CN101173914A - 大气压力液相质谱分析方法及大气压力液相质谱仪 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大气压力液相质谱分析方法，是将一个含有包括待测物与溶剂的溶液以及基质的液态样品，施以一道激光光束射击，使基质把能量传递给待测物并助其解吸后，解吸出的待测物与一颗经由电喷雾程序所产生的带电粒子结合，而形成一个待测物离子后进入一台质量分析器内，并产生一个质谱分析结果。另一方面，当该溶液为水溶液时，可不加入基质，而直接以一道红外线激光光束射击，也可获得质谱分析结果。本发明方法可供一或多个液态样品，在未经复杂的前处理下，快速地获得可信度高的质谱分析结果。本发明另提供用以实施上述方法的质谱仪，其包含一供该液态样品放置的一组承载单元、一台质量分析器、一台检测器、一组电喷雾单元以及一组激光解吸单元。

Description

大气压力液相质谱分析方法及大气压力液相质谱仪

【技术领域】

本发明涉及一种质谱分析方法，特别是涉及一种可以在大气压力环境下，直接对一个液态样品中的待测物进行质谱分析的方法。本发明另涉及一种用以实施上述质谱分析方法的质谱仪。

【背景技术】

借由质谱分析技术，人们可获知一个样品中待测物的分子量，继而配合进一步比对而确认该待测物的真实身分，因此自20世纪初期发展以来，用以实施该质谱分析技术的质谱仪，因为具有操作简便且可快速获得检测结果的优势，已然成为一种广为各领域使用的鉴定工具。

一般质谱仪主要包含电离装置、质量分析器以及检测器等三大部件。样品中的各待测物是借由电离装置来获得电荷，因而被电离化以形成一个待测物离子，之后该待测物离子会被引导入该质量分析器内并依其各自的m/z值(即“荷质比”，m为质量，z为所携价数)而被分类区隔开来，同时该质量分析器将依此释出对应的讯号供该检测器撷取，最后该检测器综合各讯号，并以图谱方式(以下称为质谱图)就各待测物所分别形成的离子峰群，呈现一系列统计结果，且配合软件运作而计算出该等待测物的分子量；更进一步地，在质谱图中的每一个离子峰群，可经由电脑软件的简并(deconvolute)处理后，另形成一个简并图，其呈现有分别对照于一个特定待测物的单一波峰，以更利操作者判读。

以下暂以蛋白质作为待测物进行相关说明。由于细胞功能是借由蛋白质来控制，所以对于医学或药学等相关领域而言，皆需要先就一个生化样品中的蛋白质种类或浓度加以了解，方能继续探讨它们在细胞中运作的机制，或者是判断该样品中的蛋白质是否处在正常的状态，可想而知，蛋白质的鉴定在医学检验以及学术研究上，显然是非常重要。

特别是在医学方面，许多疾病的检测皆是要探究体液(例如血液、尿液)中的蛋白质或药物状况，而体液又通常是可直接且快速地获得，因此，若是可直接对体液进行快速且精准的蛋白质或药物的定性分析，无疑地对于疾病的立即性的判断，将甚为有利。

另外，许多有机或生化反应也是在一个液态环境中持续地进行，若可即时了解该液态环境中的产物、中间物或反应物的种类与量，也有利于掌控该有机或生化反应。

长久以来，质谱分析技术已发展出数种用以检测蛋白质的方法；对于一个含有蛋白质的液态样品，在常压环境下，可利用电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)程序来将蛋白质电离化，并使用包含一个如图1所示的电喷雾电离源11的质谱仪1来施行此电喷雾电离质谱分析法(以下简称为ESI-MS)，以进行蛋白质分析。相关技术可参阅以下论文：Yamashita，M.，Fenn，J.B.J.Phys.Chem.1984；88，4451.、Fenn，J.B.et al.Science 1989；246，64.、Fenn，J.B.et al.Mass Spectrom.Rev.1990；9，37.。

该电离源11包括有一支其开口端111朝向该质量分析器12的入口121的毛细管112，且使用时需在该毛细管112的开口端111与该质量分析器入口121之间建立一电场，例如于此两者间形成2-5kV的电位差。之后，使待测的蛋白质溶液于该毛细管112内朝该开口端111流动，于该开口端111的溶液会因电场的牵引与液面表面张力的作用，而形成一个满布电荷的泰勒锥(Taylor cone)2，当电场作用力可克服液体的表面张力时，带有多价电荷且包含有蛋白质分子的液滴就会被形成，并朝该质量分析器12喷洒出，继而由该入口121进入质量分析器12。

该等带电液滴的液体部分会随着飞行而蒸发，此时多价电荷会移转至蛋白质分子上，而成为具有较低的m/z值的待测物离子。此法不但可让如蛋白质的大分子被高效率地电离，且因为可具低m/z值而较不受该质量分析器12的检测极限的限制，所以甚至可测得分子量高达十万的蛋白质分子。

但是，体液或其他生化溶液中，一般皆存有高含量且多样化的盐类，若它们未经由例如透析的“去盐类”的前处理模式就直接施以ESI-MS分析，则蛋白质将会因为极有机会接附有源自于盐类的Na⁺、K⁺、H⁺，而形成非常多种待测物离子，相对地使最后所获得的质谱图上呈现出多样且复杂的离子峰，导致在离子峰的归纳判断上(也就是判断哪些离子峰是由哪个特定的蛋白质所造成)，纵使有电脑软件的辅助也容易造成误差，并影响到最终蛋白质的分子量与其身份的计算与判断。

虽然先将液态样品施以例如透析等方式，将盐类先去除后再进行ESI-MS，即可于最终获得较为单纯的ESI-MS质谱图，但此“去盐类处理”过程不仅需要专业人员执行，且其过程十分繁琐又耗时，非常不便。显然地，对于就液态样品的蛋白质定性检测结果的精准度有极高要求，且偏向以最短时间内即获知结果的医学检测而言，ESI-MS显然并非是一个适宜的质谱分析方式。

又或者，将原呈液态的样品转换为一种固态状态下进行分析，也就是将含有蛋白质的液态样品干燥后，形成一片固体干燥物，再将其施以质谱分析方法【例如“解吸电喷雾电离质谱分析法”(以下简称为DESI-MS)、“基质辅助激光解吸电离质谱分析法”(以下简称为MALDI-MS)以及“经电喷雾辅助的激光解吸电离质谱分析法”(以下简称ELDI-MS)等等】，也可获得蛋白质的定性结果。

参阅图2，执行DESI-MS的质谱仪3包含的解吸电喷雾电离源31是一个类似图1中所示的电喷雾电离源11，不同点是在于该解吸电喷雾电离源31是以一朝向于一片固体干燥物4的方位设置，且还具有一个包绕着该毛细管112并能喷出高压气流311的气流供应件312。

该解吸电喷雾电离源31是将一电喷雾介质32灌入该毛细管112并施以高电压，来进行上述电喷雾程序，启动时会自该毛细管开口端111同向喷洒出复数滴带电液滴321与高压气流311，并借由高压气流311来撞击该固体干燥物4，使得该固体干燥物4中的蛋白质受力而解吸出，之后被解吸的蛋白质会与该等待电液滴321结合带电而成为离子态，继而再由质量分析器33的入口331以被该质量分析器33接收，并进行后续的质谱分析。

但是，以带电液滴321轰击于该固体干燥物4的解吸能量并不足以有效率地将被束缚于上的蛋白质分子解吸出来，进而使DESI-MS的效果大受影响。

MALDI-MS则具有极佳的灵敏度与高检测范围。相关技术可参阅以下论文：Karas，M.，Hillenkamp，F.Anal.Chem.1988；60，2299.、Tanaka，K.et al.Rapid Commum.Mass Spectrom.1988；2，151.、Berkenkamp，S.，Kirpekar，F.，Hillenkamp，F.Science 1998；281，260.、Karas，M.et al.Mass Spectrom.Rev.1991；10，335.、Stoechli，M.et al.Nat.Med.2001；7，493、Schwartz，S.A.et al.Cancer Research.2005；65，7674.、Caldwell，R.L.，Caprioli，R.M.Mole.Cell.Proteomics.2005；4，394.、Pierson，J.et al.J.Proteome Res.2004；3，289.。

当以MALDI-MS分析一个含蛋白质的液态样品时，一般做法是将一种可溶于水并可大量吸光的有机酸基质【例如对-羟基苯甲酸(2，5-dihydroxy benzoic acid)等具有共轭双键或芳香族环的小分子】加入于该液态样品内，待其溶解并与蛋白质均匀混合后，将该液态样品干燥，使该有机酸基质与蛋白质形成共结晶，继而以一台发射机构发射激光光束至此结晶表面，让基质辅助其形成待测物离子而顺利解吸，再经一电场的作用下进入质量分析器而获得一个质谱分析结果。

然而，MALDI-MS的解析度差，且受限于解吸出的蛋白质的低数量，使得MALDI-MS需在真空环境下进行，不但设备成本极高，置换样品时也需考量真空/常压环境的转换，而必须经过多重且繁琐的仪器操作步骤，非常不便。

ELDI-MS是近日发展出的新颖的质谱分析方法，相关技术可参阅论文Rapid Commun.Mass Spectrom.2005；19：3701-3704。参阅图3，ELDI-MS是可在一个常压状态下，借由一道激光光束5射击在该液态样品的干燥物4的表面上，以解吸出复数个待测物(图未示)；同步地，利用例如图2中所示的电喷雾电离源31，并配合一台质量分析器12(与图1的质量分析器12类似)所创造出的电位差，将一电喷雾介质32进行电喷雾程序，并经由一支毛细管112喷洒出复数个朝该质量分析器12飞行的带正电荷的粒子。待测物将与该经由电喷雾程序而获得的粒子相互结合成为一个待测物离子，继而在该电位差的引导下进入该质量分析器12中，而获得一个质谱分析结果。

虽然上述各式质谱分析方法皆可成功地确认出一个固态样品中的蛋白质种类，但在许多状况下，第一时间所获得的样品都是呈液态，例如尿液、血液等生物体液，因此需再将该液态样品转变为固态后才施以质谱分析，总是不如直接以液态样品进行质谱分析来得方便，特别是当样品个数极多时，还可省下许多操作时间。

但是，依据目前DESI-MS与ELDI-MS的技术揭示，当以一道高压气流，或是以一道激光光束直接轰击一个液态样品，并无法使其中的蛋白质顺利解吸出来，而此也是DESI-MS、ELDI-MS直接对一个液态样品内的待测物进行质谱分析时所面临的技术困难点；因此上述DESI-MS与ELDI-MS仅能采用间接的做法，也就是自一个由液态样品经干燥后所形成的干燥物中解吸出蛋白质，再施以质谱分析。

于论文Anal.Chem.1995；67：4335-4342中，已揭示出另一种较特殊的MALDI-MS分析方法，它是直接对一个液态样品进行质谱分析。此方法是以一个甘油溶液作为液态样品，且该液态样品内是含有蛋白质(即待测物)与基质(例如碳粉)，并以波长337nm的一道紫外线激光光束轰击，进而获得一个质谱分析结果，证实获得此结果的关键是在于该液态样品进行MALDI-MS时，其中的碳粉仍可辅助蛋白质使其自该液态样品以离子形态解吸出来。

然而，此方法因是针对MALDI-MS分析系统而开发的，因此当然地受限于在真空设备下的操作，而需使用高粘度溶剂(例如甘油)来调配该液态样品，此导致了设备成本居高不下以及液态样品的繁琐的前置作业等缺点。

虽然一种可在大气压力环境下直接对一个液态样品进行定性分析，且操作方便省时、精准度高的质谱分析方法对需要应用到化学定性分析的各专业领域有极大的帮助，因为此方法将可借由低设备成本与简单的操作流程，并且在不改变液态样品的态样下，来获得一个可信的质谱分析结果，所以此将对疾病的即时判断有极大的助益；但是，迄今为止，如何以一个仅接受简单且快速，甚至不需经过任何前处理的液态样品，在大气压力环境下，直接施以质谱分析并获得一个可信度高的结果，是长久以来研发质谱分析方法与质谱仪的相关学界与业界，肠思枯竭却难以突破的瓶颈。

【发明内容】

如前述地，就ELDI-MS的操作流程，是先将一道激光光束射击在一个固态样品上以使复数个待测物从样品中解吸后，再以一电喷雾介质施以一电喷雾过程而形成带电液滴，而带电液滴将与解吸出的待测物结合，终而成为数量足够的待测物离子，并经质量分析器分析后，在后续的质谱图上明显地呈现出离子峰。然此机制对于液态样品却不适用，申请人认为，原因可能是在于当一道激光光束射击液态样品，并无法使待测物获得足够的能量而解吸，因此成功解吸出的待测物量太少，以致无法获得质谱分析结果。

又，MALDI-MS除了也是以激光光束射击固态样品以外，另一个技术要点是在样品中加入基质，依目前学术界的推测，基质是可吸收激光的能量并将能量转移给待测物，而可让其顺利解吸。

因此，参阅图4-6，申请人首先尝试在一电喷雾介质51施以电喷雾程序的同时，以一道激光光束81射击一个摆置在一台质量分析器6通道前的液态样品4(其是将复数个基质42与一个含有待测物412的溶液41相互混合而形成)上，竟意外地获得了令人惊喜的质谱分析结果！

申请人推测，其机制应是当该激光光束81射击该液态样品4时，该等基质42吸收了该激光光束81的能量后，将其转移到至少一个待测物412上而助其解吸，并与该电喷雾介质51经电喷雾程序所形成的带电粒子511融合，之后带电粒子511中的液体部分随着飞行时间逐渐挥发，于是电荷密度提高，使得能量增加而爆裂(plume)，电荷随即附着在各待测物412上，这些带有电荷(被电离)的待测物412继而会进入一台质量分析器6内并接受质谱分析。

此外，基于水分子对于红外线有强烈的吸收，所以申请人推测，在适当条件下，水分子或许也具有类似上述基质的特质，因而尝试以类似于上述的操作条件，但以改用一道红外线激光光束直接射击于一个含有待测物的水溶液，也同样地获得了优异的质谱分析结果！

综合说来，申请人首先提出的一个概念是，将一个基质与一个含有待测物的溶液相互混合而成为一个液态样品后，使一道激光光束射击到该液态样品，就可使该液态样品中的待测物顺利解吸，继而配合一道电喷雾程序，即可进一步地使解吸出的待测物被电离，而形成待测物离子，进而进行质谱分析，并获得良好的结果。更延伸地，当该溶液是水溶液时，只要施以一道红外线激光光束，也可以获得良好的质谱分析结果，依申请人推测，这是因为水发挥了吸收红外线能量的作用，于是使得待测物可顺利解吸，也就是说在此情况中，水担任了“基质”的角色。

以上所述的新颖的大气压力液相质谱分析方法(也可称为“大气压力液相质谱法”，Ambient Liquid Mass Spectrometry，以下简称ALMS)显然地为液态样品(特别是一个含有蛋白质的水溶液)的质谱分析技术开创了新时代。ALMS能够直接以一个液态样品进行检测，操作非常简便且快速，且具有比ESI-MS还要高的解析度；而即便待测物是例如蛋白质的大分子，ALMS也可精准地检测其分子量，展现出优异的蛋白质鉴定能力，这些优势使得ALMS当可快速分析生化及医学方面的液态样品，并获得可信的结果，在相关应用上，例如疾病的即时判定，有极大的助益。

因此，在第一方面，本发明的目的是在提供一种大气压力液相质谱分析方法(ALMS)。

本发明大气压力液相质谱分析方法包含：

配置一个要被质谱分析的液态样品，其包含有一种溶液与一个和该溶液相互混合的基质，该溶液具有一溶剂与多个要被解吸并电离的待测物，而该基质是用以助该待测物解吸；

提供一组电喷雾单元，该电喷雾单元具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一个与该容器呈流体相通的喷嘴；

提供一台质量分析器，该质量分析器是远离该喷嘴地设置，用于接收并分析自该液态样品中被解吸并电离的待测物；

提供一台检测器，用于检测经该质量分析器分析的待测物所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

令该喷嘴与质量分析器间产生一个电位差，以使该喷嘴将该电喷雾介质朝该质量分析器喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子，该等带电粒子在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器移动；以及

使用一道激光光束来照射该液态样品，以使得该液态样品中至少一个待测物接收由该基质所传递的能量而被解吸后沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，且使得该至少一个待测物在接触该等带电粒子中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动而被该质量分析器接收，以进行质谱分析。

在第二方面，本发明的目的是在提供另一种大气压力液相质谱分析方法。

本发明大气压力液相质谱分析方法，是与上述第一方面的大气压力液相质谱分析方法类似；不同点是在于，本第二方面的方法所适用的液态样品是一种水溶液，未额外含有基质，且使用一道红外线激光光束将该水溶液中的待测物进行解吸。

在第三方面，本发明的目的是在提供一种大气压力液相质谱仪。

本发明大气压力液相质谱仪是用以实施先前该第一方面中所述的大气压力液相质谱分析方法，因此该大气压力液相质谱仪包含一用以供该液态样品放置的承载单元，与一用以提供该激光光束的激光解吸单元，以及如该第一方面中所述的一组电喷雾单元、一台质量分析器，和一台检测器。而各主要构件当可依操作者的需要而进行改造或置换，例如，该激光解吸单元是具有一台发射机构，其可为紫外线激光仪(UVlaser)、红外线激光仪(IR laser)、氮气激光仪(nitrogen laser)、氩离子激光仪(argon-ion laser)、氦氖激光仪(helium/neon laser)、二氧化碳激光仪(CO₂ laser)或石榴石激光仪(Nd:YAG laser)。

在第四方面，本发明的目的是在提供另一种大气压力液相质谱仪。

本发明大气压力液相质谱仪是用以实施先前该第二方面中所述的大气压力液相质谱分析方法，因此和该第三方面中所述的大气压力液相质谱仪相较，是具有类似的各主要构件，然不同点是在于，其激光解吸单元是必须具有一台可提供一道红外线激光光束的发射机构，以利于将一种水溶液内的待测物顺利解吸出。

本发明的有益效果在于：在一个常压环境而非真空环境下，直接施行，且所需的操作时间极短，所以相对于需在真空环境下进行的MALDI-MS，本发明在设备成本、仪器制造与操控的技术门槛等等，更是大幅降低；而经由申请人证实，不论是蛋白质水溶液、体液或是含有有机化合物的有机溶液等各种液态样品，都可借由本发明大气压力液相质谱分析方法直接施行，而且就定性分析(即依所测得的待测物分子量加以判别其确实身分)与相对定量分析结果(即反映出该液态样品内各待测物的含量比例)，都可获得优异的结果。

因此，本发明ALMS可应用于分析一种其内部正在进行有机反应的溶液，借由其反应物、中间物、产物的身分及相对浓度，了解该有机反应所进行的程度；或者是应用于分析一种生物体液，同样地借由体液内各物质的身分与相对浓度，立即判断该生物体的生理状况。

基于上述操作上的便利性、即时量测及快速获得精确的结果...等等优势，显见本发明大气压力液相质谱分析方法暨质谱仪对于“常需对大量液态样品进行其中的待测物的定性分析”、“需快速了解液态样品中待测物的相对浓度”的相关业界，将是一大利器。

【附图说明】

图1是一示意图，说明一种电喷雾电离质谱分析法(ESI-MS)的作用方式；

图2是一示意图，说明一种解吸电喷雾电离质谱分析法(DESI-MS)的作用方式；

图3是一示意图，说明一种经电喷雾辅助的激光解吸电离质谱分析法(ELDI-MS)的作用方式；

图4、5各是一示意图，相互配合以说明进行本发明大气压力液相质谱分析方法，在检测一个液态样品中的待测物时，可能依循的机制；

图6是一侧视图，说明本发明大气压力液相质谱仪的实施例1及实施例5中，各元件的位置相对关系；

图7是一局部剖视图，说明本发明大气压力液相质谱仪的实施例2中，一个气流供应机构与一支毛细管的相对设置关系；

图8是一局部示意图，说明本发明大气压力液相质谱仪的实施例3中，一个三通接管与其他部件的相对设置关系；

图9是一侧视图，说明本发明大气压力液相质谱仪的实施例4及实施例6中，各元件的位置相对关系；

图10-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行比较例1的结果；

图10-2是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例1的结果；

图10-3是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例2的结果；

图11-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例3的结果，“●”表示由未变性的肌红蛋白所形成的离子峰，而“○”表示由已变性的肌红蛋白所形成的离子峰；

图11-2是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例4的结果，该液态样品中的基质是在一种溶解状态；

图11-3是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例4的结果，该液态样品中的基质是在一种析出状态；

图11-4是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例5的结果，该液态样品中的基质是在一种溶解状态；

图11-5是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例5的结果，该液态样品中的基质是在一种析出状态；

图11-6是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例6的结果，该液态样品中的基质是在一种溶解状态；

图11-7是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例6的结果，该液态样品中的基质是在一种析出状态；

图12-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例7的结果；

图12-2是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例8的结果；

图12-3是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例9的结果；

图13-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例10的结果，“◆”表示由胰岛素所形成的离子峰，“■”表示由细胞色素c所形成的离子峰，“▲”表示由溶菌酶所形成的离子峰，“●”表示由未变性的肌红蛋白所形成的离子峰，“○”表示由已变性的肌红蛋白所形成的离子峰；

图13-2是图13-1的简并图，各标记符号则同图13-1；

图13-3是一质谱图，说明以ESI-MS进行比较例2的结果，各标记符号则同图13-1；

图13-4是图13-3的简并图，各标记符号则同图13-1；

图13-5是一质谱图，说明以MALDI-MS进行比较例3的结果，各标记符号则同图13-1；

图14-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例11的结果，该液态样品的反应是历时0分钟；

图14-2是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例11的结果，该液态样品的反应是历时15分钟，“●”表示由细胞色素c的肽所形成的离子峰，未标示的离子峰则是由细胞色素c所形成；

图14-3是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例11的结果，该液态样品的反应是历时30分钟，其标记则同图14-2；

图15-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例12的结果，“A”表示由溶菌酶所形成的离子峰，“C”表示由溶菌酶所形成的离子峰，“B”表示由一种未知蛋白质所形成的离子峰；

图15-2是图15-1的简并图，其标记则同图15-2；

图15-3是一质谱图，说明以ESI-MS进行比较例4的结果；

图15-4是一质谱图，说明以MALDI-MS进行比较例5的结果；

图16-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例13的结果；

图16-2是图16-1的简并图；

图16-3是一质谱图，说明以ESI-MS进行比较例6的结果；

图16-4是一质谱图，说明以MALDI-MS进行比较例7的结果；

图17-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例14的结果；

图17-2是图17-1的简并图；

图17-3是一质谱图，说明以ESI-MS进行比较例8的结果；

图17-4是一质谱图，说明以MALDI-MS进行比较例9的结果；

图18-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法进行应用例15的结果；

图18-2是图18-1的简并图；

图18-3是一质谱图，说明以ESI-MS进行比较例10的结果；

图18-4是一质谱图，说明以MALDI-MS进行比较例11的结果；

图19-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法的实施例1，进行应用例16的结果，“α”表示由Hb的α链分子所形成的离子峰，“β”表示由Hb的β链分子所形成的离子峰；

图19-2是图19-1的简并图，“α+葡萄糖”表示由HbA1中，接附有葡萄糖分子的α链分子所形成的离子峰；而“β+葡萄糖”表示由HbA1中，接附有葡萄糖分子的β链分子所形成的离子峰；其标记则同图19-1；

图20是一X-Y坐标图，横轴表示病患血液经由IC分析后获得的“(HbA1/Hb)值”，纵轴表示经由本发明ALMS分析后所获得的“(HbA1/Hb)值”；

图21-1是一质谱图，说明以本发明大气压力液相质谱分析方法的实施例2，进行应用例18的结果，其标记则同图19-1；

图21-2是图21-1的简并图，其标记则同图19-2。

【具体实施方式】

下面结合附图、实施例及应用例，对本发明进行详细说明；需事先了解的是，为使各图式方便详尽地表达本案ALMS的发明概念，各构件的尺寸及它们的相对距离，并未依实际比例绘制：

参阅图4-6，本发明大气压力液相质谱分析方法，是借由以下构件及步骤而实施：

配置一个要被质谱分析的液态样品4，其包含有一种溶液41与一和该溶液41相互混合的基质42，该溶液41具有一溶剂411与多个要被解吸并电离的待测物412，而该基质42是能够辅助该待测物412解吸；

提供一组电喷雾单元5，该电喷雾单元5具有一个可容置一电喷雾介质51的容器52以及一个与该容器52呈流体相通的喷嘴53；

提供一台质量分析器6，该质量分析器6是远离该喷嘴53地设置，用于接收并分析自该液态样品4中被解吸并电离的待测物412；

提供一台检测器7，用于检测经该质量分析器6分析的待测物412所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

令该喷嘴53与质量分析器6间产生一个电位差，以使该喷嘴53将该电喷雾介质51朝该质量分析器6喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子511，该等带电粒子511在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器6移动；以及

使用一道激光光束81来照射该液态样品4，以使得该液态样品4中至少一个待测物412接收由该基质42所传递的能量而被解吸后沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，且使得该至少一个待测物412在接触该等带电粒子511中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动并被该质量分析器接收，以进行质谱分析。

该等带电粒子511是一颗带电荷液滴，它们电性是依据因该电位差所建立的电场方向而定(图4、5中所例示为正电性的情形)，而该等粒子511的电量则大部分为多价，也可为单价。

用以形成该等带电粒子511的电喷雾介质51，为一般电喷雾方法实施时适用的溶液，例如可含有一种挥发性液体，以利该待测物在被该质量分析器接收前，附着于上的液体得以先挥发；进一步地，为有利于欲检测的蛋白质分子溶解于内，并避免盐类溶入而干扰，而有助于图谱的单纯化，优选地该挥发性液体是具有较低极性，例如乙腈、丙酮、醇类等。

为便于图谱的解读，在进行与电喷雾技术相关的质谱分析法时，一般是采用包含有H⁺的带电粒子的“正离子模式”(positive-mode)，而此模式是通过该质量分析器建立在其与喷嘴之间的电场方向(其是指向该质量分析器)来呈现。而该电场应配合该质量分析器的设计而建立，例如在该电喷雾单元的滤嘴施以一至少2kV的电压并将该质量分析器接地；或是如本发明的各具体例中进行的，将该喷嘴接地，并于该质量分析器施以一为-4kV的负电压。

因此，在待测物被解吸出后，若是欲提高其被离子化的机率，优选地，可使用含有质子(H⁺)的溶液来作为电喷雾介质，质子可借由添加酸的方式而获得；更优选地，该酸可为甲酸、乙酸、三氟醋酸(简称TFA)以及它们的一组合。

另一方面，例如，若液态样品中的待测物为一种蛋白质，且欲探究的是该蛋白质未变性的状态，优选地是选用含有挥发性液体但不含有酸的电喷雾介质，例如甲醇水溶液。

基于以上说明，依据不同的需求，于本发明的各具体例中，是分别使用“含有甲醇及乙酸的水溶液”及“甲醇水溶液”作为电喷雾介质，并推测所获得的待测物离子大部分将具有多价电荷，每一电荷各为一质子(H⁺)的贡献。

本发明大气压力液相质谱分析方法，其中的一个技术要点是通过该液态样品中的基质辅助待测物解吸出该液态样品，因此，对于该液态样品中的待测物以及溶解该待测物的溶剂的种类，就本发明ALMS的实施而言，并无限制，无论该待测物是例如蛋白质的大分子或是一般化合物的小分子，或者该溶剂是水或有机溶剂，甚至于是成分复杂的一种由生物所分泌的体液(以下简称为生物体液)，都可顺利以本发明ALMS获得结果。

因此，该液态样品中的溶液，可为生物体液、化学药品溶液、环境取样溶液或是各式液相层析分离液的收取溶液等等。上述生物体液，优选地是选自于血液、泪液、乳汁、汗液、肠液、脑浆、脊髓液、淋巴液、脓液、血清、唾液、鼻水、尿液或粪液。于本发明ALMS的部分应用例中，所使用的由生物所分泌的体液是选自于血液、泪液、乳汁或血清。上述化学药品溶液，可为例如本案的部分应用例中所示，为由胰岛素、肌红蛋白、溶菌酶及细胞色素c混合配制而成的蛋白质溶液。该化学药品溶液也可为一种有机溶液，其溶剂部分并不限于使用任何有机溶剂，待测物部分也不限于任何有机化合物；于本案的部分应用例中所示范，该化学药品溶液是氯化血红素的甲醇溶液、18-冠-6-醚的四氢呋喃(THF)溶液及1-十六胺的乙酸乙酯溶液。

优选地，该基质是由无法被一道激光光束穿透的材质所构成；更优选地，该基质的材质是可为金、碳、钴、铁、2，5-二羟基苯甲酸(简称2，5-DHB)、芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，简称SA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(简称α-CHC)或它们的组合。

当该基质具有至少一定的粒径时，将具有较好的效果；优选地，该基质的粒径是介于50nm至50μm。而于本案的各具体例中，该基质是选自于金纳米粒子、碳粉、2，5-DHB、芥子酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸或它们的组合。

特别地，一种水溶液可在不另加入基质的状况下，直接接受一道红外线激光射击，也可使其待测物解吸而达到检测该待测物的目的；而当然，若是要另加入基质，而形成一种包含有该水溶液及基质的液态样品来进行本发明，也是可行的。但当欲分析一种有机溶液时，则需再加入基质后，以此包含有该有机溶液与基质的液态样品，来施以本发明ALMS。关于以上详细的操作方式与作用机制的讨论，将于后续的应用例中进行。

而本发明的大气压力液相质谱仪，是用以实施本发明大气压力液相质谱分析方法，包含有一用以供该液态样品放置的承载单元与一用以提供该激光光束的激光解吸单元以及一组电喷雾单元、一台质量分析器和一台检测器。

该等主要构件是可依据使用者的需求而进行改造，或是种类与相关位置的置换；例如，该承载单元、激光解吸单元、电喷雾单元与质量分析器皆可设计为可移动式，俾利使用者依其需求来调控该等构件的相对位置，只要能达到以下目的即可：使该液态样品解吸出至少一个待测物，且该至少一个待测物能接触到由该电喷雾单元所形成的该等带电粒子中至少一个，并在电位差引导下，朝向该质量分析器移动并被该质量分析器的通道接收，而执行后续的质谱分析。

为维持操作时因该电位差的存在而形成的电场的良好方向性，以使该等接触有带电粒子的待测物顺利地进入所对应的质量分析器，优选地，该承载单元是未接地。

该承载单元是供该液态样品放置，就该承载单元的型态而言，例如，可包括有一个由无法被激光穿透的材质所制成的承载件，另，为避免该喷嘴与质量分析器之间的电场受影响，建议该承载件的材质是可使用非金属材质，例如特氟隆或压克力，以使激光光束能量的能量集中在所射击到的液态样品上，该承载件是用以呈放该液态样品并具有一和该液态样品直接接触的承载面，此时操作者可直接将该液态样品滴在该承载面上，并开始操作ALMS。

或者，为有利于对多个液态样品依序进行分析，该承载单元可包括有一条轨道及一组可移动地安装在该轨道上的承载座组，该承载座组是可供各盛装有该液态样品的容置件放置，并沿着该轨道而运行。于是，进一步地，该承载座组可通过电脑控制，将各液态样品运送至一定点后进行ALMS，以提高分析效率并降低人力成本。而此种承载单元的相关的制备技术已极为熟知，所以在此不加以累赘地说明。

该质量分析器具有一条通道，其可接收待测物离子，之后依其m/z值而分别归类且产生对应讯号。选择性地，该质量分析器是选自于离子阱质量分析器(ion trap mass analyzer)、四极-飞行时间式质量分析器(quadruple time-of-flight mass analyzer)、三段四极柱串联式质量分析器(triple quadrupole mass analyzer)、离子阱飞行时间质量分析器(ion traptime-of-flight analyzer)、飞行时间-飞行时间质量分析器(time-of-flighttime-of-flight analyzer)或傅立叶转换离子回旋共振质量分析器(fouriertransform ion cyclotron resonance analyzer，FTICR)。于本案的具体例中，该质量分析器是四极-飞行时间式质量分析器。

该检测器是用于检测经该质量分析器分析所产生的各讯号，并将该等讯号转化为一质谱分析图。优选地，且于本案的具体例中所选用的，该检测器为电子倍增器。

该电喷雾单元具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一喷嘴。

优选地，该喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且该电喷雾单元进一步包含一台将电喷雾介质汲取至该毛细管的汲液泵，该毛细管为金属材质，并配合该质量分析器的设计而被直接施加一电压或接地，而与该质量分析器形成一电位差，又，该等电喷雾介质物质是自该毛细管的管口端被朝该质量分析器喷洒出。

优选地，该喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且该电喷雾单元进一步包含一台将该电喷雾介质汲取至该毛细管的汲液泵以及一个三通接管，该三通接管具有一远离该管口端地连接于该毛细管的第一端、一用以供该电喷雾介质流入的第二端及一被施加一电压或接地以建立该电位差的第三端。此种设置方式是适用于非导电材质(例如玻璃)的毛细管。

该激光解吸单元所发射的激光光束的波长、能量以及频率无特殊限制，只要能使被照射的液态样品时能解吸出至少一个待测物即可。优选地，该激光解吸单元是具有一发射机构，其是选自于紫外线激光仪、红外线激光仪、氮气激光仪、氩离子激光仪、氦氖激光仪、二氧化碳激光仪以及石榴石激光仪；于本案的一具体例中，该激光解吸单元是具有一台紫外线激光仪，以发射一道紫外线激光光束。

值得一提的是，当该激光解吸单元具有一台用以提供一道红外线激光光束的激光发射机构(即一红外线激光仪)时，可将一个含有待测物的水溶液在未加入基质下，直接作为液态样品并进行ALMS。

本发明质谱仪的各部件可设计为可移动式，以随操作者的需求自行调整位置，来决定各部件的相对方位或距离。类似地，该激光解吸单元的激光光束的能量、频率、入射角、电喷雾单元的电喷雾介质的组成与流速等各参数，可依目的所需来调整，以寻求最佳的检测结果。

当该电喷雾单元的喷嘴是一支具有一管口端的毛细管时，优选地，该毛细管的中心轴线与该质量分析器通道的中心轴线近呈平行，且该毛细管的管口端与该质量分析器通道的入口距离是介于0.5mm至20mm之间。而为使该解吸出的待测物被更顺利地电离，优选地，在一使用状态下，当该液态样品是放置于该承载单元上时，该毛细管的管口端与该液态样品的最短距离是介于0.1mm至2mm。

<实施例>

本发明将就以下实施例与应用例来作进一步说明，但应了解的是，该等实施例及应用例仅是用来作为例示说明，而不应被解释为本发明实施的限制。

化学品暨使用器材

下面的实施例、应用例及比较例将使用下列化学品及设备进行：

1.激光解吸单元：

a.紫外线激光仪(UV laser，以下简称为UV激光)，由美国的Laser，Science Inc.公司所制造，型号为VSL-337i。所发出激光光束的波长为337nm，频率为10Hz，脉冲时间长度为4ns，每次射击能量为100μJ。

b.红外线激光仪(IR laser，以下简称为IR激光)，由俄罗斯的LOTIS TII公司所制造，型号为LS-2130SHP。所发的激光光束的波长为1064nm，频率为2Hz，脉冲时间长度为0.5ns，每次射击能量为50mJ。

2.质量分析器(含检测器)：为四极-飞行时间式质量分析器，由德国Bruker Dalton公司所制造，型号为BioTOF-Q。

3.电喷雾介质的成分：

a.甲醇：由德国Merck公司生产，为HPLC级。

b.乙酸：美国Mallinckrodt公司制造，为HPLC级。

4.待测物：

a.蛋白质标准品：分别为胰岛素(分子量为5733)、肌红蛋白(分子量为17566)、溶菌酶(分子量为14305)以及细胞色素c(分子量为12232)，皆由美国Sigma-Aldrich公司所制造，浓度为至少95％的高纯度蛋白质。

b.氯化血红素：分子量为652.0，由美国Aldrich公司所制造，型号为H-2250。

c.18-冠-6-醚：分子量为264.32，由日本的东京化成工业株式会社公司所制造，型号为C0860。

d.1-十六胺：分子量为241.46，由美国Aldrich公司所制造，型号为H740-8。

5.溶剂：

a.甲醇(同上述)。

b.四氢呋喃：由美国J.T.Baker公司所制造，型号为9440-03。

c.乙酸乙酯：由美国J.T.Baker公司所制造，型号为9282-03。

6.基质：

a.碳粉：由德国Merck公司所制造，型号为4206A；其粒径在50μm以下。

b.金纳米粒子：由私人提供；粒径约为56nm。

c.α-氰基-4-羟基肉桂酸：由美国Sigma-Aldrich公司所制造，为HPLC级。

d.2，5-二羟基苯甲酸：由日本的东京化成工业株式会社公司所制造，型号为D0569。

e.芥子酸：由日本的东京化成工业株式会社公司所制造，型号为D1765。

7.基质辅助激光解吸电离质谱仪：为适用于分析巨大分子的线性式(linear mode)，由德国Bruker Dalton公司所制造，型号为AutoflexMALDI/TOF。

8.电喷雾电离质谱仪：包含有一组电喷雾单元、一台质量分析器以及一台检测器；该电喷雾单元皆是使用与本发明大气压力液相质谱仪的实施例1中相同。

9.细菌萃取液的相关化学品或设备：

a.玻璃珠(glass beads)：由Biospec Products，Inc.公司制造，型号为11079101，直径为100μm。

b.超音波探针震荡器：由Heat Systems，Inc.公司制造，型号XL2020。

c.离心机：由Digisystem Laboratory Instruments，Inc.公司制造，型号为DSC-1524SDT TFA。

d.三氟醋酸：由Riedek-deHaen公司制造，型号为61030，为分析级。

e.乙腈(简称ACN)：由德国Merck公司制造，型号为UN1648，为HPLC级。

大气压力液相质谱仪

<实施例1>

图6所示的本发明大气压力液相质谱仪是用以对至少一个液态样品4进行质谱分析。参阅图4至6，该液态样品4包含有一种溶液41与一和该溶液41相互混合的基质42，该溶液41具有一溶剂411与多个要被解吸并电离的待测物412，而该基质42是能够辅助该待测物412解吸；该大气压力液相质谱仪包含一组电喷雾单元5、一台质量分析器6、一台检测器7、一组激光解吸单元8以及一组承载单元9。

该激光解吸单元8是包括有一台可发射激光光束81的紫外线激光仪82、一块设置于该激光光束81的行进路径中用于聚集能量的透镜83及一面设置于该激光光束81的行进路径中并用于改变该激光光束81的行进方向的反射镜84。基本上，只要在一使用状态下，该激光光束81能够射击到该液态样品4并使其中的待测物412解吸出，所以在机台设计的实务上，也可选择性地改变该反射镜84与该透镜83的位置，甚至是将它们移除。

该承载单元9包括有一个由无法被激光光束81穿透的材质所制成的承载件91以及一个供该承载件91放置且为可动式的升降平台92，该承载件91是用以呈放该液态样品4并具有一片和该液态样品4直接接触的承载面911。因此，一操作者可将该液态样品4滴在该承载面911上，以进行ALMS。

该质量分析器6用于接收并分析自该液态样品4被解吸出且电离的该等待测物412，且该质量分析器6是具有一与外界互通的通道61。该检测器7是用于检测经该质量分析器6分析的待测物412所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果。

该电喷雾单元5具有一个可容置一电喷雾介质51的容器52、一个与该容器52呈流体相通的喷嘴(于各实施例中，该喷嘴是一支毛细管)53以及一台将该电喷雾介质51汲取至该喷嘴53的汲液泵54。

该喷嘴53是远离该质量分析器6地设置，且是用于与该质量分析器6配合，以使得当该喷嘴53与质量分析器6间建立一个电位差时，该电喷雾介质51会自该喷嘴53的管口端531朝该质量分析器6喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子511，该等带电粒子511在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器6移动。

于实施例1中，该喷嘴53是金属材质，且该喷嘴53的中心轴线532与该质量分析器6的通道61的中心轴线62呈平行，而该喷嘴53的管口端531与该质量分析器6的通道61的入口距离是8mm；另，在该液态样品41是放置于该承载面911上的一使用状态下，该喷嘴53的管口端531与该液态样品4的最短距离是1.5mm。

当该激光光束81照射该液态样品4的液滴时，该液态样品4中的至少一个待测物412将接收由该基质42所传递的能量而被解吸，并沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，当该至少一个待测物412在接触该等带电粒子511中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器6移动并进入该通道61后，被该质量分析器6接收，以进行质谱分析。

<实施例2>

参阅图6、7，实施例2的构造及操作模式与实施例1大致相同，所以相同点不再重复说明，两者的不同点在于，实施例2的电喷雾单元5还包括一个包绕着该喷嘴53的管壁的气流供应机构55，并朝如图6中所示的质量分析器6提供一经高压喷出的氮气流311，以加速图5中该等带电粒子511中的液体挥发。进一步地，该氮气流311的温度是视操作者的需要而可被调控在室温至325℃之间。

<实施例3>

参阅图6、8，实施例3的构造及操作模式也与实施例1大致相同，相同部件也不再重复说明，两者的不同点主要在于该电喷雾单元5；实施例3的喷嘴53是非为金属材质，且其电喷雾单元5还具有一个三通接管56，该三通接管56具有一远离该喷嘴53的管口端531地连接于该喷嘴53的第一端561、一用以供该电喷雾介质5流入的第二端562及一被接地的第三端563。

<实施例4>

参阅图9，实施例4的构造及操作模式与实施例1大致相同，所以相同点不再重复说明，两者的不同点在于该承载单元9；实施例4的承载单元9并不包括该承载件91与升降平台92，而是包括有一条轨道93及一组可在该轨道93上移动的承载座组94，该承载座组94是包括有多个依序串联的承载座941。

在一使用状态下，多个液态样品4是各自以一个容置件10(例如一试管或离心管)分别盛装后，将各容置件10一一放置在一个承载座941上，之后，通过电脑软件控制，使该承载座组94在该轨道93上移行，且每一放置有该容置件10的承载座941将陆续到达该操作者事先所预设好的定点，并在此让该容置件10中的液态样品4受该激光光束81的射击，以进行ALMS。

需说明的是，因图示的观察方向的缘故，于图9中仅先以一个承载座941与一个容置件10表示。

<实施例5>

参阅图6，实施例5的构造及操作模式与实施例1大致相同，所以相同点不再重复说明，两者的不同点在于实施例5是将该紫外线激光仪82置换为红外线激光仪82。

<实施例6>

参阅图9，实施例6的构造及操作模式与实施例4大致相同，所以相同点不再重复说明，两者的不同点在于实施例6是将该紫外线激光仪82置换为红外线激光仪82。

在以下本发明大气压力液相质谱分析法的实施例7、8的各应用例与比较例中，各液态样品与电喷雾溶液皆是在常温常压下依特定比例配置，或是直接获得。若未特别说明，则液态样品是水溶液；各电喷雾介质的成分体积比例为【水∶甲醇∶乙酸＝50∶50∶0.1】，流速是每分钟150μL。

再者，施行实施例7(ALMS)的应用例或比较例是以本发明大气压力液相质谱仪的实施例3来进行。而各质谱仪的质量分析器，是以两秒(2s/scan)来进行每次扫描；再者，各液态样品中，溶剂的分子量是先排除在质量分析器的扫描范围以外。

另，施行MALDI-MS的各比较例是将其液态样品施以干燥而成一干燥物后再施行MALDI-MS。

大气压力液相质谱分析法(ALMS)

应用例1、2及比较例1：以ALMS分析蛋白质溶液

应用例1、2与比较例1的电喷雾介质为20vol％的甲醇水溶液，并分别以不同含量的碳粉作为基质；应用例1、2与比较例1的液态样品成分以及进行ALMS之后所获得的质谱图结果如下列表1所列：

表1

由于所使用的电喷雾介质并不含有酸，因此，申请人预测所获得的质谱图所呈现的应是“未变性蛋白质”形成的结果；也就是说，肌红蛋白经由应用例1、2的ALMS，计算后的分子量应为17567Da，而非变性后脱去一个血红素分子(分子量为616Da)所呈现的分子量16951Da。

结果

于图10-2、10-3中，皆可清楚地显示出分别以■、▲、●为标记的三大离子峰群，且经由电脑软件计算后所得到的待测物分子量，则分别为12232Da、14306Da，与17567Da，与供应商所注明的细胞色素c、溶菌酶及肌红蛋白的分子量几乎完全符合(且显然肌红蛋白是在一未变性状态)，证实ALMS不但能有效运作，且对于一个含有蛋白质的液态样品的直接检测，还具有十分精准且令人满意的定量效果。

追究其因，显然是该液态样品在接受UV激光的轰击后，其中的碳粉顺利地辅助该待测物(蛋白质)成功解吸；反观比较例1，所使用的液态样品中并未含碳粉或其他基质，于是待测物无法有效地解吸出该液态样品外(或者是解吸出的量过少)，导致质量分析器未能接获待测物并反应出相关讯号。

需说明的是，图10-1中的波峰是一干扰讯号，并且在无待测物讯号的情况下被相对地放大。

应用例3-6：以ALMS分析含有不同基质的液态样品

应用例3-6是以不同的物质为基质；2，5-DHB、芥子酸与α-氰基-4-羟基肉桂酸为水溶性。而应用例4-6也分别在其基质为溶解状态以及当其基质因液态样品中的溶剂逐渐挥发导致基质因浓度渐提高终致饱和而析出时，分别施以ALMS。应用例3-6的液态样品成分与之后所获得的质谱图结果如下列表2所列。应用4-6的基质的添加方式是将所对应使用的基质2mg溶于1ml、70vol％的ACN水溶液中，而形成一个基质溶液，并选取澄清的溶液部分，与一已配置好的肌红蛋白溶液(浓度为10^-4M)以1∶1的体积相互混合，而形成该液态样品。

表2

结果

图11-1清楚地显示出由待测物(未变性与已变性的肌红蛋白)所形成的离子峰群。然于应用例4-6中，在基质为溶解状态时所获得的质谱图11-2、11-4、11-6中，只有观察到由液态样品所形成的杂讯，并未显示出由肌红蛋白所形成的离子峰群；但是，基质析出后施以ALMS所获得的质谱图11-3、11-5、11-7中，则显然地可观察到已变性后的肌红蛋白所形成的离子峰群，而该等结果也十分接近。

另，质谱图11-3、11-5、11-7中未观察到如图11-1中所示的m/z值大于1400的由未变性肌红蛋白所形成的离子峰，申请人认为，此是因为2，5-DHB、芥子酸与α-氰基-4-羟基肉桂酸等基质皆属于有机酸，于是在应用例4-6的液态样品内的肌红蛋白应该已呈变性状态所致，因此质谱图11-3、11-5、11-7显示不出由未变性肌红蛋白所形成的离子峰。

以上结果显示，除了碳粉以外，金纳米粒子、2，5-DHB、芥子酸及α-氰基-4-羟基肉桂酸等皆可应用于ALMS所需要的基质；然而基质可能需要具有至少一定的粒径，方能展现足够的辅助能力，以使待测物成功地解吸出该液态样品，继而获得相对应的质谱分析结果。

应用例7-9：以ALMS分析包含有有机溶液与碳粉的液态样品

应用例7-9的液态样品成分与进行ALMS后所获得的质谱图结果如下列表3所列：

表3

结果

由图12-1～12-3中，皆可清楚地观察到由所对应的待测物形成的离子峰，且经推算后获知的待测物分子量也与事实相符，证实ALMS的操作方式也适用于分析包含有机溶剂及有机化合物的液态样品。

应用例10与比较例2、3：比较ALMS、ESI-S与MALDI-MS对蛋 白质标准品的分析结果

应用例10与比较例2、3是使用一致的待测物(蛋白质标准品)分别配成适当的液态样品(待测物是胰岛素、细胞色素c、溶菌酶与肌红蛋白)后各自施行ALMS、ESI-MS与MALDI-MS，兹将应用例10与比较例2、3所使用的样品与进行质谱分析后所获得的质谱图结果列于下方表4；液态样品是为水溶液，且“-”表示未使用，而比较例3的样品配制方式是将该基质的饱和水溶液与一个含该等待测物的溶液以体积比1∶1混合而得一个液态样品，取适量的该液态样品并使其干燥后，进行MALSI-MS：

表4

结果

由图13-1中可看出，可以观察到由各待测物所分别形成的离子峰群，且在经由简并化的图13-2中，也清楚地显示出各待测物的代表离子峰m/z值为17567、16951分别为未变性及已变性的肌红蛋白。

由于该液态样品中胰岛素、细胞色素c、溶菌酶与肌红蛋白的含量比为1∶2∶5∶10，可观察到的是，图13-2中的各离子峰相对强度(就肌红蛋白请参阅m/z值为17567、16951两离子峰相对强度的总合)的比例大致地反应出该样品中各待测物含量的比例。

但是，在图13-3中并未显示出由溶菌酶所形成的离子峰；另外，就胰岛素所形成的离子峰，强度也低到难以观察，纵使经过简并化后形成的图13-4，仍无法清楚呈现由胰岛素所形成的离子峰。

另外，图13-5中也没有显示出由胰岛素所形成的离子峰，且其他离子峰的相对强度更无法实质反应出原液态样品内细胞色素c、溶菌酶与肌红蛋白的含量比例。

此结果显示，相对于MALDI-MS与ESI-MS，本发明ALMS可快速且精准地反应出一个液态样品中各待测物的浓度比例。进一步地，本发明ALMS应还具有“蛋白质定量”功能的潜力；也就是说，若在一个液态样品中具有一已知浓度的特定蛋白质及其他未知浓度的待测物，则在经由ALMS后，应可借所获得的简并化质谱图中，依各离子峰的相对强度推算该等待测物的浓度。

应用例11：以ALMS追踪生化反应进行程度

由于ALMS的分析过程十分快速，所以申请人推测，ALMS应可用来观察与监测一正在进行的化学或生化反应，以了解到该反应实质进行的程度。

应用例11是配置好一细胞色素c水溶液后，继而将表面涂敷有胰蛋白酶的纳米磁性粒子(为私人提供，掺入)添加于其中，而形成一个液态样品，并在获得该液态样品的当下(0分钟)、15分钟后及30分钟后分别进行ALMS。该液态样品的成分与各时刻所对应获得的质谱图结果如下表5所列：

表5

据悉，胰蛋白酶可切断蛋白质中精氨酸与赖氨酸之间的键结，因此推测，随着反应时间的增加，应该会有越来越多源自于细胞色素c的肽产生；也就是说，在所对应的质谱图中，相对于由细胞色素c所形成的离子峰，该等肽所形成的离子峰的相对强度应有随时间而越接近细胞色素c的离子峰的趋势，甚至超越。

结果

图14-1中所显示的三根离子峰皆是来自于细胞色素c，尚未观察到由肽所形成的离子峰；在图14-2、14-3中，确实皆有肽形成的离子峰出现，且图14-3中来自于肽的离子峰，其相对强度比图14-2中所示更接近于细胞色素c的离子峰的相对强度。

此结果印证了申请人先前的推测，并显示ALMS确实可用以监控一生化反应的进行程度。

应用例12-15与比较例4-11：比较ALMS、ESI-MS与MALDI-MS对各式体液进行分析的结果。

应用例12-15与比较例4-11是使用相同的各式体液分别以去离子水稀释十倍后配成适当的液态样品，并各自施行ALMS、ESI-MS，与MALDI-MS。施行MALDI-MS的各比较例是将其液态样品施以干燥而成一干燥物后再施行MALDI-MS。

兹将应用例12-15与比较例4-11所使用的样品与进行质谱分析后所获得的质谱图结果列于下方表6；“-”表示未使用，而应用例15与比较例10、11所使用的细菌萃取液，其制备过程如下：

将养好的细菌(由台湾的食品工业研究所所制造，型号为“大肠杆菌-13082”的标准菌种)以1ml纯水清洗后离心，移除上清液后，加入500μl的含有0.1g的玻璃珠与70vol％ACN及0.25vol％TFA的水溶液，继而借由超音波震荡探针，以间歇性震荡来破坏细菌的细胞壁，操作方式为每震荡10秒钟即停止10秒钟，反复进行至历时20分钟。离心之后再取上清液，此即为细菌萃取液。

表6

结果

于应用例12的图15-1、15-2中，可知ALMS成功地测得了人类泪液中的三种主要蛋白质；标记A的离子峰群为溶菌酶所形成，标记为C则是涙脂质运载蛋白(tear lipocalin)所形成。而应用例13的图16-1、16-2中，也观察到牛奶中的主要蛋白质-酪蛋白(casin)以及一些推测是由脂质所造成的离子峰。另外，应用例14的图17-1、17-2中，也有观察到血清中的主要蛋白质-白蛋白的讯号；标记A的离子峰群应为载脂蛋白A1(apolipoprotein A1)，标记为C则是涙脂质运载蛋白。应用例15的图18-1、18-2中也显示出来自于大肠杆菌的三个主要蛋白质的离子峰。

另，分别就图15-20中的各图-1、-3、-4的型态可看出，不管该液态样品中所采用的是何种体液，以ALMS所获得的各质谱图-1，相对于由ESI-MS所获得的图15-3、图16-3、图17-3、图18-3及由MALDI-MS所获得的图15-4、图16-4、图17-4、图18-4，皆具有显著的更高的解析度，而可准确地计算出待测物的分子量。

就此现象的起因，申请人认为是，虽然该液态样品中含有多量且种类丰富的盐类(原本即存在于体液内)，然而在ALMS的分析过程中，仅有待测物解吸出，盐类并未附着于该待测物上，再者电喷雾介质中所含有的阳离子也仅有H⁺，使得质量分析器所接收到的待测物离子皆是MH_n ⁿ⁺(M表示待测物，n表示附着于该待测物上的个数)，而获得了较高的解析度。

应用例16：以ALMS分析糖尿病患者的血液

应用例16所使用的电喷雾溶液是20vol％的甲醇水溶液。将一糖尿病患者的血液(私人提供)以去离子水稀释10倍并加入碳粉作为基质且使其浓度为0.8mg/μL，而形成一个液态样品后进行ALMS，试图检测血红蛋白(Hb)及糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1)，并获得如图19-1、图19-2所示的分析结果；图19-2为图19-1的简并图。

Hb是由α链分子与β链分子以非共价键相互结合而形成，因此两者的键结能力很弱；而HbA1则是Hb分子接附葡萄糖后形成。于图19-1与图19-2中，可清楚地看出分别由Hb中的α链分子与β链分子以及HbA1中的接附有葡萄糖的α链分子与接附有葡萄糖的β链分子所构成的离子峰。

进一步地，就经过简并化的图19-2中，估算HbA1相对于Hb的比值【以下简称为“(HbA1/Hb)值”】；计算方式是以α链分子(假设其所形成的离子峰涵盖面积为C值)及有接附葡萄糖的α链分子(假设其所形成的离子峰涵盖面积为D值)来代表计算，数字(D/C+D)，即为上述“(HbA1/Hb)值”。

应用例17：评估“以ALMS来分析糖尿病患血液中的醣化血红蛋白 含量”的可信度

取9位糖尿病患者的血液，并个别进行三次的如上述应用例16的操作及数值评估计算，而获得相对于该9位病患的各三个，总数为27个的“(HbA1/Hb)值”；另，将当次/当位病患的血液也同步以离子交换层析法(简称IC，为目前医界普遍用来检测Hb与HbA1含量的方法)来进行(HbA1/Hb)值的检测与计算，该9位病患各有一个“(HbA1/Hb)值”，所以共有9个“(HbA1/Hb)值”。

之后，在如图20所示的X-Y坐标图上，将每位病患分别以ALMS与IC所得到“(HbA1/Hb)值”以“点”来表示，所以每位病患各可获得三个点。将该三个点取一平均点，进而获得9个平均点，再将此9个平均点进行线性回归分析，获得一相关直线：y＝0.5882x+1.1964，R2＝0.8666。

结果

依线性回归的数值可知，以ALMS所获得的“(HbA1/Hb)值”与借由医界普遍使用的IC法所获得的“(HbA1/Hb)值”有一相关性，因此经由ALMS而获得的“(HbA1/Hb)值”应也有可信度，而非常具有参考价值；特别是，以IC法对一血液的“(HbA1/Hb)值”进行判断，包含样品的前处理，据悉也需要约一小时的时间，但ALMS却可即时检测并即时获知结果，所以ALMS应有足够的潜力取代IC法，以其分析结果作为疾病判断的依据。

应用例18：以ALMS分析糖尿病患者的血液

应用例18是以本发明大气压力液相质谱仪的实施例5来进行；所使用的电喷雾介质为20vol％甲醇水溶液。

由于水对于IR光有强烈的吸收，因此申请人预测，水在吸收IR光的能量后，应可辅助待测物脱离液态样品，继而此该待测物电离后进入质量分析器；也就是说，就此特殊的ALMS而言，“水”即扮演了“基质”的角色。

基于上述概念，本应用例是采用相同于应用例16的糖尿病患者血液，以去离子水稀释十倍之后即成为所欲的液态样品(未再加入其它物质，例如先前所述的各基质)，并以本发明大气压力液相质谱仪的实施例5，直接进行ALMS，而获得如图21-1、图21-2所示的分析结果；图21-2为图21-1的简并图。

结果

图21-1、21-2皆明显地呈现出离子峰群，特别是经过简并化的图21-2，其几乎与应用例16的图21-2相同！此结果完全地验证了申请人先前的预测，且显然地，当液态溶液为一种水溶液时，即便是成分复杂且含有多量盐类的体液，经由简单的稀释步骤，也可通过“不加入基质而直接以IR激光射击该液态溶液”的ALMS分析方式，在一极为简便且快速的操作过程，获得一个可信度高的质谱分析结果。

借由以上各应用例所显示的结果以及各比较例的对应说明，都显示出本发明ALMS暨其质谱仪确实可对一个液态样品立即进行快速且结果精准的质谱分析；同时，分析对象也未有特别的限制，不论是一成分复杂的体液，或是一种有机溶液，都可通过ALMS来加以定性其中的内容物；再者，除了优良的定性能力，ALMS更可精准地反应出一个液态样品中各待测物的含量比例，因此ALMS可借由其定性与相对定量的能力，探究一化学或生化反应的起始物、中间物、反应物的种类与含量比例，了解该进行程度；最特别的是，当液态样品为一种水溶液时，ALMS只要以一道红外线激光光束来配合施行，直接射击一种水溶液(此时是以水来作为基质)，也可获得极佳的检测结果。

归纳上述，可知本发明ALMS已然突破了质谱界存在已久的技术瓶颈，而可直接对一几乎不需施以任何前置作业的液态样品，进行质谱分析，同时也可快速且精准地获知结果，因此，特别是对于常需要对大批液态样品中的内含物进行定性或进一步相对定量的业界，例如医学或环境检验、刑事鉴定、学术研究等等，本发明ALMS暨其质谱仪都可提供极大的助益。

Claims (33)

1.一种大气压力液相质谱分析方法，其特征在于，该大气压力液相质谱分析方法包含：

配置一个要被质谱分析的液态样品，其包含有一种溶液与一和该溶液相互混合的基质，该溶液具有一溶剂与多个要被解吸并电离的待测物，而该基质用以助该待测物解吸；

提供一组电喷雾单元，该电喷雾单元具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一个与该容器呈流体相通的喷嘴；

提供一台质量分析器，该质量分析器是远离该喷嘴地设置，用于接收并分析自该样品中被解吸并电离的待测物；

提供一台检测器，用于检测经该质量分析器分析的待测物所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

令该喷嘴与质量分析器间产生一个电位差，以使该喷嘴将该电喷雾介质朝该质量分析器喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子，所述带电粒子在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器移动；以及

使用一道激光光束来照射该液态样品，以使得该液态样品中至少一个待测物接收由该基质所传递的能量而被解吸后沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，且使得该至少一个待测物在接触所述带电粒子中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动并被该质量分析器接收，以进行质谱分析。

2.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该基质是由无法被激光穿透的材质所构成。

3.如权利要求2所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该基质的材质是选自于金、碳、钴、铁、2，5-DHB、芥子酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸或它们的组合。

4.如权利要求3所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该基质的材质是选自于金、碳、2，5-DHB、芥子酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸或它们的组合。

5.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该基质的粒径是介于50nm至50μm。

6.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该液态样品的溶液是一由一生物所分泌出的体液。

7.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该液态样品的溶液是将一由一生物所分泌的体液经以水稀释后而形成。

8.如权利要求7所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该生物所分泌的体液是选自于血液、泪液、乳汁、汗液、肠液、脑浆、脊髓液、淋巴液、脓液、血清、唾液、鼻水、尿液或粪液。

9.如权利要求8所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该生物所分泌的体液是选自于血液、泪液、乳汁或血清。

10.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该液态样品的溶液是一种蛋白质溶液。

11.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该液态样品的溶剂是一有机溶剂，该待测物是一有机化合物。

12.如权利要求1所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该电喷雾介质是含有一种挥发性液体的水溶液。

13.如权利要求12所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该挥发性液体是选自于乙腈、丙酮、醇类或它们的一组合。

14.如权利要求13所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该挥发性液体是醇类。

15.如权利要求14所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该挥发性液体是甲醇。

16.如权利要求12所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该电喷雾介质是还含有一酸。

17.如权利要求16所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该电喷雾介质是含有醇，并还含有甲酸、乙酸、三氟醋酸或它们的一组合。

18.如权利要求17所述的大气压力液相质谱分析方法，其特征在于：

该电喷雾介质是含有甲醇及乙酸的水溶液。

19.一种大气压力液相质谱分析方法，其特征在于，该大气压力液相质谱分析方法包含：

配置一种水溶液，其包含多个要被解吸并电离以接受质谱分析的待测物；

提供一组电喷雾单元，其具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一个与该容器呈流体相通的喷嘴；

提供一台质量分析器，该质量分析器是远离该喷嘴地设置，用于接收并分析自该样品中被解吸并电离的待测物；

提供一台检测器，用于检测经该质量分析器分析的待测物所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

令该喷嘴与质量分析器间产生一个电位差，以使该喷嘴将该电喷雾介质朝该质量分析器喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子，所述带电粒子在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器移动；以及

使用一道红外线激光光束来照射该水溶液，以使得水溶液内的至少一个待测物接收由水所传递的能量而被解吸后沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，且使得该至少一个待测物在接触所述带电粒子中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动并被该质量分析器接收，以进行质谱分析。

20.一种大气压力液相质谱仪，用以对至少一个液态样品进行质谱分析，该液态样品包含一种溶液与一和该溶液相互混合的基质，该溶液具有一溶剂与多个要被解吸并电离的待测物，而该基质是用以助该待测物解吸；其特征在于，该大气压力液相质谱仪包含：

一组承载单元，用以供该液态样品放置；

一台质量分析器，用于接收并分析所述自该液态样品被解吸出且电离的待测物；

一台检测器，用于检测经该质量分析器分析的待测物所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

一组电喷雾单元，具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一个与该容器呈流体相通的喷嘴，该喷嘴是远离该质量分析器地设置，且是用于与该质量分析器配合，以使得当该喷嘴与质量分析器间建立一个电位差时，该电喷雾介质会自该喷嘴朝该质量分析器喷雾出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子，所述带电粒子在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器移动；以及

一组激光解吸单元，用以发射一道激光光束，当该激光光束照射该液态样品时，该液态样品中的至少一个待测物将接收由该基质所传递的能量而被解吸，并沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，当该至少一个待测物在接触所述带电粒子中至少一个后，会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动并进入该质量分析器的通道后被接收，以进行质谱分析。

21.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该电喷雾单元的喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且该电喷雾单元进一步包含一台将该电喷雾介质汲取至该毛细管的汲液泵，该毛细管为金属材质，且该电喷雾介质是自该毛细管的管口端被喷雾出。

22.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该电喷雾单元的喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且该电喷雾单元进一步包含一台将该电喷雾介质汲取至该毛细管的汲液泵以及一个三通接管，该三通接管具有一远离该管口端地连接于该毛细管的第一端、一用以供该电喷雾介质流入的第二端及一用以建立该电位差的第三端。

23.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该激光解吸单元具有一发射机构，其为紫外线激光仪、红外线激光仪、氮气激光仪、氩离子激光仪、氦氖激光仪、二氧化碳激光仪或石榴石激光仪。

24.如权利要求23所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该激光解吸单元具有一台紫外线激光仪。

25.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该电喷雾单元还包括一用以加速位于该电喷雾单元与质量分析器间带电粒子中的液体挥发的气流供应机构。

26.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该电喷雾单元的喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且该毛细管的中心轴线与该质量分析器通道的中心轴线呈平行，而该毛细管的管口端与该质量分析器通道的入口距离是介于0.5mm至20mm之间。

27.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该电喷雾单元的喷嘴是一支具有一管口端的毛细管，且在该液态样品是放置于该承载单元上的一使用状态下，该毛细管的管口端与该液态样品的最短距离是介于0.5mm至3mm。

28.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该承载单元包括有一条轨道及一组可移动地装设在该轨道上的承载座组，该承载座组是可供该液态样品放置，且沿着该轨道而运行。

29.如权利要求20所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该承载单元包括有一个由无法被激光穿透的材质所制成的承载件，该承载件是用以呈放该液态样品并具有一片和该液态样品直接接触的承载面。

30.一种大气压力液相质谱仪，用以对至少一种水溶液进行质谱分析，该水溶液包含多个要被解吸并电离的待测物，其特征在于，该大气压力液相质谱仪包含：

一组承载单元，用以供该水溶液放置；

一台质量分析器，用于接收并分析所述自该液态样品被解吸出且电离的待测物；

一台检测器，用于检测经该质量分析器分析的待测物所产生的讯号，并产生一个质谱分析结果；

一组电喷雾单元，具有一个可容置一电喷雾介质的容器以及一个与该容器呈流体相通的喷嘴，该喷嘴是远离该质量分析器地设置，且是用于与该质量分析器配合，以使得当该喷嘴与质量分析器间建立一个电位差时，该电喷雾介质会自该喷嘴朝该质量分析器喷洒出，并形成多颗作为电荷供体的微小带电粒子，所述带电粒子在该电位差的作用下，会沿着一条电荷移转路径朝向该质量分析器移动；以及

一组激光解吸单元，用于提供一道红外线激光以照射该水溶液，当该红外线激光照射该水溶液时，该水溶液内的水将吸收红外线激光的能量并把能量传递到至少一个待测物上，而使其被解吸，并沿着一与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，当该至少一个待测物在接触所述带电粒子中至少一个后，会因电荷移转而被电离，之后在该电位差引导下，朝向该质量分析器移动并进入该质量分析器的通道后被接收，以进行质谱分析。

31.如权利要求30所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该激光解吸单元是具有一道红外线激光仪。

32.如权利要求30所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该承载单元包括有一条轨道及一组可移动地装设在该轨道上的承载座组，该承载座组是可供该水溶液放置，且沿着该轨道而运行。

33.如权利要求30所述的大气压力液相质谱仪，其特征在于：

该承载单元包括有一个由无法被激光穿透的材质所制成的承载件，该承载件是用以呈放该水溶液并具有一片和该水溶液直接接触的承载面。

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