JP2018530543A - 固相ペプチド合成のための方法およびシステム - Google Patents

Abstract

固相ペプチド合成を制御するための方法およびシステムを概略的に記載する。固相ペプチド合成の制御は、固相ペプチド合成システムで生じる１つまたは複数の反応および／またはプロセス（例えば、試薬除去）からのフィードバックを使用する。検出器は、固相ペプチド合成システムの検出ゾーンを横断して流れる１つまたは複数の流体を検出し得、１つまたは複数の信号を、流体に対応して発生し得る。例えば、反応器の下流に位置決めされた電磁放射線検出器は、脱保護反応器の後に反応器から出て行く流体を検出し信号を生成し得る。一部の実施形態では、少なくとも一部では信号から誘導された情報に基づいて、固相ペプチド合成システムで生じる１つまたは複数の後続の反応および／またはプロセスの前および／または最中にシステムのパラメータを変調し得、固相ペプチド合成システムで生ずるにおける問題を決定し補正し得る。

Description

関連出願
本出願は、２０１５年９月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／２２０，２３３号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張しており、この仮出願の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に参考として援用される。

固相ペプチド合成でフィードバック制御を行うための方法およびシステムについて、概略的に記載する。

背景
固相ペプチド合成は、固体支持体上にペプチドを化学的に合成するのに使用されるプロセスである。固相ペプチド合成では、アミノ酸またはペプチドが、通常はＣ末端を介して固体支持体に結合される。結合されたアミノ酸またはペプチドには、カップリング反応を介して新しいアミノ酸が付加される。意図しない反応の可能性があるので、保護基が典型的には使用される。今日までに、固相ペプチド合成は、化学的ペプチド合成の標準的な実施手法になっている。固相ペプチド合成の広範な有用性は、自動化固相ペプチド合成の商業的な成功によって実証されてきた。固相ペプチド合成は３０年以上にわたり使用されてきたが、個々のカップリング反応に対する高度な制御をもたらしかつ／または副反応を最小限に抑える自動化固相ペプチド合成器は、未だ開発されていない。したがって、改善されたプロセスおよびシステムが必要とされている。

要旨
固相ペプチド合成法および関連するシステムについて、概略的に記載する。ある特定の実施形態は、フィードバック制御するためのシステムおよび方法に関する。本発明の主題は、いくつかの場合、相互に関連した生成物、特定の課題に対する代替の解決策、および／または、１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を含む。

ひと組の実施形態では、方法が提供される。一実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、カップリング反応が反応器内で生じた後に、脱保護試薬を含む流体流を反応器に通して流すことであって、反応器が、固体支持体上に固定化された複数のペプチドを含むこと；信号を生成するために、流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を、反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで検出すること；ならびに少なくとも一部では信号から誘導された情報に基づいて、反応器内での後続のカップリング反応の前および／または最中に、システムのパラメータを変調させることを含む。

別の実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、ペプチド合成反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで第１および第２の信号を生成すること、第１の信号を第２の信号および／または参照信号と比較すること、ならびに少なくとも一部では比較するステップから誘導された情報に基づいて、反応器内での反応の前および／または最中にシステムのパラメータを変調させることを含み、パラメータは、流量、反応時間、温度、反応物のタイプ、反応物の濃度、反応物の比、添加剤の添加、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

さらに別の実施形態では、ペプチド合成システム内でペプチドを形成する方法は、ペプチド断片を形成するために、アミノ酸と、固体支持体上に固定化されたアミノ酸残基との間のカップリング反応の後に、脱保護試薬を含む流体流を反応器に通して流すこと；信号を生成するために、流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を、反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで検出すること；ならびに少なくとも一部では信号から誘導された強度成分および時間成分に基づいて、反応器内でペプチド断片を含むペプチドを形成する前にシステムのパラメータを変調させることを含む。

別の組の実施形態では、ペプチド合成器システムが提供される。一実施形態では、ペプチド合成器システムは、第１の試薬チャネルに接続された第１の試薬リザーバと、第２の試薬チャネルに接続された第２の試薬リザーバと、第１および第２の試薬リザーバの下流に位置決めされ、流体接続されているペプチド合成反応器と、反応器に接続された送出チャネルであって、第１および第２のチャネルがそれぞれ接合部で送出チャネルの上流にあり、流体接続されている送出チャネルと、反応器の下流にあり、流体接続されている流出物チャネルと、流出物チャネルに接続され、流出物チャネルの下流にある電磁放射線検出器と、電磁放射線検出器と電気通信する制御器であって、システムの１つまたは複数のパラメータを制御するよう構成された制御器とを含む。

本発明のその他の利点および新規な特徴は、添付される図面と併せて考慮すると、本発明の様々な非限定的実施形態に関する以下の詳細な記述から明らかになるであろう。本明細書および参照により組み込まれる文書が、相反するおよび／または矛盾する開示を含む場合、本明細書が優先するものとする。

本発明の非限定的な実施形態について、概略的でありかつ縮尺に合わせて描かれていないものである、添付される図面を参照しながら、例として記載する。図面中、図示される同一のまたはほぼ同一の構成要素のそれぞれは、典型的には単一の符号によって表される。明瞭にする目的で、全ての図で全ての構成要素に標識しているわけではなく、当業者が本発明を理解することを可能にするのに必ずしも図示が必要ではない場合には、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されているわけでもない。

図１Ａは、ひと組の実施形態によるペプチド合成を行うためのシステムの概略図である。 図１Ｂは、ひと組の実施形態によるペプチド合成を行うためのシステムの概略図である。 図２Ａは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図２Ａは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図２Ｂは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図２Ｂは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図２Ｃは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図２Ｃは、ある特定の実施形態によるペプチド合成の概略図である。 図３Ａは、ひと組の実施形態による、ある特定のペプチド合成ステップに対応する信号の概略図である。図３Ｂは、ひと組の実施形態による、ある特定のペプチド合成ステップに対応する信号の概略図である。図３Ｃは、ひと組の実施形態による、ある特定のペプチド合成ステップに対応する信号の概略図である。 図４は、ある特定の実施形態による、電磁放射線検出器を有する自動化流動ペプチド合成器の概略図である。 図５は、ある特定に実施形態による、１９アミノ酸ペプチドの合成中に検出器を使用して決定された時間に対する相対吸光度のグラフである。 図６Ａは、ある特定の実施形態による、ＨＡＴＵを使用したときのＥＥＴＩ−ＩＩの合成から得たジベンゾフルベン信号および質量スペクトルのＵＶ軌跡である。図６Ｂは、ある特定の実施形態による、ＨＡＴＵを使用したときのＥＥＴＩ−ＩＩの合成から得たジベンゾフルベン信号および質量スペクトルのＵＶ軌跡である。 図７Ａは、ひと組の実施形態による、ある特定の反応条件下でのＵＶ軌跡である。図７Ｂは、ひと組の実施形態による、ある特定の反応条件下でのＵＶ軌跡である。 図７Ｃは、ひと組の実施形態による、液体クロマトグラムである。図７Ｄは、ひと組の実施形態による、吸光度対カップリング数のグラフである。 図８Ａは、ひと組の実施形態による、自動化流動固相合成器の写真である。 図８Ｂは、ある特定の実施形態による、ペプチド合成のサイクル図である。 図８Ｃは、ひと組の実施形態による、アシル担体タンパク質（６５〜７４）合成の粗製生成物についてのＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。 図８Ｄは、ひと組の実施形態による、１つのカップリングおよび脱保護サイクルについてのＵＶ吸光度スペクトルである。 図９Ａは、ひと組の実施形態による、異なる方法を介して合成された成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ：Growth Hormone Releasing Hormone）についてのＬＣ−ＭＳクロマトグラフである。 図９Ｂは、ひと組の実施形態による、異なる方法を使用して合成されたインスリンＢ鎖についてのＬＣ−ＭＳクロマトグラフである。 図９Ｃは、ひと組の実施形態による、ＧＨＲＨおよびインスリンＢ鎖についての合成の各サイクルについての、Ｆｍｏｃ脱保護ＵＶデータのプロットである。 図１０Ａは、ひと組の実施形態による、自動化流動ペプチド合成器の加熱部分の図である。図１０Ｂは、ひと組の実施形態による、方法Ｂを使用した流動合成からの代表的な試料（上）と、真正Ｃｙｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とを示す、モデルペプチドＧＣＦのジアステレオマー分析である。 図１０Ｃは、ひと組の実施形態による、方法Ｂを使用した、流量（ｍｌ／分）の関数としてのＣｙｓジアステレオマー形成のパーセンテージのグラフである。図１０Ｄは、ひと組の実施形態による、方法Ｂを使用した流動合成からの代表的な試料（上）と、真正Ｃｙｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とを示す、モデルペプチドＦＨＬのジアステレオマー分析である。 図１０Ｅは、流量（ｍｌ／分）の関数としての、ヒスチジンジアステレオマー形成のパーセンテージのグラフである。 図１１Ａは、ひと組の実施形態による、方法Ｂを使用したＪＲ１０量体（ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭ）の初期合成について記録したときの、ＵＶ吸光度スペクトルである。 図１１Ｂは、ひと組の実施形態による、ひと組の実施形態の分析によるカップリングに対する相対主ピークパーセンテージのグラフである。図１１Ｃは、ひと組の実施形態による、樹脂負荷の関数としてＵＶ吸光度スペクトルから得た残基９から１０までの脱保護ピーク面積の変化のプロットである。 図１１Ｄは、ひと組の実施形態による、ＬＣ−ＭＳから決定された樹脂負荷の関数としてのＴｒｐ欠失のプロットである。図１１Ｅは、ひと組の実施形態による、０．４５ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷を用いた手動式バッチにより調製されたＪＲ１０量体に関する、最終粗製生成物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。 図１１Ｆは、ひと組の実施形態による、０．４５ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷を用いた自動化流動により調製されたＪＲ１０量体に関する、最終粗製生成物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。図１１Ｇは、０．２７ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷を用いた自動化流動により調製されたＪＲ１０量体に関する、最終粗製生成物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムである。

詳細な説明
固相ペプチド合成を制御するための方法およびシステムについて、概略的に記載する。固相ペプチド合成の制御では、固相ペプチド合成システム内で生ずる１つまたは複数の反応および／またはプロセス（例えば、試薬除去）のフィードバックを使用する。一部の実施形態では、検出器は、固相ペプチド合成システムの検出ゾーンを横断して流れる１種または複数の流体を検出してもよく、流体（単数または複数）に対応する１つまたは複数の信号を生成してもよい。例えば、反応器の下流に位置決めされた電磁放射線検出器は、脱保護反応の後に反応器から出て行く流体を検出し、信号（単数または複数）を生成してもよい。一部の実施形態では、少なくとも一部では信号（単数または複数）から誘導された情報に基づいて、固相ペプチド合成システム内で生ずる１つまたは複数の後続の反応および／またはプロセスの前および／または最中に、システムのパラメータを変調させてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法およびシステムは、固相ペプチド合成システムで生ずる反応（例えば、カップリング反応）の課題（例えば、凝集、切断、欠失）を決定し、補正するように、品質管理を実行するのに使用することができる。

固相ペプチド合成は、固体支持体上に固定化されているペプチドにアミノ酸残基を付加する公知のプロセスである。一般に、固相ペプチド合成は、アミノ酸付加サイクルを繰り返すことを含む。各アミノ酸付加サイクルは、ペプチドに単一のアミノ酸残基を付加することが意図される。アミノ酸付加サイクルは、脱保護反応、カップリング反応、および各反応後の１つまたは複数の任意選択の試薬除去（例えば、洗浄）ステップを含んでいてもよい。ペプチドは一度に一アミノ酸ずつ合成されるので、各アミノ酸付加サイクルの収率は、ペプチドについての全収率に著しい影響を及ぼす。例えば、２６アミノ酸を含有するペプチドの合成では、活性化剤によるキャッピングなどの第３のアミノ酸付加サイクル中のカップリング反応における課題によって、補正なしでは、後続のカップリング反応を妨げ、ペプチドについて０％の収率をもたらす可能性がある。別の例として、固相ペプチド合成システムにおける全てのカップリング反応に関して選択された一般的反応条件は、ある特定のアミノ酸には不適切である可能性があり、それらのアミノ酸の付加についてより低いカップリング収率を、したがってより低い全体収率をもたらし得る。固相ペプチド合成システムで生ずる課題を決定し、補正するため、品質管理を実行することが可能な固相ペプチド合成法およびシステムの必要性がある。

いくつかの従来の固相ペプチド合成システムは、反応を停止させるべきということを示すため、反応器からの流出物を周期的にモニタリングすることにより、この課題に対処しようとしてきた。しかしこれら従来のシステムの多くは、複雑および／または費用のかかる方法および設備を必要とせずに、反応で生ずる課題を識別し、モニタリングの結果から補正動作に移行し、かつ／またはモニタリングから誘導された情報に基づいて補正動作を行うことができない。

ある特定の本発明の概念は、ある特定の反応で生ずる課題の特定、モニタリングの結果から補正動作への移行、および／または少なくとも一部ではモニタリングから誘導される情報に基づく補正動作の実施を可能にする、固相ペプチド合成の方法およびシステムに関する。図１は、本明細書に記載される本発明の方法のある特定のもの行うのに使用することができる、例示的なシステム５の概略図である。本明細書に記載されるシステムおよび方法（例えば、図１中のシステム５）は、ある特定の実施形態では、流動ベースの合成（多くの伝統的な固相ペプチド合成システムで用いられる、バッチベースの合成とは対照的に）を含む。一部のそのような実施形態では、流体（１つの形態または別の形態）が反応器を通って検出ゾーン上を実質的に連続的に輸送される、連続ペプチド合成を行うことができる。例えば、ある特定の実施形態では、試薬および濯ぎ流体を、代わりにおよび連続的に検出ゾーン上に輸送してもよい。

一部の実施形態では、固相ペプチド合成システム５は、反応器１０を含んでいてもよい。反応器は、固体支持体１５上に固定化されたペプチド２０を含んでいてもよい。一部の実施形態では、図１に示されるように、試薬リザーバ（例えば、２５、３０）を、反応器１０の上流に位置付け、反応器に流体接続しもよい。例えば、第１の試薬リザーバ２５および第２の試薬リザーバ３０は、それぞれ、反応器１０に接続された送出チャネル４５に接続される第１の試薬チャネル３５および第２の試薬チャネル４０を介して反応器に流体接続されていてもよい。試薬リザーバはペプチド合成に必要な試薬の少なくとも一部を含有していてもよい。例えば、試薬リザーバ２５はアミノ酸を含有していてもよく、試薬リザーバ３０は活性化剤（例えば、ウロニウム活性化剤）を含有していてもよい。システムは、塩基を含有し得る任意選択の試薬リザーバ５０、および／またはピペリジンもしくはトリフルオロ酢酸などの脱保護試薬を含有し得る任意選択の試薬リザーバ５５を含んでいてもよい。システムは、例えば試薬除去ステップで使用され得るジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒を含有し得る、反応器に流体接続された図示されない任意選択の試薬リザーバを含んでいてもよい。

一部の実施形態では、固相ペプチド合成システム６は、分子間の１つまたは複数の反応を促進および／または容易にするよう構成された反応器を含んでいてもよい。例えば図１Ｂに示されるように、システム６は、例えば反応動態および／または反応時間を変調させることによって、ある特定の試薬および／またはその反応生成物の間の１つまたは複数の化学反応を促進および／または容易にするよう構成された、反応器８を含んでいてもよい。例えば反応器８は、反応器内の流体流の温度プロファイルが制御され、１つまたは複数の温度依存性反応速度を変調（例えば、上昇、維持、および／または低下）させて所望の反応速度（単数または複数）、反応生成物（単数または複数）、反応生成物（単数または複数）の量、および／または反応収率（単数または複数）を実現することができるように、構成されてもよい。一部の実施形態では、図１Ｂに示されるように、反応リザーバ（例えば、１６、１８）を反応器８の上流に位置付け、反応器に流体接続してもよい。例えば、第１の試薬リザーバ１６および第２の試薬リザーバ１８は、それぞれ、反応器８に接続された送出チャネル２６に接続される第１の試薬チャネル２２および第２の試薬チャネル２４を介して反応器に流体接続されていてもよい。試薬リザーバは、ペプチド合成に必要な試薬の少なくとも一部を含有していてもよい。例えば、試薬リザーバ１６はアミノ酸を含有していてもよく、試薬リザーバ３０は活性化剤（例えば、ウロニウム活性化剤）を含有していてもよい。システムは、塩基を含有し得る任意選択の試薬リザーバ２８Ａ、および／またはピペリジンもしくはトリフルオロ酢酸などの脱保護試薬を含有し得る任意選択の試薬リザーバ２８Ｂを含んでいてもよい。システムは、例えば試薬除去ステップで使用され得るジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒を含有し得る、反応器に流体接続された図示されない任意選択の試薬リザーバを含んでいてもよい。

一部の実施形態では、反応器８は、反応器８の上流に位置付けられた１つまたは複数のリザーバからの試薬間、試薬の反応生成物と試薬との間、および／または試薬の反応生成物間の化学反応を、促進および／または容易にするように構成されてもよい。ある特定の実施形態では、反応器８は、反応器８の上流に位置付けられたリザーバからの２種またはそれよりも多くの試薬間の化学反応を容易におよび／または促進してもよい。一部の実施形態では、反応器８は、加熱ゾーン（図示せず）内にあってもよく、またはその他の手法で熱源と連絡していてもよい。例えばシステム６は、加熱ゾーン（図示せず）を含んでいてもよく、その内部では反応器６内の流体流の内容物が加熱されてもよい。加熱ゾーンは、加熱器などの熱源を含んでいてもよい。一般に、加熱する任意の適切な方法は、反応器内の流体流の温度を制御するのに使用され得る。例えば、加熱ゾーンは、液体浴（例えば、水浴）、抵抗加熱器、気体対流をベースにした加熱素子、マイクロ波素子、またはエネルギーを加えることによりもしくは化学反応に起因して熱を生成するよう設計された任意のその他の適切なデバイスを含んでいてもよい。一部の実施形態では、システム６は２つまたはそれよりも多くの反応器を含んでいてもよい。例えば、図１Ｂに示されるように、システム６は、反応器１２の上流に反応器８を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、反応器８は、固体支持体上に固定化された複数のアミノ酸および／または複数のペプチドを含んでいなくてもよい。一部のそのような場合、１つまたは複数のアミノ酸残基の形成は、反応器８内で生じなくてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基の形成は、反応器１２内で生じてもよい。一部のそのような実施形態では、反応器１２は、固体支持体上に固定化されたペプチドおよび／またはアミノ酸を含有していてもよい。例えば、図１Ｂに示されるように、ペプチド１４は、固体支持体１３上に固定化されていてもよい。固体支持体１３は、反応器８内に収容されていてもよい。

簡略化のため単一のリザーバについて図１Ａおよび１Ｂに示してきたが、単一のリザーバが示されている図１Ａおよび１Ｂでは、単一のリザーバの代わりに複数のリザーバ（例えば、それぞれが異なるタイプのアミノ酸、異なるタイプの活性化剤、異なるタイプの脱保護剤、異なるタイプの塩基などを含有する）を使用できることを、理解すべきである。

一部の実施形態では、ペプチド合成は、例えば試薬リザーバから反応器（例えば、８、１０）を通して流体流を流すことを含む。例えば、脱保護試薬を含む流体流は、カップリング反応後に反応器内を流れてもよい。流体は、反応器に接続された流出物チャネルを通して反応器から出て行ってもよい。流出物チャネルは、検出ゾーン（例えば、３４、６５）に流体接続されていてもよい。ある特定の実施形態では、流出物チャネル（例えば、３２、６０）は、分離要素（例えば、サイズ排除カラム、親和性カラム）を含んでいなくてもよく、かつ／または検出ゾーンに接続されていてもよい。

一部の実施形態では、検出ゾーン（例えば、３４、６５）は、１つまたは複数の電磁放射線検出器を含んでいてもよい。検出器（単数または複数）は、反応器から出て行く１種または複数の流体の電磁吸光度および／または電磁放射を測定してもよく、流体（単数または複数）に対応する１つまたは複数の信号を生成してもよい。信号（単数または複数）は、検出器（単数または複数）と電気通信するユニット（例えば、３６、７０）に伝送されてもよい。一部の実施形態では、ユニット（例えば、３６、７０）が、システムの１つまたは複数のパラメータを制御するように構成された制御器であってもよい。そのような実施形態では、制御器は、システムの１つもしくは複数の構成要素（例えば、温度調節器、流体流動源）に、かつ／またはシステムの構成要素（単数または複数）を制御するための１つもしくは複数のプロセッサに、作動可能に関連付けられていてもよい。例えば制御器は、流量、温度、試薬タイプの選択、試薬濃度の選択、反応時間、試薬の比の選択、添加剤の添加、またはこれらの組合せを制御するための１つまたは複数のプロセッサに、作動可能に関連付けられていてもよい。任意選択で、制御器は、ユーザインターフェースおよび外部通信ユニット（例えば、ＵＳＢ）、および／またはより詳細に以下に記載されるその他の構成要素などのその他の構成要素に、作動可能に関連付けられていてもよい。ユーザインターフェースは、信号（単数または複数）を表示し、ある特定の反応に関する課題をユーザに警告し、かつ／またはユーザからの操作命令を受信するのに使用されてもよい。

本明細書で使用される、１つまたは複数のその他の構成要素に「作動可能に関連付けられた」ユニットは、そのような構成要素が互いに直接接続されており、互いに接続されもしくは取着されることなしに互いに直接物理接触しており、または互いに直接接続されておらずもしくは互いに接触していないが、機械的に、電気的に（空間を通して伝送される電磁信号を介することを含む）、または流体によって相互接続されることにより（例えば、チャネルを介して）、そのように関連付けられている構成要素でそれらが意図する機能を発揮させまたは発揮できるようになることを示す。例えば一部の実施形態では、制御器は、無線または有線電子接続を介して構成要素に電子的に連結されていてもよい。例えば制御器は、流量、温度、試薬タイプの選択、試薬濃度の選択、反応時間、試薬の比の選択、添加剤の添加、またはこれらの組合せを制御するために、無線または有線電子接続を介して１つまたは複数のプロセッサに電子的に連結されていてもよい。ある特定の実施形態では、制御器は、１つもしくは複数の流体流および／または反応器用の温度調節器に、無線または有線電子接続を介して電子的に連結されていてもよい。一部の実施形態では、制御器は、無線または有線電子接続を介して、１つまたは複数の流体流に関する流体流動源（例えば、ポンプ）および／または反応器に電子的に連結されていてもよい。ある特定の実施形態では、制御器は、試薬の１つまたは複数の選択（例えば、タイプ、濃度、比）を制御するために、無線または有線電子接続を介して１つまたは複数のプロセッサに電子的に連結されていてもよい。

一般に、３６または７０などのユニット（例えば、制御器）は、固相ペプチド合成システムで生じる１つまたは複数の反応および／またはプロセス（例えば、試薬除去ステップ）からのフィードバックの使用によって、品質管理を実行するのに使用されてもよい。例えば制御器は、１つもしくは複数の検出器から信号（単数または複数）を受信するように、１つもしくは複数の信号もしくは信号のパターンを定量的に分析するように、１つもしくは複数の信号もしくは信号のパターンとその他の信号（例えば、参照信号）もしくは制御器に事前にプログラムされた値とを比較するように、かつ／または１つもしくは複数のパラメータを変調させて固相ペプチド合成システムの動作を制御するように、構成されてもよい。フィードバック制御の特定の例について、より詳細に以下に記載する。

本明細書に記載されるように、ある特定の本発明の概念は、固相ペプチド合成システムにおけるフィードバック制御のための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、信号を生成するためのアミノ酸付加サイクルでの反応ステップの間に、そして／または直後に（例えば、流れが反応器から出て行った後であるが、次のアミノ酸付加ステップの前である）、反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を検出することを含んでいてもよい。少なくとも一部では信号から誘導された情報（例えば、信号から誘導された強度成分および時間成分）に基づいて、反応器内での後続の反応（例えば、カップリング反応）の前および／もしくは最中に、ならびに／または反応器内でのペプチドの形成の前に、システムの１つまたは複数のパラメータを変調させてもよい。

一部の実施形態では、アミノ酸付加サイクルでの反応ステップ中に検出することは、反応ステップの始まりから反応ステップの終わりまで検出すること、反応ステップの少なくとも一部の最中に検出すること（例えば、反応ステップの合計時間の少なくとも約２０％、反応ステップの合計時間の少なくとも約３０％、反応ステップの合計時間の少なくとも約４０％、反応ステップの合計時間の少なくとも約５０％、反応ステップの合計時間の少なくとも約６０％、または反応ステップの合計時間の少なくとも約７５％、かつ約１００％未満）、ならびに／または２つもしくはそれよりも多くの反応ステップ（例えば、脱保護ステップ）および／または完全ペプチド合成の少なくとも一部の最中での連続検出を含んでいてもよい。

ペプチド合成および生成され得る信号の例示的な概略図を、図２Ａ〜２Ｃに示す。一部の実施形態では、図２Ａ〜２Ｃに示されるように、ペプチド８０が固体支持体８５に固定化されていてもよい。ペプチドは、そのＣ末端を介して固体支持体に結合され、それによってペプチドを固定化してもよい。一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、ある特定の実施形態では、図２Ａ〜２Ｃの矢印９０で示されるように、活性化アミノ酸９５を固定化ペプチドに曝すことを含む。一部の実施形態では、図２Ａに示されるように、活性化アミノ酸に固定化ペプチドを曝露した結果、活性化アミノ酸の少なくとも一部が固定化ペプチドに結合されて、新しく結合されたアミノ酸残基が形成されてもよい。例えばペプチドは、ペプチドの遊離Ｎ末端１００と反応する活性化アミノ酸９５に曝されてもよい。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸含有流を活性化剤流および／または塩基流と混合することにより、脱保護ペプチドとの反応に向けて活性化することができる。いくつかの場合、活性化アミノ酸のアミノ基を保護してもよく、アミノ酸の付加によって、保護Ｎ末端１０５を持つ固定化ペプチドが得られるようになる。

一般にペプチド８０は、例えばペプチドのＮ末端および／または側鎖１１０上に保護基を含んでいてもよい。本明細書で使用される「保護基」という用語には、当技術分野でのその通常の意味が与えられる。保護基は、保護基によって保護された基が反応しないようにまたはその他の手法で反応が阻止されるように、分子（例えば、ペプチド）内の反応性基（即ち、保護される基）に付着されたまたは付着するよう構成された化学的部分を含む。保護は、保護基を分子に付着することによって生じてもよい。一部の実施形態では、ペプチド中のアミノ酸残基の側鎖１１０が、保護基を含んでいてもよい。脱保護は、例えば保護基を除去する化学変化によって、保護基が分子から除去されたときに、生じてもよい。

一部の実施形態では、後続のカップリング反応の前に、新たに形成された保護Ｎ末端１０５の保護基を除去して、遊離Ｎ末端を形成しなければならない。一部のそのような実施形態では、脱保護プロセスは、矢印１１５で示されるように、脱保護試薬を固定化ペプチドに曝すことを含み、保護基の少なくとも一部を固定化ペプチドの少なくとも一部から除去する。固定化ペプチドは、脱保護試薬を含む流体流を反応器に通して流すことにより、脱保護試薬に曝されてもよい。脱保護試薬曝露ステップは、ある特定の実施形態では、側鎖保護基が保存されると共にＮ末端保護基が除去されるように構成することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドを保護するのに使用される保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む。一部のそのような実施形態では、ピペリジンを含む脱保護試薬（例えば、ピペリジン溶液）は、Ｆｍｏｃ保護基が固定化ペプチドの少なくとも一部から除去されるように、固定化ペプチドに曝されてもよい。

一部の実施形態では、反応器からの流出物を、１つまたは複数の反応（例えば、脱保護反応、カップリング反応）および／またはプロセス（例えば、試薬除去ステップ）の最中および／または後に、モニタリングしてもよい。ある特定の実施形態では、図２Ａ〜２Ｃに示されるように、反応器から出て行く流体流は、脱保護ステップの最中および／または後に、電磁放射線検出器を使用して検出されてもよい。電磁放射線検出器は、流体流の電磁吸光度および／または電子放射を測定し、１つまたは複数の対応する信号を生成してもよい。一部の実施形態では、信号（単数または複数）は、流体流中の１種もしくは複数の成分、および／または流体流中の２種もしくはそれよりも多くの成分間の相互作用に対応していてもよい。一部のそのような実施形態では、１種または複数の成分は、反応器内で生じた反応および／またはプロセスの副生成物（byproductまたはside product）であってもよい。例えば、ペプチドのＮ末端を保護するのにＦｍｏｃ保護基が使用される実施形態では、ジベンゾフルベン付加物が、脱保護反応の副生成物として形成されてもよい。ジベンゾフルベン付加物の少なくとも一部は、脱保護ステップの最中および／または後に反応器から除去されてもよく、反応器から出て行く流体流中で検出されてもよい。ある特定の実施形態では、信号は、データ点の収集を含んでいてもよい。一部のそのような実施形態では、検出器によって生成された信号は、強度成分、持続時間成分（例えば、信号の持続時間、および／または時間成分（例えば、半値幅、時間における位置、時間における相対位置）を含んでいてもよい。例えば、電磁放射線検出器は、強度および時間成分（例えば、強度対時間）を含む信号を生成してもよい。その他の場合には、信号は単一の値であってもよい。

脱保護反応後に検出器により生成された信号の非限定的な例を、図２Ａ〜２Ｃに示す。検出器は、図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃでそれぞれ示される、信号１２０、１２５、および１３０で示されるデータの分布を生成してもよい。一部の実施形態では、信号の１つまたは複数の特徴（例えば、ピーク面積、ピーク高さ、ピーク幅、半値幅）を使用して、従来の反応で生じた課題を識別し、現行の反応で生じた課題を識別し、かつ／または課題の根源を決定して、適切な補正作業の選択を支援してもよい。例えば図２Ａは、問題のないアミノ酸付加サイクルについてのカップリング反応および脱保護反応を示す。信号１２０は、脱保護ステップの最中および／または後の、検出器の下流での流体流の検出から生成されてもよい。信号１２０は、経時的な副生成物（例えば、ジベンゾフルベン付加物）の電磁放射線強度に対応していてもよい。信号１２０ならびに／または信号の１つもしくは複数の特徴、例えばピーク面積、ピーク高さ１３５、および／もしくはピーク幅、例えば半値高さ１４０（例えば、ピーク高さおよび半値幅）を、別の信号および／または参照信号と比較して、反応器内での先の反応（例えば、カップリング反応）中に問題が生じたか否かおよび／または現在生じているのか否か（例えば、脱保護反応）を決定してもよい。

図２Ｂは、アミノ酸付加サイクルについてのカップリング反応および脱保護反応を示し、このカップリング反応は、ペプチドの少なくとも一部で遮断されるものである。図２Ｂに示されるように、未反応の活性化剤１４５を、遊離Ｎ末端の少なくとも一部と反応させ、それによって活性化アミノ酸９５とのカップリングを防止してもよい。信号１２５は、脱保護ステップの最中および／または後で検出器の下流での流体流の検出から生成されてもよく、経時的な副生成物（例えば、ジベンゾフルベン付加物）の電磁放射線強度に対応していてもよい。信号１２５ならびに／または信号の１つもしくは複数の特徴、例えばピーク面積、ピーク高さ１３５、および／もしくは半値幅１４０を、別の信号（例えば、信号１２０）および／または参照信号と比較して、反応器内での先の反応（例えば、カップリング反応）中に問題が生じたか否かおよび／または現在（例えば、脱保護反応）生じているか否か決定し、問題の根源を識別してもよい。例えば、参照信号および／または信号１２０の間の半値幅ではなくピーク高さの差は、ある特定のタイプの問題を示す可能性がある（例えば、活性化剤による切断）。図１を参照すると、ユニット７０および／またはユーザを使用して、検出器からの信号（単数または複数）を分析し、問題の存在、非存在および／または根源を識別してもよい。一部のそのような実施形態では、ユニット７０および／またはユーザは、後続の反応（例えば、カップリング反応）の前および／または最中に適切な補正動作を実施することを決定してもよい。ある特定の実施形態では、ユニット７０は、問題を自動的に識別し、問題の根源を決定し、かつ／または適切な補正動作を実施してもよい。いくつかの場合、ユーザが問題の識別に、問題の根源の決定に、および／または適切な補正動作の実施に関わっていてもよい。一部の実施形態では、補正動作は、ペプチドの合成の完了前に実施されてもよい。例えば、ペプチド断片を形成するために、アミノ酸と固定支持体に固定化されたアミノ酸残基との間のカップリング反応の後の、脱保護ステップの最中および／または直後に流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を検出することによって生成された信号から誘導された情報（例えば、時間成分、強度成分）は、ペプチド断片を含むペプチドの形成前にシステムのパラメータを変調させるのに使用されてもよい。

図２Ｃは、アミノ酸付加サイクルについてのカップリング反応および脱保護反応を示し、ここでペプチドが凝集される。図２Ｃに示されるように、ペプチド８０はカップリング中に凝集し、それが反応動態に悪影響を及ぼす。信号１３０は、脱保護ステップの最中および／または後に、検出器の下流の流体流の検出から生成されてもよく、経時的な副生成物（例えば、ジベンゾフルベン付加物）の電磁放射線強度に対応していてもよい。信号１３０および／または信号の１つもしくは複数の特徴、例えばピーク面積、ピーク高さ１３５、および／もしくは半値幅１４０を、別の信号（例えば、信号１２０および／または信号１２５）および／または参照信号と比較して、反応器内での先の反応の最中に問題が生じたか否か、および／または現在生じているか否かを決定し、問題の根源を識別してもよい。例えば、参照信号および／または信号１２０の間のピーク高さではなく半値幅の差は、ある特定のタイプの問題（例えば、凝集）を示す可能性がある。

一部の実施形態では、信号のパターンと、それらそれぞれの特徴の１つまたは複数（例えば、ピーク面積、ピーク高さ、半値幅）を使用して、先の反応で生じた問題を識別し、現行の反応で生じている問題を識別し、かつ／または問題の根源を決定して適切な補正動作の選択を支援してもよい。信号のパターンは、検出ゾーン６５で、１つまたは複数の検出器を使用して生成される。信号のパターンは、反応器内での複数の反応および／またはプロセスの最中および／または後の、流体流中の電磁放射線の測定値（例えば、ＵＶ吸光度）に対応していてもよい。例えば、一部の実施形態では、信号のパターンは、各脱保護ステップの最中および／または後の、流体流中の電磁放射線の測定値に対応していてもよい。

ある特定の実施形態では、信号のパターンは、第１の信号および第２の信号を含む。いくつかの場合、第１および第２の信号は、強度成分、持続時間成分、および／または時間成分を含んでいてもよい。例えば信号は、信号１２０、１２５、および１３０に類似していてもよい。一部の実施形態では、信号のパターンの分析は、時間におけるその信号の、時間における別の信号位置に対する位置など、単一の信号に存在していない情報を提供し得る。ある特定の実施形態では、信号のパターンは、一部の実施形態で、特定の反応またはプロセスが固相ペプチド合成システム内で適正に生じるか否かを示してもよい。例えば表１は、信号のパターンから得ることができる例示的な情報、ある特定のパターンにより示される問題、および可能な補正動作を示す。表１において、Ｈは高いを指し、Ｌは低いを指す。

一部の実施形態では、表１に例示するように、信号のパターンの分析によって、問題の根源および／または潜在的な補正動作に関する追加の情報を決定することが可能になり得る。例えば２つまたはそれよりも多くの信号を比較することにより、特定の問題に関するある特定の理由を終局的に決定することが可能になり得る。例えば、凝集による切断は、活性化剤または別の汚染物質との反応に起因した切断とは決定的に区別され得る。図３Ａ〜３Ｃは、それぞれ、効率的なカップリング、活性化剤に起因した残基１の後の切断、および凝集に起因した残基１の後の切断に関する、信号のパターンの例示的な概略図を示す。

例えば、図３Ａ〜３Ｃに示されるように、一連の（例えば、２つまたはそれよりも多くの、３つまたはそれよりも多くの）脱保護反応の最中および／または後に、脱保護の副生成物（例えば、ジベンゾフルベン付加物）を検出するために、流体流での電磁吸光度（例えば、ＵＶ吸光度、ＵＶ−可視吸光度）を測定することによって、一連の曲線を生成することができる。ピーク面積、ピーク高さ、および／または半値幅を使用して、効率的なカップリングが生じたか否か、凝集がカップリング中に生じたか否か、欠失がカップリング中に生じたか否か、切断がカップリング中に生じたか否か、不適正な樹脂がカップリング中に生じたか否か、および／または機械故障がカップリング中に生じたか否かを決定してもよい。ある特定の実施形態では、図３Ａに示されるように、全ての曲線の間での約５％未満（例えば、約４％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満）のピーク面積および／または半値幅の変化は、効率的なカップリングが生じていることを示すことができる。

一部の実施形態では、ピーク面積の変化のパーセンテージを使用して、１つまたは複数のステップ（例えば、それぞれ）で欠失および／または切断の量を推定してもよい。これはピーク（例えば、ＵＶ吸光度測定値から）の曲線下の面積を積分し、その面積を、別の信号（単数または複数）の面積と比較することによって、行ってもよい。一部の実施形態では、図３Ｂに示されるように、約５％よりも大きくまたは約５％に等しい（例えば、約１０％よりも大きいまたはそれに等しい、約１５％よりも大きいまたはそれに等しい、約２０％よりも大きいまたはそれに等しい）ピーク面積の変化は、欠失および／または切断が生じたことを示し得る。表１を参照すると、一部の実施形態では、ＨからＬへのまたはＬからＨへのピーク面積の変化は、約５％よりも大きいまたはそれに等しいピーク面積の変化を指してもよい。ある特定の実施形態では、ピーク面積の変化が約５％よりも大きいまたはそれに等しいが３０％未満であるときに、補正動作を行ってもよい。補正動作は、１つまたは複数のパラメータを変調させることを含んでいてもよい。例えば、反応時間の変調、流量の変調、温度の上昇、流体流添加物の導入、脱保護時間の増加、および／または活性化剤の変更は、後続のカップリング反応を改善するのに行ってもよい。一部の実施形態では、面積の変化が約３０％よりも大きいまたはそれに等しい場合は、低収率により合成を中断してもよい。

一部の実施形態では、図３Ｃに示されるように、曲線（単数または複数）の半値幅を使用して、活性化剤に起因する切断と凝集に起因する切断と区別すると共に凝集に起因するその他の問題を識別してもよい。一部の実施形態では、図３Ｃに示されるように、約５％よりも大きいまたはそれに等しい（例えば、約１０％よりも大きいまたはそれに等しい、約１５％よりも大きいまたはそれに等しい、約２０％よりも大きいまたはそれに等しい）半値幅の変化は、理論に拘泥するものではないが、より低速のカップリング動態、ならびに最終的には凝集および／または拡散の問題を示し得る。表１を参照すると、一部の実施形態では、半値幅の増大は、約５％よりも大きいまたはそれに等しいピーク幅の変化を指していてもよい。一部の実施形態では、補正動作は、１つまたは複数のパラメータの変調を含んでいてもよい。例えば、共溶媒および／または洗浄添加剤（単数または複数）を添加して、ペプチド凝集体を破壊してもよく、反応器および／または１つもしくは複数の流体流の温度、および／またはカップリング反応時間も同様に増大させて、反応が終了に向かうよう進行させてもよい。

２つの値間の差のパーセンテージを計算するとき（本明細書で他に指示しない限り）、パーセンテージの計算は、基本的にその大きさがより大きい値を使用して行われる。例示すると、第１の値がＶ_１であり第２の値がＶ_２（Ｖ_１よりも大きい）である場合、Ｖ_１とＶ_２と間の差のパーセンテージ（Ｖ_{％Ｄｉｆｆ}）は
として計算され得る。

第１および第２の値は、Ｖ_{％Ｄｉｆｆ}がＸ％未満である場合、互いにＸ％以内にあると言うことができる。第１および第２の値は、Ｖ_{％Ｄｉｆｆ}がＸ％またはそれよりも大きい場合、少なくともＸ％異なると言うことができる。

本明細書に記載されるように、信号または信号のパターンは、問題に対処するための適切な補正動作を決定し実施するのに使用されてもよい。一部の実施形態では、補正動作は、少なくとも一部では信号および／または２つもしくはそれよりも多くの信号の比較から誘導された情報に基づいて、反応器内での反応の前および／または最中にシステムのパラメータを変調させることを含んでいてもよい。例えばパラメータは、流量、温度、反応時間、試薬タイプ、試薬濃度、反応時間、試薬の比、添加剤の添加、およびこれらの組合せからなる群から選択されてもよい。補正動作を行うことができない実施形態では、合成を停止してもよい。例えば表１に示すように、活性化剤に起因する切断は、例えばグアニジニウム活性化剤の代わりにカルボジイミドを使用して、活性化ステップ中に活性化剤の化学的性質および／または化学量論比を変化させることによって、あるいはアミノ酸と活性化剤との比を増大させることによって、補正されてもよい。別の例として、反応器の温度を上昇させてもよく、洗浄剤または共溶媒を試薬流体流に添加して、凝集したペプチドをより良好に可溶化してもよい。一実施例では、試薬濃度を増大させて、欠失を防止してもよい。流量および／または反応時間を増大させて、低速カップリングのための欠失を防止してもよい。一般に、補正動作は、現在の合成および／または将来の合成中に実施してもよい。補正動作を行うことができない実施形態では、合成を停止してもよい。

一部の実施形態では、１つまたは複数のパラメータを変調させることは、反応器および／または１つもしくは複数の流体流の温度を上昇させることを含んでいてもよい。１つまたは複数のパラメータを変調させることは、反応器および／または１つもしくは複数の流体流の温度を低下させることを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のパラメータを変調させることは、２種もしくはそれよりも多くの試薬のモル比、および／または試薬の濃度を、増大させることを含んでいてもよい。１つまたは複数のパラメータを変調させることは、２種もしくは複数の試薬のモル比、および／または試薬の濃度を、低下させることを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のパラメータを変調させることは、１つまたは複数の流体流の流量を増大させることを含んでいてもよい。１つまたは複数のパラメータを変調させることは、１つまたは複数の流体流の流量を減少させることを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のパラメータを変調させることは、１つまたは複数の反応（例えば、カップリング反応）の反応時間を増大させることを含んでいてもよい。１つまたは複数のパラメータを変調させることは、１つまたは複数の反応（例えば、カップリング反応）の反応時間を低減させることを含んでいてもよい。

一部の実施形態では、補正動作の実施は、制御器および／またはユーザを介して行ってもよい。例えば、固相ペプチド合成システムにおける反応および／またはプロセスの検出は、制御器に伝送され得る信号または信号のパターンを生成することができる。制御器が受信した信号（単数または複数）に基づいて（少なくとも一部では）、このフィードバックは、例えばポンプ、減圧、弁、温度調節器、および／またはその他の構成要素の１つまたは複数を制御することにより、システムのパラメータを変調させるのに使用することができる。いくつかの場合、フィードバックは、固相ペプチド合成システムで生じたまたは生じている問題を決定することができ、制御器は、１つまたは複数の信号を１つまたは複数の構成要素に送信して、システムの全てまたは部分におけるパラメータの変調を引き起こしてもよい。あるいは、補正動作を行うことができない場合、制御器は、１つまたは複数の信号を１つまたは複数の構成要素に送信して、システムを停止させてもよい。

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の測定された信号を、加工しまたは処理してもよい（例えば、伝送の前もしくは後、および／または信号と比較する前もしくは後）。したがって、信号が伝送され（例えば、制御器、ユーザに）、比較され（例えば、参照信号または別の信号と）、またはその他の手法でフィードバックプロセスに使用される場合、生の信号を使用してもよく、または生の信号に基づいて（少なくとも一部では）加工され／処理された信号を使用してもよいことを、理解すべきである。例えば、いくつかの場合、測定された信号の１つまたは複数の微分信号を、計算することができ（例えば、微分器または任意のその他の適切な方法を使用して）、フィードバックを提供するために使用することができる。その他の場合には、信号を正規化する（例えば、測定された信号をバックグラウンド信号から差し引く）。ひと組の実施形態において、信号は、勾配または平均勾配、例えば時間の関数として強度の平均勾配を含む。

いくつかの場合、測定された信号を、アナログデジタルコンバータを使用してデジタル信号に変換して、デジタルコンピュータまたはデジタル信号プロセッサにより全てのさらなる信号処理を行うことができるようにしてもよい。一実施形態では全ての信号処理をデジタル式に行うが、本発明はそれに限定するものではなく、それはアナログ処理技法を代わりに使用してもよいからである。例えばデジタルアナログコンバータは、出力信号を生成するのに使用してもよい。信号は、時間ドメイン（一次元信号）、空間ドメイン（多次元信号）、周波数ドメイン、自動補正ドメイン、または任意のその他の適切なドメインで処理されてもよい。いくつかの場合、例えば線形フィルタ（測定された信号の線形変換）、非線形フィルタ、因果フィルタ、非因果フィルタ、時不変フィルタ、時変フィルタ、またはその他の適切なフィルタを使用して、信号を濾波する。信号、パターン、およびそれらの、本明細書に記載されるフィードバックでの使用は、例示的なものであり、本発明がこの点に限定されないことを、理解すべきである。

信号または信号のパターンが決定されたら、信号（単数または複数）を任意選択で制御器に伝送してもよい。いくつかの場合、制御器は、信号または信号のパターンを第２の組の信号（単数または複数）と比較する。第２の信号または信号のパターンは、例えば、固相ペプチドシステムで先に決定された信号（単数または複数）または参照信号（単数または複数）であってもよい。いくつかの場合、参照信号または信号のパターンは、１つもしくは複数の閾値またはある範囲の閾値を含む。制御器は、第１の信号または信号のパターンを、第２の信号または信号のパターン（例えば、参照信号）と比較し、固相ペプチド合成システムにおける１つまたは複数のパラメータを変調させるか否かを決定してもよい。即ち、測定された信号または信号のパターンは、制御器によって使用されて駆動信号を発生させ、固相ペプチド合成システムのフィードバック制御を行うことができる。この変調は、ある特定の実施形態では制御器が行ってもよく、１つまたは複数の駆動信号を、固相ペプチド合成システムの適切な構成要素に送信して、その構成要素または別の構成要素を作動させる。任意の適切な弁駆動電子回路を使用して、駆動信号を受信し、駆動信号を、構成要素を作動させることが可能な電圧、電流、またはその他の信号に変換してもよい。ある特定の実施形態では、制御器は、固相ペプチド合成システムの１つまたは複数の構成要素の動作を変調させるか否かを決定することができる。いくつかの場合、制御器は、固相ペプチド合成システムで実行されている合成を停止させるか否かを決定してもよい。

一部の実施形態では、比例制御、積分制御、比例積分制御、微分制御、比例微分制御、積分微分制御、および比例積分微分制御などの１つまたは複数のフィードバック制御法を、制御器が使用して、パラメータを変調させることができる。フィードバック制御は、一部の実施形態ではフィードバックループを含んでいてもよい。前述のフィードバック制御法の１つまたは複数を含むいくつかの場合には、（例えばマイクロ流体システムの構成要素を作動させることにより、パラメータを変調させるのに使用されてもよい）駆動信号を、少なくとも一部では検出器により測定される信号およびフィードバック信号に基づいて、発生させてもよい。

上記のように、本発明のシステムのある特定の実施形態は、システムの様々な構成要素／サブシステムを作動させ、データ／画像解析を行うなどのための１つまたは複数の制御器（例えば、コンピュータ実装式制御器）を含む。一部の実施形態では、制御器は、コンピュータ実装式であってもよい。一般に、本明細書に記載される任意の計算方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム、およびシステム要素は、以下に記載されるコンピュータ実装式システムの様々な実施形態など、１つまたは複数のコンピュータ実装式制御器（単数または複数）を使用して、実施および／または制御されてもよい。本明細書に記載される方法、ステップ、制御器、および制御器要素は、それらの実施に際し、多くのその他の異なる機械を使用してもよいので、本明細書に記載されるいかなる特定のコンピュータシステムにも限定するものではない。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、画像解析システムおよび／またはその他の自動化システム構成要素の一部であることができ、またはそれらに動作可能に関連付けられるように連結することができ、一部の実施形態では、操作パラメータを制御し調節するように、ならびに値を解析し計算するように、例えば上記の分子または粒子濃度を分析するように、構成および／またはプログラムされる。一部の実施形態では、コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、参照信号を送信および受信して、システム装置の操作パラメータを設定および／または制御することができる。その他の実施形態では、コンピュータ実装式システム（単数または複数）を、その他のシステムに対して分離し、および／または遠隔に位置付けることができ、間接的および／または携帯式手段を介して、例えば磁気ディスクなどの携帯電子データ記憶デバイスを介して、またはインターネットもしくはローカルイントラネットなどのコンピュータネットワーク上の通信を介して、本発明の１つまたは複数の遠隔アッセイシステムからデータを受信するように構成されてもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、処理ユニット（即ち、プロセッサ）、メモリシステム、入力および出力デバイスおよびインターフェース（例えば、相互接続機構）を含むいくつかの公知の構成要素および回路、ならびにその他の構成要素、例えば輸送回路（例えば、１つまたは複数のバス）、ビデオおよびオーディオデータ入力／出力（Ｉ／Ｏ）サブシステム、専用ハードウェア、ならびに以下にさらに詳細に記載されるその他の構成要素および回路を含んでいてもよい。さらに、コンピュータシステム（単数または複数）は、マルチプロセッサコンピュータシステムであってもよく、またはコンピュータネットワーク上の複数のコンピュータを含んでいてもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、プロセッサ、例えば、Ｉｎｔｅｌから入手可能なシリーズｘ８６、ＣｅｌｅｒｏｎおよびＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサ、ＡＭＤおよびＣｙｒｉｘ製の類似のデバイス、Ｍｏｔｏｒｏｌａから入手可能な６８０Ｘ０シリーズマイクロプロセッサ、およびＩＢＭ製のＰｏｗｅｒＰＣマイクロプロセッサの１つなど、市販されているプロセッサを含んでいてもよい。多くのその他のプロセッサが入手可能であり、コンピュータシステムは特定のプロセッサに限定されない。

プロセッサは、オペレーティングシステムと呼ばれるプログラムを典型的には実行し、その例はＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５または９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） Ｖｉｓｔａ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ７、ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、ＤＯＳ、ＶＭＳ、ＭａｃＯＳおよびＯＳ８であり、これらはその他のコンピュータプログラムの実行を制御し、スケジューリング、デバッギング、入力／出力制御、アカウンティング、編集、記憶域割り当て、データ管理およびメモリ管理、通信制御および関連するサービスを提供する。プロセッサおよびオペレーティングシステムは一緒に、高水準プログラミング言語でアプリケーションプログラムが書かれているコンピュータプラットフォームを定義する。コンピュータ実装式制御器は、特定のコンピュータプラットフォームに限定するものではない。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、例として磁気ディスク、光ディスク、フラッシュメモリ、およびテープが例として挙げられるコンピュータ可読式および書込み可能な不揮発性記録媒体を典型的には含む、メモリシステムを含んでいてもよい。そのような記録媒体は、取外し可能であってもよく、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、読出し／書込みＣＤもしくはメモリスティックであり、または永続的な、例えばハードドライブであってもよい。

そのような記録媒体は、典型的には二進法（即ち、１および０の配列として解釈される形態）で表される信号を記憶する。ディスク（例えば、磁気または光）にはいくつかのトラックがあり、このトラックに、典型的には二進法で表される、即ち１および０の配列として解釈される形態で信号を記憶させてもよい。そのような信号は、ソフトウェアプログラム、例えばアプリケーションプログラムをマイクロプロセッサで実行するように、または情報をアプリケーションプログラムで処理するように、定義してもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）のメモリシステムは、典型的には、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）またはスタティックメモリ（ＳＲＡＭ）などの揮発性のランダムアクセスメモリである、集積回路メモリ素子を含んでいてもよい。典型的には、動作中に、プロセッサによりプログラムおよびデータを不揮発性記録媒体から集積回路メモリ素子へと読み取らせ、不揮発性記録媒体でなされるよりもプロセッサによるプログラム命令およびデータへのより高速なアクセスが典型的には可能になる。

プロセッサは、一般に、プログラム命令に従って集積回路メモリ素子内でデータを操作し、次いで操作したデータを、処理が完了した後に不揮発性記録媒体にコピーする。不揮発性記録媒体と集積回路メモリ素子との間のデータ移動を管理するための様々なメカニズムが公知であり、上記の方法、ステップ、システム制御、およびシステム要素制御を実施するコンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、それらに限定するものではない。コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、特定のメモリシステムに限定するものではない。

上記のそのようなメモリシステムの少なくとも一部は、１つまたは複数のデータ構造（例えば、ルックアップテーブル）または較正曲線方程式などの方程式を記憶するのに使用されてもよい。例えば、不揮発性記録媒体の少なくとも一部は、そのようなデータ構造の１つまたは複数を含むデータベースの少なくとも一部を記憶してもよい。そのようなデータベースは、様々なタイプのデータベースのいずれか、例えば、データをデリミッタにより分離されたデータ単位に編成する１つまたは複数のフラットファイルデータ構造を含むファイルシステム、データをテーブルに記憶されたデータ単位に編成する関係データベース、データをオブジェクトとして記憶されたデータ単位に編成するオブジェクト指向データベース、別のタイプのデータベース、またはこれらの任意の組合せのいずれかであってもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、ビデオおよびオーディオデータＩ／Ｏサブシステムを含んでいてもよい。サブシステムのオーディオ部分は、アナログオーディオ情報を受信しその情報をデジタル情報に変換する、アナログデジタル（Ａ／Ｄ）コンバータを含んでいてもよい。デジタル情報は、別の機会に使用されるようハードディスクに記憶するために、公知の圧縮システムを使用して圧縮されてもよい。Ｉ／Ｏサブシステムの典型的なビデオ部分は、その多くが当技術分野で公知のビデオ画像圧縮器／圧縮解除器を含んでいてもよい。そのような圧縮器／圧縮解除器は、アナログビデオ情報を圧縮デジタル情報に変換し、またその逆も同様である。圧縮されたデジタル情報は、後の時期に使用するためにハードディスクに記憶されてもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、１つまたは複数の出力デバイスを含んでいてもよい。出力デバイスの例には、陰極線管（ＣＲＴ）ディスプレイ、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）およびその他のビデオ出力デバイス、プリンタ、モデムまたはネットワークインターフェースなどの通信デバイス、ディスクまたはテープなどの記憶デバイス、およびスピーカなどのオーディオ出力デバイスが含まれる。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、１つまたは複数の入力デバイスを含んでいてもよい。入力デバイスの例には、キーボード、キーパッド、トラックボール、マウス、ペンおよびタブレット、上記のような通信デバイス、オーディオおよびビデオ獲得デバイスおよびセンサなどのデータ入力デバイスが含まれる。コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、本明細書に記載される特定の入力または出力デバイスに限定するものではない。

本明細書に記載される様々な実施形態を実施するのに、任意のタイプのコンピュータ実装式制御器の１つまたは複数を使用してもよいことを、理解すべきである。本発明の態様は、ソフトウェア、ハードウェア、もしくはファームウェア、またはこれらの任意の組合せで実施してもよい。コンピュータ実装式制御器（単数または複数）は、特別にプログラムされた専用ハードウェア、例えば特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含んでいてもよい。そのような専用ハードウェアは、上記のコンピュータ実装式制御器（単数または複数）の一部としてまたは独立した構成要素として、上述の方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、およびシステム要素制御の１つまたは複数を実施するように構成されてもよい。

コンピュータ実装式制御器（単数または複数）およびその構成要素は、様々な１つまたは複数の適切なコンピュータプログラミング言語のいずれかを使用して、プログラム可能であってもよい。そのような言語は、手続き型プログラミング言語、例えばＬａｂＶｉｅｗ、Ｃ、Ｐａｓｃａｌ、Ｆｏｒｔｒａｎ、およびＢＡＳＩＣ、オブジェクト指向言語、例えばＣ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、およびＥｉｆｆｅｌ、ならびにその他の言語、例えばスクリプト言語、またはアセンブリ言語さえも含んでいてもよい。

方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、およびシステム要素制御は、そのようなコンピュータシステムにより実行されてもよい、手続き型プログラミング言語、オブジェクト指向プログラミング言語、その他の言語、およびこれらの組合せを含む様々な適切なプログラミング言語のいずれかを使用して実施してもよい。そのような方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、およびシステム要素制御は、コンピュータプログラムの別々のモジュールとして実施することができ、または個別のコンピュータプログラムとして個々に実施することができる。そのようなモジュールおよびプログラムは、別々のコンピュータで実行することができる。

そのような方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、およびシステム要素制御は、個々にまたは組み合わせて、コンピュータ可読式媒体、例えば不揮発性記録媒体、集積回路メモリ素子、またはこれらの組合せにおけるコンピュータ可読式信号として目に見えるように具体化された、コンピュータプログラムプロダクトとして実施されてもよい。そのような方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、またはシステム要素制御のそれぞれの場合、そのようなコンピュータプログラムプロダクトは、コンピュータにより実行されている結果としてコンピュータに方法、ステップ、シミュレーション、アルゴリズム、システム制御、またはシステム要素制御を行うように命令する、例えば１つまたは複数のプログラムの部分として命令を定義する、コンピュータ可読式媒体上で目に見えるように具体化されたコンピュータ可読式信号を含んでいてもよい。

一般に、任意の適切な電磁放射線検出器を使用して、任意の形態の電磁放射線を検出してもよい。例えば、電磁放射線検出器は、ＵＶ−ｖｉｓ検出器としてのＵＶ検出器、および／または赤外線検出器であってもよい。一部の実施形態では、検出される電磁吸光度および／または電磁放射は、赤外線吸光度、赤外線放射、紫外線吸光度、および／または紫外線放射からなる群から選択される。一部の実施形態では、電磁吸光度（例えば、ＵＶ、ＵＶ−ｖｉｓ、赤外線）が検出される。

本明細書に記載されるように、フィードバック制御するための方法およびシステムは、以下にさらに詳細に記載される固相ペプチド合成で使用されてもよい。例示的なアミノ酸付加サイクルステップおよびペプチド合成について、ここでさらに詳細に記載する。一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、上記のように、脱保護試薬を固定化ペプチドに曝して、保護基の少なくとも一部を固定化ペプチドの少なくとも一部から除去することを含む。

一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、脱保護試薬の少なくとも一部を除去することを含む。一部の実施形態では、脱保護ステップ中に形成されていてもよい任意の反応副生成物（例えば、除去された保護基）の少なくとも一部を除去することができる。いくつかの場合、脱保護試薬（ある特定の実施形態では、副生成物）は、ペプチド、固体支持体、および／または周囲の領域を、例えば任意選択のリザーバ１２５内に保存された流体（例えば、水性または非水性溶媒、超臨界流体、および／または同様のものなどの液体）で洗浄することによって除去されてもよい。いくつかの場合、脱保護試薬および反応副生成物の除去は、後続のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することによって）。ある特定の実施形態では、後続のステップの性能は、脱保護試薬および／または反応副生成物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。いくつかのそのような場合、除去ステップは任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態では、除去ステップは、削減（例えば、除去ステップの時間の削減、除去ステップで使用される溶媒の量の低減）および／または除外してもよい。１つまたは複数の除去ステップの削減は、全サイクル時間を削減することができる。任意選択の除去ステップが削減されまたは除外された場合、付加サイクル中の後続のステップは、例えばシステム内の流体流に起因して、脱保護試薬および／または反応生成物の少なくとも一部を除去する役割を果たし得ることを、理解すべきである。

固定化ペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、ある特定の実施形態では、活性化アミノ酸を固定化ペプチドに曝して、活性化アミノ酸の少なくとも一部が固定化ペプチドに結合されることにより新たに結合されたアミノ酸残基が形成されるようにすることを含む。例えば、ペプチドを、ペプチドの脱保護Ｎ末端と反応する活性化アミノ酸に曝してもよい。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、以下により詳細に論じるように、アミノ酸含有流と活性化剤流とを混合することにより、脱保護ペプチドとの反応に向けて活性化することができる。いくつかの場合、アミノ酸の付加によって保護Ｎ末端を持つ固定化ペプチドが得られるように、活性化アミノ酸のアミン基を保護してもよい。

一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、固定化ペプチドに結合しない活性化アミノ酸の少なくとも一部を除去することを含む。一部の実施形態では、活性化アミノ酸曝露ステップ中に形成され得る反応副生成物の少なくとも一部を、除去してもよい。いくつかの場合、活性化アミノ酸および副生成物は、例えば任意選択のリザーバ１２５内に保存された流体（例えば、水性または非水性溶媒、超臨界流体、および／または同様のものなどの液体）で、ペプチド、固体支持体、および／または周囲の領域を洗浄することによって除去されてもよい。いくつかの場合、活性化アミノ酸および反応副生成物の少なくとも一部を除去することにより、後続のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することによって）。ある特定の実施形態では、後続のステップの性能は、活性化アミノ酸および／または反応副生成物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。いくつかのそのような場合、除去ステップは任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態では、除去ステップは、削減（例えば、除去ステップの時間の削減、除去ステップで使用される溶媒の量の低減）および／または除外してもよい。１つまたは複数の除去ステップの削減または除外は、全体のサイクル時間を削減してもよい。任意選択の除去ステップが削減されまたは除外された場合、付加サイクル中の後続のステップは、例えばシステム内の流体流に起因して、活性化アミノ酸および／または反応副生成物の少なくとも一部を除去する役割を果たし得ることを、理解すべきである。

上記言及されたステップは例示的であり、アミノ酸付加サイクルは、上記言及されたステップの全てを必ずしも含む必要はないことを、理解すべきである。例えばアミノ酸付加サイクルは、脱保護試薬除去ステップおよび／または活性化アミノ酸除去ステップを含まなくてもよい。一般に、アミノ酸付加サイクルは、ペプチドへのアミノ酸残基の付加をもたらす任意の一連のステップを含む。

ある特定の実施形態では、アミノ酸付加ステップ中、アミノ酸を付加する結果、単一の付加アミノ酸残基を組み込んだペプチドを得ることができる（即ち、単一のアミノ酸残基は、付加ステップ後に所与のペプチドが単一の付加アミノ酸残基を含むように、固定化ペプチドに付加することができる）。一部のそのような実施形態では、後続のアミノ酸付加ステップは、所望のペプチドが合成されるまでアミノ酸残基を個々に付加することによってペプチドを構築するのに使用することができる。一部の実施形態では、１つよりも多くのアミノ酸残基（例えば、ペプチドの形態の）を、固体支持体上に固定化されたペプチドに付加してもよい（即ち、複数のアミノ酸残基を含むペプチドを、所与の固定化ペプチドに付加することができる）。固定化ペプチドへのペプチドの付加は、当業者に公知のプロセス（例えば、フラグメント縮合、化学ライゲーション）を通して実現することができる。即ち、アミノ酸付加ステップ中、固定化ペプチドへのアミノ酸の付加は、単一アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加すること、または複数のアミノ酸残基（例えば、ペプチドとして）を固定化ペプチドに付加することを含むことができる。

ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸付加ステップ（および／または後続のアミノ酸付加ステップ）は、比較的高い収率でアミノ酸を付加してもよい。例えば、ある特定の実施形態は、アミノ酸残基が固定化ペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％に付加されるように、アミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸残基が固定化ペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％に付加されるように、アミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含んでいてもよい第２の（一部の実施形態では、第３、第４、第５、および／または後続の）アミノ酸付加サイクルを行うことができる。ある特定の実施形態では、本発明のプロセスの使用およびシステムは、高い反応収率を維持しながら、固定化ペプチドへの１つよりも多くのアミノ酸の付加を比較的迅速に（上記開示されたまたは本明細書のその他の箇所に開示された時間範囲のいずれか以内を含む）行うことが可能になるようにしてもよい。

ある特定の実施形態では、二重の組込みをほとんどまたは全く行わずに、１つまたは複数のアミノ酸付加ステップを行うことができる（即ち、単一付加ステップ中に所望のアミノ酸（例えば、単一のアミノ酸残基またはペプチド）の複数の複製物を付加する）。例えば、ある特定の実施形態では、所望のアミノ酸の複数の複製物を、第１（および／または第２、第３、第４、第５、および／または後続）のアミノ酸付加ステップ中に、固定化ペプチドの約１％よりも少ない（または約０．１％よりも少ない、約０．０１％よりも少ない、約０．００１％よりも少ない、約０．０００１％よりも少ない、約０．００００１％よりも少ない、または実質的にない）程度まで結合させる。

一部の実施形態では、複数のアミノ酸付加サイクルを行うことができる。複数のアミノ酸付加サイクルを行うことにより、ペプチドに付加された１つよりも多くの単一アミノ酸残基（または１つよりも多くのペプチド、ならびに／または少なくとも１つの単一アミノ酸残基、および少なくとも１つのペプチド）を得ることができる。ある特定の実施形態では、１つよりも多くのアミノ酸を固定化ペプチドに付加するためのプロセスは、第１のアミノ酸付加サイクルを行って第１のアミノ酸を付加すること、および第２のアミノ酸付加サイクルを行って第２のアミノ酸を付加することを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、第３、第４、第５、および後続のアミノ酸付加サイクルを行って、任意の所望の長さの固定化ペプチドを生成してもよい。一部の実施形態では、少なくとも約１０のアミノ酸付加サイクル、少なくとも約５０のアミノ酸付加サイクル、または少なくとも約１００のアミノ酸付加サイクルを行い、その結果、固定化ペプチドに、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、少なくとも約５０個のアミノ酸残基、または少なくとも約１００個のアミノ酸残基が付加される。ある特定のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を高収率（例えば、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％）で行うことができる。一部のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を、例えば上記指定されたまたは本明細書のその他の箇所に指定された時間範囲のいずれか以内で迅速に行うことができる。一部のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を、限られた状態または二重の組込みがない状態で、例えば上記指定されたまたは本明細書のその他の箇所に指定された二重組込み範囲のいずれか内で行うことができる。

一部の実施形態では、固相ペプチド合成は、反応器に到達する前であるが反応器に到達するまでの短い時間内で流れを加熱することを含んでいてもよい。反応器に加熱流を供給することにより、反応器内で引き起こされるプロセスの動態を変化させてもよい。例えば、固定化ペプチド、固体支持体、またはその他の合成成分を加熱流に曝すことにより、アミノ酸付加プロセスの反応速度および／または拡散速度を変化させてもよい。例えば、活性化アミノ酸を含む加熱流にペプチドを曝すことにより、アミノ酸がペプチドに付加される速度が増大してもよい。一部の実施形態では、反応器に到着する前であるが反応器に到達するまでの短い時間内で流れを加熱することにより、補助熱（即ち、１つまたは複数の予熱流からのものではない熱）を反応器に供給する必要性が実質的に低減または除外されてもよい。いくつかの場合、反応器に供給される熱のほとんどまたは実質的に全ては、予熱流由来である。例えば一部の実施形態では、予熱流（単数または複数）由来の、反応器を加熱するのに使用される熱エネルギーのパーセンテージは、約５０％よりも大きいまたはそれに等しく、約６０％よりも大きいまたはそれに等しく、約７０％よりも大きいまたはそれに等しく、約８０％よりも大きいまたはそれに等しく、約９０％よりも大きいまたはそれに等しく、約９５％よりも大きいまたはそれに等しく、あるいは約９９％よりも大きいまたはそれに等しくてもよい。一部のそのような実施形態では、このようにシステムを加熱することにより、反応器、固定化ペプチド、固体支持体、活性化アミノ酸、脱保護試薬、洗浄流体、および／またはその他の合成成分を、所望の反応温度まで加熱するのに必要な時間を削減することができる。

一部の実施形態では、アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスは、活性化アミノ酸の温度が少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）上昇するように、活性化アミノ酸を含む流れを加熱し、その後、加熱されたアミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、任意のその他の成分（例えば、洗浄剤、脱保護剤、または任意のその他の成分）を含む流れは、流れの内容物の温度が少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）上昇するように加熱し、その後、流れの内容物を固定化ペプチドに曝してもよい。いくつかの場合、加熱ステップ（例えば、固定化ペプチドに輸送される流れの中の活性化アミノ酸および／または任意のその他の成分の加熱）は、流れの内容物（例えば、加熱された活性化アミノ酸）を固定化ペプチドに曝してから約３０秒以内（または約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、約１秒以内、約０．１秒以内、または約０．０１秒以内）に行ってもよい。一部のそのような実施形態では、そのような加熱は、固定化ペプチドの上流の位置を加熱することによって実現されてもよい。一部のそのような実施形態では、アミノ酸の加熱は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す少なくとも約０．１秒前、少なくとも約１秒前、少なくとも約５秒前、または少なくとも約１０秒前に開始する。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す少なくとも約０．１秒前、少なくとも約１秒前、少なくとも約５秒前、または少なくとも約１０秒前に、少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）加熱される。

一部の実施形態では、アミノ酸の加熱、ならびにアミノ酸と塩基および／または活性化剤との合流は、共に、アミノ酸が固定化ペプチドに接触する前および接触してから比較的短い時間内に行うことができる。アミノ酸の加熱は、流れを合流させる前、最中、および／または後に行ってもよい。

一般に、当業者に公知の任意の保護基を使用することができる。保護基（例えば、ｎ末端保護基）の非限定的な例には、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、カルボキシベンジル、および光解離性保護基が含まれる。ある特定の実施形態では、固定化ペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む。一部の実施形態では、固定化ペプチドは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む。

他の箇所に記載されるように、活性化剤は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す前に、アミノ酸を活性化しまたは活性化を終了させるのに使用されてもよい。任意の適切な活性化剤を使用してもよい。活性化剤は、一部の実施形態では、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを含む。ある特定の実施形態では、活性化剤は、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）；２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）；および１−［（１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）などのウロニウム活性化剤を含む。

他に記載されるように、ペプチドは固体支持体上に固定化されてもよい。一般に、任意の固体支持体は、本明細書に記載される付加サイクルのいずれかと共に使用してもよい。固体支持材料の非限定的な例には、ポリスチレン（例えば、微孔質ポリスチレン樹脂、メソ多孔質ポリスチレン樹脂、マクロ多孔質ポリスチレン樹脂などの樹脂形態の）、ガラス、多糖（例えば、セルロース、アガロース）、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール、またはコポリマー樹脂（例えば、ポリエチレングリコール、ポリスチレンなどを含む）が含まれる。

固体支持体は、任意の適切な形状因子を有していてもよい。例えば固体支持体は、ビーズ、粒子、繊維の形態、または任意のその他の適切な形状因子にあるものとすることができる。

一部の実施形態では、固体支持体は多孔質であってもよい。例えば一部の実施形態では、マクロ多孔質材料（例えば、マクロ多孔質ポリスチレン樹脂）、メソ多孔質材料、および／または微孔質材料（例えば、微孔質ポリスチレン樹脂）を固体支持体として用いてもよい。「マクロ多孔質」、「メソ多孔質」、および「微孔質」という用語は、ペプチド合成用の固体支持体に関連して使用される場合には当業者に公知であり、本明細書では、the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Compendium of Chemical Terminology、２．３．２版、２０１２年８月１９日（「Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ」として非公式に公知である）におけるそれらの記載と矛盾のない状態で使用される。一般に微孔質材料は、約２ナノメートル未満の断面直径を持つ細孔を有するものを含む。メソ多孔質材料は、約２ナノメートルから約５０ナノメートルの断面直径を持つ細孔を有するものを含む。マクロ多孔質材料は、約５０ナノメートルよりも大きくかつ１マイクロメートル程度の大きさの断面直径を持つ細孔を有するものを含む。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、当技術分野における通常の意味を有し、慣用的な水の損失がある状態で、一方のカルボニル炭素から別の窒素原子への共有結合の形成によって２個またはそれよりも多くのアミノカルボン酸分子（同じまたは異なる）から誘導されたアミドを指してもよい。「アミノ酸残基」も、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ペプチド、別のアミノ酸、またはアミノ酸残基と組み合わされた後のアミノ酸の組成物（単一のアミノ酸としてまたはペプチドの部分として）を指す。一般に、アミノ酸が別のアミノ酸またはアミノ酸残基と組み合わされると水が除去され、アミノ酸の残りをアミノ酸残基と呼ぶ。「アミノ酸」という用語も、当技術分野におけるその通常の意味を有し、タンパク新生および非タンパク新生アミノ酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アミノ酸は、カルボキシレート形態であってもよい。

本明細書で使用される「保護基」という用語には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。保護基は、保護基によって保護された基が反応するのを防止しまたはその他の手法で阻止するように、分子（例えば、ペプチド）内の反応性基（即ち、保護された基）に付着したまたは付着するように構成された化学的部分を含む。保護は、保護基を分子に付着することによって生じてもよい。脱保護は、例えば保護基を除去する化学変換によって、保護基が分子から除去されるときに生じてもよい。

下記の実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示することを意図するものであり、本発明の全範囲を例示するものではない。

（実施例１）
この実施例は、流動ペプチド合成の実時間制御を行うための、ライン内ＵＶ吸光度分光法の使用について記載する。これはＦｍｏｃ除去ステップ中に樹脂結合ポリペプチドから放出されたジベンゾフルベン付加物の定量分析によって、実現した。実時間制御では、流量を低減させ、温度を上昇させ、カップリング時間を増大させ、脱保護時間を増大させ、または代替カップリング試薬を使用するなど、合成を高めるための措置をとった。合成が修復できないと考えられる場合には、合成を中止して試薬を節約した。この方法は、ＬＣ−ＭＳ分析で観察された生成物に対して合成条件を定量的に相関させるため、ＵＶ吸光度を使用した。

図４は、ライン内ＵＶ−可視分光計を持つ自動化流動ペプチド合成器の概略図を示す。固相ペプチド合成のＦｍｏｃ除去ステップ中、Ｆｍｏｃで保護されたポリペプチド鎖の処理により、二酸化炭素およびジベンゾフルベンが、成長するペプチド鎖のＮ末端から放出される。ジベンゾフルベンは、溶液中の脱保護剤と素早く反応し、この付加物はＵＶ範囲で吸収される。自動化流動合成器は、標準のＵＶ−可視分光計を使用して実時間で、反応器流出物流中に存在するジベンゾフルベン付加物のＵＶ吸光度を独自にモニタリングすることができた。ＵＶ−可視分光計は、各カップリングステップおよび／または各脱保護ステップの効率に関する定量的な情報を与えた。図５は、１９アミノ酸ペプチドの合成中に、検出器を使用して決定された、時間に対する相対的豊富さのグラフを示す。高い過飽和ピークが、アミノ酸および活性化剤の反応器への注入中に生じた。ピペリジンでの処理中、より小さいピークが、ジベンゾフルベンの放出によって発生した。赤色矢印により示されるように、回復しないＦｍｏｃ除去の急峻な低下は、連鎖停止を示した。

ジベンゾフルベン付加物の定量の、流動ベースの手法は、バッチ式のＦｍｏｃ除去の伝統的な測定よりも有利であった。バッチ式でこのタイプのモニタリングを行うには、樹脂を綿密に洗浄しなければならず、全ての洗浄液を節約しなければならない。溶液の最終体積の差も補正しなければならない。実際に、これらの制約は、測定を非定量的にする。この実施例では、対照的に、ＵＶモニタリングのプロセスが厳密に制御され、時間的に解像された信号をクロマトグラム様式で積分して、カップリング効率の測定値を得ることができた。

ジベンゾフルベン吸光度の低下は、鎖切断事象およびアミノ酸の非組込みに相関することが観察された。鎖切断の場合、吸光度は先のレベルにまで決して回復せず、アミノ酸の非組込みでは、後続の脱保護中に除去されたＦｍｏｃの量がしばしば回復した。実際にこれらのデータは、プロセススループットを増大させる鎖アセンブリ条件の、ポリペプチドの切断およびクロマトグラフ分析の前の、素早い最適化のために使用した。

図６は、ＥＥＴＩ−ＩＩ、システインノットミニタンパク質の、２つの残基、トレオニンおよびシステインについてのＦｍｏｃ除去ピークを示す。合成は、ペプチドのＣからＮ末端へと行い、したがってシステインが最初にカップリングされ、そのピークは左側に現れることに留意されたい。ＨＢＴＵを合成中に最初に使用した場合、トレオニンのＦｍｏｃ除去に関して積分ピーク面積に３０％の減少があった。この１つのデータは、カップリングが完全には効率的でないことを示唆し、ＨＡＴＵへの切換えを促すが、ＨＡＴＵは、まさにカップリングについて、より反応性があるがより費用がかかるカップリング剤であったことを示唆した。ＨＡＴＵを使用すると、信号の低下は８％だけであった。ＬＣ−ＭＳによるこの粗製ペプチドの分析は、ＨＢＴＵによる合成の主な副生成物が、主ピーク強度の４０％でトレオニン欠失であることを明らかにした。このトレオニン欠失は、ＨＡＴＵを使用したときには観察されなかった。最も重要なことは、この完全な最適化が１時間未満で行われたことであり、これは伝統的な方法では不可能と考えられた。図６は、（Ａ）ＨＡＴＵまたは（Ｂ）ＨＢＴＵを使用したときの、ＥＥＴＩ−ＩＩの合成からのジベンゾフルベン信号の比較を示す。ＨＢＴＵを使用したときのトレオニンカップリング後のＦｍｏｃ除去に関する信号の大きな低下は、大きなトレオニン欠失として粗製ペプチドクロマトグラムで明示された。

図７は、このタイプの最適化の別の実施例を示す。「ＪＲ１０量体」（即ち、ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭ）ポリペプチド、古典的に困難な配列の合成での最初の試みは、図７のパネルＡに見られるように、ペプチド合成の終わりに向けてＵＶ脱保護信号の面積の減少をもたらした。このことは、ＬＣ−ＭＳにより観察されたポリペプチド鎖の切断（パネルＣ、生成物５）、ならびにフェニルアラニンおよびトリプトファンの主要欠失（パネルＣ、生成物２、３、および４）の両方に対応する。ＵＶデータのみに基づいて、配列中の最終残基に関してカップリング時間を増大させるべきと決定された。この補正動作は、ＬＣ−ＭＳにより分析したときに所望のポリペプチドの品質を劇的に上昇させ、パネルＢに見られるように、ＵＶ信号の回復が脱保護に関して観察された。この最適化全体は、ＬＣ−ＭＳデータのみを使用した場合とは対照的に、このデータを使用して２０分で行った。

図６に示される配列、ＥＥＴＩ−ＩＩは、ＨＢＴＵにより、７０℃および４０ｍＬ／分の合計流量で、標準の合成パラメータを使用して合成した。強調されるトレオニンのカップリング中、３０％のピーク面積の減少が、脱保護信号に関して観察された。このピーク面積の減少は、ペプチドの最終ＬＣ−ＭＳ分析におけるトレオニン残基欠失に対応した。トレオニン残基の次のカップリング中、ＨＡＴＵ、より反応性ある活性化剤を、カップリングに使用した。ピーク面積のわずか８％の変化が、トレオニンの脱保護中に観察され、欠失は、最終生成物のＬＣ−ＭＳ軌跡で観察されなかった。

１０量体（即ち、ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭ）ポリペプチドを、９０℃、８０ｍＬ／分の流量で最初に合成し、このとき５ｍＬのカップリング溶液を、アミノ酸付加ステップ中に送出した。図７のパネルＡに示されるＵＶ軌跡の極端な低減は、ＬＣ−ＭＳクロマトグラム（パネルＣ、上）におけるアミノ酸欠失を示した。これらの残基に関するカップリング時間の延長により、図７のパネルＢに示されるようにＵＶ軌跡が回復し、図８、下のパネルＣに示されるようなこれらの欠失が排除された。図７のパネルＤは、折れ線グラフとして脱保護ピークの積分を示す。

ＵＶ信号を使用した切断副生成物の欠失を、図７、パネルＡに示す。図７、パネルＡは、９０℃および８０ｍＬ／分の合計流量で合成されたＪＲ１０量体（ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭ）の合成中に得られた、ＵＶ軌跡を示す。脱保護ピークを、それらの対応する残基で標識した。ＬからＴカップリングに進行すると、ピーク面積の急激な減少が観察され、面積は、後続の信号で回復しなかった。このことは、生成物混合物中の副生成物５、切断部の観察内容に該当する。

図７、パネルＢは、ＵＶデータを使用して行われた合成最適化の結果を示す。ピーク面積および高さの急激な減少が、実験ＡでＬからＴカップリングへと進行して観察されたので、２つの補正動作を行った。まず、第２の脱保護ステップを、第１の脱保護ステップの後に行って、脱保護が定量的であるか否かを評価した。第２の脱保護処理中の信号の不在は、脱保護ではなくカップリングに問題があることを示した。第２に、固定化ペプチドを活性化アミノ酸に曝す時間の長さを、実験Ｂで２倍にした。得られたＵＶ軌跡は、カップリング効率が大幅に増大することを実証した。このことは、欠失生成物のほとんどが存在しない非常に清浄な粗製ペプチドに対応した（パネルＣ）。この同じ最適化は、トレオニンカップリング中の第１のピークの高さの減少の観察により、行うことができた。切断は依然として存在する可能性があり；しかしフェニルアラニンおよびトリプトファンの欠失生成物は、この場合は回避することができた。
（実施例２）

この実施例は、流動ペプチド合成の実時間制御を行うための、ライン内ＵＶ吸光度分光法の使用について記載する。

アミド結合形成反応は、治療剤の小分子、ペプチド、およびタンパク質の合成で広く用いられている。１２８種の最近調査された小分子薬候補の中で、６５％はアミドの形成が必要であった。小分子に加え、糖尿病治療のためのＧＬＰ−１アゴニストを含めたペプチドは、最大で４０のアミド結合の形成を必要とする。がん治療の最前線である個別化されたペプチドワクチンは、各患者ごとのカスタム合成を必要とする。しかし、これらのペプチドの研究、開発、および生産は、合成速度により制限され、典型的には各アミノ酸付加および脱保護サイクルに数分から数時間かかる。この実施例において、本発明者らは、７秒でのアミド結合の形成による、固相ポリペプチド合成に対する完全に自動化された流動化学手法について報告し、４０秒での完全サイクル時間について記載する。粗製ペプチドの品質および単離された収率は、標準のバッチ式固相ペプチド合成と同等であった。フル操業で、この機械は、年当たり２５，０００個の３０量体個別ペプチドを合成することができ、その重量は合わせて２５キログラムであった。

ペプチドおよびタンパク質は、新しい治療剤の探索に重要である。基礎を支えるペプチドおよびタンパク質の研究は、新しい機能的変種を設計しかつこれらの設計を迅速に繰り返す必要性である。ペプチドの生物学的発現は、速くすることができかつ規模を縮小拡大することができ−リボソームは、秒当たり１５のペプチド結合の速さでペプチドを合成する−しかし２０の天然に生ずるアミノ酸以外では難しくなる。一方、増大した数のモノマーにも関わらず、化学的ペプチド合成は比較的遅いままである。この実施例では、リボソームの速度に近付く化学合成の柔軟性を持つ方法である、自動化流動ペプチド合成（Automated Flow Peptide Synthesis：ＡＦＰＳ）について記載する。ＡＦＰＳは、アミド結合形成ステップを７秒まで低減させ、各アミノ酸付加に関する全サイクルを４０秒まで低減させ、それと共に化学的性質の高レベルの制御を維持する。ＵＶモニタリングおよび使い捨て反応器によって、収率の定量と高速自動化切換えが可能になる。

自動化流動ペプチド合成器は、図８Ａ〜８Ｂに示される５つのモジュールからなる。カップリング反応中、機械は、試薬を貯蔵モジュールから引き出し、次いで所望のアミノ酸を、アミン塩基（ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＥＡ）および活性化剤（例えば、ＨＡＴＵまたはＰｙＡＯＰ）と、混合モジュール内で混合する。この混合物は、活性化モジュール、電気的に加熱されたプラグ流反応器であって、９０℃まで迅速に加熱される反応器内を流れる。活性化の２秒以内に、活性化アミノ酸はカップリングモジュール、ペプチド合成樹脂の充填床内を流れ、そこでアミド結合の形成が７秒以内に完了する。樹脂は、容易に除去されるように６ｍＬの使い捨てシリンジカートリッジに収容される。ＡＦＰＳは、時間の関数として反応器流出物の吸光度を記録することにより、各サイクルごとにＦｍｏｃ除去をモニタリングする。Ｆｍｏｃ除去吸光度クロマトグラムにより、脱保護効率、カップリング収率、およびペプチジル樹脂内を通る材料流束の速さを推論することが可能になり、これにより樹脂上ペプチド凝集の特定が可能になる。

ＡＦＰＳは、図８Ｄに示されるように、試験ペプチドＡＬＦＡＬＦＡおよびアシル担体タンパク質の断片（ＡＣＰ_{６５〜７４}）を合成することによって最初に検証した。これらのペプチドを、高収率で、副生成物が低レベルの状態で合成した。次いで比較研究を、図９Ａ〜９Ｂに示されるように、ＡＦＰＳ、バッチ合成、および信頼の置けるカスタムペプチドベンダーによって生成された、より長いペプチドの間で行った。標準のバッチ法に比べ、高温での高速連続流活性化を使用したペプチド合成では、長いポリペプチドの同等のまたはより高い品質の合成を僅かな時間で可能にした。さらに、図９Ｃに示されるように、プロセス内ＵＶモニタリングは、各ステップの合成収率に関する情報を与えた。インスリンＢ鎖に関して観察されたピーク面積の定常的な減少は、連鎖停止副反応から得られた。これらの副生成物は、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける主ピークの周囲の一連の不純物として現れた。

次いで高温流活性化によるＣｙｓおよびＨｉｓのエピマー化を評価した。活性化されると、ＣｙｓおよびＨｉｓは、Ｃ^α位で立体化学的性質を失う可能性がある。この問題は、特に高温でのバッチ合成技法を複雑にするが、それは活性化、カップリング、および分解の全てが同じ槽内で同時に起こるからである。バッチ式マイクロ波合成器では、ＨＢＴＵおよびＤＩＥＡを用いたマイクロ波照射の下での９０℃で１．５分間にわたるＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）のカップリングによって、望ましくないＤ−Ｃｙｓ生成物１６．７％が形成されることが見出された。対照的に、連続流では、システムの加熱ゾーン内での時間の長さによって、活性化プロセスが制御可能になることが見出された。これを探るため、そのジアステレオマーを分離することができかつＬＣ−ＭＳにより定量することができる２つのモデルペプチドＦＨＬおよびＧＣＦを使用した。流量を増大させることにより、したがって活性化Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）の温度での滞留時間を低減させることにより、ジアステレオマー形成は、ＡＦＰＳ法Ｂに関して、ＦＨＬでは０．５％におよびＧＣＦでは３％に限定された。このレベルのジアステレオマー形成は、最適化された室温バッチ合成プロトコールに一致する。

最後に、「困難」ペプチドの合成について調査した。そのような配列では、カップリングおよび脱保護の動態が低速になり、その結果、欠失および切断性生物が生じる。困難ペプチドは、成長するペプチジル鎖の凝集から得られると仮定した。しかし困難配列の識別は、ＬＣ−ＭＳ分析、定量的ニンヒドリン試験、またはＫａｉｓｅｒ試験を含む時間のかかる手順を必要とする。対照的に、連続流動条件下でのＵＶ吸光度によるＦｍｏｃ除去の分析は、ペプチドアセンブリの成功および樹脂結合ペプチドの凝集状態の、迅速な定量測定を提供することが観察された。

ＵＶモニタリングの有効性を研究するために、Ｊｕｎｇ−Ｒｅｄｍａｎｎ（ＪＲ）１０量体を、困難ペプチドとして使用した。まず、このペプチドのバッチＳＰＰＳを室温で行い、合成は、６回目のカップリングで失敗し始め、図１０Ｅに示されるように大量のＴｒｐ、Ｐｈｅ、およびＴｈｒ欠失をもたらしたことを見出した。次に、ＡＦＰＳを使用して、このポリペプチドを９０℃で合成し、各アミノ酸付加の後のＦｍｏｃ除去に関する曲線を検査した。図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、各脱保護曲線下の面積は、最終脱保護中の急激な減少まで一定であった。生成物のＬＣ−ＭＳは、主要な副生成物がＴｒｐ欠失であることを明らかにし、より高い温度が、バッチ式の場合に観察されたＰｈｅおよびＴｈｒ欠失をなくしたことを強調している。後者のカップリング中にほぼ２０％拡がった脱保護ピークの半値全幅は、Ｆｍｏｃ除去が低速になること、または凝集ペプチドを通る拡散速度が低減したことのいずれかを示唆しており、最終欠失の前触れとしての役割を果たしている。

ＵＶ読出しを使用して、Ｔｒｐ欠失を最小限に抑えた。合成中のペプチド凝集を軽減する１つの方法は、樹脂置換を低下させることであり；したがって、ひと組のアミン低減樹脂を調製し、鎖アセンブリの間にＦｍｏｃ除去信号をモニタリングした。図１０Ｃに示されるように、負荷が低減すると、最終Ｔｒｐカップリングに関するピーク面積で観察される減少はそれほど顕著ではなくなり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの観察に則して０．３ｍｍｏｌ／ｇの最適負荷へと向かった。等しく重要なことは、この欠失生成物に関し、ＵＶ読出しが、図１０Ｃ〜１０Ｆに示されるＬＣ−ＭＳデータを裏付けることを見出したことである。

この実施例に記載される方法は、手動式流動合成、熱加速式バッチ合成、およびその他の連続流動ペプチド合成法に勝る、数多くの利点を提供する。第１に、巧く組み合わせたフォーマットにおけるアミノ酸の加熱、混合、および活性化の全プロセスの自動化は、残基ごとのケミストリーを調整する無限の可能性を有効にする。第２に、精密ポンプおよび弁の作動によるこれら試薬のライン内混合によって、化学量論、滞留時間、およびアミノ酸エピマー化の制御が可能になり、合成を高度に再現可能にする。第３に、インフローＵＶモニタリングおよびデータ収集によって、アミドカップリング効率に相関する各サイクルごとのＦｍｏｃ除去の相対的定量が可能になる。第４に、高流束の洗浄溶媒、脱保護剤、および活性化アミノ酸を、樹脂ビーズ上で定常状態に維持することにより、ペプチド合成が著しく改善された。

図８Ａは、自動化流動固相合成器の写真を示し、異なるシステムモジュールおよびプロセス流れ図を強調している。アミノ酸、活性化剤、およびＤＩＥＡは、３つのＨＰＬＣポンプによって一緒に合流する。一連の多位置弁は、アミノ酸および活性化剤の選択を制御する。アミノ酸活性化は、カラム切換え弁の位置によって決定されるいくつかの加熱された流路の１つを通る流れにより、引き起こされる。次いで活性化アミノ酸は、加熱されたジャケットにより覆われた６ｍＬのフリットポリプロピレンシリンジに収容されたペプチジル樹脂２００ｍｇを含有する樹脂床上を流れる。廃棄流出物はＵＶ−可視分光計を通過し、次いで廃棄される。図８Ｂは、各ステップの持続時間、混合後の各ステップ中の溶液組成、および各ステップで使用される試薬の合計体積を示す、サイクル図を示す。図８Ｃは、４４％の単離収率で合成された、方法Ｂを使用するアシル担体タンパク質（６５〜７４）合成の粗製生成物についての、ＬＣ−ＭＳデータを示す。この合成では、出発ペプチジル樹脂２００ｍｇは、乾燥樹脂３１４ｍｇをもたらした。この研究の全体を通して、単離された粗製ペプチドの収率は、樹脂の名目上の負荷をベースにする。図８Ｄは、１つのカップリングおよび脱保護サイクルについてのＵＶ吸光度データの例を示す。

図９Ａは、異なる方法を介して合成された成長ホルモン放出ホルモンの、ＬＣ−ＭＳデータを示す。成長ホルモン放出ホルモンを、（ｉ）方法Ａにより４０分で、５８％の単離収率で合成し、（ｉｉ）手動式バッチ技法を使用した３０時間での、６０％の単離収率と比較した。このペプチドはまた、６週間のリードタイムで２つのベンダー（ｉｉｉ、ｉｖ）から購入した。これらペプチジル樹脂のそれぞれの２００ｍｇの切断は、自動化および手動合成と同等の量の、７６ｍｇおよび９０ｍｇをもたらした。図９Ｂは、異なる方法を使用して合成されたインスリンＢ鎖についてのＬＣ−ＭＳデータを示す。インスリンＢ鎖は、方法Ｂを使用して２０分で、５３％の単離収率で合成し、手動式バッチ技法による３０時間および４５％の収率と比較した。図９Ｃは、ＧＨＲＨおよびインスリンＢ鎖についての合成の各サイクルごとのＦｍｏｃ脱保護ＵＶデータのプロットを示す。ピーク面積、半値全幅、およびピーク最大値を、カップリング数の関数としてプロットする。液体クロマトグラフィおよびＥＳＩ−ＭＳを、６５２０ ＱＴＯＦ質量分光計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣで行った。各試料を、０．１％のギ酸を含む５％のアセトニトリル水溶液で予備平衡させたＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラムに注入した。４分保持した後、アセトニトリル濃度は６０分にわたって６５％に上昇した。

図１０Ａは、自動化流動ペプチド合成器の加熱部分の図を示す。図１０Ｂは、モデルペプチドＧＣＦのジアステレオマー分析を示し、方法Ｂを使用した流動合成からの代表的な試料（上）と、真正のＣｙｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とを示している。図１０Ｂは、方法Ｂを使用した流量（ｍｌ／分）の関数としてのＣｙｓジアステレオマー形成のパーセンテージを示す。図１０Ｄは、流動活性化中のＨｉｓエピマー化を調査するために、モデルペプチドＦＨＬについての図３Ｂと同じ分析を示す。方法Ｂを使用して合成されたモデルペプチドＦＨＬ（上部パネル）と、真正Ｈｉｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とのＬＣ−ＭＳである。図１０Ｅは、流量（ｍｌ／分）の関数としての、ヒスチジンジアステレオマー形成のパーセンテージを示す。

図１１Ａは、方法Ｂを使用したＪＲ１０量体（ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭ）の初期合成に関して記録された、ＵＶ吸光度データを示す。図１１Ｂは、Ｆｍｏｃ除去ＵＶピークの分析を示す。分析は、４回目のカップリング後、ピーク幅が徐々に増大するが、ピーク面積は最後のカップリングまで一定であることを明らかにした。図１１Ｃは、樹脂負荷の関数として、ＵＶ吸光度データから得た残基９から１０までの脱保護ピーク面積の変化のプロットを示す。図１１Ｄは、ＬＣ−ＭＳから決定された樹脂負荷の関数として、Ｔｒｐ欠失のプロットを示す。ＬＣ−ＭＳにより測定された欠失の量は、ＵＶプロセス内測定により予測される欠失の量を裏付ける。図１１Ｅ〜１１Ｇは、０．４５ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷による手動式バッチ（Ｅ）、０．４５ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷による自動化流動（Ｆ）、および０．２７ｍｍｏｌ／ｇの樹脂負荷による自動化流動（Ｇ）により調製された、ＪＲ１０量体に関する最終粗製生成物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
（実施例３）

この実施例は、実施例２で使用される材料、方法、および計装について記載する。

材料：全ての試薬を購入し、受け取ったままの状態で使用した。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｃｒｅｏ Ｓａｌｕｓから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＯ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）は、ＣｈｅｍＩｍｐｅｘから購入した。ＯｍｎｉｓｏｌｖグレードのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＤＸ１７２６−１）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、カタログ番号３８７６４９）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、アセトニトリル、および１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｈ−ＲｉｎｋアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘポリエチレングリコール樹脂は、Ｐｃａｓ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（カタログ番号１７４４）から購入した。

試薬保存および流体マニホールド：試薬保存システムは、試薬を収容するための２つの異なる槽：大量向けのＣｈｅｍｇｌａｓｓ３つ口５００ｍＬスピナーフラスコ（ＣＬＳ−１４０１−５００）、およびより少量向けの５０ｍＬポリプロピレンシリンジ管（部品＃ＡＤ９３０−Ｎ、ＡＤ９５５−Ｎ）を使用した。ガラス瓶の全てに、ＵＶ耐性マットスプレー塗料（Ｋｒｙｌｏｎ １３０９）を塗って試薬のＵＶ分解を低減させ、これらの瓶は、アルゴン圧力下での動作のために緑色保護安全ネットを有していた。アルゴン圧力は、Ｓｗａｇｅｌｏｋ圧力調節器（部品＃ＫＣＰ１ＣＦＢ２Ｂ７Ｐ６００００）により５ｐｓｉの圧力で維持した。試薬引出しラインは、ポンプ、逆止め弁、およびラインが任意の試薬の結晶化または不純物によって詰まるのを防ぐために、２０ｕｍポリプロピレンフィルター（部品＃ＪＲ−３２１７８）を備えていた。

９個のアミノ酸の瓶およびシリンジの各列は、ＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ １０位置弁（Ｖｉｃｉ部品＃Ｃ２５−３１８０ＥＵＨＡ）に供給され、第１０の位置はＤＭＦであった。それらの弁は全て、主要なＶｉｃｉ Ｖａｌｃｏ １０位置弁に供給された。この主要な弁は、アミノ酸ポンプに供給した。ＨＡＴＵ、その他のカップリング剤、４０％ピペリジン、およびＤＭＦを含有する瓶は、個別の１０位置弁に供給された。この弁を、カップリング剤ポンプに接続した。ＤＩＥＡは、第３のポンプに直接供給される。

ポンピングおよび混合：ＡＦＰＳは、３つのＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ポンプで動作した。第１のポンプはアミノ酸またはＤＭＦのいずれかを送出した。第２のポンプは、カップリング剤、４０％ピペリジン溶液、またはＤＭＦのいずれかを送出した。第３のポンプはＤＩＥＡを送出した。カップリング剤およびアミノ酸ポンプは、５０ｍｌ／分のステンレス鋼揚程（ｐｕｍｐ ｈｅａｄ）を有していた（Ａｇｉｌｅｎｔ部品＃５０−ＷＳＳ）。ＤＩＥＡポンプは、５ｍｌ／分の揚程（Ａｇｉｌｅｎｔ部品＃５−Ｔｉ）を有していた。３つのポンプの出口は、３つの入口逆止め弁（ＩＤＥＸ部品＃ＣＶ−３３２０）とのクロス部（ＩＤＥＸ部品＃Ｐ−７２２）で合流して、クロス部と揚程との間での拡散を防止した。ＰＥＥＫのクロス部と、ポンプの全てとの間のＰＥＥＫ管材（１／１６”ＯＤ、０．０２０”ＩＤ）の長さは、一致した体積を有していた。クロス部の後の、ある長さのＦＥＰ管材（１／１６”ＯＤ、０．０３０”ＩＤ）を、１／２インチのシリンダの周りに２２回、コイル状に巻いて、高いディーン数（＞３０００）の静止混合器を形成して、試薬混合を容易にした。

活性化およびカップリング反応器：混合後、試薬流は、ＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ ６位置カラム切換え弁（Ｖｉｃｉ部品＃ＡＣＳＴ６ＵＷ−ＥＵＴＡ）を使用して選択された熱交換器に進行した。これらの熱交換器は、アルミニウムのスプールに巻き付けられかつ絶縁のためシリコーンで被覆された、ある長さのステンレス鋼管材からなるものであった。スプールを、２つの抵抗カートリッジ加熱器（Ｏｍｅｇａ部品＃ＣＳＳ−１０２５０／１２０Ｖ）で加熱した。ペプチド合成法Ａについて、３ｍ（１０ｆｔ、１．３６８ｍｌ）の熱交換器ループを９０℃で使用し；ペプチド合成法Ｂについて、１．５ｍ（５ｆｔ、０．６８４ｍｌ）の熱交換器ループを７０℃で使用した。

Ａｒｄｕｉｎｏ上での試作：最初に、制御システムをＡｒｄｕｉｎｏ Ｍｅｇａで試作した。ポンプおよび弁をデイジーチェーン接続し、ＲＳ２３２ ＭＡＸ３２３２ ＳｐａｒｋＦｕｎ Ｔｒａｎｓｃｅｉｖｅｒ Ｂｒｅａｋｏｕｔ（ＢＯＢ−１１１８９）を使用してＡｒｄｕｉｎｏ上でＴＴＬシリアルポートを分離した。

ポンプおよび弁とのシリアル通信：標準のＲＳ−４８５シリアルプロトコールを使用して、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ２１０ポンプおよびＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ弁と通信を行った。ポンプ通信は、１９２００ボー、８ビット、偶数パリティであり、１ストップビットであった。弁通信は、９６００ボーであり、パリティはなく、１ストップビットであった。

加熱および温度制御：全ての加熱器を、８チャネルＷａｔｌｏｗ ＥＺ−Ｚｏｎｅ ＲＭ制御器（部品番号ＲＭＨＦ−１１２２−Ａ１ＡＡ）で制御した。この制御器は、基板上にＰＩＤ制御を集積する。温度を、Ｗａｔｌｏｗにより提供されたソフトウェアを使用して、ＲＳ−２３２シリアルポートを通してソフトウェア内に読み取った。全ての熱電対を、摂氏０度での１点較正を使用して較正した。

プロセスデータ収集：ソフトウェアは、各合成中に、温度、質量流量、圧力、およびＵＶ吸光度を記録した。上記のＷａｔｌｏｗ ＰＩＤ制御ユニットを使用して、温度データを獲得した。質量流量データの場合、Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ Ｃｏｒｉｏｌｉｓ質量流量計を使用し（部品＃Ｍ１４−ＸＡＤ−１１−０−５）、流体密度のモニタリングも可能にした。反応器の両端の差圧を、２つのＤＪ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＨＰＬＣ貫通孔チタン圧力センサ（部品＃ＤＦ２−０１−ＴＩ−５００−５Ｖ−４１”）を使用してモニタリングした。これらのセンサを、１００ｐｓｉで、摂氏９０度で１点較正した。

３１２ｎｍでのＵＶモニタリングは、Ｓｕｐｅｒ Ｐｒｅｐ ２重経路長フローセル（名目上の経路長が４ｍｍおよび０．１５ｍｍ）を備えたＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２３０ ＵＶ−Ｖｉｓ出器を使用することによって実現した。この二重経路長フローセル装置は、高いダイナミックレンジの吸光度測定を可能にし−大きいフローセルの線形範囲を超えて吸光度が増大したときはいつでも、この機器は、より小さいフローセルを通して吸光度を記録するよう切り換わった。フローセルの切換え中に正確な測定を確実にするために、Letters in Peptide Science、９巻：２０３〜２０６頁、２００２年に記載されるように調製されたジベンゾフルベンの標準溶液を使用して、経路長の比を較正した。

温度および質量流量のデータを、Ｗａｔｌｏｗ ＰＩＤおよびＢｒｏｎｋｈｏｒｓｔ流量計とのシリアル通信を通して獲得した。圧力およびＵＶデータについての電圧測定値は、ＮＩ ９２０５ ３２−チャネルアナログ入力カード（部品番号７７９３５７−０１）を備えたＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＮＩ ｃＤＡＱ−９１８４（部品番号７８２０６９−０１）を使用した機器から得た。データ点を、平均して５０ｍｓごとに記録した。ＵＶ検出器では、信号応答時間を１０ｍｓに設定し、全電圧スケールは１００ｍｖであった。

ソフトウェアは、アミノ酸、活性化剤、カップリングおよび脱保護ステップの温度、カップリングおよび脱保護ステップの流量、ならびに使用される試薬の量（ポンプストロークの数）のカスタマイゼーションを可能にした。これらは、システムが動作中に修正することができ：例えば、凝集を提示したＵＶに応答して、温度、使用されるアミノ酸の量、または活性化剤を変更することができた。

合成器を、イーサネット（登録商標）、およびＬａｂ Ｖｉｅｗ ＶＩ搭載のウィンドウズ（登録商標）コンピュータのＵＳＢで制御した。ＶＩは、ユーザが所望のペプチドのレシピを容易に作成できるよう、グラフィカルインターフェースを有する。レシピによって、ユーザは、流量、使用されるアミノ酸の量、活性化剤、活性化の温度および滞留時間、脱保護滞留時間、および合成の各ステップごとの脱保護試薬の量を、制御することができる。ユーザは、所望のレシピを作成したら、レシピをマシンキューに出し、「Ｒｕｎ」を押す。ユーザは、合成中に、ＵＶ軌跡をモニタリングすることによって合成品質の変化に気付いた場合、急いで任意の後続のカップリングステップに関するレシピを修正することができた。「Ｒｕｎ」を押すと、ソフトウェアは、ユーザが選択したアミノ酸、流量、温度、試薬の量、および活性化試薬のタイプを用いて、各アミノ酸ごとに事前に定義されたルーチンを生成する。

コードは、ポンプ、弁、またはモータのいずれかで行われる操作からなるものであった。各操作は、ひと組の入力および休止時間からなるものであった。弁は、弁ＩＤおよび弁位置を受け取り；ポンプはポンプＩＤおよびポンプ流量を受け取り；モータはモータＩＤおよびモータ位置を受け取る。ステップが完了した後、次のステップを実行する前に休止時間が完了するまで、プログラムを待機させた。＃変数により表された休止時間を、レシピ入力を使用して実行中に演算する。例えば、ステップ１２でポンプを動作させた後の休止時間は、レシピ中の「ＣＰＬ ＮＳｔｒｋ」（カップリングストロークの数）パラメータにより決定する。表１は、単一アミノ酸ペプチドのアセンブリについてのプログラムを示す。

分析ペプチド切断および側鎖保護基の除去：ペプチジル樹脂約１０ｍｇを、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に加えた。切断溶液（９４％ＴＦＡ、１％ＴＩＰＳ、２．５％ＥＤＴ、２．５％水）２００μＬを管に加え、６０℃で５分間インキュベートした。切断の完了後、２００μＬ ＴＦＡを管に加えて樹脂を濯ぎ、可能な限り多くの液体を、ピペットチップを使用し樹脂を回避して別の管に移した。切断溶液の管に、８００μＬの冷ジエチルエーテルを加えた。管を振盪させ−目に見える蝋状沈殿物が形成され、遠心分離によって収集した。上澄みエーテルを注ぎ込み、さらに２回のエーテル洗浄を行った。

最後に、窒素ガスの流れの下で、蝋状固体を簡単に乾燥させた。５０％のアセトニトリル水溶液５００μＬを管に加え、完全に混合した。この溶液を、遠心分離バスケットフィルターに通して濾過し、０．１％のＴＦＡを含む５０％のアセトニトリル水溶液に入れて１：１０に希釈し、液体クロマトグラフィ分析を行った。

分取ペプチド切断：合成後、ペプチジル樹脂をジクロロメタンで洗浄し、真空チャンバ内で乾燥し、秤量した。樹脂を、１５ｍＬの円錐ポリプロピレン管に移した。切断溶液（９４％ＴＦＡ、１％ＴＩＰＳ、２．５％ＥＤＴ、２．５％水）約７ｍＬを管に加えた。より多くの切断溶液を加えて、完全な浸漬を確実にした。管にキャップをし、反転させて半時間ごとに混合し、室温で２時間進行させた。

次いで樹脂スラリーを、１０ｍＬのＴｏｒｖｉｑシリンジに嵌め込まれた１０μｍのポリエチレン膜ディスクに通して濾過した。樹脂を１ｍＬのＴＦＡでさらに２回濯ぎ、濾液を５０ｍＬのポリプロピレン円錐管に移した。３５ｍＬの氷冷ジエチルエーテルを濾液に加え、３０分間静置して、ペプチドを沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、３５ｍＬの冷ジエチルエーテルでさらに２回磨砕した。上澄みを廃棄した。

最後に、残留エーテルを蒸発させ、ペプチドを５０％のアセトニトリル水溶液に溶解した。ペプチド溶液を凍結させ、乾燥するまで凍結乾燥し、秤量した。

ペプチド試料の分析液体クロマトグラフィ分析：希釈ペプチド試料１μＬを、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ粒度）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０ ＬＣ−ＭＳで分析した。図９および図１１の試料について、０．１％のギ酸添加剤を含む水中でのアセトニトリルの勾配を使用した。勾配は、５％のアセトニトリルで開始して、分当たり１％のアセトニトリルの速度で６５％のアセトニトリルまで上昇した。完全な方法は、勾配の合計時間と共に１％で保持時間を含んでいた。

初期合成条件およびシステムの特徴付け：２０ｍＬ／分の合計システム流量および７０℃で、２０％ピペリジンによる処理は２０秒になるように選択され、先に示された条件は完全Ｆｍｏｃ除去に十分になるように選択された。ＤＭＦ洗浄は、３０秒になるように選択された。洗出し時間は、Ｆｍｏｃアミノ酸を反応器内に導入し、ＤＭＦ洗浄後にいかなるＵＶ活性材料もシステムから確実に取り除かれるようＵＶ検出器を使用して、検証した。

活性化剤およびアミノ酸の流体流をライン内混合するためのスキームは、カップリングに使用される条件の多様性を可能にした。しかし、Ｆｍｏｃ合成におけるアミノアシル化で伝統的に使用されてきた条件からの、逸脱を必要とした。典型的には、試薬は、それらの溶解限度、Ｆｍｏｃアミノ酸およびウロニウムカップリング剤については０．４Ｍ程度で使用される。しかし、これらの試薬はＡＦＰＳ上で別々に保存されかつカップリングでは２種の濃縮溶液を混合するので、最初にアミノアシル化に使用される最終溶液は、０．２Ｍのアミノ酸および活性化剤で構成された。典型的なカップリングでは、このカップリング溶液を合計で９．６ｍＬ使用して、完全なカップリングを確実にした。これらの条件を、短いポリペプチド、ＡＬＦＡＬＦＡの合成に関して最初に試験した。

合成サイクルの最適化：診断「困難」配列として典型的に使用される１０残基ペプチド、ＡＣＰを、同じ体積のカップリング剤を各実験で使用して、２０、４０、および６０ｍＬ／分の合計流量で７０℃で合成した。より高い流量では、連鎖停止副生成物の形成の増大−グルタミンカップリング中のテトラメチルグアニジル切断の増大が、観察された。このことは、高流量での不完全な活性化に起因すると仮定され：活性化剤およびアミノ酸の量がほぼ等しい場合、成長するペプチジル鎖のＮ末端をグアニジニル化することができる、残留ＨＡＴＵが存在することができた。活性化剤の濃度を０．３４Ｍに低減させ、それと共に揚程の完全同期化を確実にすることにより、この副反応はほとんどの場合になくなり、８０ｍＬ／分でＡＣＰを定量的収率で合成することが可能になる。その他のペプチドにおけるＦｍｏｃ−Ａｒｇカップリングでは、これらの切断部が依然として観察され、したがってＰｙＡＯＰを、これらのカップリングの活性化剤として使用した。

脱保護に対する温度の影響の調査：２０％のピペリジンを含むＦｍｏｃ−グリシン官能化ペプチジル樹脂の、７０、８０、および９０℃での脱保護を、検査した。３つの全ての場合に、バッチ式カップリング法を使用して、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙをＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋアミド樹脂２００ｍｇに室温で連結した。次いで樹脂を自動化流動合成に写し、２０％ピペリジンの単一の処理を、７０、８０、または９０℃のいずれかで行った。３つの全ての場合に、Ｆｍｏｃ除去ピークの積分面積は同じであり、完全なＦｍｏｃ除去を示唆している。しかし、より高い温度ではピーク最大値が初期に生じ、樹脂から出て行くＦｍｏｃ−ジベンゾフルベン付加物の、より高速の脱保護およびより高速の拡散のいずれか、またはその両方を示唆している。

自動化流動ペプチド合成器でペプチドを合成するための代表的なプロトコール：ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ ＰＥＧ Ｒｉｎｋアミド樹脂２００ｍｇを、フリットの上部に追加の７〜１２μｍ Ｐｏｒｅｘ ＵＨＭＷＰＥ（ＸＳ−ＰＯＲ−７４７４）膜を備えた６ｍＬのＴｏｒｖｉｑフリットシリンジに投入した。樹脂をＤＭＦで５分間予備膨潤させ、その後、大きい樹脂凝集物を、シリンジプランジャを挿入することによって手動で破壊した。シリンジにＤＭＦを満たし、流体入口に投入し、９０℃の加熱チャンバ内に投入した。合成器を、図８に示されるように設定し、全ての試薬は、８０ｍＬ／分の合計流量でポンプ送出されるが、クロスマニホールド、混合器、および１０ｆｔのステンレス鋼は、９０℃でループを加熱し、その後、樹脂上にポンプ送出される。３つのＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ ＨＰＬＣポンプを使用し、２つは、アミノ酸および活性化剤に関して５０ｍＬ／分の揚程を有し、１つは、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）に関して５ｍＬ／分の揚程を有していた。５０ｍＬ／分の揚程は、ポンプストローク当たり４００μＬの液体をポンプ送出し；５ｍＬ／分の揚程は、ポンプストローク当たり４０μＬの液体をポンプ送出した。

使用される標準合成サイクルは、高温で２０秒間、８０ｍＬ／分で樹脂を予備洗浄する第１のステップを含んでいた。カップリングステップ中、３つのＨＰＬＣポンプを使用し：５０ｍＬ／分の揚程は、活性化剤（典型的には、０．３４Ｍ ＨＡＴＵ）をポンプ送出し、第２の５０ｍＬ／分の揚程は、アミノ酸（０．４Ｍ）をポンプ送出し、５ｍＬ／分の揚程は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を送出した。最初の２つのポンプは、ＤＩＥＡポンプが始動する前にカップリング剤およびアミノ酸をプライム処理するために、５回のポンピングストロークを始動させた。次いで３つのポンプを、７回のポンピングストローク期間にわたり一緒に作動させ、その後、ＤＭＦが選択されるように回転弁を使用して、活性化剤ポンプおよびアミノ酸ポンプを切り換えた。３つのポンプを、最終的な５回のポンピングストロークにわたって一緒に作動させ、その後、ＤＩＥＡポンプを遮断し、その他２つのポンプは、さらに１６回のポンプストロークにわたって樹脂を洗浄し続けた。

脱保護ステップ中、２つのＨＰＬＣポンプを使用した。回転弁を使用することにより、１つのＨＰＬＣポンプは４０％のピペリジンを選択し、その他はＤＭＦを選択する。ポンプを、１３回のポンプストロークにわたり作動させた。混合後、ピペリジンの最終濃度は２０％である。次に回転弁は、両方のＨＰＬＣポンプに関してＤＭＦを選択し、樹脂は、さらに１６回のポンプストロークにわたり洗浄された。カップリング／脱保護サイクルを、全ての追加のモノマーに関して繰り返した。

アスパルチミド形成および高温ＧＨＲＨ合成：図６に示される７０℃での、および９０℃でのＧＨＲＨ合成について調査した。この合成を９０℃で行う場合、７０℃とは対照的に、サイン−１８Ｄａ質量およびシフトした滞留時間を持つ、アスパルチミド副生成物の形成が認められた。この副反応は、高温および特定のＡｓｐ含有ペプチドの両方で起こることが公知である。この副反応に対するピペラジン、より穏和な塩基の影響を、調査した。脱保護のために、２０％ピペリジンの代わりに２．５％ピペラジンを使用することにより、ＬＣ−ＭＳで測定したときにこの副生成物の量が著しく低減したが、アミノ酸欠失の量は増加し、特にＡｌａおよびＬｅｕに関して増加した。０．１Ｍ ＨＯＢｔを２．５％ピペラジン脱保護カクテルに加えた結果、ほぼ同じ合成品質が得られた。したがって、アスパルチミド形成が疑われるＡｓｐ含有ペプチドの場合、低下した温度、低下した強度の脱保護カクテルのいずれか、またはこれらの両方を使用することが有利である。

低減負荷樹脂の合成およびＪＲ１０量体負荷の研究：低減負荷樹脂は、第１のアミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨを、０．４５ｍｍｏｌ／ｇの名目上の負荷を有する２００ｍｇのＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＨＲ樹脂とカップリングすることによって調製した。１バッチ分の樹脂について、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨを、２．５ｍＬの０．４Ｍ ＨＢＴＵ、０．４Ｍ ＨＯＢＴ溶液と混合し、そして溶解した。５００μＬのＤＩＥＡを添加し、完全に混合し、次いで樹脂に添加した。カップリングを１時間進行させた。その他４つのバッチの樹脂について、酢酸を、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨの代わりに化学量論的に置き換えて、所望の負荷：当初の負荷の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、および２５％に到達させた。図１１で使用した相対負荷を、最初の脱保護積分を使用して計算した。

次いで自動化流動ペプチド合成器で、配列ＷＦＴＴＬＩＳＴＩＭを、これら樹脂のそれぞれで合成した。条件は、下記の通りであった：熱交換器、反応器入口、および反応器本体で９０℃。８０ｍＬ／分のカップリング／脱保護、７カップリングストローク、１３脱保護ストローク、２４洗浄ストローク。最初のカップリング−Ｍ−は、樹脂が依然として完全に保護されていたので、樹脂に何も付加しなかった。最初の脱保護は、ベースラインＵＶ吸光度を与え、キャッピングステップ中に得られた負荷の推定を可能にした。

ＪＲ１０量体、インスリンＢ鎖およびＧＨＲＨの手動合成：これらのペプチドを、Kentら、Org Lett. ２０１５年、１７巻（１４号）、３５２１頁に従い合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ−アミド樹脂（０．１ｍｍｏｌ；０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した。まず、カップリングさせるアミノ酸０．５５ｍｍｏｌを１．２５ｍＬの０．４Ｍ ＨＢＴＵ／０．４Ｍ ＨＯＢＴに溶解し、次いでＤＩＥＡ １２２μＬ（０．７ｍｍｏｌ）を加えることによって、アミノ酸を３０秒間活性化した。３０秒後、溶液を樹脂に加えた。カップリングを、断続的に撹拌しながら３０分間進行させた。

各カップリングステップ後、４５ｍＬのＤＭＦ流洗浄を行った。次いで３ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを樹脂に加え、撹拌し、５分間インキュベートさせた。このプロセスを１回繰り返した。各脱保護の後、４５ｍＬの流動洗浄を行い、その後、ＤＭＦによる１分間のバッチ処理を行った。

ＣｙｓおよびＨｉｓエピマー化の決定：ＣｙｓおよびＨｉｓエピマー化を、２種のモデルペプチドＧＣＦおよびＦＨＬをそれぞれ使用して測定した。各合成ごとに、ＣおよびＨカップリングについての流量を変化させ、フランキング残基（ＧＣＦに関してはＧおよびＦ；ＦＨＬに関してはＦおよびＬ）についてのカップリング条件を、９０℃および８０ｍＬ／分の合計流量で一定に保った。各モデルペプチドの合成後、切断を上記のように行った。

切断された生成物のＬＣ−ＭＳ分析を行った。それぞれの場合に形成されたＤ−エピマーの量を決定するために、２つの立体異性体の、抽出されたイオンクロマトグラムを得た：ＧＣＦについて３４２．５〜３２９．０Ｄａ、およびＦＨＬについて４９４．９〜４１７．６Ｄａ。各エピマーに該当するピークを積分した。真正標準を調製し、各エピマーの滞留時間を検証するために同じ方法で分析した。

本発明のいくつかの実施形態について本明細書に記載し例示してきたが、当業者なら、機能を発揮しかつ／または結果および／もしくは本明細書に記載される利点の１つもしくは複数を得るための、様々なその他の手段および／または構造を容易に想像するであろうし、そのような変形例および／または修正例のそれぞれは、本発明の範囲内にあると考える。より一般的には、当業者なら、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示（単数または複数）が使用される特定の１つまたは複数の適用例に依存することになることを、容易に理解するであろう。当業者なら、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識しまたは確認できるであろう。したがって、前述の実施形態は単なる例として提供され、添付される特許請求の範囲内およびその均等物の範囲内で、特に記載されておりかつ特許請求されるもの以外に本発明を実施してもよいことを理解されたい。本発明は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法のそれぞれを対象とする。さらに、２つまたはそれよりも多くのそのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾していない場合、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書でおよび特許請求の範囲で使用される不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、反対の内容が明示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。

本明細書でおよび特許請求の範囲で使用される「および／または」という文言は、そのように連合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきであり、即ち要素は、場合によっては共同的に存在し、その他の場合には離接的に存在する。その他の要素は、反対の内容が明示されない限り、特に特定されたそれらの要素に関連しても関連していなくても、「および／または」という節によって特に特定された要素以外で任意選択で存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」と言う場合には、「含む」などの非限定言語と併せて使用されるとき、一実施形態ではＢのないＡ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＡのないＢ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択で、その他の要素を含む）などを指すことができる。

本明細書および特許請求の範囲で使用される「または」は、上記定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈するものとし、即ち、いくつかの要素または要素のリスト、および任意選択で追加の列挙されていない項目の、少なくとも１つを含むが１つよりも多くのものも含むものとする。「〜の１つのみ」または「〜のまさに１つ」、あるいは特許請求の範囲で使用される場合の「〜からなる」などの、反対の内容を明示する用語のみは、いくつかの要素または要素のリストのまさに１つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「〜のまさに１つ」などの排他性の用語が先行するときには、排他的代替例（即ち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すとして単に解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるようなその通常の意味を有するものとする。

本明細書および特許請求の範囲で使用される「少なくとも１つ」という文言は、１つまたは複数の要素のリストに言及する場合、要素のリスト中の要素のいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に特に列挙されたそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組合せを排除しないことを理解すべきである。この定義によれば、要素は、特に特定された要素に関係していても関係していなくても、「少なくとも１つ」という文言が指す要素のリスト内で特に特定される要素以外が任意選択で存在していてもよいことも可能になる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等しく「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等しく「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＡであってＢが存在しないこと（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＢであってＡが存在しないこと（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＡと、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＢ（任意選択で、その他の要素を含む）などを指すことができる。

特許請求の範囲において、ならびに上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運ぶ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関わる（involving）」、および「保持する（holding）」などの全ての移行句は、オープンエンドであると理解され、即ち、含むがそれらに限定されないことを意味すると理解されたい。「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみは、the United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures、Section 2111.03に記載されているように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。

Claims (32)

1. ペプチド合成システムを操作する方法であって、
   カップリング反応が反応器内で生じた後に、脱保護試薬を含む流体流を前記反応器に通して流すことであって、前記反応器が、固体支持体上に固定化された複数のペプチドを含むこと、
   信号を生成するために、前記流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を、前記反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで検出すること、
   少なくとも一部では前記信号から誘導された情報に基づいて、前記反応器内での後続のカップリング反応の前および／または最中に、前記システムのパラメータを変調させること
   を含む方法。
2. 第２のアミノ酸が、前記後続のカップリング反応中に、前記固定化ペプチドの約９９％よりも多くに結合される、請求項１に記載の方法。
3. 前記カップリング反応が、アミノ酸と固定化アミノ酸残基との間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
4. 少なくとも一部では前記信号から誘導された情報に基づいて、複数のペプチドの凝集の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
5. 少なくとも一部では前記信号から誘導された情報に基づいて、複数のペプチドの切断の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
6. ペプチド合成システム内でペプチドを形成する方法であって、
   ペプチド断片を形成するために、アミノ酸と、固体支持体上に固定化されたアミノ酸残基との間のカップリング反応の後に、脱保護試薬を含む流体流を反応器に通して流すこと、
   信号を生成するために、前記流体流の電磁吸光度および／または電磁放射を、前記反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで検出すること、
   少なくとも一部では前記信号から誘導された強度成分および時間成分に基づいて、前記反応器内で、前記ペプチド断片を含むペプチドを形成する前に、前記システムのパラメータを変調させること
   を含む方法。
7. 前記信号が時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記信号が強度成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
9. 前記信号が持続時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
10. 前記信号が、強度成分および時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
11. 前記信号が、ピーク面積、ピーク高さ、および／または半値幅の決定を介して特徴付けることが可能な少なくとも１つのピークを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記脱保護試薬が、塩基、酸、または求核試薬からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記アミノ酸が保護基を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記電磁吸光度および／または前記電磁放射が、赤外吸光度、赤外線放射、紫外吸光度、および／または紫外線放射からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
15. 少なくとも一部では前記強度成分および／または前記時間成分に基づいて、複数のペプチドの凝集の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
16. 少なくとも一部では前記強度成分および／または前記時間成分に基づいて、複数のペプチドの切断の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
17. 前記検出するステップには、前記流体流中の脱保護副生成物の存在、非存在、または量が含まれる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
18. ペプチド合成システムを操作する方法であって、
    ペプチド合成反応器の下流に位置決めされた検出ゾーンで第１および第２の信号を生成すること、
    前記第１の信号を前記第２の信号および／または参照信号と比較すること、ならびに
    少なくとも一部では前記比較するステップから誘導された情報に基づいて、前記反応器内での反応の前および／または最中に前記システムのパラメータを変調させることを含み、前記パラメータが、流量、反応時間、温度、反応物のタイプ、反応物の濃度、反応物の比、添加剤の添加、およびこれらの組合せからなる群から選択される、方法。
19. 前記第１の信号および／または前記第２の信号が時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
20. 前記第１の信号および／または前記第２の信号が強度成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
21. 前記第１の信号および／または前記第２の信号が持続時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
22. 前記第１の信号および／または前記第２の信号が、強度成分および時間成分を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
23. 前記第１の信号および／または前記第２の信号が、ピーク面積、ピーク高さ、および／または半値幅の決定を介して特徴付けることが可能な少なくとも１つのピークを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
24. 前記時間成分が半値幅である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
25. 前記強度成分がピーク高さである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
26. 少なくとも一部では前記比較するステップから誘導された情報に基づいて、複数のペプチドの凝集の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
27. 少なくとも一部では前記比較するステップから誘導された情報に基づいて、複数のペプチドの切断の存在または非存在を決定することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
28. 前記変調させるステップが、先行するカップリング反応の反応動態に比べて、後続のカップリング反応の反応動態を変化させることを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
29. 前記第１の信号を前記第２の信号と比較することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
30. 前記第１の信号および前記第２の信号を前記参照信号と比較することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
31. 第１の試薬チャネルに接続された第１の試薬リザーバと、
    第２の試薬チャネルに接続された第２の試薬リザーバと、
    前記第１および第２の試薬リザーバの下流に位置決めされ、流体接続されているペプチド合成反応器と、
    前記反応器に接続された送出チャネルであって、前記第１および第２のチャネルがそれぞれ接合部で前記送出チャネルの上流にあり、流体接続されている送出チャネルと、
    前記反応器の下流にあり、流体接続されている流出物チャネルと、
    前記流出物チャネルに接続され、前記流出物チャネルの下流にある電磁放射線検出器と、
    前記電磁放射線検出器と電気通信する制御器であって、システムの１つまたは複数のパラメータを制御するよう構成された制御器と
    を含む、ペプチド合成器システム。
32. 前記システムには、前記反応器と前記検出ゾーンとの間に位置決めされた分離カラムがない、前記請求項のいずれかに記載の方法。