CN102924568A - 一种合成多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成多肽及其制备方法和用途，该合成多肽产品具有以下氨基酸序列特征：H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH，使用该多肽产品连接对硝基苯胺形成的终产品可以用于蛋白酶制剂酶活性的快速检测。

Description

一种合成多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种合成多肽及其制备方法和用途。 

背景技术

生物酶制剂自从被发现和利用以来，为人类做出了巨大的贡献，蛋白酶被世界生物酶界公认为是使用最广、技术较复杂的酶种，以碱性蛋白酶为代表的洗涤剂用酶一直占据酶制剂市场三分之一的份额，随着蛋白类相关产品在人类日常生活中的重要性逐渐加强，蛋白酶在其他领域的应用被充分认识，应用领域不断扩大。 

目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中应用得最多的一种酶，约占酶总量的60％。这类酶可广泛应用于制革、丝绸、医药、食品和生物化学试剂等领域，在改善人民生活质量、降低劳动强度、节约原料和能源、保护环境等方面发挥着重要作用，并产生巨大的经济效益和社会效益。在高技术日新月异的今天，蛋白酶在日用化工、食品、环保、医药及一些新兴产业中更是具有巨大的市场潜力，发展前景极其广阔，大力开蛋白酶的应用基础研究及生产研究势在必行。 

但由于自然界蛋白质底物的多样性，造成蛋白酶品种众多，根据菌种来源不同可分为：细菌蛋白酶、真菌蛋白酶等；根据提取来源不同可分为：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、姜蛋白酶等；根据反应条件不同可分为：中性、碱性、酸性蛋白酶、低温蛋白酶等；根据反应性能可分为：角蛋白酶、肽酶等，蛋白酶的多样性造成酶的应用不同于淀粉酶类产品，相关应用技术更加复杂。 

国内酶制剂行业经过40年的发展，经历了创建、繁荣的过程，同时也随着国际先进的酶制剂公司诺维信和杰能科的进入而于上世纪90年代开始走向衰退。酶制剂行业是高技术和高垄断的行业，国际上最大的酶制剂公司包括诺维信、杰能科两家公司，目前占有国际市场的60％以上，在我国的占有率达到70％。导致这种局面的发生，部分原因是由于我国缺乏权威的检验评价方法。当国外产品进入国内市场时，国内外蛋白酶的分析检测标准混乱不统一，严重限制了蛋白酶产品的推广应用，产品检测体系严重滞后导致鱼龙混杂，难于评价产品优劣，催化功能相同的酶活力监测和表达方式不同，分类不明确。同时，我国及行业对于蛋白酶制剂标准又极不健全，整个行业缺乏必要的技术规范指导，严重影响产业提升，评价体系严重滞后导致鱼龙混杂，难于评价产品优劣。随着食品安全的日趋严格，作为添加剂的蛋白酶制剂产品，目前只有GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》一个相关标准，不足以评价所有蛋白酶产品。因此，开发各种蛋白酶的标准底物及检测方法，为建立健全各蛋白酶制剂的国家标 准或行业标准奠定基础，既有利于规范蛋白酶制剂生产企业的生产管理，也将有利于提高蛋白酶制剂生产企业的生产技术水平，推动行业进步，为各生产企业、应用企业服务。当建成统一的国家标准或行业标准后，有利于各行业间的交流和蛋白酶制剂产品的市场开发应用。同时，可有效地规避竞争，提高竞争门槛，淘汰不符合标准的企业，提升整个行业的信誉。 

我国的酶制剂产品活力的测定，大都采用绝对法，在规定的条件下(反应温度、时间、PpH)，以酶对底物水解的消耗速率或产物的生成速率进行定量，求得酶活力。因此，底物的质量就变的非常重要了。同一名称的底物因不同产地、不同型号测定出的结果，有时会出现较大差异。 

通常，测定一种酶制剂的产品酶活力的检测方法，对底物的选择是经过反复试验后才确定的。当前用于饲料的植酸酶、木聚糖酶、芽孢杆菌蛋白酶等酶制剂的酶活力底物均采用Sigma公司产品，虽然产品质量稳定，但是价格也是相当高。以N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，N-Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanine4-nitroanilide等底物为例，250mg的售价在均在500以上。 

为了改善国内酶制剂行业检测标准混乱的状况，我们进行了大量的技术方案的设计和研究，设计一种新型的酶制剂检测底物，用于快速高效检测蛋白酶制剂的酶活性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的蛋白酶检测底物，旨在提供一种高效快速检测蛋白酶制剂酶活性的方法。 

本发明的另一个目的在于提供一种制备多肽的方法，为多肽的全合成提供一种简单可行，费用低廉的方法。 

根据本发明的一个方面，提供一种全新的蛋白酶检测底物，该底物为全合成多肽产品，序列如下：N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-对硝基苯胺。 

根据本发明的另一个方面，提供一种用于合成该专利目标多肽的全合成方法：采用标准Fmoc方案，选用2-HCl-Trt树脂进行微波固相合成。 

与现有技术相比，采用目标多肽进行蛋白酶制剂的检测，具有高效和快速的优点，进一步，将蛋白酶制剂的酶活性标准进行统一，便于进行蛋白酶制剂的质量控制和确定。另外，采用本专利所提及的多肽全合成方法，具有操作简便，低毒高效，副产物少，纯度高，后处理方便等优点。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施 例的范围。 

实施例1 

以自制微波固相合成反应管进行H₂N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH的合成 

树脂上载 

将取代度约0.5mmol/g的2-Cl-Trt树脂5g置固相反应管中，以含5％DIPEA的DCM溶液洗涤树脂2次。将Fmoc-Phe-OH(5.142g，5.7mmol)溶于DCM(30ml)中，加入DIPEA(2.615ml，15mmol)，全部溶解后加入树脂中，室温摇摆反应2h，抽干后用DCM(30ml)洗涤树脂3次，加入DCM-MeOH-DIPEA(17∶2∶1)混合液反应30min封闭未反应的树脂，抽干后用DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次，最后用无水乙醚洗涤2次后抽干，红外干燥后得树脂9.873g，用UV-Fmoc方法测得上载后的取代度为0.62mmol/g，上载产率为98.4％。 

微波辅助脱除Fmoc保护基 

将树脂转移至100ml微波反应管中，加入含20％哌啶的DMF溶液30ml，氮气鼓泡，微波功率65W，温度50℃，反应时间3min。之后抽除反应液，再加入含20％哌啶的DMF溶液30ml以相同微波条件再反应1次，抽除反应液后以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次。 

微波辅助氨基酸缩合反应 

Fmoc保护氨基酸(10mmol)、HATU(3.147g，10mmol)和HOOBt(1.391g，10mmol)共同溶于DMF(30ml)中并加入DCM(5ml)，冰水浴冷却至5℃，加入DIPEA(1.743ml，10mmol)后混合均匀反应1min，将该反应液加至脱除保护基后的树脂中，通氮气鼓泡混合，微波功率45W，时间5min，温度50℃。之后抽干反应液，以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次，取少量树脂以Kaiser方法检测缩合情况，确认结果为阴性后脱除Fmoc保护基。 

裂解树脂制备H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH 

将完成所有缩合循环后的树脂以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤2次后转至100ml茄形瓶中，以无水乙醚(30ml×3)洗涤，以带有PP滤头的聚四氟乙烯(PTFE)管抽干后置于红外灯下充分干燥。向树脂中加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚(90：5：5)(70ml)，氩气保护下搅拌反应2h。完毕后过滤，滤液缓慢滴至冰无水乙醚(2L)中，产生沉淀，离心(2500×g)3min，弃去上清液，沉淀再用无水乙醚搅拌-离心-弃上清重复操作5次，合并沉淀，置真空干燥箱中于40℃避光干燥6h，得类白色固体(6.264g，以树脂计粗产率为89.7％)。 

实施例2 

蛋白酶制剂的检测方法 

1试剂 

1.1缓冲溶液(50mM) 

1M储存液

121.1克Tris(三羟甲基氨基甲烷)，157.6克组氨酸盐酸盐，各溶解于1000ml脱盐水，混合后调pH至7.5。 

50mM缓冲液

取50ml储存液用脱盐水定容至1000ml。 

1.2底物溶液 

称取0.020g L-亮氨酸-对硝基苯胺(M＝251.29g*mole-1)溶解于1-2ml乙醇中，添加40ml50mM pH7.5的Tris缓冲液，调节pH至7.5，然后用缓冲液定容至50ml。此时溶液的浓度是1.6mM。使用前检查pH值，若有必要使用1MNaOH或1M HCl进行调节。 

储存于4度，有效期一周。 

1.3酶液 

使用50mMTris缓冲液对酶进行稀释。该方法的有效工作范围是速度在 0.03-0.09OD*min-1。 

注意：在检测开始前应快速溶解和稀释酶液，因为时间长了可能会导致相当一部分活力丧失。 

酶的称量： 

将装有底物的试管在水浴锅中放置10分钟以保温，在此时间内溶解和稀释酶样。 

2方法 

2.1样品 

在装有3ml底物的比色杯中加入0.225ml的酶液，30℃保温。混匀后，记录不少于10min的405nm处的消光(每分钟记录一个值)。 

消光值改变的首个分钟不可以用于评价。 

评价扩展数据只能使用线性范围。 

3评价 

在标准曲线上确定摩尔消光系数。 

$\left(1\right),\mathrm{\ϵ}=\frac{E}{c*d}$

ε＝962 l*mole^-1*mm^-1＝962 ml*mmole^-1*mm^-1

活力计算 

$\left(2\right),\mathrm{LAP}*g^{-1}=\frac{\mathrm{\ΔE}*V*{10}^3}{\mathrm{\ϵ}*d*v*\mathrm{\Δt}*c_s}$

$\left(3\right),\mathrm{LAP}*g^{-1}=\frac{\mathrm{OD}*(\mathrm{mmole}*{10}^3)*\mathrm{mm}*\mathrm{ml}*\mathrm{ml}}{\mathrm{OD}*\mathrm{ml}*\mathrm{mm}*\mathrm{ml}*\min *g}\mathrm{abbrev}.\mathrm{LAP}*g^{-1}=\frac{\mathrm{\μmole}}{\min *g}$

4示例 

称取酶样0.160g于50ml缓冲液中，从中取1ml用缓冲液定容至50ml，得到浓度为0.0064g/ml的酶稀释液。 

ΔE₄₀₅nm＝0.539[in 8 min] 

根据公式2 

$\left(4\right),\mathrm{LAP}*g^{-1}=\frac{0.539*3.225*{10}^3}{962*10*0.225*8*0.000064}=1568$

5附件 

5.1符号说明 

。

Claims (2)

1.一种合成多肽产品，具有以下氨基酸序列特征：H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH。

2.根据权利要求1所述的多肽产品，是经过以下步骤制备而来：

(1)树脂上载

将取代度约0.5mmol/g的2-Cl-Trt树脂5g置固相反应管中，以含5％DIPEA的DCM溶液洗涤树脂2次。将Fmoc-Phe-OH(5.142g，5.7mmol)溶于DCM(30ml)中，加入DIPEA(2.615ml，15mmol)，全部溶解后加入树脂中，室温摇摆反应2h，抽干后用DCM(30ml)洗涤树脂3次，加入DCM-MeOH-DIPEA(17∶2∶1)混合液反应30min封闭未反应的树脂，抽干后用DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次，最后用无水乙醚洗涤2次后抽干，红外干燥后得树脂9.873g，用UV-Fmoc方法测得上载后的取代度为0.62mmol/g，上载产率为98.4％。

(2)微波辅助脱除Fmoc保护基

将树脂转移至100ml微波反应管中，加入含20％哌啶的DMF溶液30ml，氮气鼓泡，微波功率65W，温度50℃，反应时间3min。之后抽除反应液，再加入含20％哌啶的DMF溶液30ml以相同微波条件再反应1次，抽除反应液后以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次。

(3)微波辅助氨基酸缩合反应

Fmoc保护氨基酸(10mmol)、HATU(3.147g，10mmol)和HOOBt(1.391g，10mmol)共同溶于DMF(30ml)中并加入DCM(5ml)，冰水浴冷却至5℃，加入DIPEA(1.743ml，10mmol)后混合均匀反应1min，将该反应液加至脱除保护基后的树脂中，通氮气鼓泡混合，微波功率45W，时间5min，温度50℃。之后抽干反应液，以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤3次，取少量树脂以Kaiser方法检测缩合情况，确认结果为阴性后脱除Fmoc保护基。

(4)裂解树脂制备H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH将完成所有缩合循环后的树脂以DCM(30ml×2)、DMF(30ml×2)交替洗涤2次后转至100ml茄形瓶中，以无水乙醚(30ml×3)洗涤，以带有PP滤头的聚四氟乙烯(PTFE)管抽干后置于红外灯下充分干燥。向树脂中加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚(90∶5∶5)(70ml)，氩气保护下搅拌反应2h。完毕后过滤，滤液缓慢滴至冰无水乙醚(2L)中，产生沉淀，离心(2500×g)3min，弃去上清液，沉淀再用无水乙醚搅拌-离心-弃上清重复操作5次，合并沉淀，置真空干燥箱中于40℃避光干燥6h，得类白色固体(6.264g，以树脂计粗产率为89.7％)。