ES2239364T3 - Sintesis de peptidos en fase solida. - Google Patents
Sintesis de peptidos en fase solida.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS X - AA 1 AA 2...AA N - Y, DONDE AA ES UN RESIDUO AMINOACIDO L O D, X ES HIDROGENO O UN GRUPO PROTECTOR DE AMINO, Y ES OH, NH 2 O UNA SECUENCIA AMINOACIDA QUE COMPRENDE DE 3 A 9 RESIDUOS AMINOACIDOS Y N ES UN ENTERO SUPERIOR A 2. DICHOS PEPTIDOS SE PREPARAN MEDIANTE SINTESIS EN FASE SOLIDA, PREFERIBLEMENTE UTILIZANDO LA QUIMICA FMOC. LA MEJORA CONSISTE EN QUE LA FRACCION C - TERMINAL UNIDA A LA FASE SOLIDA COMPRENDE UNA PRESECUENCIA FORMADA POR 3 A 9, PREFERIBLEMENTE 5 A 7, RESIDUOS AMINOACIDOS, SELECCIONADOS INDEPENDIENTEMENTE A PARTIR DE AMINOACIDOS L NATIVOS CON UNA FUNCIONALIDAD DE CADENA LATERAL QUE ESTA PROTEGIDA DE FORMA ADECUADA DURANTE LAS FASES DE ENLACE Y QUE PRESENTA UN FACTOR DE PROPENSION P AL > 0,57 Y UN FACTOR DE PROPENSION P BE > 1,10. SE DISOCIAN OPCIONALMENTE DEL PEPTI DO FORMADO LYS Y/O GLU PREFERIBLEMENTE, O LOS CORRESPONDIENTES AMINOACIDOS D Y DICHA PRESECUENCIA.
Description
Síntesis de péptidos en fase sólida.
La presente invención se refiere a un proceso
para la producción de péptidos mediante síntesis en fase
sólida.
La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) es
un procedimiento altamente exitoso introducido por Merrifield en
1963 (Ref. 1). Desde entonces, se han sintetizado numerosos
péptidos con esta técnica. S.B.H. Kent (Ref. 2) proporciona una
excelente revisión de la actual síntesis química de péptidos y
proteínas, la cual se incluye en ésta por referencia.
En la práctica, se usan dos estrategias para el
ensamblaje de cadenas peptídicas mediante síntesis en fase sólida,
a saber, la síntesis en fase sólida paso a paso, y la condensación
de fragmentos en fase sólida.
En la SPPS paso a paso, el aminoácido
C-terminal en forma de derivado reactivo
N-\alpha-protegido, si es
necesario protegido en su cadena lateral, se acopla covalentemente,
bien directamente o por medio de un eslabón apropiado, a un soporte
"sólido", por Ejemplo, una resina polimérica, la cual se
empapa en un solvente orgánico. Se retira el grupo
N-\alpha-protector, y los
subsiguientes aminoácidos protegidos se añaden de forma paso a
paso.
Cuando se ha obtenido la longitud de cadena
peptídica deseada, se retiran los grupo protectores de las cadenas
laterales, y se separa el péptido de la resina, lo que podría
hacerse en pasos separados o a la vez.
En la condensación de fragmentos en fase sólida,
la secuencia diana se ensambla mediante la condensación consecutiva
de fragmentos sobre un soporte sólido usando fragmentos protegidos
preparados mediante la SPPS de paso de paso.
A lo largo de los años, se han desarrollado dos
estrategias de acoplamiento, basadas en el uso de diferentes grupos
N-\alpha-protectores y grupos
protectores apropiados para las cadenas laterales.
Merrifield usó el
ter-butiloxicarbonilo (Boc) como grupo
N-\alpha-protector, mientras que
el 9-fluorometiloxicarbonilo (Fmoc) fue introducido
por Carpino y Han (Ref. 12).
Las operaciones implicadas en un ciclo de
extensión de la cadena en la SPPS de paso a paso usando las
químicas del Boc o Fmoc se ilustra en el siguiente esquema de
reacción (tomado de la Ref. 2).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El péptido
N-\alpha-Boc-protegido
acoplado a una resina PAM se
N-\alpha-desprotege con ácido
trifluoroacético (TFA). La sal de amina resultante se lava y
neutraliza con una amina terciaria. El enlace peptídico
subsiguiente se forma mediante reacción con un
Boc-aminoácido activado, por ejemplo, un anhídrido
simétrico. Generalmente, la protección de la cadena lateral se basa
en bencilo, y la desprotección se realiza con HF o un ácido
sulfónico.
El péptido
N-\alpha-Fmoc-protegido
acoplado a una resina se
N-\alpha-desprotege mediante
tratamiento con una amina secundaria, normalmente piperidina, en un
solvente orgánico, por Ejemplo,
N,N-dimetilformamida (DMF) o diclorometano (DCM).
Después del lavado, el péptido-resina neutro se hace
reaccionar con un Fmoc-aminoácido activado, por
Ejemplo, un éster activo de hidroxibenzotriazola.
La protección de la cadena lateral se basa en
terbutil, tritilo, y arilsulfonilo, y para la desprotección de las
cadenas laterales se usa preferiblemente TFA.
Aunque las estrategias Boc y Fmoc se usan
esencialmente en todas las síntesis de péptidos actuales, se han
propuesto otros grupos protectores N-\alpha
(Steward y Young, Ref. 13).
El Boc forma un grupo uretano
ácido-lábil, y otras propuestas de esta categoría
son el bifenil-isopropiloxicarbonilo (Bpoc),
3,5-dimetoxifenil-isopropilioxicarbonilo
(Ddz), fenilisopropiloxicarbonil (Poc) y
2,3,5-tetrametilbenciloxicarboxilo (Tmz).
Otros tipos de grupos
N-\alpha-protectores disponibles
incluyen el nitrofenilsulfenilo (Nps), el cual puede retirarse,
bien mediante un ácido anhidro diluido, por ejemplo, HCl, o
mediante ataque nucleofílico, por Ejemplo, con
metil-3-nitro-4-mercapto
benzoato. También podría usarse el ditiasuccinilo (Dts), el cual
puede retirarse mediante ataque nucleofílico.
La SPPS tiene la ventaja general de que se presta
a la química de ensamblaje de cadena totalmente automatizada o
semi-automatizada. Dryland y Sheppard desarrollaron
un sistema para SPPS bajo condiciones de flujo continuo a baja
presión (Ref. 7), que fue ulteriormente refinado, ver Cameron,
Meldal y Sheppard (Ref. 14), Holm y Meldal (Ref. 15), y
WO-90/02605.
Mientras que la SPPS se ha convertido actualmente
en una piedra angular en la síntesis de proteínas y péptidos,
todavía permanecen sin resolver ciertos problemas. Puesto que
algunos de estos problemas podrían estar claramente relacionados
con la estructura peptídica, se considera apropiada una breve
discusión del tema.
Se han hecho predicciones de las conformaciones
de proteínas por parte de Chou y Fasman (Ref. 6). Es bien sabido
que la arquitectura de las proteínas podría describirse en términos
de estructura primaria, secundaria y terciaria. La estructura
primaria se refiere a la secuencia de aminoácidos de la proteína.
La estructura secundaria es la organización espacial local del
esqueleto polimérico sin tener en cuenta la conformación de las
cadenas laterales. Como Ejemplo de estructuras secundarias, pueden
mencionarse las hélices \alpha, las hojas \beta y los giros
\beta, los cuales son regiones de cadena invertida que consisten
en tetrapéptidos. La estructura terciaria es la disposición de
todos los átomos en el espacio, incluyendo los enlaces disulfuro y
las posiciones de las cadenas laterales, de forma que se consideren
todas las interacciones de corto y largo alcance.
El término estructura cuaternaria podría usarse
para denotar la interacción entre subunidades de la proteína, por
Ejemplo, las cadenas \alpha y \beta de las hemoglobinas.
A continuación de una discusión de los primeros
intentos de correlacionar la estructura secundaria de la proteína
con la composición en aminoácidos, en donde, por ejemplo, Ser, Thr,
Val, Ile y Cys se clasificaban como "rompedores de hélice", y
Ala, Leu y Glu como "formadores de hélice", mientras que los
residuos hidrofóbicos se clasificaban como
"\beta-formadores" fuertes, y la prolina
junto con los residuos aminoácidos cargados como
"\beta-rompedores", Chou y Fasman hicieron un
análisis estadístico de 29 proteínas, con estructura de rayos X
conocida, con objeto de establecer reglas de predicción para las
regiones \alpha y \beta.
En base a estos estudios, determinaron los
denominados factores de propensión P\alpha, P\beta y Pt, los
cuales son parámetros conformacionales que expresan respectivamente
las preferencias posicionales como hélice \alpha, hoja \beta y
giro \beta, para los L-aminoácidos naturales que
forman parte de las proteínas.
Por motivos de conveniencia, los P\alpha y
P\beta se listan a continuación. Las abreviaturas de una letra
para los aminoácidos individuales se indican entre paréntesis.
Hablando en términos generales, los valores por
debajo de 1,00 indican que el aminoácido en cuestión deber
considerarse como desfavorable para la estructura secundaria
concreta.
Como Ejemplo, los ácidos hidrofóbicos (por
ejemplo, Val, Ile, Leu) son fuertes formadores de hoja \beta,
mientras que los aminoácidos cargados (por Ejemplo, Glu, Asp, His)
son rompedores de la hoja \beta.
En la estructura de la hélice \alpha, la
configuración en espiral del péptido se mantiene rígidamente en su
lugar mediante puentes de hidrógeno entre el átomo de hidrógeno
unido al átomo de nitrógeno en una unidad de repetición
(C---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---\uelm{N}{\uelm{\para}{H}}---)
y el átomo de oxígeno unido a un
átomo de carbono a tres unidades a lo largo de la
cadena.
Si un polipéptido se lleva a solución, puede
hacerse que la hélice \alpha se desenrolle para formar un ovillo
aleatorio (random coil) mediante ajuste del pH. La
transición desde una forma de hélice \alpha a un ovillo aleatorio
ocurre dentro de un rango de pH estrecho. Puesto que los puentes de
hidrógeno son todos equivalentes en fuerza de enlace en la hélice
\alpha, tienden a desvanecerse todos a la vez. El cambio también
puede inducirse mediante calor.
La hoja \beta consiste en cadenas peptídicas
completamente extendida, en las cuales los puentes de hidrógeno
unen los átomos de hidrógeno en una cadena con los átomos de
oxígeno de la cadena vecina. Por tanto, los puentes de hidrógeno no
contribuyen a la organización interna de la cadena como lo hacen en
la hélice \alpha, sino que tan sólo unen cadena con cadena. Las
cadenas adyacentes podrían ser paralelas o antiparalelas.
Los giros \beta se observan frecuentemente en
aquellas partes de un péptido que conectan cadenas antiparalelas en
un estructura hoja \beta.
En un giro \beta, los grupos CO y NH de un
aminoácido nº n en la cadena peptídica forman puente de hidrógeno
con los correspondientes grupos en el aminoácido nº n+4.
La hélice \alpha y la hoja \beta constituyen
partes fuertemente variables de la conformación peptídica de las
proteínas (de 0 al 80%), y las restantes partes de las proteínas se
pliegan en otras estructuras. En la mayoría de las proteínas, hay
secciones de las cadenas peptídicas que aparecen como "ovillos
aleatorios" irregularmente plegados.
Volviendo ahora a los problemas generales todavía
vigentes en relación con la SPPS, S.B.H. Kent (Ref. 2) destaca la
síntesis de secuencias difíciles.
Obviamente, toda la lógica de la SPPS se basa en
una completa desprotección de N-\alpha antes de
cada uno de los pasos de acoplamiento implicados.
Del mismo modo, idealmente todos los grupos amino
N-\alpha desprotegidos deberían acoplarse al
derivado reactivo de aminoácido de acuerdo con la secuencia
deseada, es decir, debería tener lugar una aminoacilación
completa.
Kent afirma que el problema potencial más serio
en la SPPS de paso a paso es la formación incompleta del enlace
peptídico, que da lugar a péptidos con uno o más aminoácidos
ausentes (supresiones), pero con propiedades similares a la de la
secuencia diana.
Tales acoplamientos incompletos son más
frecuentes en algunas secuencias que en otras, de ahí el término
"secuencias difíciles", y también son, aparentemente, más
predominantes en la química del Fmoc que en la química del Boc.
Un cierto número de "secuencias difíciles"
reconocidas han sido estudiadas por los científicos, incluyendo a
los actuales inventores.
Durante la SPPS de
homo-oligopéptidos que contienen leucina o alanina
usando la estrategia del Fmoc, se observó la desprotección
N-\alpha ineficiente con piperidina de manera
dependiente de la secuencia (Refs. 3 y 4). Las investigaciones
mostraron que este fenómeno está asociado con el subsiguiente
acoplamiento lento o incompleto del aminoácido, y se presentó
evidencia de la agregación en hoja \beta de la cadena peptídica
en crecimiento como una causa de los difíciles acoplamientos y de
la desprotecciones incompletas del Fmoc. Esta evidencia se basó en
observaciones físico-químicas generales (Ref. 4) y
1 en un estudio detallado mediante espectroscopia Raman en el
infrarrojo cercano (Ref. 5). Las observaciones
físico-químicas mencionadas podrían resumirse como
sigue: en caso de síntesis de
H-(Ala)_{n}-Lys-OH sobre
una matriz Kieselguhr de poliamida polimerizada (PenSyn K), no se
observaron problemas hasta que n = 5, pero aproximadamente un
20-25% del péptido protegido con Fmoc estaba todavía
presente después de la desprotección estándar con piperidina
(piperidina al 20% en DMF) con n = 6. Cuando se continuó la
síntesis hasta n = 10, se obtuvo una mezcla relativamente
complicada que incluía el péptido diana (n = 10), así como péptidos
de supresión correspondientes a n = 6, 7, 8 y 9, y péptidos de
supresión con el grupo Fmoc unido todavía al
N-terminal, en donde n = 6, 7, 8 y 9,
respectivamente (Figura 1). Esta mezcla se identificó mediante FAB
MS después de la separación mediante HPLC de los componentes
individuales. No se observaron secuencias erróneas o desprotección
parcial con n = 2-5, o desprotección incompleta del
péptido diana (n = 10), confinando por tanto los problemas a una
determinada porción de la cadena
homo-oligopeptídica. Por tanto, este tipo de
aminoacilaciones difíciles y desprotecciones incompletas pueden
denominarse como no-aleatorias, en contraste con
las dificultades aleatorias que de deben sólo a problemas estéricos
comunes (Ref. 2). Aunque se variaron las condiciones
experimentales, por Ejemplo, tipo de resina, tiempo de
desprotección, solventes, adición de caotropos, los problemas
todavía persistían, aunque el calentamiento hasta 50ºC tenía un
efecto óptimo sobre la desprotección incompleta del Fmoc (Ref.
4).
Una de las características más destacables de la
cadena de homo-oligo alanina es que los pasos de
desprotección incompleta del Fmoc son seguidos por acilaciones
sorprendentemente lentas con el siguiente aminoácido en la
secuencia. Así pues, los tiempos de acilación para cada una de las
primeras seis alaninas son inferiores a 60 minutos, mientras que la
acilación completa con Ala_{7}, Ala_{8}, Ala_{9}, Ala_{10}
dura respectivamente 26, 28, 30 y 7 horas (Figura 2).
Kent (Ref. 2) propone un cierto número de
soluciones al problema relacionado con las dificultades de
acoplamiento dependientes de la secuencia, a saber, el uso de calor
en el paso de acoplamiento y una conversión cuantitativa de las
cadenas peptídicas residuales unidas a la resina y sin reaccionar a
especies terminadas en un procedimiento de "taponado".
La patente estadounidense nº 5.021.550 descubre
un procedimiento de síntesis de péptidos en fase sólida en el cual
los intermediarios sin reaccionar se suprimen de la reacción
mediante enlace covalente de su extremo N-terminal
reactivo al soporte sólido, anclando por tanto los intermediarios
en dos lugares.
El objeto de la presente invención es
proporcionar una SPPS de acuerdo con la cual los péptidos que se
reconocen como o demuestran ser "secuencias difíciles" pueden
sintetizarse con rendimientos y pureza elevados.
Un objeto adicional de la invención es
proporcionar una SPPS que proporciona tiempos de acoplamiento
reducidos, no sólo para las secuencias difíciles, sino también para
las secuencias de otro modo no complicadas, en donde es deseable
reducir los normalmente largos tiempos de acoplamiento.
La manera en la cual se consiguen estos y otros
objetos y ventajas de la invención será más evidente a partir de la
siguiente descripción y las Figuras que la acompañan, las cuales
muestran diagramas de HPLC para varios péptidos obtenidos mediante
síntesis en fase sólida.
La Figura 1 es una HPLC de un crudo de
H-Ala_{10}-Lys-OH
que muestra una cantidad sustancial de péptidos de supresión (picos
1, 2, 3 y 4) y péptidos incompletamente
Fmoc-desprotegidos (picos 6, 7, 8 y 9), además del
péptido diana (pico 5).
La Figura 2 es un diagrama que muestra los
tiempos de acoplamiento secuencial para cada una de las alaninas en
la síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH.
La Figura 3 es un HPLC de
H-Ala_{10}-Lys_{3}-OH
que muestra el péptido diana. No se observan péptidos de
supresión.
La Figura 4 es un HPLC de
H-Ala_{20}-Lys_{3}-OH
que muestra péptidos de supresión (picos 1, 2, 3, 4 y 5) junto con
el péptido diana (pico 6).
La Figura 5 es un HPLC de
H-Ala_{10}-Lys_{6}-OH
que muestra el péptido diana. No se observan péptidos de
supresión.
La Figura 6 es un HPLC de
H-Ala_{20}-Lys_{6}-OH
que muestra el péptido diana. No se observan péptidos de
supresión.
La Figura 7 es un HPLC de
H-VQAAIDYING-OH (Proteína
Acil-Portadora (ACP), 65-74). El
péptido diana (pico 3) está acompañado por péptidos de supresión
(el pico 2 es el péptido des-Val).
La Figura 8 es un HPLC de
H-VQAAIDYING-K_{6}-OH,
Proteína Acil-Portadora (ACP) 65-74
acoplada a la pre-secuencia
Lys(Boc)_{6}, con sólo una pequeña cantidad de
péptido des-Val (pico 1).
La Figura 9 es un HPLC de
H-Ala_{10}-Lys-OH
preparado mediante la introducción de un eslabón HMPA. Se observan
varios péptidos de supresión (procedentes de
Ala_{10}-Lys(tBOC)-HMPA-(Lys(tBoc))_{6}-resina),
y se muestra sólo con propósito ilustrativo.
La Figura 10 es un HPLC de
H-Ala_{10}-Lys-OH,
preparado usando un eslabón MMA, que muestra una reducción
significativa de la cantidad de péptidos de supresión en
comparación con la Figura 9 (procedentes de
Ala_{10}-Lys-MMa-(Lys(tBoc))_{6}-resina).
Para investigar aún más los problemas descritos
más arriba en relación a la Ref. 3 y 4, los presentes inventores se
plantearon la pregunta de hasta qué punto la formación de la hoja
\beta de la cadena de homo oligoalanina podría verse afectada por
la inclusión de una secuencia peptídica más corta, una
pre-secuencia, en el extremo
C-terminal de la cadena. Esta cuestión está asociada
con el hecho de que las estructuras proteicas y las secuencias
polipeptídicas podrían tener segmentos de estructuras bien
definidas en función de los aminoácidos en la secuencia y de los
aminoácidos precedentes. Tal como se ha mencionado antes, las
investigaciones de Chou y Fasman (Ref. 6) sobre estructuras de
proteínas han conducido al reconocimiento de clases de aminoácidos
que se definen como inductoras predominantemente de hélice
\alpha, hoja \beta, o inductoras de ovillos aleatorios. Aunque
a priori podría asumirse que podrían aplicarse predicciones
similares a homo oligoalaninas o leucinas, en la Ref. 4 se
puntualizó que, sin embargo, las reglas de Chou y Fasman no
predicen los péptidos de homo oligoalanina o leucina como cadenas
formadoras de hoja \beta. Más aún, no puede esperarse que las
reglas de Chou y Fasman se apliquen durante la síntesis peptídica
sobre una resina, y claramente no se aplican cuando los aminoácidos
con cadena lateral son parte de la síntesis.
En los estudios básicos, se estudió la síntesis
de H-(Ala)_{n}-(Lys)_{m}-OH, en
donde (Lys)_{m} representa la presecuencia con m
igual a 1, 3 y 6. Se usó una versión con flujo continuo del
procedimiento en fase sólida de poliamida (Ref. 7) en un
sintetizador de péptidos completamente automatizado, tal como se ha
descrito previamente (Ref. 14), con DMF como solvente y un exceso
de 3 veces de Fmoc-alanina y ésteres
Fmoc-lisina(tBoc)-pfp,
respectivamente, y desprotección del Fmoc estándar con piperidina
al 20% en DMF durante 10 minutos. Los tiempos de acoplamiento se
monitorizaron con Dhbt-OH, el cual se desprotona al
anión Dhbt-O^{-} amarillo cuando todavía están
presentes grupos amino no acilados, y la desaparición del color
amarillo marca el punto final de la síntesis. Después de separar el
péptido de la resina con TFA acuoso al 95%, se lavó el producto con
éter y se analizó mediante HPLC. Los resultados con m = 1 se
describen más arriba (Figura 1). En el caso m = 3, se observa a
partir de la traza de HPLC mostrada en la Figura 3 que la síntesis
podría continuarse hasta Ala_{10} sin cantidades detectables de
péptidos de supresión o desprotección del Fmoc incompleta. Sin
embargo, cuando se continúa la síntesis hasta Ala_{20}, el
cromatograma (Figura 4) muestra la presencia de péptidos de
supresión. Los resultados son aún más sorprendentes con
H-(Ala)_{n}-(Lys)_{6}-OH, en
donde los productos con péptidos de supresión detectables se
obtienen con ambos, Ala_{10} (Figura 5) y Ala_{20} (Figura 6).
Más aún, los tiempos de acoplamiento se reducen drásticamente desde
hasta 30 horas, a tiempos de acoplamiento estándares (< 2 horas)
en cada paso. Previamente se ha intentado sintetizar la secuencia
H-Ala_{20}-OH mediante la
metodología del Boc, pero se obtuvieron niveles elevados de
péptidos de supresión e inserción (Ref. 8). Claramente, la
pre-secuencia Lys_{6}, la cual en las condiciones
de síntesis dominantes está completamente protegida por el grupo
tBoc, tiene un máximo efecto definitivo y favorable en la
estructura de la cadena peptídica en crecimiento, eliminando los,
de otra forma, graves problemas sintéticos debidos a las
desprotecciones incompletas y los acoplamientos
\hbox{extremadamente lentos.}
De acuerdo con estos hallazgos sorprendentes, la
presente invención se basa en la incorporación de una
pre-secuencia determinada en la parte
C-terminal unida al soporte sólido.
Esto es una ruptura fundamental con los intentos
de la técnica previa para arreglárselas con las secuencias
difíciles, en donde el foco estaba en las condiciones de reacción y
en la naturaleza del soporte sólido.
Tal como se discutirá más adelante, la secuencia
C-terminal mediante la cual el péptido deseado se
une al soporte sólido también podría incluir eslabones apropiados
con objeto de proporcionar, por Ejemplo, un mejor anclaje o mejores
condiciones de corte.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente
invención se refiere a un proceso para la producción de
péptidos
X-AA_{1}-AA_{2}
...
AA_{n}-Y
en donde AA e un residuo L- o
D-aminoácido,
X es hidrógeno o un grupo amino
protector,
y
Y es OH, NH_{2}, y n es un
entero mayor de
2,
mediante síntesis en fase sólida, en donde el
aminoácido C-terminal en forma de derivado reactivo
N-\alpha-protegido, y si es
necesario protegido en su cadena lateral, se acopla a un soporte
sólido o un polímero, opcionalmente por medio de un eslabón,
subsiguientemente se
N-\alpha-desprotege, y a partir de
ese momento los subsiguientes aminoácidos que forman la secuencia
peptídica se acoplan paso a paso, o se acoplan como fragmento
peptídico en forma de derivados o fragmentos reactivos
convenientemente protegidos, en donde el grupo
N-\alpha-protector se retira a
continuación de formarse el péptido deseado, y el péptido se separa
del soporte sólido,
caracterizado en que el proceso comprende además
seleccionar una pre-secuencia que contiene de 3 a 9
residuos, independientemente seleccionados de entre los aminoácidos
que tienen una funcionalidad de la cadena lateral que está
protegida durante los pasos de acoplamiento y que tienen un factor
de propensión P\alpha > 0,57 y un factor de propensión
P\beta \leq 1,10, comprendiendo la parte
C-terminal de dicho péptido la
pre-secuencia, y cortándose dicha
pre-secuencia del péptido formado.
Los aminoácidos que cumplen los límites antes
mencionados para los factores de propensión P\alpha y P\beta son
Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met y Gln.
Todos estos aminoácidos tiene una funcionalidad
de cadena lateral seleccionada de entre un grupo carboxi,
carboxamido, amino, hidroxi, guanidino, sulfuro o imidazol.
Los aminoácidos actualmente preferidos en la
pre-secuencia son Lys y Glu y combinaciones de los
mismos, por ejemplo, (Glu)_{q}-(Lys)_{p}, en
donde p+q es de 3 a 9, preferiblemente de 6 a 9, y la disposición
de Lys y Glu se escoge arbitrariamente.
El grupo N-\alpha amino de los
aminoácidos o fragmentos peptídicos usados en cada paso de
acoplamiento deberían estar convenientemente protegidos durante el
acoplamiento. El grupo protector podría ser el Fmoc o Boc, o
cualquier otro grupo protector apropiado, por Ejemplo, aquéllos
descritos más arriba en relación a las Ref. 13 y 18. El grupo
N-\alpha-protector actualmente
preferido el es Fmoc.
Es importante que la funcionalidad de la cadena
lateral de la pre-secuencia esté convenientemente
protegida durante los pasos de acoplamiento. Tales grupos
protectores son bien conocidos por una persona especialista en la
técnica, y los grupos preferidos se listan en las reivindicaciones
7-12.
Sin querer estar condicionados por ninguna teoría
concreta, se asume que las propiedades
físico-químicas de la cadena lateral protegida de
la pre-secuencia ilustrada por la lisina son
responsables de la "síntesis peptídica asistida por la
estructura" (SAPS) reduciendo o eliminando la formación de hoja
\beta en la secuencia de poli-alanina.
En el caso de otras homo-oligo
pre-secuencias, se ha observado que
(Glu(tBu))_{6}, así como la secuencia mixta
(Glu(tBu)Lys(tBoc))_{3} induce una estructura
favorable en la cadena de poli-alanina, permitiendo
productos sin péptidos de supresión.
Para investigar si la SAPS es un fenómeno más
general, o si está confinado sólo a
homo-oligopéptidos tales como la secuencia de
poli-alanina, se investigaron varias secuencias
mixtas que, según la opinión común, se conocen como secuencias
difíciles.
La síntesis de
H-VQAAIDYING-OH, Proteína Portadora
de Acilo (ACP), 65-74, es una síntesis difícil bien
conocida, la cual se ha usado como modelo de reacción en un cierto
número de casos (Ref. 9). Los péptidos de supresión se observan en
la síntesis estándar con un péptido des-Val (pico
2) como prominente producto secundario (ver Ejemplo 7 y Figura
7).
De acuerdo con la invención, se sintetizó la
secuencia
H-VQAAIDYING-K_{6}-OH
usando la pre-secuencia (Lys(tBoc))_{6}
unida al extremo C-terminal sobre una Pepsyn K. La
síntesis progresó hasta proporcionar un producto con el peso
molecular correcto, con elevada pureza, y con una cantidad
significativamente reducida de péptido des-Val (ver
Ejemplo 8 y Figura 8).
Se ha descrito que la secuencia
H-VNVNVQVQVD-OH es otra secuencia
difícil, la cual se ha sintetizado sobre una diversidad de resinas
de flujo (polímero Rapp, PEG-PS, Pepsyn K, PEGA
1900/300, PEGA 800/130 y PEGA 300/130), acompañada en todos los
casos por un anticipo de glutamina procedente de Val^{1} excepto
cuando se usó la resina PEGA 1900/300 (Ref. 10). De acuerdo con la
invención, la síntesis de
H-VNVNVQVQVDK6-OH progresó hasta
proporcionar un producto con el peso molecular correcto. No se
detectaron péptidos de supresión en el espectro (ver el Ejemplo
9).
Con objeto de verificar otro aspecto importante
de la presente invención, a saber, los tiempos de acoplamiento
reducidos obtenidos mediante la introducción de una
pre-secuencia en la parte C-terminal
del péptido deseado, se han controlado los tiempos de acoplamiento
de los aminoácidos individuales en la síntesis de la encefalina,
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH,
con y sin la pre-secuencia
(Lys(tBoc))_{6}, tal como se describe en el Ejemplo
15.
Los resultados de la medición demuestran que los
tiempos de acoplamiento en esta síntesis, por otra parte no
complicada, progresan efectivamente en combinación con la
pre-secuencia escogida.
En los casos descritos más arriba se han obtenido
las secuencias peptídicas con un pre-secuencia
hexalisina, lo que para cierto propósitos podría ser aceptable o
incluso una ventaja. Por tanto, una secuencia formadora de hoja
\beta podría causar un graves problemas de solubilidad, pero en
el caso de
H-Ala_{20}(Lys)6-OH,
el péptido resultó ser soluble en soluciones acuosas, mientras que
H-Ala_{10}-Lys-OH
precipitó rápidamente a partir de soluciones en TFA cuando se
diluía con agua. En el caso de (Glu)_{6}, la solubilidad
proporcionada por la pre-secuencia, y la multitud
de grupos ácido carboxílico podrían utilizarse, por Ejemplo, en
ELISA, en donde la unión dirigida a un sitio sobre una superficie
apropiada activada con grupos amino es posible a causa de la fácil
activación en solución acuosa, por Ejemplo, con carbodiimida. No
obstante, también se ha considerado cómo podrían usarse las
observaciones para la síntesis peptídica práctica sin presencia de
la pre-secuencia en el producto final. Por tanto,
se intentó introducir un eslabón entre la
pre-secuencia y el péptido diana, por ejemplo,
resina-(Lys(tBoc))_{6}-eslabón-péptido,
permitiendo la separación del péptido del eslabón con reactivos
estándares tales como soluciones de TFA que contienen limpiador
(scavenger). La introducción del eslabón HMPA comúnmente
usado tal como se describe más abajo en el Ejemplo 10,
resina-(Lys(tBoc))_{6}-HMPA-Lys(tBoc)Ala_{10},
tiene, sin embargo, un claro efecto negativo sobre la síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH,
dando lugar a la formación de péptidos de supresión (Figura 9).
Aparentemente, se pierde el efecto de la
pre-secuencia sobre la estructura de
poli-alanina, apuntando a que el grupo aromático en
el eslabón rompe el efecto de estructura en el esqueleto peptídico
de (Ala)_{n}-(Lys)_{m}.
Las condiciones específicas usadas en los
experimentos en los que se basa esta invención se detallan más
adelante en los procedimientos generales.
En términos generales, aparte de los aspectos
característicos relacionados con la pre-secuencia y
los eslabones de corte, el procedimiento acorde con la invención
podría realizarse en las condiciones tradicionales para la síntesis
de péptidos en fase sólida descritas en la literatura mencionada en
los antecedentes de la técnica.
No obstante, se considera apropiado un breve
resumen.
Los grupos Fmoc podrían desprotegerse por medio
de una amina tal como la piperidina o la
diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno
(DBU).
Los grupos protectores de las cadenas laterales
podrían desprotegerse por medio de un ácido tal como el ácido
trifluoroacético (TFA), el ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA),
HBr, HCl o HF.
El soporte sólido se selecciona preferiblemente
de entre resinas funcionalizadas tales como el poliestireno, la
poliacrilamida, el polietilenglicol, la celulosa, el polietileno,
el látex o las "dynabeads".
Si se desea, el aminoácidos
C-terminales podrían unirse al soporte sólido por
medio de un eslabón común tal como la
2,4-dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona,
el ácido
4-(4-hidroxi-metil-3-metoxifenoxi)-butírico
(HMPB), el ácido 4-hidroximetilbenzoico, el ácido
4-hidroximetilfenoxiacético (HMPA), el ácido
3-(4-hidroximetilfenoxi)propiónico, o el
ácido
p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacético
(AM).
La síntesis podría llevarse a cabo por lotes o
continuamente, en un sintetizador de péptidos automatizado o
semi-automatizado.
Los pasos de acoplamiento individuales podrían
realizarse en presencia de un solvente, por Ejemplo, seleccionado
de entre acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF),
N-metilpirrolidona (NMP), diclorometano (DCM),
trifluoroetanol (TFE), etanol, metanol, agua, mezclas de los
solventes mencionados, con o sin aditivos tales como el perclorato
o el etilencarbonato.
Los acoplamientos individuales entre dos
aminoácidos, un aminoácido y la secuencia peptídica formada
anteriormente, o un fragmentos peptídico y la secuencias peptídica
formada anteriormente, podrían realizarse de acuerdo con los
procedimientos de condensación usuales, tales como el procedimiento
de la azida, el procedimiento mixto de ácido anhídrido, el
procedimiento del anhídrido simétrico, el procedimiento de la
carbodiimida, el procedimiento del éster activo, tal como el
pentafluorofenilo (Pfp),
3,4-dihidro-4-oxobenzotriazin-3-ilo
(Dhbt), benzotriazol-1-ilo (Bt),
7-azabenzotriazol-ilo (At),
4-nitrofenilo, imido ésteres del ácido
N-hidroxisuccínico (NHS), cloruros de ácidos,
fluoruros de ácidos, activación in situ mediante
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), hexafluorofosfato de
O-(benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU), tetrafluorobotaro de
O-(benzotriazol-il)-1,1,3,3-tetrametiuronio
(TBTU), o hexafluorofosfato de
benzotriazolil-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
(BOP).
El péptido formado podría separarse del soporte
por medio de un ácido como el ácido trifluoroacético (TFA), el
ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA), el bromuro de hidrógeno
(HBr), el cloruro de hidrógeno (HCl), el fluoruro de hidrógeno
(HF), o una base tal como el amoníaco, la hidrazina, un alcóxido o
un hidróxido.
Alternativamente, el péptido podría separarse del
soporte por medio de la fotolisis.
En una realización, en la que se inserta un
eslabón entre la pre-secuencia unida al soporte y la
secuencia AA_{1}-AA_{n}, el cual permite un
corte selectivo de dicha secuencia, dicho corte podría realizarse
por medio de un ácido tal como el ácido trifluoroacético (TFA), el
ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA), el bromuro de hidrógeno
(HBr), el cloruro de hidrógeno (HCl), el fluoruro de hidrógeno
(HF), o una base tal como el amoníaco, la hidrazina, un alcóxido o
un hidróxido.
La pre-secuencia se corta
enzimáticamente del péptido formado. En una realización preferida,
el enzima se selecciona de entre carboxi- y endopeptidasas
apropiadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se sintetizaron, bien por lotes en
un frasco de polietileno equipado con un filtro de polipropileno
para filtración, o en la versión con flujo continuo del
procedimiento en fase sólida de poliamida (Dryland, A. y Sheppard,
R.C., Ref. 7) en un sintetizador de péptidos completamente
automatizado (Cameron et al., Ref. 14) usando
9-fluoroenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o
ter-Butiloxicarbonilo (Boc) como grupo protector
N-\alpha-amino, y grupos
protectores normales apropiados para las funcionalidades de las
cadenas laterales.
El solvente DMF
(N,N-dimetilformamida, Riedel de Häen, Alemania) se
purificó pasándolo a través de una columna empaquetada con una
resina de intercambio catiónico fuerte (Lewatit S 100 MB/H Strong
Acid, Bayer AG Leverkusen, Alemania) y se analizó en busca de
aminas libres antes de su uso mediante la adición de
3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(Dhbt-OH) que da lugar a un color amarillo (anión
Dhbt-O^{-}) si hay aminas libres. El solvente DCM
(diclorometano, grado analítico, Riedel de Häen, Alemania) se usó
directamente sin purificación.
Los aminoácidos protegidos con Fmoc y los
correspondientes ésteres de pentafluorofenilo (Pfp) se compraron a
Milli-Gen, U.K., Novabiochem, Suiza , y Bachem,
Suiza, y los ésteres de Dhbt a Novabiochem, Suiza, en formas
apropiadas con la cadena lateral protegida. Los aminoácidos
protegidos con Boc se compraron a Bachem, Suiza.
El reactivo de acoplamiento
diisopropilcarbodiimida (DIC) se compró a Riedel de Häen, Alemania,
y se destiló antes de su uso, la diciclohexilcarbodiimida (DCC) se
compró a Merck-Schuchardt, Niinchen, Alemania, y se
purificó mediante destilación. El tretrafluorobotaro de
o-benzotriazolil-N,N,N',N'-tetrametiluronio
(TBTU) se compró a PerSeptive Biosystems GmbH, Hamburgo,
Alemania.
Los eslabones HMPA, Novabiochem, Suiza; ácido
4-hidroximetilbenzoico, Novabiochem; ácido
4-metoximandélico, Aldrich, Alemania; HMPB,
Novabiochem; AM, Novabiochem; ácido
3-(4-hidroximetilfenoxi)propiónico,
Novabiochem, se acoplaron a la resina como un éster de
1-hidroxibenzotriazola (HObt) formado previamente y
generado por medio DIC.
Los péptidos sintetizados de acuerdo con la
estrategia Fmoc se sintetizaron sobre tres tipos diferentes de
soporte sólido usando concentraciones de 0,05 M o superiores de
aminoácidos protegidos con Fmoc en DMF. 1) PEG-PS
(polietilenglicol injertado sobre poliestireno; resina TentaGel S
NH_{2}, 0,27 mmoles/g, Rapp Polymere, Alemania, o resina NovaSyn
TG, 0,29 mmoles/g, Novabiochem, Suiza); 2) PepSyn Gel (resina de
polidimetilacrilamida funcionalizada con metiléster de sarcosina,
1,0 mmoles/g; MilliGen, U.K.); 3) PepSyn K (resina de
polidimetilacrilamida soportada sobre Kieselguhr y funcionalizada
con metiléster de sarcosina 0,11 mmoles/g; MilliGen, U.K.).
Los péptidos sintetizados de acuerdo con la
estrategia Boc se sintetizaron sobre una resina Merrifield
(poliestiren-divinil-benceno) con el
primer aminoácido unido (Novabiochem, Switzerland).
La (DIEA) se compró a Aldrich, Alemania, y la
etilendiamina a Fluka, Suiza, la piperidina a Riedel de Häen,
Frankfurt, Alemania. La
4-(N,N-dimetilamino)piridina (DMAP) se
compró a Fluka, Suiza y se usó como un catalizador en las
reacciones de acoplamiento que implicaban anhídridos simétricos. La
3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzo-triazine
(Dhbt-OH) se obtuvo de Fluka, Suiza, y la
1-hidroxibenzotriazola (HObt) procedía de
Novabiochem, Suiza.
El primer aminoácido se acopló como un anhídrido
simétrico en DMF, generado a partir del aminoácido protegido en
N-\alpha apropiado y de DIC. Los aminoácido
siguientes se acoplaron como ésteres de Pfp o Dhbt, o como ésteres
de HObt formados previamente a partir de los aminoácidos
N-protegido apropiados y de HObt por medio de DIC o
TBTU en DMF. En el caso del Fmoc, todas las acilaciones se
comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina, realizado a 800ºC
con objeto de impedir la desprotección del Fmoc durante el ensayo
(Larsen, B.D. y Holm, A., Ref. 4).
La desprotección del grupo Fmoc se realizó
mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF (1 x 3 y 1 x 7
minutos cuando se sintetizaron en lotes), o haciendo circular el
solvente de desprotección a través de la resina (10 minutos,
velocidad de flujo de 1 ml/minuto) al usar la síntesis con flujo
continuo, seguida por lavado con DMF hasta que no se podía detectar
color amarillo (Dhbt-O^{-}) después de la adición
de Dhbt-OH a la DMF desaguada.
La desprotección del grupo Boc se realizó
mediante tratamiento con TFA al 50% en DCM (v/v) 1 x 1,5 minutos y
1 x 20 minutos, seguido por lavado de 6 x 90 minutos cada uno con
DCM, neutralización con trietilamina al 10% en DCM (v/v) de 2 x 1,5
minuto cada uno, seguidos por lavados de 6 x 9 minutos con DCM.
Los péptidos se separaron de las resinas mediante
tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% (TFA, Halocarbon
Products Corporation, EE.UU.; Biesterfeld & Co. Hamburgo,
Alemania) en agua v/v a temperatura ambiente durante 2 horas. Las
resinas filtradas se lavaron con TFA al 95%-agua y los filtrados y
los lavados se evaporaron bajo presión reducida. El residuo se lavó
con éter y se liofilizó a partir de ácido
acético-agua. El producto liofilizado crudo se
analizó mediante cromatografía líquida de elevadas prestaciones
(HPLC) y se identificó mediante espectrometría de masas con
desorción e ionización por láser asistida por matriz y análisis del
tiempo de vuelo (MALDI TOF MS) o mediante espectrometría de masas
con ionización mediante electrospray.
La resina secada (1 g) se trató con hidróxido
sódico 1 M (10 ml) a 4ºC, y se dejó durante 15 minutos a
temperatura ambiente. La resina se filtró en un frasco que contenía
ácido acético acuoso al 10%. El péptido se aisló mediante
liofilización y se sometió a filtración en gel.
La resina secada (250 mg) se colocó en un frasco
de fondo redondo con un imán agitador. Se añadió
tioanisol/etanodiol (2:1, 750 \mul), se enfrió la muestra en
hielo, se añadieron 5 ml de TFA, y se agitó la muestra durante
5-10 minutos. Se añadió TFMSA (500 \mul) gota a
gota y se continuó la reacción a temperatura ambiente durante
30-60 minutos. El péptido se precipitó después de la
adición de éter.
Preferiblemente, las cadenas laterales se
desprotegen simultáneamente a la separación del péptido de la
resina.
Procedimiento a. Se disolvieron 3
equivalentes de aminoácido protegido en N-\alpha
en DMF, junto con 3 eq. de HObt y 3 eq. de DIC. Se dejó la solución
a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a continuación se
añadió a la resina, la cual se había lavado con una solución de
Dhbt-OH al 0,2% en DMF antes de la adición del
aminoácido previamente activado.
Procedimiento b. Se disolvieron 3
equivalentes de aminoácido protegido en N-\alpha
en DMF, junto con 3 eq. de HObt, 3 eq. de TBTU, y DIEA. Se dejó la
solución a temperatura ambiente durante 5 minutos, y a continuación
se añadió a la resina.
Se disolvieron 6 equivalentes de aminoácido
protegido en N-\alpha en DCM, y se enfriaron a
0ºC. Se añadió DCC (3 eq.) y se continuó la reacción durante 10
minutos. Se retiró el solvente bajo vacío, y los restos se
disolvieron en DMF. Se filtró la solución e inmediatamente se
añadió a la resina seguida por 0,1 eq. de DMAP.
Se trataron 3-5 mg de
resina-péptido protegido con Fmoc secos con 5 ml de
piperidina al 20% en DMF durante 10 minutos a temperatura ambiente,
y se estimó la absorción en el UV a 301 nm para el aducto
dibenzofulveno-piperidina. El rendimiento se estimó
usando un coeficiente de extinción calculado e_{301} basado en un
estándar Fmoc-Ala-OH.
En el caso de protección con Boc, el acoplamiento
se estimó de acuerdo con el procedimiento de la ninhidrina después
de retirar el grupo Boc (Sarin, V.K. et al., Ref. 11).
Se cubrió la PepSyn K seca (aproximadamente 500
mg) con etilendiamina y se dejó a temperatura ambiente durante la
noche. Se escurrió la resina y se lavó con DMF 10 x 15 ml, 5
minutos cada uno. Después de escurrirla, se lavó la resina con DIEA
al 10% v/v en DMF (2 x 15, 5 minutos cada uno), y finalmente se
lavó con DMF hasta no que no detectó color amarillo por la adición
de Dhbt-OH a la DMF escurrida. Se disolvieron 3 eq.
de HMPA, 3 eq. de HObt, y 3 eq. de DIC en 10 ml de DMF, y se
dejaron activar durante 10 minutos, transcurridos los cuales se
añadió la mezcla a la resina y se continuó el acoplamiento durante
24 horas. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (10 x 15 ml, 5
minutos cada uno), y se comprobó la acilación mediante el ensayo de
la ninhidrina. El primer aminoácido se acopló como el anhídrido
simétrico preformado protegido en la cadena lateral (ver más
arriba), y los rendimientos del acoplamiento se estimaron tal como
se ha descrito más arriba. Éste fue, en todos los casos, superior
al 70%. La síntesis se continuó entonces bien como "con flujo
continuo" o como "por lotes", tal como se ha descrito más
arriba.
La resina (aproximadamente 500 mg) con el primer
aminoácido unido se colocó en una columna conectada a un
sintetizador de péptidos completamente automatizado. El grupo Fmoc
se desprotegió tal como se ha descrito más arriba. Los aminoácidos
restantes, de acuerdo con la secuencia, se acoplaron como ésteres
de Pfp (3 eq.), protegidos con Fmoc, si era preciso con su cadena
lateral protegida, con la adición de Dhbt-OH (1
eq.). El punto final de cada acoplamiento se determinó
automáticamente monitorizando espectrofotométricamente la
desaparición del color amarillo del anión del
Dhbt-OH. Una vez completada la síntesis, se lavó el
péptido-resina con DMF (10 minutos, velocidad de
flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5 ml, 3 minutos cada uno), y
finalmente con dietiléter (3 x 5 ml cada uno), se retiró de la
columna, y se secó al vacío.
La resina (aproximadamente 500 mg) con el primer
aminoácido unido se colocó en un frasco de polietileno equipado con
un filtro de polipropileno para la filtración, y se desprotegió el
grupo Fmoc como se ha descrito más arriba. Los aminoácidos
restantes, de acuerdo con la secuencia, se acoplaron como ésteres
de HObt (3 eq.) previamente formados, protegidos con Fmoc, si era
preciso con su cadena lateral protegida, en DMF (5 ml), preparados
tal como se ha descrito más arriba. Los acoplamientos se
continuaron durante 2 horas a menos que se especifique lo
contrario. A continuación se retiró el exceso de reactivo mediante
lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo de 1 ml/minuto).
Todas las acilaciones se comprobaron mediante el ensayo de la
ninhidrina realizado a 80ºC. Una vez completada la síntesis, se
lavó el péptido-resina con DMF (10 minutos,
velocidad de flujo: 1 ml/minutos), DCM (5 x 5 ml, 1 minuto cada
uno), y finalmente con dietiléter (5 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
se secó al vacío.
Se colocó resina TentaGel S NH_{2} o NovaSyn TG
(250 mg, 0,27-0,29 mmoles/g) en un frasco de
polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la
filtración. Se empapó la resina en DMF (5 ml), y se trató con
piperidina al 20% en DMF para asegurar la presencia de grupos amino
no protonados sobre la resina. Se escurrió la resina y se lavó con
DMF hasta que no se pudo detectar color amarillo después de la
adición de Dhbt-OH a la DMF drenada. Se acopló el
HMPA (3 eq.) como un éster de HObt previamente formado, tal como se
ha descrito más arriba, y se continuó el acoplamiento durante 24
horas. Se escurrió la resina y se lavó con DMF (5 x 5 ml, 5 minutos
cada uno), y se comprobó la acilación mediante el ensayo de la
ninhidrina. El primer aminoácido se acopló como un anhídrido
simétrico preformado tal como se ha descrito más arriba. Los
rendimientos del acoplamiento de los primeros aminoácidos
protegidos con Fmoc se estimaron como se ha descrito más arriba. En
todos los casos fue superior al 60%. Los aminoácidos siguientes, de
acuerdo con la secuencia, se acoplaron como ésteres de HObt
preformados (3 eq.), protegidos con Fmoc, si era preciso con la
cadena lateral protegida, tal como se ha descrito más arriba. Los
acoplamientos se continuaron durante 2 horas a menos que se
especifique lo contrario. Se escurrió la resina, y se lavó con DMF
(5 x 5 ml, 5 minutos cada uno) con objeto de retirar el exceso de
reactivo. Todas las acilaciones se comprobaron mediante el ensayo
de la ninhidrina realizado a 80ºC. Una vez completada la síntesis,
se lavó el péptido-resina con DMF (3 x 5 ml, 5
minutos cada uno), DCM (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y finalmente
con dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y se secó al
vacío.
Se colocó resina PepSyn Gel (500 mg, 1 mmol/g) en
un frasco de polietileno equipado con un filtro de polipropileno
para la filtración. Se empapó la resina en etilendiamina (15 ml) y
se agitó suavemente mediante agitación durante 20 horas. Se
escurrió la resina y se lavó con DMF (10 x 15 ml, 5 minutos cada
uno). Después de escurrida, se lavó la resina con DIEA al 10% v/v
en DMF (2 x 5 ml, 5 minutos cada uno) y finalmente se lavó con DMF
(5 x 15 ml, 5 minutos cada uno) hasta que no se pudo detectar color
amarillo después de la adición de Dhbt-OH a la DMF
drenada. Se acopló el HMPA (3 eq.) como un éster de HObt tal como
se ha descrito más arriba (procedimiento a) y se continuó el
acoplamiento durante 24 horas. A continuación, se escurrió la
resina y se lavó con DMF (5 x 5 ml, 5 minutos cada uno). La
acilación se comprobó mediante el ensayo de la ninhidrina. El
primer aminoácido se acopló como un anhídrido simétrico preformado
tal como se ha descrito más arriba. Los rendimientos del
acoplamiento de los primeros aminoácidos protegidos con Fmoc se
estimaron como se ha descrito más arriba. En todos los casos fue
superior al 70%. Los aminoácidos siguientes, de acuerdo con la
secuencia, se acoplaron como ésteres de HObt preformados (3 eq.),
protegidos con Fmoc, si era preciso con la cadena lateral
protegida, tal como se ha descrito más arriba (procedimiento a).
Los acoplamientos se continuaron durante 2 horas y, si era preciso,
doblemente acoplados a lo largo de la noche. Se escurrió la
resina, y se lavó con DMF (5 x 5 ml, 5 minutos cada uno) con objeto
de retirar el exceso de reactivo. Todas las acilaciones se
comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina realizado a 80ºC.
El grupo Fmoc se desprotegió tal como se ha descrito más arriba.
Una vez completada la síntesis, se lavó el
péptido-resina con DMF (3 x 5 ml, 5 minutos cada
uno), DCM (3 x 15 ml, 2 minutos cada uno), y finalmente con
dietiléter (3 x 15 ml, 2 minutos cada uno), y se secó al vacío.
La HPLC se realizó en un instrumento Waters 600 E
equipado con un detector de matriz de fotodiodos Waters 996, con
una columna de fase inversa C18 Waters Radial Pak 8 x 100 mm C18.
El tampón A fue 0,1% en volumen de TFA en agua, y el tampón B fue
90% en volumen de acetonitrilo, 9,9% en volumen de agua, y 0,1% en
volumen de TFA. Los tampones se bombearon a través de la columna
con una velocidad de flujo de 1,5 ml/minuto usando el gradiente:
1. Gradiente lineal desde el 0%-70% B (20 minutos), gradiente
lineal desde el 70-100% B (1 minuto), isocrático
con 100% de B (5 minutos). 2. Isocrático con 0% de B (2 minutos),
gradiente lineal desde el 0-50% B (23 minutos),
gradiente lineal desde el 50-100% B (5 min),
isocrático con 100% de B (5 minutos).
Los espectros de masas con desorción e ionización
por láser asistida por matriz y análisis del tiempo de vuelo
(MALDI TOF) se obtuvieron en un instrumento Fison TofSpec E. Los
espectros de masas con ionización mediante electrospray se
obtuvieron en un instrumento Finnigan Mat LCQ equipado con una
sonda de electrospray (ESI) (ES-MS).
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que era una mezcla compleja que comprendía el
péptido diana (n = 10), así como péptidos de supresión
correspondientes a n = 6, 7, 8 y 9, y péptidos de supresión con el
grupo Fmoc todavía unido al N-terminal cuando n =
6, 7, 8 y 9, respectivamente. La identidad de los péptidos
individuales se confirmó mediante MALDI TOF MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g) para
la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que era homogéneo, sin secuencias de supresión y
protegidas con Fmoc. Rendimiento del 91,0%. Se halló que la pureza
era superior al 98% de acuerdo con la HPLC (ver Figura 3). La
identidad del péptido se confirmó mediante MALDI TOF MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que era homogéneo, sin secuencias de supresión y
protegidas con Fmoc. Rendimiento del 90,9%. Se halló que la pureza
era superior al 98% de acuerdo con la HPCL (ver Figura 5). La
identidad del péptido se confirmó mediante ES MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Ala_{10}-(Lys(Boc))_{3} PepSyn KA
(0,086 mmoles/g) (procedente de la síntesis de
H-Ala_{10}-Lys_{3}-OH)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo", y se prosiguió la síntesis.
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que comprendía el péptido diana
H-Ala_{n}-Lys_{3}-OH
(n = 20) así como péptidos de supresión correspondientes a n = 19,
18, 17 y 16 (ver Figura 4). No se detectaron secuencias protegidas
con Fmoc. La identidad de los péptidos se confirmó mediante ES
MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que era homogéneo, sin secuencias de supresión y
protegidas con Fmoc. Rendimiento del 91,4%. Se halló que la pureza
era superior al 98% de acuerdo con la HPLC (ver Figura 6). La
identidad del péptido se confirmó mediante ES MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC. Se halló que mejor que el 98% puro, sin secuencias de
supresión y protegidas con Fmoc. Rendimiento del 97%.
La identidad del péptido se confirmó mediante ES
MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Gly PepSyn KA (0,074 mmoles/g) para la
síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC y se halló que contenía la molécula diana acompañada por
aproximadamente un 16% del péptido des-Val. La
identidad de los péptidos se confirmó mediante MALDI TOF MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC y se halló que contenía el péptido diana con pureza elevada
(\sim95%) con una cantidad significativamente reducida del
péptido des-Val. La identidad del péptido se
confirmó mediante MALDI TOF MS.
Se usaron 500 mg de resina
Fmoc-Lys(Boc) PepSyn KA (0,086 mmoles/g)
para la síntesis de acuerdo con la "técnica de flujo
continuo".
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC y se halló que era más del 90% puro, sin secuencias de
supresión o Fmoc-protegidas. El rendimiento era del
100%. La identidad del péptido se confirmó mediante MALDI TOF
MS.
Síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH
usando (Lys(Boc))_{6} como pre-secuencia y
HMPA como eslabón.
(H-Ala_{10}-Lys(Boc)-OCH_{2}-PhOCH_{2}CO-
(Lys(Boc))_{6}-NHCH_{2}CH_{2}NH PepSyn
K). Solamente con propósito
ilustrativo
Se cubrieron 500 mg de PepSyn K (0,1 mmoles/g)
con etilendiamina (5 ml) y se dejaron a temperatura ambiente
durante la noche. Se escurrió la resina, y se lavó con DMF 10 x 15
ml, 5 minutos cada uno. Después de escurrir la resina, se lavó con
DIEA al 10% v/v en DMF (2 x 15 ml, 5 minutos cada uno), y
finalmente se lavó con DMF hasta que no se pudo detectar color
amarillo mediante la adición Dhbt-OH a la DMF
drenada. La resina derivada se usó para la síntesis de acuerdo con
la "técnica del flujo continuo".
La primeras 6 lisinas que formaban la
pre-secuencia se acoplaron como ésteres
Fmoc-Lys-(Boc)-Pfp (3 eq.) con la
adición de Dhbt-OH (1 eq.). El punto final de cada
acoplamiento se determinó automáticamente tal como se ha descrito
más arriba. El grupo Fmoc se separó como se ha descrito más arriba.
Una vez completada la pre-secuencia, se
introdujeron en la parte superior de la columna 3 eq. de HMPA
acoplado con un éster de HObt previamente activado, tal como se ha
descrito más arriba. El sintetizador se operó en modo de
recirculación durante 2 horas, y a continuación se retiró el exceso
de reactivo mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad de
flujo: 1 ml/minuto). Se extrajo una pequeña muestra de resina con
objeto de comprobar la acilación mediante el ensayo de la
ninhidrina. El siguiente aminoácido de acuerdo con la secuencia se
acopló como anhídrido simétrico preformado con la cadena lateral
protegida, tal como se ha descrito más arriba, y se introdujo por
la parte superior de la columna junto con DMAP (0,1 eq.), y se
operó el sintetizador en modo de recirculación durante 90 minutos.
A continuación se retiró el exceso de reactivo mediante lavado con
DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto). Se extrajo una
pequeña muestra de resina con objeto de comprobar el rendimiento
del acoplamiento, el cual se estimó como se ha descrito
anteriormente y se halló que era del 84%. La síntesis se siguió a
continuación mediante separación del grupo Fmoc tal como se ha
descrito más arriba. Los aminoácidos restantes de acuerdo con la
secuencia se acoplaron como ésteres de Pfp (3 eq.) protegidos con
Fmoc, si era preciso con la cadena lateral protegida, con la
adición de Dhbt-OH (1 eq.). El punto final de cada
acoplamiento se determinó automáticamente tal como se ha descrito
más arriba. Una vez completada la síntesis, se lavó el
péptido-resina con DMF (10 minutos, velocidad de
flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
finalmente con dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), se retiró
de la columna, y se secó
al vacío.
al vacío.
El péptido se separó de la resina tal como se ha
descrito más arriba.
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC, y se halló que comprendía el péptido diana
H-Alan-Lys_{3}-OH
(n = 10) así como péptidos de supresión correspondientes a n = 9,
8, 7 y 6 (ver Figura 9). No se detectaron secuencias protegidas con
Fmoc. La identidad de los péptidos se confirmó mediante MALDI TOF
MS.
Síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH
usando el ácido
(+/-)-4-metoximandélico como
eslabón.
(H-Ala_{10}-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CONHCH_{2}CH_{2}NH
resina PepSyn K). Solamente con propósito
ilustrativo
Se trataron 500 mg de PepSyn K (0,1 mmoles/g) con
etilendiamina tal como se ha descrito más arriba. La resina
derivada se usó para la síntesis de acuerdo con la "técnica del
flujo continuo". Se disolvieron 10 eq. de ácido
(+/-)-4-metoximandélico, 10 eq. de
HObt y 10 eq. de DIC en 5 ml de DMF, se preactivaron durante 10
minutos, y se introdujeron en la parte superior de la columna, y se
operó el sintetizador en modo de recirculación durante 2 horas. A
continuación se retiró el exceso de reactivo mediante lavado con
DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minutos). Se extrajo una
pequeña muestra de resina con objeto de comprobar la acilación
mediante el ensayo de la ninhidrina. El primer aminoácido, de
acuerdo con la secuencia, se acopló como anhídrido simétrico
preformado con la cadena lateral protegida, tal como se ha descrito
más arriba, y se introdujo por la parte superior de la columna
junto con DMAP (0,1 eq.), y se operó el sintetizador en modo de
recirculación durante 90 minutos. A continuación se retiró el
exceso de reactivo mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad
de flujo: 1 ml/minuto). Se extrajo una pequeña muestra de resina
con objeto de comprobar el rendimiento del acoplamiento, el cual
se estimó como se ha descrito anteriormente, y se halló que era del
75%. A continuación se prosiguió la síntesis mediante separación
del grupo Fmoc tal como se ha descrito más arriba. Los aminoácidos
restantes de acuerdo con la secuencia se acoplaron como ésteres de
Pfp (3 eq.) protegidos con Fmoc con la adición de
Dhbt-OH (1 eq.). El punto final de cada
acoplamiento se determinó automáticamente tal como se ha descrito
más arriba. Una vez completada la síntesis, se lavó el
péptido-resina con DMF (10 minutos, velocidad de
flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
finalmente con dietiléter, se retiró de la columna, y se secó
al
vacío.
vacío.
El péptido se separó de la resina tal como se ha
descrito más arriba y se liofilizó a partir del ácido
acético-agua.
El producto liofilizado crudo se analizó mediante
HPLC y se halló que comprendía el péptido diana
H-Alan-Lys-OH (n =
10) así como los péptidos de supresión correspondientes a n = 9, 8,
7 y 6. La identidad de los péptidos se confirmó mediante MALDI TOF
MS.
Síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH
usando (Lys(Boc))_{6} como pre-secuencia, y
el ácido (+/-)-4-metoximandélico
como eslabón.
(H-Ala_{10}-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))_{6}-NHCH_{2}CH_{2}NH
resina PepSyn K). Solamente con propósito
ilustrativo
Se trataron 500 mg de PepSyn K (0,1 mmoles/g) con
etilendiamina tal como se ha descrito más arriba. La resina
derivada se usó para la síntesis de acuerdo con la "técnica del
flujo continuo". Las primeras 6 lisinas que formaban la
pre-secuencia se acoplaron como ésteres de Pfp (3
eq.) con la adición de Dhbt-OH (1 eq.). El punto
final de cada acoplamiento se determinó automáticamente tal como
se ha descrito más arriba. El grupo Fmoc se separó como se ha
descrito más arriba. Una vez completada la
pre-secuencia, se acoplaron 10 eq. de ácido
(+/-)-4-metoximandélico como éster
de HObt pre-activado, tal como se ha descrito más
arriba, y se introdujeron en la parte superior de la columna. Se
operó el sintetizador en modo de recirculación durante 2 horas, y a
continuación se retiró el exceso de reactivo mediante lavado con
DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minutos). Se extrajo una
pequeña muestra de resina con objeto de comprobar la acilación
mediante el ensayo de la ninhidrina. El siguiente aminoácido, de
acuerdo con la secuencia, se acopló como anhídrido simétrico
preformado con la cadena lateral protegida, tal como se ha descrito
más arriba, y se introdujo por la parte superior de la columna
junto con DMAP (0,1 eq.). Se operó el sintetizador en modo de
recirculación durante 90 minutos. A continuación se retiró el
exceso de reactivo mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad
de flujo: 1 ml/minuto). Se extrajo una pequeña muestra de resina
con objeto de comprobar el rendimiento del acoplamiento, el cual se
estimó como se ha descrito anteriormente, y se halló que era del
68%. A continuación se prosiguió la síntesis mediante separación
del grupo Fmoc tal como se ha descrito más arriba. Los aminoácidos
restantes de acuerdo con la secuencia se acoplaron como ésteres de
Pfp (3 eq.) protegidos con Fmoc con la adición de
Dhbt-OH (1 eq.). El punto final de cada acoplamiento
se determinó automáticamente tal como se ha descrito más arriba.
Una vez completada la síntesis, se lavó el
péptido-resina con DMF (10 minutos, velocidad de
flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
finalmente con dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), se retiró
de la columna, y se secó al vacío. El péptido se separó de la
resina tal como se ha descrito más arriba y se liofilizó a partir
del ácido acético-agua. El producto liofilizado
crudo se analizó mediante HPLC y se halló que comprendía el péptido
diana
H-Ala_{n}-Lys-OH
(n = 10) así como los péptidos de supresión correspondientes a n =
9, 8, 7 y 6. Se halló que la cantidad de péptidos de supresión
esta reducida significativamente en comparación con los Ejemplos 10
y 11 (ver Figura 10). No se detectaron secuencias protegidas con
Fmoc. La identidad de los péptidos se confirmó mediante MALDI TOF
MS.
\newpage
Síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH
usando (Lys(Boc))_{6} como pre-secuencia, y
el ácido (+/-)-4-metoximandélico
como eslabón.
(H-Ala_{10}-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Lys(Boc))_{6}-
NHCH_{2}CH_{2}NH resina PepSyn K). Solamente con propósito
ilustrativo
Se colocó PepSyn K (aproximadamente 500 mg, 0,1
mmoles/g) en un frasco de polietileno equipado con un filtro de
polipropileno para filtración, y se trataron con etilendiamina tal
como se ha descrito anteriormente. Las primeras 6 lisinas que
formaban la pre-secuencia se acoplaron como ésteres
de Pfp (3 eq.) protegidos con Fmoc y con la cadena lateral
protegida, con la adición de Dhbt-OH (1 eq.). La
acilaciones se comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina
realizado a 80ºC tal como se ha descrito más arriba. El grupo Fmoc
se desprotegió tal como se ha descrito más arriba. Una vez
completada la pre-secuencia, el péptido
desprotegido-resina se hizo reaccionar con 10 eq.
de ácido (+/-)-4-metoximandélico,
como éster de HObt pre-activado tal como se ha
descrito más arriba (resuelto tal como se ha descrito más arriba,
95,8% de pureza óptica), y se continuó el acoplamiento durante 24
horas. A continuación se retiró el exceso de reactivo mediante
lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minutos). Se
comprobó la acilación mediante el ensayo de la ninhidrina. El
siguiente aminoácido, de acuerdo con la secuencia, se acopló como
anhídrido simétrico preformado protegido con Fmoc y con la cadena
lateral protegida, tal como se ha descrito más arriba, y se continuó
la reacción durante 2 horas. A continuación se retiró el exceso de
reactivo mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1
ml/minuto). Se extrajo una pequeña muestra de resina con objeto de
comprobar el rendimiento del acoplamiento, el cual se estimó como
se ha descrito anteriormente, y se halló que era del 66%. A
continuación se prosiguió la síntesis mediante separación del grupo
Fmoc tal como se ha descrito más arriba.
La primera alanina se acopló como éster de Pfp (3
eq.) con la adición de Dhbt-OH (1 eq.) en DMf (2
ml) durante 2 horas. A continuación se retiró el exceso de reactivo
mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1
ml/minutos), y se comprobó la acilación mediante el ensayo de la
ninhidrina realizado a 80ºC tal como se ha descrito más arriba. A
continuación se retiró el grupo Fmoc mediante tratamiento con
piperidina al 20% v/v en DMF (1 minutos, velocidad de flujo 1
ml/min), seguido por lavado con chorro de DMF (10 sec, velocidad de
flujo 10 ml/minuto), y flujo de Dhbt-OH al 0,2% en
DMF (20 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), y lavando
finalmente con DMF (2 x 5 ml, 1 minuto cada uno). La siguiente
alanina protegida con Fmoc se acopló como inmediatamente como
éster de Pfp (3 eq.) con la adición de 1 eq. de
Dhbt-OH en DMf (2 ml) durante 2 horas. Se comprobó
la acilación mediante el ensayo de la ninhidrina realizado tal como
se ha descrito más arriba. Los aminoácidos restantes de acuerdo
con la secuencia se acoplaron como ésteres de Pfp (3 eq.)
protegidos con Fmoc con la adición de Dhbt-OH (1
eq.) en DMf (2 ml). El exceso de reactivo se retiró mediante
lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), y las
acilaciones se comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina
realizado a 80ºC tal como se ha descrito más arriba. El grup Fmoc
se desprotegió tal como se ha descrito más arriba. Una vez
completada la síntesis, se lavó el péptido-resina
con DMF (10 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5
ml, 1 minuto cada uno), dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
se secó al vacío.
El péptido se separó de la resina tal como se ha
descrito más arriba y se liofilizó a partir de ácido acético
glacial. El producto liofilizado crudo se analizó mediante HPLC y
se halló que era homogéneo, sin secuencias de supresión ni
protegidas con Fmoc.
Síntesis de
H-Ala_{10}-Lys-OH
usando (Glu(OtBu))_{6} como pre-secuencia,
y el ácido (+/-)-4-metoximandélico
como eslabón.
(H-Alan-Lys(Boc)-OCH-(4-MeOPh)CO-(Glu(OtBu))_{6}-
NHCH_{2}CH_{2}NH resina PepSyn K). Solamente con propósito
ilustrativo
Se colocó PepSyn K (aproximadamente 500 mg) en un
frasco de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para
filtración, y se trataron con etilendiamina tal como se ha descrito
anteriormente. Los primeros 6 ácidos glutámicos que formaban la
pre-secuencia se acoplaron como
Fmoc-Glu(OtBu)-ésteres de Pfp (3 eq.) con la
adición de Dhbt-OH (1 eq.). Las acilaciones se
comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina realizado a 80ºC
tal como se ha descrito más arriba. El grupo Fmoc se desprotegió
tal como se ha descrito más arriba. Una vez completada la
pre-secuencia, se acoplaron 10 eq. de ácido
(+/-)-4-metoximandélico (resuelto
tal como se ha descrito más arriba, 95,8% de pureza óptica) como
éster de HObt pre-activado tal como se ha descrito
más arriba. Se continuó el acoplamiento durante 24 horas y a
continuación se retiró el exceso de reactivo mediante lavado con
DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minutos). Se comprobó la
acilación mediante el ensayo de la ninhidrina. El siguiente
aminoácido, de acuerdo con la secuencia, se acopló como anhídrido
simétrico preformado protegido con Fmoc y con la cadena lateral
protegida, tal como se ha descrito más arriba, catalizado por DMAP
(0,1 eq.), y se continuó la reacción durante 2 horas. Se retiró el
exceso de reactivo mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad
de flujo: 1 ml/minuto). Se extrajo una pequeña muestra de resina
con objeto de comprobar el rendimiento del acoplamiento, el cual se
estimó como se ha descrito anteriormente, y se halló que era del
75%. A continuación se prosiguió la síntesis mediante separación
del grupo Fmoc tal como se ha descrito más arriba.
La primera alanina se acopló como éster de Pfp (3
eq.) con la adición de Dhbt-OH (1 eq.) en DMf (2
ml) durante 2 horas. A continuación se retiró el exceso de reactivo
mediante lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1
ml/minutos), y se comprobó la acilación mediante el ensayo de la
ninhidrina realizado a 80ºC tal como se ha descrito más arriba. A
continuación se retiró el grup Fmoc mediante tratamiento con
piperidina al 20% v/v en DMF (1 minutos, velocidad de flujo 1
ml/min), seguido por lavado con chorro de DMF (10 sec, velocidad de
flujo 10 ml/minuto), y flujo de Dhbt-OH al 0,2% en
DMF (20 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), y lavando
finalmente con DMF (2 x 5 ml, 1 minuto cada uno). La siguiente
alanina protegida con Fmoc se acopló como inmediatamente como
éster de Pfp (3 eq.) con la adición de 1 eq. de
Dhbt-OH en DMF (2 ml) durante 2 horas. Se comprobó
la acilación mediante el ensayo de la ninhidrina realizado tal como
se ha descrito más arriba. Los aminoácidos restantes de acuerdo
con la secuencia se acoplaron como ésteres de Pfp (3 eq.)
protegidos con Fmoc con la adición de Dhbt-OH (1
eq.) en DMf (2 ml). El exceso de reactivo se retiró mediante
lavado con DMF (12 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), y las
acilaciones se comprobaron mediante el ensayo de la ninhidrina
realizado a 80ºC tal como se ha descrito más arriba. El grup Fmoc
se desprotegió tal como se ha descrito más arriba. Una vez
completada la síntesis, se lavó el péptido-resina
con DMF (10 minutos, velocidad de flujo: 1 ml/minuto), DCM (3 x 5
ml, 1 minuto cada uno), dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y
se secó al vacío.
El péptido se separó de la resina tal como se ha
descrito más arriba y se liofilizó a partir de ácido acético
glacial. El producto liofilizado crudo se analizó mediante HPLC y
se halló que era homogéneo, sin secuencias de supresión ni
protegidas con Fmoc.
Se colocó resina NovaSyn TG seca (0,29 mmoles/g,
250 mg) en un frasco de polietileno equipado con un filtro de
polipropileno para filtración, y se trató tal como se ha descrito
en "síntesis peptídica por lotes sobre PEG-PS"
hasta que se completó la pre-secuencia Lys_{6}.
Los siguientes aminoácidos, que forman la secuencia
Leu-encefalina, se acoplaron como ésteres de HObt
(3 eq.) protegidos con Fmoc, en DMF (5 ml), generados por medio de
DIC. Antes de cada uno de los últimos cinco acoplamientos, se lavó
la resina con una solución de Dhbt-OH (80 mg en 25
ml) con objeto de seguir la desaparición del color amarillo a
medida que progresaba la reacción de acoplamiento. Cuando el color
amarillo ya no fue visible, se interrumpieron los acoplamientos
lavando la resina con DMF (5 x 5 ml, 5 minutos cada uno). A
continuación se comprobaron las acilaciones mediante el ensayo de
la ninhidrina a 80ºC tal como se ha descrito previamente. Una vez
completada la síntesis, se lavó el péptido-resina
con DMF (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), DCM (3 x 5 ml, 1 minuto
cada uno), dietiléter (3 x 5 ml, 1 minuto cada uno), y se secó al
vacío.
El péptido se separó de la resina tal como se ha
descrito más arriba y se liofilizó a partir de ácido acético. El
producto liofilizado crudo se analizó mediante HPLC y se halló que
era homogéneo, sin secuencias de supresión ni protegidas con Fmoc.
Se halló que la pureza era superior al 98%, y la identidad del
péptido se confirmó mediante ES-MS. Rendimiento:
84%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- AM,
- ácido p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacético
- At,
- 7-azabenzotriazol-1-ilo
- Boc,
- ter-butiloxicarbonilo
- BOP,
- benzotriazolil-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio hexafluorofosfato
- Bpoc,
- bifenilpropiloxicarbonilo
- Bt,
- benzotriazol-1-il
- tBu,
- ter-butilo
- DBU,
- diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno
- Ddz,
- 3,5-dimetoxifenilisopropiloxicarbonilo
- DCC,
- diciclohexilcarbodiimida
- DCM,
- diclorometano
- DIC,
- diisopropilcarbodiimida
- DIEA,
- N,N-diisopropiletilamina
- DMAP,
- 4-(N,N-dimetilamino)piridina
- Dhbt-OH,
- 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
- DMF,
- N,N-dimetilformamida
- Dts,
- ditiasuccinilo
- EDT,
- etanoditiol
- FAB,
- bombardeo con átomos rápidos
- Fmoc,
- 9-fluoroenilmetiloxicarbonilo
- HATU,
- hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- HBTU,
- hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- HMPA,
- ácido 4-hidroximetilfenoxiacético
- HMPB,
- ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)-butírico
- HObt,
- 1-hidroxibenzotriazola
- HOAt,
- 1-hidroxi-7-azobenzotriazola
- HPLC,
- cromatografía líquida de elevadas prestaciones
- MCPS,
- síntesis peptídica en múltiples columnas
- MHC,
- complejo de histocompatibilidad principal
- MMa,
- ácido 4-metoximandélico
- NMR,
- resonancia magnética nuclear
- NHS,
- imido éster de ácido N-hidroxi-succínico
- NMP,
- N-metilpirrolidona
- NPS,
- nitrofenilsulfenilo
- Mtr,
- 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonilo
- PAM,
- fenilacetamidometilo
- Pbf,
- 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
- PEG-PS,
- polietilenglicol injertado sobre poliestireno
- PepSin Gel,
- resina de polidimetilacrilamida funcionalizada con metiléster de sarcosina
- PepSin K,
- resina de poliacrilamida soportada sobre Kieselguhr funcionalizada con metiléster de sarcosina
- Pfp,
- pentafluorofenilo
- Pmc,
- 2,2,5,7,8-pentametilcorman-6-sulfonilo
- Poc,
- fenilisopropiloxicarbonilo
- TBTU,
- tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- TFA,
- ácido trifluoroacético
- TFE,
- trifluoretanol
- TFMSA,
- ácido trifluorometanosulfónico
- Tmz,
- 2,4,5-tetrametilbenziloxicarboxilo
1. Merrifield, R.B. (1963), J.
Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154.
2. Kent, S.B.H. (1988), Annu
Rev. Biochem. 57:957-989.
3. Larsen, B.D., Larsen, C., y
Holm, A., Peptides 1990; E. Giralt y D.
Andreu, (Eds). 1991, ESCOM Science Publishers B.V., pp.
183-185.
4. Larsen, B.D., y Holm, A.
(1994), Int. J. Peptide & Protein Res.
43:1-9.
5. Due Larsen, B., Christensen,
D.H., Holm, A., Zillmer, R., y Faurskov, O.
(1993), J. Amer. Chem. Soc.
115:6247-6253.
6. Chou, P.Y. y Fasman, G.D.
(1978), Annu. Rev. Biochem.
47:251-276.
7. Dryland, A. y Sheppard, R.C.
(1986), J. Chem. Soc. Perkin Trans.
1:125-137.
8. Merrifield, R.B., Singer, J. y
Chait, B.T. (1988) Anal. Biochem.
174:399-414.
9. Cameron, L.R., Meldal, M. y
Sheppard, R.C. (1987), J. Chem. Soc. Chem.
Commun, 270-272.
10. Meldal, M. (1993), Peptides
1993; Schneider, C.H. y Eberle, A.N. (Eds). 1993,
ESCOM Science Publishers B.V., pp. 61-62.
11. Sarin, V.K., Kent, S.B.H.,
Tam, J.P. y Merrifield, R.B. (1981), Anal.
Biochem., 117:147-157.
12. Carpino, L.A. y Han, G.Y.
(1972), J. Org. Chem.
37:3404-3409.
13. Stewart, J.M. y Young, J.D.,
"Solid phase peptide synthesis", Pierce Chemical Company
(1984).
114. Cameron, L., Meldal, M. y
Sheppard, R.C. (1987), J. Chem. Soc. Chem.
Commun., 270-272.
15. Meldal, M., Bisgaard Holm, C.,
Boejesen, G., Haysteen Jakobsen, M. y Holm, A.
(1993), Int. J. Peptide and Protein Res.
41:250-260.
16. McKenzie, A., Pirie, D.J.C.
(1936), Berichte 69:868.
17. Knorr, E. (1904),
Berichte 37:3172.
18. "Peptides: Synthesis, structures and
applications." Gutte, B., Ed., Academic Press Inc.
1995.
Claims (26)
1. Proceso para la producción de péptidos
X-AA_{1}-AA_{2}
...
AA_{n}-Y
en
donde
AA es un residuo L- o
D-aminoácido,
X es hidrógeno o un grupo amino protector, y
Y es OH, NH_{2}, y n es un entero mayor de
2,
mediante síntesis en fase sólida,
en donde el aminoácido C-terminal, en forma de
derivado reactivo
N-\alpha-protegido y si es
necesario protegido en su cadena lateral, se acopla a un soporte
sólido o un polímero, opcionalmente por medio de un eslabón,
subsiguientemente se
N-\alpha-desprotege, y a partir
de ese momento los subsiguientes aminoácidos que forman la
secuencia peptídica se acoplan paso a paso, o se acoplan como
fragmento peptídico en forma de derivados o fragmentos reactivos
convenientemente protegidos, en donde el grupo
N-\alpha-protector se retira a
continuación de formarse el péptido deseado, y el péptido se separa
del soporte sólido, caracterizado en que el proceso
comprende
además,
- seleccionar una pre-secuencia que comprende de 3 a 9 residuos seleccionados independientemente de entre los aminoácidos que tienen una funcionalidad de la cadena lateral que está protegida durante los pasos de acoplamiento y que tienen un factor de propensión P\alpha > 0,57 y un factor de propensión P\beta \leq 1,10, comprendiendo la parte C-terminal de dicho péptido la pre-secuencia, y
- cortar dicha pre-secuencia del péptido formado.
2. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde los aminoácidos en la pre-secuencia se escogen
de entre aminoácidos que tienen una funcionalidad de cadena
lateral que es un grupo carboxi, carboxamido, amino, hidroxi,
guanidino, sulfuro o imidazol.
3. El proceso acorde con la reivindicación 2, en
donde los aminoácidos que forman parte de la
pre-secuencia se seleccionan independientemente de
entre Lys, Glu, Asp, Ser, His, Asn, Arg, Met y Gln.
4. El proceso acorde con la reivindicación 3, en
donde los aminoácidos son, o bien exclusivamente Lys o Glu, o una
secuencia (Glu)q(Lys)p, en donde p+q es de 3 a
9, preferiblemente de 6 a 9, y el orden de Lys y Glu se escoge
arbitrariamente.
5. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde el grupo protector del N-\alpha amino es
Fmoc, Boc, o cualquier otro grupo protector apropiado.
6. El proceso acorde con la reivindicación 5, en
donde el grupo protector del N-\alpha amino es
Fmoc o Boc.
7. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo carboxi, el cual
está convenientemente protegido, preferiblemente con tBu.
8. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo amino, el cual está
convenientemente protegido, preferiblemente con Boc.
9. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo hidroxi, el cual
está convenientemente protegido, preferiblemente con tBu.
10. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo carboxamido
protegido con a) benzhidrilo, b) tritilo, c) tBu.
11. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo guanidino protegido
con
4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonilo
(Mtr),
2,2,5,7,8-pentametil-corman-6-sulfonilo
(Pmc), o
2,2,4,6,7-pentametil-dihidro-benzofuran-5-sulfonilo
(Pbf).
12. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la funcionalidad de la cadena lateral en la
pre-secuencia comprende un grupo imidazol protegido
con Boc.
13. El proceso acorde con la reivindicación 5, en
donde los grupos Fmoc se desprotegen por medio de una amina tal
como la piperidina o la
diazabicicl[5,4,0]undec-7-ene
(DBU).
14. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde los grupos protectores de la cadena lateral se desprotegen
por medio de un ácido tal como el ácido trifluoroacético (TFA), el
ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA), HBr, HCl o HF.
15. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde el soporte sólido se selecciona a partir de resinas
funcionalizadas tales como el poliestireno, la poliacrilamida, el
polietilenglicol, la celulosa, el polietileno, el látex o las
"dynabeads".
16. El proceso acorde con la reivindicación 15,
en donde las resinas funcionalizadas se seleccionan de entre
resinas de PEG-PS (polietilenglicol injertado sobre
poliestireno) o de polimetilacrilamida.
17. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la pre-secuencia comprende de 5 a 7 residuos
aminoácidos.
18. El proceso acorde con la reivindicación 15,
en donde la aminoácido C-terminal se une al soporte
sólido por medio de un eslabón común, tal como la
2,4-dimetoxi-4'-hidroxi-benzofenona,
el ácido
4-(4-hidroxi-metil-3-metoxifenoxi)-butírico
(HMPB), el ácido 4-hidroximetilbenzoico, el ácido
4-hidroximetilfenoxiacético (HMPA), el ácido
3-(4-hidroximetilfenoxi)propiónico, o el
ácido
p-[(R,S)-a[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]-fenoxiacético
(AM).
19. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la síntesis se realiza por lotes.
20. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde el proceso se realiza de forma continuada en un sintetizador
de péptidos automatizado o semi-automatizado.
21. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde los pasos de acoplamiento se realizan en presencia de un
solvente seleccionado de entre acetonitrilo,
N,N-dimetilformamida (DMF),
N-metilpirrolidona (NMP), diclorometano (DCM),
trifluoroetanol (TFE), etanol, metanol, agua, mezclas de los
solventes mencionados, con o sin aditivos tales como el perclorato
o el etilencarbonato.
22. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde los acoplamientos entre dos aminoácidos, un aminoácido y la
secuencia peptídica formada anteriormente, o un fragmento peptídico
y la secuencia peptídica formada anteriormente, se lleva a cabo de
acuerdo con los procedimientos de condensación usuales, tales como
el procedimiento de la azida, el procedimiento mixto de ácido y
anhídrido, el procedimiento del anhídrido simétrico, el
procedimiento de la carbodiimida, el procedimiento del éster
activo, tal como el pentafluorofenilo (Pfp),
3,4-dihidro-4-oxobenzotriazin-3-ilo
(Dhbt), benzotriazol-1-ilo (Bt),
7-azabenzotriazol-ilo (At),
4-nitrofenilo, imido ésteres del ácido
N-hidroxisuccínico (NHS), cloruros de ácidos,
fluoruros de ácidos, activación in situ mediante
hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), hexafluorofosfato de
O-(benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HBTU), tetrafluoroborato de
O-(benzotriazol-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(TBTU), o hexafluorofosfato de
benzotriazolil-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
(BOP).
23. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde el péptido se separa del soporte por medio de un ácido tal
como el ácido trifluoroacético (TFA), el ácido
trifluorometanosulfónico (TFMSA), el bromuro de hidrógeno (HBr), el
cloruro de hidrógeno (HCl), el fluoruro de hidrógeno (HF), o una
base tal como el amoníaco, la hidrazina, un alcóxido o un
hidróxido.
24. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde el péptido se separa del soporte por medio de la
fotolisis.
25. El proceso acorde con la reivindicación 1, en
donde la pre-secuencia se separa enzimáticamente
del péptido formado.
26. El proceso acorde con la reivindicación 24,
en donde el enzima se selecciona de entre las carboxi- y
endopeptidasas apropiadas.
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| US7550425B2 (en) | 2000-06-16 | 2009-06-23 | Zealand Pharma A/S | Diuretic peptide conjugates |
| DK1737889T3 (da) | 2004-10-19 | 2011-01-03 | Lonza Ag | Fremgangsmåde til fastfase-peptidsyntese |
| EP2295451A1 (en) | 2005-05-04 | 2011-03-16 | Zealand Pharma A/S | Glucagon-like-peptide (GLP-2) analogues |
| GB0514071D0 (en) | 2005-07-07 | 2005-08-17 | Zealand Pharma As | N- or C- terminally modified small peptides |
| WO2007060860A1 (ja) * | 2005-11-22 | 2007-05-31 | Nihon University | ピロールイミダゾールポリアミドの固相自動合成 |
| JP5473334B2 (ja) | 2005-12-23 | 2014-04-16 | ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ | 修飾リジン模倣化合物 |
| KR100859972B1 (ko) * | 2006-02-20 | 2008-09-25 | 이화여자대학교 산학협력단 | 막투과 단백질 도메인 펩타이드 |
| SG170022A1 (en) * | 2006-03-29 | 2011-04-29 | Otsuka Chemical Co Ltd | Method for production of peptide thioester compound |
| EA023886B1 (ru) | 2006-11-08 | 2016-07-29 | Зеаланд Фарма А/С | Селективные аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2) |
| DK2158214T3 (da) | 2007-06-15 | 2011-12-05 | Zealand Pharma As | Glukagonanaloger |
| EA020537B1 (ru) | 2008-12-15 | 2014-11-28 | Зилэнд Фарма А/С | Аналоги глюкагона |
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| US9156901B2 (en) | 2009-07-13 | 2015-10-13 | Ditte Riber | Acylated glucagon analogues |
| JP5969461B2 (ja) | 2010-04-27 | 2016-08-17 | ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ | Ｇｌｐ−１受容体作動薬とガストリンとのペプチド複合体及びその使用 |
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| CN103068841A (zh) | 2010-06-24 | 2013-04-24 | 西兰制药公司 | 胰高血糖素类似物 |
| US20140011733A1 (en) | 2011-01-20 | 2014-01-09 | Zealand Pharma A/S | Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues |
| CA2853884A1 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Zealand Pharma A/S | Glp-1 receptor agonist peptide gastrin conjugates |
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| EP2809339A2 (en) | 2012-02-03 | 2014-12-10 | Zealand Pharma A/S | Ghrelin analogues |
| SG11201407137PA (en) | 2012-05-03 | 2014-11-27 | Zealand Pharma As | Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods |
| AU2013255752B2 (en) | 2012-05-03 | 2017-11-09 | Zealand Pharma A/S | Glucagon-like-peptide-2 (GLP-2) analogues |
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| TWI608013B (zh) | 2012-09-17 | 2017-12-11 | 西蘭製藥公司 | 升糖素類似物 |
| JP6472784B2 (ja) | 2013-03-12 | 2019-02-20 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 細胞内在化を誘導するためのｃｄ２０結合免疫毒素及びそれを用いる方法 |
| US9695214B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Solid phase peptide synthesis processes and associated systems |
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| SG11201506885UA (en) | 2013-03-21 | 2015-09-29 | Sanofi Aventis Deutschland | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
| CA2907454C (en) | 2013-03-21 | 2021-05-04 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of hydantoin containing peptide products |
| BR112016008115B1 (pt) | 2013-10-17 | 2024-03-12 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Análogos de glucagon acilados |
| US9988429B2 (en) | 2013-10-17 | 2018-06-05 | Zealand Pharma A/S | Glucagon analogues |
| WO2015067715A2 (en) | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Zealand Pharma A/S | Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods |
| BR112016009995B1 (pt) | 2013-11-06 | 2023-04-18 | Zealand Pharma A/S | Compostos agonistas triplos glucagon-glp-1-gip |
| US10435474B2 (en) | 2013-12-24 | 2019-10-08 | Ossianix, Inc. | Baff selective binding compounds and related methods |
| US20160340394A1 (en) | 2014-01-27 | 2016-11-24 | Molecular Templates, Inc. | De-immunized shiga toxin a subunit effector polypeptides for applications in mammals |
| EP3116904B1 (en) | 2014-03-11 | 2020-05-06 | Molecular Templates, Inc. | Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding her2/neu/erbb2 |
| ES2723774T3 (es) | 2014-03-11 | 2019-09-02 | Molecular Templates Inc | Proteínas que comprenden regiones de unión, regiones efectoras de la subunidad A de toxina Shiga y motivos señal de localización de retículo endoplasmático carboxi terminal |
| CN113831416A (zh) | 2014-06-11 | 2021-12-24 | 分子模板公司 | 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子 |
| WO2015200883A2 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Ossianix, Inc. | Semi-synthetic nurse shark vnar libraries for making and using selective binding compounds |
| JP6898231B6 (ja) | 2014-10-29 | 2021-07-28 | ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ | Ｇｉｐアゴニスト化合物及び方法 |
| EP3218411B1 (en) | 2014-11-14 | 2022-01-12 | Ossianix, Inc. | Variable new antigen receptors (vnars) directed against transferrin receptor (tfr) and their use |
| CN108064247B (zh) | 2015-02-05 | 2022-06-03 | 分子模板公司 | 包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物 |
| AU2016232218B2 (en) | 2015-03-18 | 2020-09-10 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Amylin analogues |
| GB201506380D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Serodus Asa | Materials and methods for treatment of pulmonary hypertension |
| ES2763329T3 (es) | 2015-04-16 | 2020-05-28 | Zealand Pharma As | Análogo de glucagón acilado |
| LT3303373T (lt) | 2015-05-30 | 2020-07-10 | Molecular Templates, Inc. | Deimunizuoto shiga toksino a subvieneto karkasai ir juos apimančios ląstelės taikinio molekulės |
| CA2991259A1 (en) | 2015-07-26 | 2017-02-02 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
| JP2018530543A (ja) | 2015-09-17 | 2018-10-18 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 固相ペプチド合成のための方法およびシステム |
| WO2018031424A1 (en) | 2016-08-06 | 2018-02-15 | Ossianix, Inc. | In vivo methods for selecting peptides that cross the blood brain barrier, related compositions and methods of use |
| TWI784968B (zh) | 2016-09-09 | 2022-12-01 | 丹麥商西蘭製藥公司 | 澱粉素類似物 |
| CA3044915A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018103868A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Acylated glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018104559A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2018104558A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Zealand Pharma A/S | Acylated glp-1/glp-2 dual agonists |
| KR102502040B1 (ko) | 2016-12-09 | 2023-02-24 | 질랜드 파마 에이/에스 | 아실화 glp-1/glp-2 이중 효능제 |
| JP7082424B2 (ja) | 2017-01-25 | 2022-06-08 | モレキュラー テンプレーツ，インク． | 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子 |
| EP3704149A1 (en) | 2017-11-02 | 2020-09-09 | Ossianix, Inc. | Improved tfr-selective binding peptides capable of crossing the blood brain barrier |
| EP3759120A1 (en) | 2018-02-27 | 2021-01-06 | Zp Spv 3 K/S | Compstatin analogues and their medical uses |
| EP3573652A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-12-04 | Molecular Templates, Inc. | Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds |
| WO2019246288A1 (en) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | Ossianix, Inc. | Anti-cd98hc vnars for crossing the blood brain barrier and type iv vnar libraries |
| US20210395381A1 (en) | 2018-09-14 | 2021-12-23 | Ossianix, Inc. | Tfr-specific binding moieties and transcytosis method to select vnars that cross cellular barriers |
| WO2020081493A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins |
| EP3914610A1 (en) | 2019-01-23 | 2021-12-01 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors |
| WO2020249782A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | Zealand Pharma A/S | Pharmaceutical parenteral composition of dual glp1/2 agonist |
| EP4272751A3 (en) | 2019-08-27 | 2024-02-14 | Zp Spv 3 K/S | Compstatin analogues and their medical uses |
| WO2021055816A1 (en) | 2019-09-18 | 2021-03-25 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds |
| JP2022548956A (ja) | 2019-09-20 | 2022-11-22 | ジーランド・ファーマ・ア／エス | Ｋｖ１．３遮断剤 |
| WO2021102445A1 (en) | 2019-11-24 | 2021-05-27 | Molecular Templates, Inc. | Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents |
| US20230129788A1 (en) | 2020-03-30 | 2023-04-27 | Zealand Pharma A/S | Glp-1/glp-2 dual agonists |
| WO2021198195A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Zealand Pharma A/S | Agonist combination |
| CN116209671A (zh) | 2020-07-16 | 2023-06-02 | 西兰制药第三特殊目的公司 | 补体因子c3的抑制剂及其医学用途 |
| WO2022103769A1 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Ossianix, Inc. | High affinity human and monkey specific tfr-1 vnars |
| WO2022129312A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Zealand Pharma A/S | Pharmaceutical composition of glp-1/glp-2 dual agonists |
| KR20230121822A (ko) | 2020-12-16 | 2023-08-21 | 질랜드 파마 에이/에스 | Glp-1/glp-2 이중 효능제의 약학적 조성물 |
| JP2023553561A (ja) | 2020-12-16 | 2023-12-22 | ジーランド ファーマ エー／エス | Ｇｌｐ－１／ｇｌｐ－２デュアルアゴニストの医薬組成物 |
| EP4294424A1 (en) | 2021-02-18 | 2023-12-27 | Zealand Pharma A/S | Composition for treating short bowel syndrome |
| CA3213295A1 (en) | 2021-03-17 | 2022-09-22 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens |
| KR20230159403A (ko) | 2021-03-23 | 2023-11-21 | 질랜드 파마 에이/에스 | Kv1.3 차단제 |
| WO2022260877A1 (en) | 2021-06-07 | 2022-12-15 | Ossianix, Inc. | Shark vnars for treating covid-19 |
| WO2022262837A1 (zh) | 2021-06-18 | 2022-12-22 | 北京拓界生物医药科技有限公司 | 胰高血糖素类似物及其医药用途 |
| WO2023023166A1 (en) | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Ossianix, Inc. | Deimmunized vnar domains and scaffolds |
| AU2022339044A1 (en) | 2021-09-03 | 2024-03-14 | Zealand Pharma A/S | Dosage regime |
| TW202332682A (zh) | 2021-12-01 | 2023-08-16 | 丹麥商西蘭製藥公司 | 介白素—２３受體之胜肽抑制劑 |
| WO2024068848A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Zealand Pharma A/S | Methods for treating obesity |
| WO2024083919A1 (en) | 2022-10-18 | 2024-04-25 | Zealand Pharma A/S | Inhibitors |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5116666A (es) * | 1974-07-30 | 1976-02-10 | Shionogi Seiyaku Kk | |
| US5021550A (en) * | 1986-10-07 | 1991-06-04 | Thomas Jefferson University | Method for preventing deletion sequences in solid phase synthesis |
| JP2807287B2 (ja) * | 1989-10-13 | 1998-10-08 | 株式会社医学生物学研究所 | ペプチドおよびその用途 |
| JP3929484B2 (ja) * | 1993-09-14 | 2007-06-13 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | エコチンおよびその同族体を含む医薬的組成物 |
| US7176282B1 (en) * | 1996-09-09 | 2007-02-13 | Zealand Pharma A/S | Solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis |
| CA2321026A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
-
1997
- 1997-09-09 EP EP97939974A patent/EP0929567B1/en not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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