TWI510781B - 即時監測固相胜肽合成反應之質譜系統 - Google Patents
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Description
本申請案主張2010年10月28日所申請之美國臨時申請專利案號61/408,072之優先權效益，此美國臨時專利申請號61/408,072的全部內容係納入此處參考。
本發明係提供了一種在大氣壓力下即可線上檢測胜肽中間體或產品之即時監測固相胜肽合成(SPPS)系統和方法。本發明同時也證實了此即時監測系統能追蹤固相胜肽合成中的每一個步驟並確認反應完成程度。本發明之另一態樣係提供了一種能乘載固態樣品之樣品載台，此載台能影響雷射脫附及電噴灑游離質譜之分析穩定度及靈敏度。
組合化學(combinatorial chemistry)為一種能同時很快地製造出大量不同的化合物並快速篩選出有用化合物的一種技術。如胜肽分子資料庫能被用於篩選酵素之受質及抑制劑或者細胞結合肽(cell binding peptides)。不像傳統合成方法一次只能處理一種類型的分子，組合化學為一種用來研發新藥、催化劑及材料的重要工具。由於胜肽分子具有高特異性及低毒性的性質，目前已有數百種的胜肽藥物進入臨床試驗的階段或已上市。預期後續對胜肽藥物的需求將會大量增加，而利用組合化學之化學合成方法將扮演重要的角色。
各種不同的化學合成法中，在1963年美國紐約洛克斐勒大學的Merrifiled教授首次報導了胜肽的固相合成(SPPS)，而後因其具備了簡單的反應步驟及容易將產物純化分離而成為發展組合化學的重大突破。此方法主要是將第一個胺基酸連結到由樹脂或塑膠探針構成的不溶性支撐體，並且將其他帶有保護基的胺基酸依序耦合接上而得到所欲之序列。固相合成方法可以在每一個步驟使用過量的反應試劑來趨使反應完全並利用反覆的清洗而達到純化的目的。此方法依靠高效率的化學合成步驟發展出自動化的胜肽製備流程而省去多餘且耗時的純化流程。因此，在新藥的開發中，利用固相化學合成之組合資料庫已成為例行性的策略。
然而，固相化學合成仍存在著一些缺點，特別是在分析方面。儘管質譜儀能為組合資料庫提供高通量的分析，但大多數分子因不具備適當的游離特性而使這項技術無法普及。此外，使用一般光譜檢測方法來進行多步驟之化學合成的線上監測，皆要求樣品必須脫離固相支撐體的研究下溶解樣品。通常胜肽化合物的偵測都是在一個合成階段的反應完成後才進行此乃因為此時胜肽會從固相支撐體水解釋放進入溶液中才能進行偵測。而將樣品從固相支撐體切下(cleavage)再去進行分析的策略應用於品質管控及反應監測上會導致幾個缺點。此種化合物評估的型式不僅對中間體造成破壞也造成樣品的浪費，且為了自固相支撐體切下樣品所使用的裂解試劑(cleavage reagents)也可能產生副反應(side-reactions)，而造成質譜圖的複雜性，使得胜肽產物的確定更為困難。
已有數篇報導(Michael C. F. et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,
Vol. 6,979-982,1996;Stephen C. M. et al.,Tetrahedron Letters,
Vol. 40,2407-2410,1999)顯示基質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF)能被用來分析一些以易光解的連接子(photolabile linker)連接在固相樹脂上且被Fmoc所保護的胺基酸或胜肽化合物。其他的文獻(Delphine M. et al.,Journal of the American Society for Mass Spectrometry
,Vol. 12,1099-1105,2001)也報導了利用飛行時間二次離子質譜儀(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometer,TOF-S-SIMS)在不需要樣品前處理的步驟下直接偵測連結在固體支撐物上的分析物。然而，不管是MALDI-TOF或TOF-S-SIMS，兩者均須在高真空的環境下進行脫附以及游離的操作步驟，因此仍不是監測全程固相胜肽合成反應的最佳策略。
本發明提供了一種能直接線上即時監測固相胜肽合成的分析系統，此系統可在大氣壓力下分析，樣本不需處在高真空的環境下分析，因此也提高了線上分析的可行性。此系統對待測樣品並不具破壞性或僅有極小的破壞性，因此不但可以確實監測合成的品質，並且不會降低合成的產率。
本發明係提供一種能在大氣壓力下即時監測固相胜肽合成分析系統的一種實施態樣，此系統能直接線上分析連結在固相支撐體之胜肽中間體或產物。整個偵測流程只需要將固相合成之樣品置於有機溶劑之中再以脈衝雷射照射，胜肽與固相支撐體(如樹脂)中的化學鍵斷裂後，整段胜肽產物與電噴灑游離團融合而後發生游離，並進入質譜儀分析(如圖11)。發明人也成功的驗證本發明可以利用質譜儀直接偵測連接於樹脂上的胜肽產物，而省略以酸性試劑將產物自樹脂切下等化學前處理步驟。
本發明的一種實施態樣係提供一種能直接偵測在固態支撐體上合成胜肽的重要分析方法。在某些態樣中，固態支撐體為一樹脂。該領域之習知技藝者所能得知的各種固態支撐體均能於此發明所描述之方法在本系統中使用，然而還是以對苯二甲酸二乙酯樹脂為最佳的固態支撐體。整個質譜偵測流程除了只需要將連接在樹脂上之胜肽樣品置於有機溶劑中外，並不需要額外的樣品前處理步驟。當利用傳統的破壞性分析法以特徵化於固相支撐體上的大量化合物時，必須以酸水解及酸切割胜肽分子以從非溶解性的樹脂中分離分子。結果，如解塊(de-blocking)或去保護(de-protecting)之副作用於系統中導致額外片段的形成，且中間體及產物的判斷變得混亂及困難。不像這些酸釋放方法，本系統並不需要以酸試劑將產物切下等化學前處理步驟而能成功地直接偵測到整段胜肽產物的分子離子訊號，並且能夠大大的減低因分析所需要的樣品損耗。比起需要在高度真空下操作的技術，本系統可以在大氣壓力下即時監測反應及管控品質。如此一來，此種能直接降低樣品損耗之即時監測方法可於胜肽合成反應中的每一個階段以確認產物，對整個固相合成的品質控制會有極大的幫助。
本發明的一種實施態樣係提供一種即時監測化學反應之系統，該系統包含：
(a)一樣品；
(b)一溶劑置換貯存槽；
(c)一光源；
(d)一電噴灑單元；及
(e)一質譜儀。
其中此處所提及之樣品係為胜肽合成樣品，此系統能夠用來監測發生在逐步改良之固相支撐體上的各種化學反應。如同前述，此系統包含了一種溶劑置換貯存槽，此裝置能夠讓樣品在溶劑中跟光源(一般為雷射光源)更容易接觸。溶劑一般為低沸點溶劑，其在即時監測的情況下是不反應的。此溶劑置換貯存槽可設計於系統中而能使溶劑自動的加入到樣品(及固相支撐體)中，亦或者此溶劑置換貯存槽可設計獨立於系統之外，此時溶劑則由操作者自行加入到樣品(及固相支撐體)中。光源則為典型的雷射光源並集中照射到樣品上。各種的雷射光源可以應用於此系統上，其中包括了Nd-YAG雷射(266-1064 nm,20 Hz)，Lotis-Tii公司生產型號為LS-2130的Nd-YAG雷射也可搭配高電壓電源供應器提供高電壓輸出(0-30KV,0-300 μA,Spellman公司，型號為CZE1000PN30)，以及其他可相比的雷射光源。而電噴灑單元及質譜儀則於之後介紹(其中包括了由Bruker公司所生產的離子阱質譜儀，型號為Esquire 3000 plus)。
本發明的一種實施態樣係利用質譜儀提供一種即時監測化學反應之方法，該方法包含以下步驟：
(a) 在/從一化學合成發生之容器中提供一樣品；
(b) 將此合成的樣品加入一有機溶劑；
(c) 使用一光源打斷化學鍵並將分析物分子傳送到電噴灑游離團內；及
(d) 分析分析物分子之前驅離子(precursor ion)光譜而測定合成產物之分子量。
本發明的一種實施態樣係利用質譜儀提供一種即時監測固相胜肽合成之方法，該方法包含以下步驟：
(a) 在/從一化學合成發生之容器中提供一樹脂連結之胜肽；
(b) 將此合成的胜肽加入有機溶劑後置於一載台上；
(c) 使用一光源打斷化學鍵並將分析物分子傳送到電噴灑游離團內；及
(d) 分析分析物分子之前驅離子(precursor ion)光譜而測定合成產物之分子量。
本發明的一種實施態樣，該化學反應係在一化學合成反應器中進行。其中化學反應也包括了胜肽合成。在某些態樣中，胜肽合成係為固相胜肽合成。任何固相支撐體均可應用於此系統，其中包括了聚苯乙烯(polystyrene)及聚醯胺(polyamide)樹脂。胜肽分子利用C端以共價鍵先鍵結到樹脂的連接子(linker)上，此連接子為容易被酸或光所分解之連接子。在其他態樣中，此連接子為酸不穩定之連接子。在其他態樣中，連接子係為如同2-氯三苯甲基之三苯甲基連接子。而胜肽合成一般透過耦合具有保護基之胺基酸至已結合樣品的N端。具有保護基之胺基酸係利用叔丁氧基羰基(Boc，tert-butyloxycarbonyl) or 9-薄基甲氧基羰基(Fmoc，9-fluorenylmethyloxycarbonyl)當作N端以及側鏈之保護基。
在某些態樣中，樣品或者化學合成反應器、溶劑置換貯存槽、光源、電噴灑單元以及質譜質量分析器係在同一個裝置中。在某些態樣中，化學合成反應器係與溶劑置換貯存槽以流體方式進行連結。在其他態樣中，反應室(reactor chamber)與溶劑置換貯存槽相同，即反應室亦可當作溶劑置換貯存槽。
溶劑置換貯存槽包含了欲傳遞到反應室的溶劑，如此一來樣品在暴露到雷射光源前會先與溶劑接觸。其中一種實施態樣，該溶劑係包含了極性與非極性之有機溶劑。在某些態樣中，此溶劑係為二氯甲烷。在某些態樣中，此溶劑係為一種極性含質子之溶劑，如甲醇。其中一種實施態樣，該溶劑基本上並不包含於暴露在光源下能昇華及/或轉移電荷至樣品之固態基質(solid matrices)或結晶性低分子量有機分子，例如應用於MALDI(基質輔助雷射脫附游離)的那些基質。這些所謂低分子量之基質係包含了分子量低於1000、500、400或300克/莫耳以及芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，sinapinic acid，3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid)、α-氰-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，alpha-cyano or alpha-matrix)以及2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)等化合物。
光源、電噴灑單元以及質譜儀彼此均靠近化學合成反應器。就光源而言，其定位在提供光給反應室。在某些態樣中，反應室係位於由電噴灑單元所產生之電噴灑游離團(electrospray plume)之路徑上。在某些態樣中，噴灑出來之電噴灑游離團係通過反應室。
本發明的一種實施態樣，光源係為一雷射光，如脈衝雷射。雷射光源具有足夠的能量打斷樣品與固相支撐體之間的鍵結。斷裂後的分析物隨即與電噴灑游離團融合而發生後游離，並進入質譜儀分析。
術語”電噴灑單元”與”電噴灑發射器(electrospray emitter)”在本申請案中是可互相置換的。電噴灑單元可以是任何形式存在，如針狀或者毛細管。且電噴灑單元是導電的，或包含一個電極。在某些態樣中，質譜儀係包含一個偵測離子質量之偵測器同時此偵測器，也可作為能產生與電噴灑單元之間電場的輔助電極。藉由發射器(emitter)噴灑出的帶電液滴經由轉化成包含單分散液滴(monodispersed droplet)之電噴灑游離團進入質譜儀中進行偵測。不同於傳統的電噴灑游離方法，本申請案之電噴灑液滴在噴灑之前是不含分析物的。分析物經由雷射脫附後與電噴灑液滴融合而發生游離並進入到質譜儀分析。
本發明所提及之系統、材料以及方法均在環境壓力(ambient pressure)下操作。而術語環境壓力是指在海平面上所測得之大氣壓力，一般為760毫米汞柱(mmHg)。
本發明所提及之系統、設備、材料之一種實施態樣，分析樣品係在化學合成前或者化學合成中被放置於一樣品載台上。在其他實施態樣中，分析樣品係在與雷射光源接觸前被放置於一樣品載台上。
在其他實施態樣中，此樣品載台係為鋼板或者聚酯載台。在某些態樣中，聚酯纖維係選自聚對苯二甲酸二乙酯(不織布)。在其他態樣中，聚對苯二甲酸二乙酯係為黑色的。
以下實施例為更進一步幫助瞭解本發明，不應被理解成是用來具體限定本發明。
在沒有任何樣品前處理以及酸水解的步驟下，利用雷射光源脫附以及電噴灑質譜儀直接分析了六個置放於有機溶劑中的固相胜肽合成(SPPS)產物(樣品1到樣品6)。圖1到圖6顯示出不同樣品的質譜圖，這些目標胜肽片段係利用一般常用的連接子(linker)於固相樹脂上進行一步步地鍵結合成。合成後的胜肽產物因具有完整的胜肽分子離子訊號([M+H]+
)而容易被檢測。
此系統應用了一個模擬去Fmoc保護步驟反應(從5個胺基酸分子到5個去Fmoc保護的胺基酸分子)的實施例來證明此即時監測系統具有追蹤固相胜肽合成每一步反應的能力。圖7顯示了以不同的重量比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1、95:5以及99:1)混合樣品五(5 mer de-Fmoc)與樣品四(5 mer)所分析後之質譜圖。由圖可看出，當5 mer de-Fmoc在去Fmoc的反應中增加重量比時，5 mer de-Fmoc(m/z 750.4)的訊號強度會增加，而5 mer(m/z 972.5)的訊號強度則會降低。圖8是以5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強度比例對5 mer de-Fmoc不同重量比例作圖。由圖可看出，即使5 mer的重量比已經低於5%(表示5 mer de-Fmoc高於95%)，5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強度比例能可以被偵測出往下的趨勢。這個結果說明了此偵測系統確實能夠應用在固相胜肽合成反應中並且具有鑑定每一步反應的程度。
用來乘載固態樣品的樣品載台材質也證實了會影響到雷射脫附以及電噴灑質譜儀的分析穩定度及靈敏度。圖9探討了將固相胜肽樹脂之樣品3(4 mer de-Fmoc,m/z 603.3)分別置於四種不同樣品載台之分析靈敏度，其中載台的材質包括了棉墊、白色聚對苯二甲酸二乙酯、鋼板以及黑色聚對苯二甲酸二乙酯。其結果顯示在固相胜肽合成樣品的分析上，鋼及黑色聚對苯二甲酸二乙酯具有較高的靈敏度。
此外也針對鋼及黑色聚對苯二甲酸二乙酯兩種載台，探討樣品4(5 mer，m/z 972.5)及樣品5(5 merde-Fmoc，m/z 750.4)兩種混和的固相胜肽合成樹脂的分析穩定度。如圖10所示，經過進行三次實驗後，置於黑色聚對苯二甲酸二乙酯的樣品有著比置於鋼的樣品具有更好的分析穩定性。因此樣品載台材質的確會影響到分析靈敏度及穩定度。
圖1提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品1的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖2提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品2的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖3提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品3(4mer de-Fmoc)的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖4提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品4(5mer)的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖5提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品5(5mer de-Fmoc)的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖6提供置於有機溶劑(二氯甲烷)的樣品6(6mer)的正電質譜圖，於液體溶劑中的樣品係暴露於脈衝雷射光束及電噴灑毛細管而游離且透過離子阱分析。
圖7為以不同的重量比(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1、95:5以及99:1)混合樣品5(5 mer de-Fmoc)與樣品4(5 mer)所分析後之正電質譜圖。
圖8是以5 mer與5 mer de-Fmoc的訊號強度比例對5 mer de-Fmoc重量比例作圖，(a)重量比例10%~99%；(b)重量比例30%~90%；(c)重量比例91%~99%。
圖9為4 mer de-Fmoc(m/z 603.3)之胜肽樣品分別置於四種不同樣品載台之質譜圖，其中(a)棉墊；(b)白色聚對苯二甲酸二乙酯；(c)鋼板；(d)黑色聚對苯二甲酸二乙酯。
圖10為5 mer(m/z 972.5，紅線)及5 mer de-Fmoc(m/z 750.4，藍線)胜肽所混合之樹脂樣品置於(a)鋼樣品載台及(b)黑色聚對苯二甲酸二乙酯上所得之EIC(萃取離子層析，Extract Ion Chromatogram)圖。
圖11為本發明之說明圖，其中與支撐體結合的樣品係以雷射光束打斷，以提供能利用質量分析儀於ESI發射器光線中分析最低限度的反應產物分子。
Claims (17)
- 一種利用質譜儀即時監測化學反應之方法，該方法包含以下步驟：(a)在/從一化學合成發生之容器中提供與固相合成支撐體鍵結之合成樣品；(b)在一載台上將該合成的樣品加入一有機溶劑；(c)使用一光源打斷直接接在樣品與固相合成支撐體之間的化學鍵並將該分析物分子傳送到一電噴灑游離團內；及(d)分析該分析物分子之前驅離子光譜而測定合成產物之分子量。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該化學反應為胜肽合成。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該胜肽合成為固相胜肽合成。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該有機溶劑係選自二氯甲烷或甲醇。
- 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該有機溶劑係選自二氯甲烷。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該載台係選自鋼或聚酯。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該聚酯係選自聚對苯二甲酸二乙酯。
- 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該聚對苯二甲酸二乙酯係為黑色的。
- 一種利用質譜儀提供即時監測固相胜肽合成之方法，該方法包含以下步驟：(a)在/從一化學合成發生之容器中提供與固相胜肽支 撐體直接鍵結之胜肽；(b)將該合成的胜肽加入一有機溶劑，置於一載台上；(c)使用一光源打斷直接接在樣品與固相合成支撐體之間的化學鍵並將該分析物分子傳送到一電噴灑游離團內；及(d)分析該分析物分子之前驅離子光譜而測定合成產物之分子量。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該有機溶劑係選自二氯甲烷。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該載台係選自鋼或聚酯。
- 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該聚酯係選自聚對苯二甲酸二乙酯。
- 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該聚對苯二甲酸二乙酯係為黑色的。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述之即時監測化學反應之方法係在包含以下的系統中進行：(a)一樣品；(b)一溶劑置換貯存槽；(c)一光源；(d)一電噴灑單元；及(e)一質譜儀。
- 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該樣品係在一化學合成反應器中提供、及/或從一化學合成反應器中所提供。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該化學反應為胜肽合成。
- 如申請專利範圍第16項所述之系統，其中該胜肽合成為 固相胜肽合成。
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