku HPI se nastaví na 10,2 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a přidá se 88 ml acetonitrilu. Reakce se iniciuje přidáním 12 ml roztoku aktivovaného esteru (dvojnásobný molámí nadbytek se zřetelem na HPI). Konečný objem reakční směsi je 200 ml, při obsahu HPI 8 mg/ml v 50% vodném ACN. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 60 minut. Reakce se ukončí přidáním ekvivalentního objemu (200 ml) 50 mM glycinu o hodnotě pH 10,0.

Přesný poměr ε-amino acylovaného produktu k α-amino acylovanému produktu se nevypočítává, přičemž suma všech ε-amino acylovaných produktů v chromatogramu je vypočtena jako 87 až 90 % celkové plochy, zatímco suma všech příbuzných látek (zahrnujících podle předpokladu veškeré α-amino acylované produkty) je vypočtena jako < 7 % celkové plochy pro každý daný časový bod.

Příklad 6

Acylace Arg^B31Arg^B32-inzulinu za použití hexanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru

Lidský Arg^B31Arg^B32-inzulin (1,3 mg) se rozpustí ve 200 μΐ 200 mM 3-[cyklohexylamino]-lpropansulfonové kyseliny jakožto pufru o hodnotě pH 10,4. Hexanoyl-N-hydroxysukcinimidester (0,3 pmol) se rozpustí v Ν,Ν-dimethylformamidu a přidá se za míchání do roztoku. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně čtyř hodin a reakce se ukončí nastavením hodnoty pH na přibližně 2,5 přidáním IN kyseliny chlorovodíkové. Gelovité částice se odstraní vedením směsi filtrem s 0,45 mikrometrovými otvory před analýzou chromatografií HPLC. Oddělení žádaného produktu se dosáhne na C₄reverzním fázovém analytickém HPLC sloupci. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B29Νε-hexanoyl Arg^B31Arg^B32-inzulinu v odebraném vzorku, dělené počátečním množstvím Arg^B31Arg^{B 2}-inzulinu, je 69,4 % teorie.

Příklad 7

Acylace Leu^B26-lidského inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu

Lidský Leu^B26-inzulin (1,0 mg) se rozpustí v 1 ml směsi 95 % dimethylsulfoxidu (DMSO), 5 % triethylaminu (TEA). Přidá se N-sukcinimidylpalmitát (0,7 pmol), rozpuštěný v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF), za míchání. Směs se nechá reagovat při teplotě místnosti (20 až 25 °C) po dobu přibližně 90 minut. Reakce se ukončí zředěním na 0,2 mg(ml 0,lN kyselinou chlorovodíkovou. Gelovité částice se odstraní vedením směsi filtrem s 0,45 mikrometrovými otvory před analýzou chromatografií HPLC. Oddělení žádaného produktu se dosáhne na C₄reverzním fázovém analytickém HPLC sloupci. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství Νεpalmitoyl Leu -lidského inzulínu v odebraném vzorku, dělené počátečním množství Leu inzulínu, je 36,4 % teorie.

Příklad 8

Acylace lidského inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu v dimethylsulfoxidu

Roztok inzulínu se připraví rozpuštěním krystalů biosyntetického lidského inzulínu (1 g, 0,17 mmol) dokonale ve 20 ml dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti. Současně se připraví roztok aktivovaného esteru rozpuštěním N-sukcinimidylpalmitátu (0,0817 g, 0,23 mmol) ve 3 ml dimethylsulfoxidu o teplotě 50 °C. Do intenzivně míchaného roztoku inzulínu se přidá 1,1,3-3tetramethylguanidin (0,432 ml, 3,4 mmol) a veškerý roztok aktivního esteru. Po 30 minutách se

-8CZ 287731 B6 reakce ukončí 120 ml 0,05M kyseliny chlorovodíkové, předem ochlazené na teplotu 0 °C. Hodnota pH reakční směsi je přibližně 1,8. Analýza reakční směsi reverzní fázovou chromatografií HPLC dokládá, že obsah B29-Ne-palmitoylinzulinu je 72,2 % se zřetelem na protein a představuje 95 % monoacylovaného inzulínu jako celku.

Veškerá reakční směs se vnese na preparativní reverzní fázový sloupec Vydac C4 (5 x 25 ml), předem vyvážený rozpouštědlovou směsí, obsahující 0,1% trifluoroctové kyseliny, 20% akrylonitrilu ve vodě. Po vnesení se sloupec nejdříve promyje 500 ml téhož rozpouštědla a vyvine se za rychlosti průtoku 4ml/min rozpouštědlovým systémem, obsahujícím 0,1% trifluoroctové kyseliny, acetonitril a vodu, přičemž koncentrace acetonitrilu vzrůstá z 20 na 80 % při obsahu 9 litrů. B²⁹-Ne-Palmitoylinzulin se eluuje tímto rozpouštědlovým systémem, obsahujícím přibližně 53 % acetonitrilu. Po odstranění rozpouštědla lyofilizací je výtěžek Νεpalmitoylinzulinu 414 mg (0,0684 mmol) nebo 40,2 %, vztaženo na výchozí látku.

Příklad 9

B28 B29

Acylace Lys Pro -lidského inzulínu za použití 1-oktanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru

Krystaly Lys^B28 Pro^B29-lidského inzulínu (KPB) (2 g) se rozpustí ve 200 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se krystaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (1-oktanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru) přidáním 175 mg pevného aktivovaného esteru do 25,62 ml acetonitrilu a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku KPB nastaví na přibližně 10,4 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě okolí po dobu 5 minut. Acetonitril (176 ml) se přidá do roztoku KPB s předem upravenou hodnotou pH, načež se přidá předem připravený roztok aktivovaného esteru. Směs se nechá reagovat při teplotě okolí po dobu 90 minut. Reakce se ukončí přidáním 5,5 ml 10% kyseliny chlorovodíkové (objemově 2,75%) a tří objemů (1 200 ml) studené H₂O, přičemž konečná hodnota pH je 2,70. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství LysB29(C8) KPB v reakční směsi, dělené počátečním množstvím HBI, je 75,5 % teorie. Tento roztok se rozdělí na dva 800 ml podíly pro čištění hydrofibní chromatografií (SP20SS). Po sloupcové chromatografií se provádí ultrafiltrace a lyofilizace.

Hodnoty v tabulce II dokládají selektivní acylaci inzulínu, inzulínových analogů a proinzulinu. Pokusy se prováděly při teplotě místnosti s H-hydroxysukcinimidestery mastné kyseliny. V následující tabulce znamená zkratka TMG tetramethylguanidin a TEA triethylamin. DN znamená, že hodnoty nejsou dostupné.

Průmyslová využitelnost

Jednostupňový způsob selektivní acylace ε-aminoskupin proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, majícího volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, při kterém se nechává reagovat ε-aminoskupina s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za zásaditých podmínek v polárním rozpouštědle.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob selektivní acylace proteinu, vybraného ze skupiny, zahrnující proinzulin nebo inzulínový analog, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, vyznačující se tím, že se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny za bazických podmínek v polárním rozpouštědle.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo Lys Pro -lidský inzulín.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny s 6 až 18 atomy uhlíku.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester mastné kyseliny se 14 až 18 atomy uhlíku.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že aktivovaným esterem mastné kyseliny je N-hydroxysukcinimidester palmitové kyseliny.
6. Způsob selektivní acylace proinzulinu, inzulínu nebo inzulínového analogu, které mají volnou ε-aminoskupinu a volnou α-aminoskupinu, mastnou kyselinou, podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nechává reagovat ε-aminoskupina příslušného proteinu s rozpustným aktivovaným esterem mastné kyseliny v semivodném rozpouštědle při hodnotě pH 9,0 až 12,0.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že proteinem je lidský inzulín, inzulínový analog nebo Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že hodnota pH je od 9,5 do 10,5.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že semivodným rozpouštědlem je směs acetonitrilu a vody.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je 50% acetonitril.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že esterem mastné kyseliny je Nsukcinimidylpalmitát, N-sukcinimidyloktanoát nebo N-sukcinimidylmyristát.