CN115249609A - 喷涂maldi-tof ms成像基质的超声喷雾装置和方法及应用 - Google Patents

喷涂maldi-tof ms成像基质的超声喷雾装置和方法及应用 Download PDF

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占铃鹏
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Abstract

本发明涉及基质喷涂领域，公开了喷涂MALDI‑TOF MS成像基质的超声喷雾装置和方法及应用。一种喷涂MALDI‑TOF MS成像基质的超声喷雾装置，该装置包括：溶液池(1)、置于溶液池(1)的底座凹槽内的雾化片(2)，以及与所述雾化片(2)通过电线连接的控制器(3)；其中，所述溶液池(1)用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器(3)发生电子高频震荡使所述雾化片(2)产生高频谐振，将所述喷涂液打散形成雾滴。采用本发明的超声喷雾装置进行基质喷涂具有成本低廉，制备的MALDI‑TOF MS成像基质的晶粒致密细小的优点，能够得到高分辨率的MALDI‑TOF MS成像效果。

Description

喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置和方法及应用
分案申请
本发明为申请日为2018年06月08日、申请号为201810589765.1、名称为“制备MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置和方法及应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基质喷涂领域，具体涉及喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置和方法及应用。
背景技术
基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来(1988年Karaset al.和Tanaka et al.报道)发展起来的一种软电离生物质谱，MALDI-TOF MS的原理是用激光照射基质与样品分子形成的共结晶，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，使生物分子解吸并离子化，从而实现电离的过程。MALDI-TOF MS的数据采集过程，首先将样品和基质的混合溶液点到样品板上，在空气(或真空)中干燥结晶，再将样品板送入真空样品仓，脉冲激光将基质和样品离子化以后，产生的分子离子在加速电压的作用下开始加速，此时不同质荷比的离子会加速到不同的速度，然后进入到飞行管，由于飞行管式高真空无场区，离子在这里进行匀速运动，因而距离一定，不同质荷比的离子(具有不同速度)到达检测器的时间(飞行时间)是不同的，所要可以根据飞行时间和质荷比的关系来确定分子离子的质荷比，最后数字控制系统会将信号输出得到质谱的谱图。当使用MALDI离子源的激光对生物切片进行二维逐点扫描时，每个扫描点的不同分子量分子将会被质谱仪检测，将某一分子量的生物分子根据检测的信号强度做二维热图，即可得到具有空间分布特征的MALDI-TOFMS成像图。
要得到高质量的MALDI-TOF MS成像结果，需要将基质均匀地喷涂在生物切片上。基质的结晶大小和结晶过程都会对成像质量有决定性影响。一般来说，基质的晶粒越致密越细小，质谱峰信号强度越强，能支持的成像分辨也越高。另外，基质所溶于的溶剂与切片接触越充分，对生物分子的萃取效果越好，也可使得信号强度提高。目前，主流的喷涂基质的方法有升华法、美术喷枪法、脉冲式振动喷雾法、电喷雾法等。美术喷枪法和脉冲式振动电喷雾所喷涂的基质晶粒往往较大(粒径大于50微米)，如果要进行好于50微米分辨率成像实验则不适合。电喷雾法能得到粒径10微米左右的切片，但基于这种原理的仪器需要使用高压电源和高压鞘气，售价也十分高昂。因此，希望开发一种廉价而高效的基质喷涂方法得到高质量的MALDI-TOF MS成像结果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的喷涂的基质晶粒较大、信号强度不高、成本较高，MALDI-TOF MS成像效果不佳的问题，提供喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置和方法及应用，采用本发明的超声喷雾装置进行基质喷涂具有成本低廉，制备的MALDI-TOF MS成像基质的晶粒致密细小的有点，能够得到高分辨率的MALDI-TOF MS成像效果。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置，其中，该装置包括：溶液池1、置于溶液池1的底座凹槽内的雾化片2，以及与所述雾化片2通过电线连接的控制器3；
其中，所述溶液池1用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器3发生电子高频震荡使所述雾化片2产生高频谐振，将所述喷涂液打散形成雾滴。
本发明第二方面提供了由上述的超声喷雾装置喷涂MALDI-TOF MS成像基质的方法，包括以下步骤：将所述雾化片2与控制器3通过电线连接，开启控制器3，将溶液池1内的含有基质的喷涂液通过雾化片2喷涂至待测样品切片的表面，在待测样品切片的表面形成MALDI-TOF MS成像基质。
本发明第三方面提供了上述的喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置或上述的方法在代谢组学、肿瘤学和植物学中的应用。
本发明通过上述技术方案，无需使用高压电源和鞘气，减少了设备和耗材成本，而且制备的MALDI-TOF MS成像基质晶粒致密细小，克服了传统喷雾涂覆时晶粒较大、信号强度不高的缺陷，能够得到高分辨率的MALDI-TOF MS成像效果。
附图说明
图1是本发明的喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置的示意图；
图2a是实施例1的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片；
图2b是实施例2的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片；
图2c是对比例1的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片；
图2d是对比例2的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片；
图3a是正离子质谱成像对应的全脑HE染色和小脑HE染色图；
图3b是实施例1的正离子MALDI-TOF MS成像的图片；
图3c是对比例1的正离子MALDI-TOF MS成像的图片；
图3d是正离子MALDI-TOF MS的质谱信号图；
图4a是负离子质谱成像对应的全脑HE染色和小脑HE染色图；
图4b是实施例2的负离子MALDI-TOF MS成像的图片；
图4c是对比例2的负离子MALDI-TOF MS成像的图片；
图4d是负离子MALDI-TOF MS的质谱信号图。
附图标记说明
1、溶液池 2、雾化片
3、控制器 4、喷头卡套
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供了一种喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置，如图1所示，其中，该装置包括：溶液池1、置于溶液池1的底座凹槽内的雾化片2，以及与所述雾化片2通过电线连接的控制器3；
其中，所述溶液池1用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器3发生电子高频震荡使所述雾化片2产生高频谐振，将所述喷涂液打散形成雾滴。
在本发明中，溶液池1设置有底座，底座内设置有凹槽，雾化片2置于凹槽内，溶液池1内的喷涂液可以流入雾化片2中。
在本发明中，所述控制器3发生电子高频震荡，所述雾化片2利用控制器3发生的电子高频震荡，将所述喷涂液打散形成雾滴。
在本发明中，所述雾化片2的直径以需要而定，可以为但不限于10-25mm，例如10mm、12mm、15mm、17mm、20mm、22mm、25mm以及这些数值中的任意两个所构成的范围中的任意值。所述雾化片的微孔直径同样以需要而定，可以为0.5-5μm，例如0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm以及这些数值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
在本发明中，所述雾化片2与所述溶液池1可以通过喷头卡套4进行固定，但是固体的方式并不限于此。
本发明中是以飞行时间质谱(TOF MS)作为分析手段，但本发明的MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置也可以与其它质量分析器联用。
本发明第二方面提供了由上述的超声喷雾装置喷涂MALDI-TOF MS成像基质的方法，包括以下步骤：将所述雾化片2与控制器3通过电线连接，开启控制器3，将溶液池1内的含有基质的喷涂液通过雾化片2喷涂至待测样品切片的表面，在待测样品切片的表面形成MALDI-TOF MS成像基质。
根据本发明的方法，所述喷涂液还含有溶剂，其中，所述溶剂以能够与待测样品兼容为目的，例如可以为甲醇、乙醇、水和乙腈中的一种或多种，但不限于此。
根据本发明的方法，在所述喷涂液中，基质的浓度可以为但不限于：4-15mg/mL。优选地，所述基质为2,5-二羟基苯甲酸，1,5-萘二胺盐酸盐或盐酸萘乙二胺。但基质并不限于此，以能够形成MALDI-TOF MS成像基质为目的。
根据本发明的方法，所述待测样品切片可以为但不限于：动物样品切片、植物样品切片、细菌样品切片或指纹样品切片。
根据本发明的方法，所述待测样品切片含有生物分子，优选地，所述生物分子的分子量小于1000Da。具体地，所述生物分子可以为多肽、寡钛、有机酸、磷酸腺苷、葡萄糖、脂肪酸、磷脂和硫苷脂中的一种或多种。其中，所述有机酸可以为牛磺酸和/或脂肪酸；所述多肽可以为谷胱甘肽。
根据本发明的方法，在将溶液池1内的含有基质的喷涂液通过雾化片2喷涂至待测样品切片的表面时，所述待测样品切片与雾化片2的距离大于5cm，优选为5-20cm。也即喷涂距离大于5cm，优选为5-20cm。
根据本发明的方法，喷涂液的喷涂量满足在待测样品切片的表面形成MALDI-TOFMS成像基质的涂覆量为1-10mg/玻璃片(也即，每个玻璃片上涂覆1-10mg的基质，其中，玻璃片的尺寸例如可以为：长76mm，宽26mm，厚1mm)。对于不同的待测样品切片，也即不同的生物分子，基质的涂覆量不同时，得到的MALDI-TOF MS成像效果也不同，因此，以得到成像效果最佳的基质喷涂量为目的。
例如，本发明的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片如图2a、图2b所示，而现有技术的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片如图2c、图2d所示，通过对比可以看出，本发明的超声喷雾装置制备的共结晶成像效果更好。
本发明第三方面提供了上述的喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置或上述的方法在代谢组学、肿瘤学和植物学中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，雾化片购自晶东顺电子有限公司，雾化片的直径为16mm，雾化片的微孔直径为3μm；
控制器购自晶东顺电子有限公司，震荡频率为110kHz，驱动电压为5V；
光学显微镜购自奥林巴斯公司，型号为IX73；
MALDI-TOF MS购自布鲁克公司，型号为Ultraflextreme；
市售脉冲式基质喷雾仪购自布鲁克公司，型号为Imageprep。
实施例1
(1)组装喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置
将雾化片2放入溶液池1的底座凹槽内，用喷头卡套4将雾化片2与溶液池1进行固定，通过电线将所述雾化片2控制器3连接，得到如图1所示的装置，其中，溶液池1用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器3提供电子高频震荡，所述雾化片2利用电子高频震荡产生高频谐振，将液体打散形成雾滴。
(2)制备待测样品切片
将新鲜鼠脑(动物样品切片，含有有机酸、葡萄糖、寡肽、磷酸腺苷、磷脂等分子)液氮速冻后在冷冻切片机中切成10μm厚切片，贴于氧化铟锡(ITO)导电玻璃上，然后放入干燥器中干燥20分钟。
(3)MALDI-TOF MS成像(正离子模式)
将干燥好的贴有切片的ITO玻璃放于通风橱。用铁架台固定喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置，喷头距离ITO表面(待测样品切片与雾化片的距离)15cm。将2,5-二羟基苯甲酸溶液(基质浓度为15mg/mL，溶剂为水：甲醇＝1：1)倒入超声喷雾装置的溶液池1中，开启控制器3。二小时后，将涂覆好基质的ITO玻璃拿出，在待测样品切片的表面形成了MALDI-TOF MS成像基质。将喷涂好基质晶粒的ITO玻璃放在光学显微镜下进行拍照，得到图2a所示的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片。
用光学显微镜观察MALDI-TOF MS成像基质的晶粒大小，晶粒平均直径为10μm。
对全脑和小脑分别进行HE(苏木精-伊红染色)染色，得到如图3a所示的全脑HE染色图和小脑HE染色图。
将ITO玻璃送入MALDI-TOF MS进行成像分析。质谱条件为：电压：加速电压：20.00kV；延迟引出电压：17.90kV；反射器电压：21.15kV；透镜电压：6.40kV；激光器能量：50％；累加次数：200次；正离子模式。成像扫描步径：100μm或20μm。全脑成像图和小脑成像图如图3b所示，质谱信号图如图3d的A所示。
实施例2
(1)组装喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置
将雾化片2放入溶液池1的底座凹槽内，用喷头卡套4将雾化片2与溶液池1进行固定，通过电线将所述雾化片2控制器3连接，得到如图1所示的装置，其中，溶液池1用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器3提供电子高频震荡，所述雾化片2利用电子高频震荡产生高频谐振，将液体打散形成雾滴。
(2)制备待测样品切片
将新鲜鼠脑组织(动物样品，含有有机酸、葡萄糖、寡肽、磷酸腺苷、磷脂等分子)液氮速冻后在冷冻切片机中切成10μm厚切片，贴于氧化铟锡(ITO)导电玻璃上，然后放入干燥器中干燥20分钟。
(3)MALDI-TOF MS成像(负离子模式)
将干燥好的贴有切片的ITO玻璃放于通风橱。用铁架台固定喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置，喷头距离ITO表面(待测样品切片与雾化片的距离)5cm。将1,5-萘二胺盐酸盐溶液(基质浓度为4mg/mL，溶剂为水：乙醇＝7：3)倒入超声喷雾装置的溶液池1中，开启控制器3。二小时后，将涂覆好基质的ITO玻璃拿出，在待测样品切片的表面形成了MALDI-TOF MS成像基质。将喷涂好基质晶粒的ITO玻璃放在光学显微镜下进行拍照，得到图2b所示的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片。
用光学显微镜观察MALDI-TOF MS成像基质的晶粒大小，晶粒平均直径为10μm。
对全脑和小脑分别进行HE(苏木精-伊红染色)染色，得到如图4a所示的全脑HE染色图和小脑HE染色图。
将ITO玻璃送入MALDI-TOF MS进行成像分析。质谱条件为：电压：加速电压：20.00kV；延迟引出电压：17.90kV；反射器电压：21.15kV；透镜电压：6.40kV；激光器能量：50％；累加次数：200次；负离子模式。成像扫描步径：10μm或20μm。全脑成像图和小脑成像图如图4b所示，质谱信号图如图4d的A所示。
对比例1
(1)制备待测样品切片
将新鲜鼠脑组织(动物样品，含有有机酸、葡萄糖、寡肽、磷酸腺苷、磷脂等分子)液氮速冻后在冷冻切片机中切成10μm厚切片，贴于氧化铟锡(ITO)导电玻璃上，然后放入干燥器中干燥20分钟。
(2)MALDI-TOF MS成像(正离子模式)
将干燥好的贴有切片的ITO玻璃放于通风橱，采用市售脉冲式基质喷雾仪在待测样品切片的表面形成了MALDI-TOF MS成像基质。将喷涂好基质晶粒的ITO玻璃放在光学显微镜下进行拍照，得到图2c所示的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片。
用光学显微镜观察MALDI-TOF MS成像基质的晶粒大小，晶粒平均直径为200μm。
将ITO玻璃送入MALDI-TOF MS进行成像分析。质谱条件为：电压：加速电压：20.00kV；延迟引出电压：17.90kV；反射器电压：21.15kV；透镜电压：6.40kV；激光器能量：50％；累加次数：200次；正离子模式。成像扫描步径：100μm或20μm。全脑成像图和小脑成像图如图3c所示，质谱信号图如图3d的B所示。
对比例2
(1)制备待测样品切片
将新鲜鼠脑组织(动物样品，含有有机酸、葡萄糖、寡肽、磷酸腺苷、磷脂等分子)液氮速冻后在冷冻切片机中切成10μm厚切片，贴于氧化铟锡(ITO)导电玻璃上，然后放入干燥器中干燥20分钟。
(3)MALDI-TOF MS成像(负离子模式)
将干燥好的贴有切片的ITO玻璃放于通风橱。采用市售脉冲式基质制备仪器在待测样品切片的表面形成了MALDI-TOF MS成像基质。将喷涂好基质晶粒的ITO玻璃放在光学显微镜下进行拍照，得到图2d所示的MALDI-TOF MS成像基质与样品的共结晶图片。
用光学显微镜观察MALDI-TOF MS成像基质的晶粒大小，晶粒平均直径为200μm。
将ITO玻璃送入MALDI-TOF MS进行成像分析。质谱条件为：电压：加速电压：20.00kV；延迟引出电压：17.90kV；反射器电压：21.15kV；透镜电压：6.40kV；激光器能量：50％；累加次数：200次；负离子模式。成像扫描步径：10μm或20μm。全脑成像图和小脑成像图如图4c所示，质谱信号图如图4d的B所示。
通过实施例1和对比例1能够看出，本发明的MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置喷涂的MALDI-TOF MS成像基质的晶粒细小致密，晶粒平均直径为10μm。而采用市售的脉冲式基质喷雾仪得到晶粒平均直径为200μm。进一步地，通过图3d能够看出，图中A的强度比B的强度大，因此说明使用本发明的超声喷雾装置的质谱信号更强，成像图像质量更高。更进一步地，根据本领域常规分析方法并结合图2a、2b和2c可知，一种脂类分子的分布一般和特定细胞的分布相同，特定细胞的分布可以通过HE染色看出来。因为图2b能够看到脂类分子的分布与图2a的HE染色的细胞分布一致，所以推断该方法能看到脂类分子的分布。因此可以说明，在高空间分辨率成像时，脉冲式基质喷雾仪制备的样品(图2c)只能扫描出晶粒的信号，而本发明的MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置制备的样品(图2b)能得到清晰的内源性脂类分子的分布。
通过实施例2和对比例2能够看出，同样的，本发明的MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置喷涂的MALDI-TOF MS成像基质的晶粒细小致密，晶粒平均直径为10μm。而采用市售的脉冲式基质喷雾仪得到晶粒平均直径为200μm。进一步地，通过图4d能够看出，图中A的强度比B的强度大，说明使用本发明的超声喷雾装置的质谱信号更强，成像图像质量更高。通过图4a、4b和4c能够看出，在高空间分辨率成像时，使用本发明的MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置得到的成像图像更光滑连续，而采用脉冲基质喷雾仪制备的样品图像色块变形较多。
因此，本发明喷涂的MALDI-TOF MS成像基质晶粒致密细小，克服了传统喷雾涂覆时晶粒较大、信号强度不高的缺陷，能够得到高分辨率的MALDI-TOF MS成像效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种喷涂MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置，其特征在于，该装置包括：溶液池(1)、置于溶液池(1)的底座凹槽内的雾化片(2)，以及与所述雾化片(2)通过电线连接的控制器(3)；
其中，所述溶液池(1)用于盛放含有基质的喷涂液，所述控制器(3)发生电子高频震荡使所述雾化片(2)产生高频谐振，将所述喷涂液打散形成雾滴。
2.根据权利要求1所述的超声喷雾装置，其中，所述雾化片(2)的直径为10-25mm，雾化片的微孔直径为0.5-5μm。
3.根据权利要求1所述的超声喷雾装置，其中，所述雾化片(2)与所述溶液池(1)通过喷头卡套(4)进行固定。
4.由权利要求1-3中任意一项所述的超声喷雾装置喷涂MALDI-TOF MS成像基质的方法，包括以下步骤：将所述雾化片(2)与控制器(3)通过电线连接，开启控制器(3)，将溶液池(1)内的含有基质的喷涂液通过雾化片(2)喷涂至待测样品切片的表面，在待测样品切片的表面形成MALDI-TOF MS成像基质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述喷涂液还含有溶剂；优选地，所述溶剂为甲醇、乙醇、水和乙腈中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，在所述喷涂液中，基质的浓度为4-15mg/mL；
优选地，所述基质为2,5-二羟基苯甲酸，1,5-萘二胺盐酸盐或盐酸萘乙二胺。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述待测样品切片为动物样品切片、植物样品切片、细菌样品切片或指纹样品切片。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品切片含有生物分子；优选地，所述生物分子的分子量小于1000Da；
优选地，所述生物分子为多肽、寡钛、有机酸、磷酸腺苷、葡萄糖、脂肪酸、磷脂和硫苷脂中的一种或多种；
优选地，所述有机酸为牛磺酸和/或脂肪酸；
优选地，所述多肽为谷胱甘肽。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，待测样品切片与雾化片(2)的距离大于5cm，优选为5-20cm。
10.权利要求1-3中任意一项所述的制备MALDI-TOF MS成像基质的超声喷雾装置或权利要求4-9中任意一项所述的方法在代谢组学、肿瘤学和植物学中的应用。
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