JP2018528965A - 固相ペプチド合成方法および関連するシステム - Google Patents
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Abstract
固相ペプチド合成のための方法およびシステムが提供される。固相ペプチド合成は、アミノ酸残基が、固体支持体上に固定化されたペプチドに付加される、公知のプロセスである。新しいアミノ酸残基を、活性化アミノ酸と、固定化ペプチドのアミノ酸残基との間のカップリング反応を介して付加する。アミノ酸は、例えば塩基および活性化剤を使用して活性化されてもよい。本明細書に記載される、ある特定の本発明の概念は、アミノ酸を活性化するための方法およびシステムに関する。これらのシステムおよび方法は、従来の活性化技法に比べてより少ない副反応とより高い収率とを可能にし得ると共に、費用がかかり、かつ／または複雑なプロセスの必要なしに残基ごとのカップリング反応のカスタマイゼーションを可能にし得る。
Description
関連出願
本出願は、２０１５年９月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／２２０，２３２号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張しており、この仮出願の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に参考として援用される。
本出願は、２０１５年９月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／２２０，２３２号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張しており、この仮出願の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に参考として援用される。
技術分野
固相ペプチド合成を行うための方法およびシステムについて、概略的に記載する。
固相ペプチド合成を行うための方法およびシステムについて、概略的に記載する。
背景
固相ペプチド合成は、固体支持体上にペプチドを化学的に合成するのに使用されるプロセスである。固相ペプチド合成では、アミノ酸またはペプチドが、通常はＣ末端を介して固体支持体に結合される。結合されたアミノ酸またはペプチドには、カップリング反応を介して新しいアミノ酸が付加される。意図しない反応の可能性があるので、保護基が典型的には使用される。固相ペプチド合成は、化学的ペプチド合成の標準的な実施手法になっている。固相ペプチド合成の広範な有用性は、自動化固相ペプチド合成の商業的な成功によって実証されてきた。固相ペプチド合成は３０年以上にわたり使用されてきたが、個々のカップリング反応に対する高度な制御をもたらしかつ／または副反応を最小限に抑える自動化固相ペプチド合成器は、未だ開発されていない。したがって、改善されたプロセスおよびシステムが必要とされている。
固相ペプチド合成は、固体支持体上にペプチドを化学的に合成するのに使用されるプロセスである。固相ペプチド合成では、アミノ酸またはペプチドが、通常はＣ末端を介して固体支持体に結合される。結合されたアミノ酸またはペプチドには、カップリング反応を介して新しいアミノ酸が付加される。意図しない反応の可能性があるので、保護基が典型的には使用される。固相ペプチド合成は、化学的ペプチド合成の標準的な実施手法になっている。固相ペプチド合成の広範な有用性は、自動化固相ペプチド合成の商業的な成功によって実証されてきた。固相ペプチド合成は３０年以上にわたり使用されてきたが、個々のカップリング反応に対する高度な制御をもたらしかつ／または副反応を最小限に抑える自動化固相ペプチド合成器は、未だ開発されていない。したがって、改善されたプロセスおよびシステムが必要とされている。
要旨
固相ペプチド合成法および関連するシステムについて、概略的に記載する。ある特定の実施形態は、アミノ酸を活性化するためのシステムおよび方法に関する。一部の実施形態では、活性化試薬を、副反応の量を低減させ、かつ収率を増大させるように組み合わせることができる。本発明の主題は、いくつかの場合、相互に関連した生成物、特定の課題に対する代替の解決策、および／または、１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を含む。
固相ペプチド合成法および関連するシステムについて、概略的に記載する。ある特定の実施形態は、アミノ酸を活性化するためのシステムおよび方法に関する。一部の実施形態では、活性化試薬を、副反応の量を低減させ、かつ収率を増大させるように組み合わせることができる。本発明の主題は、いくつかの場合、相互に関連した生成物、特定の課題に対する代替の解決策、および／または、１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を含む。
ひと組の実施形態では、方法が提供される。一実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流を流すこと、塩基を含む第２の流体流を流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、混合領域での混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比は、反応器でのアミノ酸と塩基とのモル比の１０％以内である。
別の実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、活性化剤を含む第１の流体流を流すこと、塩基を含む第２の流体流を流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、混合領域での混合流体流中の塩基と活性化剤とのモル比は、反応器での塩基と活性化剤とのモル比の１０％以内である。
一実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流を流すこと、塩基を含む第２の流体流を流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、アミノ酸および塩基のうち少なくとも１種が反応器に最初に到達する時点から開始するある期間にわたり、混合領域での混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比は、反応器でのアミノ酸と塩基とのモル比の１０％以内である。
別の実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、活性化剤を含む第１の流体流を流すこと、塩基を含む第２の流体流を流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、塩基および活性化剤のうち少なくとも１種が反応器に最初に到達する時点から開始するある期間にわたり、混合領域での混合流体流中の塩基と活性化剤とのモル比は、反応器での塩基と活性化剤とのモル比の１０％以内である。
一実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、塩基を含む第２の流体流を混合領域に流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、前縁が反応器に進入するときに前縁で測定されるアミノ酸と塩基とのモル比は、混合領域での混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比の１０％以内である。
別の実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、活性化剤を含む第１の流体流混合領域に流すこと、塩基を含む第２の流体流を混合領域に流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。そのような実施形態では、前縁が反応器に進入するときに前縁で測定される塩基と活性化剤とのモル比は、混合領域での混合流体流中の塩基と活性化剤とのモル比の１０％以内である。
一実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流を第１の試薬リザーバから混合領域へと流し始めること、塩基を含む第２の流体流を第２の試薬リザーバから混合領域へと流し始めることであって、第１の流体流と第２の流体流とが互いに約１０ｍｓ以内に混合領域に到達するようにすること、第１および第２の流体流を混合領域で合流させて混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。
別の実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、活性化剤を含む第１の流体流を第１の試薬リザーバから混合領域へと流し始めること、塩基を含む第２の流体流を第２の試薬リザーバから混合領域へと流し始めることであって、第１の流体流と第２の流体流とが互いに約１０ｍｓ以内に混合領域に到達するようにすること、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含む。
一実施形態では、ペプチド合成システムを操作する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流および塩基を含む第２の流体流を接合部で合流させることであって混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を接合部から反応器に流すことであって、混合流体流を反応器に導入することを含み、接合部から反応器への混合流体流の滞留時間が少なくとも約０．１秒かつ約３０秒未満であり、混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比が、混合流体流の形成から混合流体流の反応器への導入まで１０％以下で変化する。
別の実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、アミノ酸を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、塩基を含む第２の流体流を混合領域に流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含み、前縁が反応器に進入するときに前縁で測定されるアミノ酸と塩基とのモル比が、前縁が反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、反応器への進入口での混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比の１０％以内である。
一実施形態では、ペプチド合成システムの操作を開始する方法は、活性化剤を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、塩基を含む第２の流体流を混合領域に流すこと、第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに混合流体流を反応器に流すことを含み、前縁が反応器に進入するときに前縁で測定される活性化剤と塩基とのモル比が、前縁が反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、反応器への進入口での混合流体流中の活性化剤と塩基とのモル比の１０％以内である。
本発明のその他の利点および新規な特徴は、添付される図面と併せて考慮すると、本発明の様々な非限定的実施形態に関する以下の詳細な記述から明らかになるであろう。本明細書および参照により組み込まれる文書が、相反するおよび／または矛盾する開示を含む場合、本明細書が優先するものとする。
本発明の非限定的な実施形態について、概略的でありかつ縮尺に合わせて描かれていないものである、添付される図面を参照しながら、例として記載する。図面中、図示される同一のまたはほぼ同一の構成要素のそれぞれは、典型的には単一の符号によって表される。明瞭にする目的で、全ての図で全ての構成要素に標識しているわけではなく、当業者が本発明を理解することを可能にするのに必ずしも図示が必要ではない場合には、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されているわけでもない。
詳細な説明
固相ペプチド合成のための方法およびシステムが提供される。固相ペプチド合成は、固体支持体上に固定化されているペプチドにアミノ酸残基が付加される、公知のプロセスである。新しいアミノ酸残基は、活性化アミノ酸と、固定化ペプチドのアミノ酸残基との間のカップリング反応を介して付加される。アミノ酸は、例えば塩基および活性化剤を使用して活性化されてもよい。本明細書に記載される、ある特定の本発明の概念は、アミノ酸を活性化するための方法およびシステムに関する。これらのシステムおよび方法は、従来の活性化技法に比べてより少ない副反応とより高い収率とを可能にし得ると共に、費用がかかり、かつ／または複雑なプロセスの必要なしに残基ごとのカップリング反応のカスタマイゼーションを可能にし得る。
固相ペプチド合成のための方法およびシステムが提供される。固相ペプチド合成は、固体支持体上に固定化されているペプチドにアミノ酸残基が付加される、公知のプロセスである。新しいアミノ酸残基は、活性化アミノ酸と、固定化ペプチドのアミノ酸残基との間のカップリング反応を介して付加される。アミノ酸は、例えば塩基および活性化剤を使用して活性化されてもよい。本明細書に記載される、ある特定の本発明の概念は、アミノ酸を活性化するための方法およびシステムに関する。これらのシステムおよび方法は、従来の活性化技法に比べてより少ない副反応とより高い収率とを可能にし得ると共に、費用がかかり、かつ／または複雑なプロセスの必要なしに残基ごとのカップリング反応のカスタマイゼーションを可能にし得る。
固相ペプチド合成法の非限定的な概略を、図１に示す。一部の実施形態では、固相合成法は固体支持体１０を利用してもよい。ペプチド１５は、各ペプチドが固体支持体上に固定化されるように結合されてもよい。例えばペプチドは、そのＣ末端２０を介して固体支持体に結合されてもよく、それによってペプチドが固定化される。ある特定の実施形態では、ペプチド１５は、例えば、保護基２５をペプチドのＮ末端３０上に含んでいてもよい。一部の実施形態では、ペプチド中のアミノ酸残基の側鎖３５は、図１に示されるような保護基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、固定化ペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、矢印４０で示されるようにＮ末端保護基の少なくとも一部を脱保護して、図１に示されるような遊離Ｎ末端４５を形成することを含む。
一部の実施形態では、遊離Ｎ末端がアミノ酸に曝されてもよく、遊離Ｎ末端の少なくとも一部がアミノ酸のＣ末端とのカップリングを受け得るようになり、その結果、矢印５０で示されるように、アミド結合が形成され、固定化ペプチドに対して新たに結合されたアミノ酸残基が付加される。ある特定の実施形態では、アミノ酸５５は、矢印７０で示されるように、遊離Ｎ末端４５に曝される前に活性化されてもよい。アミノ酸の活性化は、カップリング反応の収率が比較的高くなるように（例えば、約９８％よりも高いまたはそれに等しい）、カップリング反応を促進させてもよい。
一般に、活性化アミノ酸は、任意の適切な試薬を使用して形成されてもよい。ある特定の実施形態では、活性化アミノ酸は、図１に示されるようにかつ矢印７０で示されるように、活性化剤６０および塩基６５を使用して形成されてもよい。一部のそのような実施形態では、活性化アミノ酸は、固定化ペプチドへの曝露の前に精製されなくてもよい。そのような場合、固定化ペプチドは、その一部がペプチド合成に悪影響を及ぼし得る未反応の活性化剤、塩基、および／またはアミノ酸の少なくとも一部に曝されてもよい。例えば、未反応のウランまたはグアニジニウム活性化剤は、遊離Ｎ末端の少なくとも一部とのカップリング反応を受け、アミノ酸残基のさらなる付加を防止してもよい。したがって一部の実施形態では、活性化試薬（例えば、活性化剤、塩基、および／またはアミノ酸）の化学量論比の精密な制御が、副反応を防止しそれによって全体収率を増大させるのに必要である。
化学量論比を制御する一部の従来のシステムでは、活性化試薬を長時間混合した後に固定化ペプチドに曝し、混合物をシステム内に保存する。ある特定の実施形態では、ある特定の活性化試薬を一緒に貯蔵する結果、固定化ペプチドへの曝露の前に望ましくない副反応が生じ得る。例えば、アミノ酸を塩基と共に保存する結果、分解、重合、保護基の除去、および／またはアミノ酸のエピマー化が生じ得る。場合によっては、カップリング反応の収率および動態が悪影響を受ける。ある特定の従来のシステムは、固定化ペプチドの存在下で活性化試薬を混合することにより、この課題に対処しようと試みてきた。しかしこの方法は、より遅い反応速度、ペプチジル鎖の切断、および最終的にはより低い収率をもたらし得る。
本明細書に記載される、ある特定の本発明の方法およびシステムは、有害な副反応および／または収率（例えば、カップリング反応の、全体として）に対する望ましくない影響がほとんどまたは全くない状態で、活性化試薬の化学量論的制御を可能にする。一部の実施形態では、１種または複数の活性化試薬は、別の活性化試薬と別々に保存されてもよい。例えば、アミノ酸および／または活性化剤は、塩基と別々に保存されてもよい（例えば、試薬リザーバ内で）。反応器に到達する前であるが反応器に到達するまでの短い時間内で、２種またはそれよりも多くの活性化試薬を混合してもよく、反応器は、活性化のために所望の比を有する混合物として、２種またはそれよりも多くの活性化剤に最初に曝されるようになる。一部のそのような実施形態では、第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）を含む第１の流体流と、第２の活性化試薬（例えば、塩基）を含む第２の流体流とを、混合領域（例えば、接合部）で合流させて、前縁を有する混合流体を形成してもよく、それが反応器に流入する。いくつかのそのような場合、混合領域での２種またはそれよりも多くの活性化試薬（例えば、塩基およびアミノ酸、塩基および活性化剤）のモル比は、反応器での２種またはそれよりも多くの活性化試薬のモル比の１０％以内（例えば、５％）である。ある特定の実施形態では、第１および第２の流体流の流れは、第１の流体流の前縁および第２の流体流の前縁が互いに約１０ｍｓ以内に（例えば、実質的に同時に）到着するように、流体流の開始時に制御されてもよい。一部の実施形態では、第１および第２の流体流は、混合流体の前縁が反応器に進入するときに、混合領域での２種またはそれよりも多くの活性化試薬（例えば、塩基およびアミノ酸、塩基および活性化剤）のモル比が反応器での２種またはそれよりも多くの活性化試薬のモル比の１０％（例えば、５％）以内になるように、合流させてもよい。一部の実施形態では、個々の活性化試薬は、混合領域での合流に起因して反応器に導入されなくてもよい。
本明細書に記載されるある特定の活性化法を行うのに使用することができる、例示的なシステム８０および２００の概略図を、図２Ａおよび２Ｂに示す。本明細書に記載されるシステムおよび方法（例えば、図２Ａ中のシステム８０、図２Ｂ中のシステム２００）は、流動ベースの合成を行うことができる（多くの伝統的な固相ペプチド合成システムに用いられるバッチベースの合成とは対照的に）。一部のそのような実施形態では、流体（どのような形であれ）が反応器内の固定化ペプチドへと実質的に連続して輸送される、連続ペプチド合成を行うことができる。例えば試薬および濯ぎ流体は、ある特定の実施形態では、固定化ペプチド上に交互におよび連続的に輸送されてもよい。
例えば、一部の実施形態では、システムは、固体支持体上に固定化されたペプチドおよび／アミノ酸が入っている反応器などの槽を含んでいてもよい。例えば、図２Ａに示されるように、ペプチド８５は固体支持体９０上に固定化されていてもよい。固体支持体９０は、反応器９５などの槽内に入れられていてもよい。一部の実施形態では、図２Ａに示されるように、複数の試薬リザーバが、反応器９５の上流に位置付けられ、流体接続されていてもよい。一部の実施形態では、試薬リザーバ１００にはアミノ酸が入っている。いくつかの場合、試薬リザーバ１０５には塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）が入っている。ある特定の実施形態では、試薬リザーバ１１０には、カルボジイミド、グアニジニウム塩、ホスホニウム塩、またはウロニウム塩などの活性化剤が入っている。一部の実施形態では、システム８０は、任意選択の試薬リザーバ１２０を含んでいてもよい。いくつかの場合、試薬リザーバ１２０には、カオトロピック塩、共溶媒、および／または界面活性剤などの１種または複数の添加剤が入っていてもよい。ある特定の実施形態では、システム８０は、第２の任意選択の試薬リザーバ１２５を含有していてもよい。いくつかの場合、試薬リザーバ１２５には、ピペリジンもしくはトリフルオロ酢酸などの脱保護試薬が入っていてもよく、または例えば洗浄ステップで使用され得るジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒が入っていてもよい。
一部の実施形態では、システムは、分子間で１つまたは複数の化学反応を促進および／または容易にするよう構成された、反応器などの槽を含む。例えば、図２Ｂに示されるように、システム２００は、例えば反応速度および／または反応時間を変調させることにより、ある特定の試薬および／またはそれらの反応生成物の間の１つまたは複数の化学反応を促進および／または容易にするよう構成された反応器２０５を含んでいてもよい。例えば反応器２０５は、反応器内の流体流の温度プロファイルが制御され、その結果、１つまたは複数の温度依存反応速度を変調させて（例えば、増大させ、維持し、および／または低下させて）所望の反応速度（単数または複数）、反応生成物（単数または複数）、反応生成物（単数または複数）の量、および／または反応収率（単数または複数）を実現することができるように構成されてもよい。一部の実施形態では、図２Ｂに示されるように、複数の試薬リザーバ（例えば、２１０、２１５、２２０）が反応器２０５の上流に位置付けられ、流体接続されていてもよい。例えば、試薬リザーバ２１０（例えば、アミノ酸が入っている）、試薬リザーバ２１５（例えば、塩基が入っている）、および／または試薬リザーバ２２０（例えば、活性化剤が入っている）が、反応器２０５の上流に位置付けられ、流体接続されていてもよい。一部の実施形態では、システム２００は、反応器２０５の上流に位置付けられ、流体接続されているような、試薬リザーバ２２５（例えば、添加剤が入っている）および／または試薬リザーバ２３０（例えば、脱保護試薬が入っている）など、１つまたは複数の任意選択の試薬リザーバを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、反応器２０５は、反応器２０５の上流に位置付けられた１つまたは複数のリザーバからの試薬間、試薬の反応生成物と試薬との間、および／または試薬の反応生成物間の化学反応を促進および／または容易にするように構成されていてもよい。ある特定の実施形態では、反応器２０５は、反応器２０５の上流に位置付けられたリザーバからの２種またはそれよりも多くの試薬の間の化学反応を容易にし、かつ／または促進させてもよい。例えば、反応器２０５は、カルボキシレート形態のアミノ酸が生成されるよう、塩基（例えば、リザーバ２１５からの）によってアミノ酸（例えば、リザーバ２１０からの）の脱プロトン化を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、反応器２０５は、反応生成物と、反応器２０５の上流に位置付けられたリザーバからの試薬との反応を、促進および／または容易にしてもよい。例えば、反応器２０５は、カルボキシレート形態のアミノ酸と活性化剤との反応を、例えば反応に熱を供給することによって促進させてもよい。いくつかのそのような場合、カルボキシレート形態のアミノ酸は、反応器２０５の上流で形成され得る（例えば、混合領域でまたはその領域の付近で）。その他の場合、カルボキシレート形態のアミノ酸を反応器２０５内で形成してもよい。
一部の実施形態では、反応器２０５は、加熱ゾーン（図示せず）内にあってもよく、またはそうでない場合には熱源に連絡していてもよい。例えばシステム２００は、その内部で反応器２０５内の流体流の内容物が加熱され得る加熱ゾーン（図示せず）を含んでいてもよい。加熱ゾーンは、加熱器などの熱源を含んでいてもよい。一般に、任意の適切な加熱方法が、反応器内の流体流の温度を制御するのに使用され得る。例えば、加熱ゾーンは、液体浴（例えば、水浴）、抵抗加熱器、気体対流をベースにした加熱素子、マイクロ波加熱素子、またはエネルギーを加えることにより、もしくは化学反応に起因して熱を生成するよう設計された任意のその他の適切なデバイスを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、混合流体流は、反応器に到達する前に熱源に曝されなくてもよい。一部の実施形態では、混合流体流は、混合領域と反応器への進入口との間で熱源からの熱に曝されなくてもよい。いくつかのそのような場合、混合流体流の温度は、反応器の進入口での前縁の温度の約１０℃以内（例えば、約８℃以内、約５℃以内、約３℃以内、約２℃以内、約１℃以内）である。例えば前縁の温度は、混合領域から反応器の進入口まで約１０℃未満またはそれに等しく（例えば、約８℃未満またはそれに等しく、約５℃未満またはそれに等しく、約３℃未満またはそれに等しく、約２℃未満またはそれに等しく、約１℃未満またはそれに等しい）変化してもよい。
一部の実施形態では、システム２００は、２つまたはそれよりも多くの反応器を含んでいてもよい。例えば、図２Ｂに示されるように、システム２００は、反応器２３５の上流に反応器２０５を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、反応器２０５は、固体支持体上に固定化された複数のアミノ酸および／または固定化された複数のペプチドを含んでいなくてもよい。いくつかのそのような場合、１つまたは複数のアミノ酸残基の形成は、反応器２０５内で生じない可能性がある。いくつかの場合、試薬またはその反応生成物は、反応器２０５内で１つまたは複数の反応を受けてもよい。例えば、混合流体流中のアミノ酸および塩基が反応して、脱プロトン化アミノ酸（例えば、カルボキシレート形態のアミノ酸）を反応器２０５内で生成してもよく、ならびに／または混合流体流中のアミノ酸（例えば、カルボキシレート形態のアミノ酸）および活性化剤が反応して、活性化アミノ酸を反応器２０５内で生成してもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基の形成は、反応器２３５内で生じてもよい。一部のそのような実施形態では、反応器２３５には、固体支持体上に固定化されたペプチドおよび／またはアミノ酸が入っていてもよい。例えば、図２Ｂに示されるように、ペプチド２４０は固体支持体２４５上に固定化されてもよい。固体支持体２４５が、反応器２３５内に入っていてもよい。
一部の実施形態では、反応器２０５および反応器２３５は、図２Ｂに示されるように、直接流体連絡していてもよい（例えば、隣接、直接接続）。反応器間の直接流体連絡が有利であってもよい。例えば、反応器２０５と反応器２３５との間の直接流体連絡は、反応器２０５内の化学反応の容易化および／または促進を、流体流が反応器２３５に曝される直前に生じさせてもよい。容易化および／または促進が流体流の加熱を含む実施形態では、反応器２３５内の固定化ペプチドに曝される直前の反応器２０５内の流体流の加熱は（固定化ペプチドに、流れの内容物を輸送するよりずっと以前での流れの加熱とは対照的に）、流れの中の１種または複数の試薬（例えば、ペプチドに添加されるアミノ酸および／または脱保護試薬など）の熱分解を最小限に抑えることができる。
いくつかの場合、反応器２０５は、反応器２３５から短距離内、例えば約５メートル以内、約１メートル以内、約５０ｃｍ以内、または約１０ｃｍ以内にあってもよい。
簡略化のために単一のリザーバを図２Ａおよび２Ｂに図示しているが、単一のリザーバが図示されている図２Ａおよび２Ｂでは、単一のリザーバの代わりに複数のリザーバ（例えば、それぞれが異なるタイプのアミノ酸、異なるタイプの活性化剤、異なるタイプの塩基、異なるタイプの添加剤などを含有する）を使用できることを、理解すべきである。第１および第２の流体流は、それぞれアミノ酸および塩基を含むとして記載されるが、第１および第２の流体流は、任意の適切な活性化試薬を含んでいてもよいことを理解すべきである。例えば、本明細書に記載される第１および第２の流体流は、それぞれ活性化剤および塩基を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、固相ペプチド合成のための方法は、第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）を含む第１の流れを流し始めること、第２の活性化試薬（例えば、塩基）を含む第２の流れを流し始めること、ならびに第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成することを含んでいてもよい。混合流体流は反応器に流れてもよい。一部の実施形態では、合流させることは、２つまたはそれよりも多くの流体流の前縁を合わせおよび／または組み合わせて単一の混合流体流を形成することを含んでいてもよい。例えば、図２Ａおよび２Ｂに戻って参照すると、流れは、試薬リザーバ（例えば、１００、２１０）から始まって、第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）を含む第１の流体流（例えば、１３０、２５０）を形成してもよく、流れは、別の試薬リザーバ（例えば、１０５、２１５）から始まって、第２の活性化試薬（例えば、塩基）を含む第２の流体流（例えば、１３５、２５５）を形成してもよい。第１および第２の流れの流動は、第１の流体流の前縁が混合領域（例えば、１４０、２７０）で第２の流体流の前縁と合うように、リザーバからの流体流の開始時に制御されてもよい。ある特定の実施形態では、第１の流体流の前縁および／または第２の流体流の前縁が、互いに約１０ｍｓ以内で（例えば、実質的に同時に）混合領域に到達してもよい。いくつかのそのような場合、第１の流体流の前縁および／または第２の流体流の前縁は、混合領域で生ずる流れの合流に先立って、混合領域（例えば、１４０、２７０）の下流で個々に（即ち、非合流状態）流れない。
一部の実施形態では、第１および第２の流れの前縁が、混合領域（例えば、１４０、２７０）で互いに約１０ｍｓ以内で合うとき、またはその他の手法で到達するとき、２種またはそれよりも多くの活性化試薬のモル比（例えば、アミノ酸と塩基、塩基と活性化剤）は、アミノ酸活性化についての所望の比、ならびに／または、反応器内のアミノ酸および／もしくは固定化ペプチドの副反応を防止するための（例えば、カップリング中）所望の比と、実質的に同じであってもよい。いくつかのそのような場合、混合流体流中の第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）と第２の活性化剤（例えば、塩基）とのモル比は、２種またはそれよりも多くの活性化試薬流体流の前縁および／または僅かにずれた（例えば、約１０ｍｓ未満ずれた）前縁から反応器内への混合流体流の導入に至る混合領域で混合流体流が形成されたときに比べ、著しく変化しない（例えば、１０％以下、５％以下）。一部のそのような実施形態では、第１の活性化試薬および第２の活性化試薬（例えば、アミノ酸および塩基のうち少なくとも１種、活性化剤および塩基のうち少なくとも１種）が反応器に最初に到達したとき、混合領域での混合流体流中の第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）と第２の活性化試薬（例えば、塩基）とのモル比は、反応器での第１の活性化試薬と第２の活性化試薬とのモル比の１０％以内（例えば、５％）である。例えば、一部の実施形態では、混合流体の前縁が反応器に進入したとき、混合流体の前縁での第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）と第２の活性化試薬（例えば、塩基）とのモル比は、混合領域での混合流体の第１の活性化試薬と第２の活性化試薬とのモル比の１０％以内（例えば、５％）である。一部の実施形態では、反応器への進入口でのモル比は、前縁が反応器に進入する時間から少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒後の時点まで、約１０％未満（例えば、５％）変化してもよい。
一部の実施形態では、混合領域での混合流体流中の第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤）と第２の活性化剤（例えば、塩基）とのモル比は、２種またはそれよりも多くの活性化試薬流体流の前縁および／または僅かにずれた（例えば、約１０ｍｓ未満ずれた）前縁からその後のある時点に至る（例えば、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒後）混合領域で混合流体流が形成されたときに比べて著しく変化しない（例えば、１０％以下、５％以下）。例えば、前縁から混合領域で混合流体流が形成されたときの、混合領域での第１の活性化試薬と第２の活性化剤とのモル比は、混合流体流が形成されてから少なくとも約１０ｍｓ（例えば、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒）後の混合領域でのモル比の１０％以内（例えば、５％、２％、１％、０．５％）であってもよい。
ある特定の実施形態では、第１または第２の流体流は、別の活性化試薬を含んでいてもよい。例えば、第２の流体流は、塩基および活性化剤を含んでいてもよい。一部のそのような実施形態では、混合流体流は、塩基および活性化剤によるアミノ酸の活性化に起因して、活性化アミノ酸を含んでいてもよい。いくつかのそのような場合、混合流体流は、過剰な塩基および／または活性化剤を含まなくてもよい。
一部の実施形態では、第１または第２の流体流は、別の活性化試薬を含まなくてもよい。一部のそのような実施形態では、固相ペプチド合成のための方法は、アミノ酸を含む第１の流れを流すこと、塩基を含む第２の流れを流すこと、活性化剤を含む第３の流れを流すこと、および流体流を混合領域で合流させて、混合流体流を形成することを含んでいてもよい。混合流体流は、反応器に流れてもよい。一部のそのような実施形態では、合流させることは、３つまたはそれよりも多くの流体流の前縁（例えば、第１、第２、および第３の流体流の前縁）を合わせかつ／または組み合わせて、前縁を有する単一の混合流体流を形成することを含んでいてもよい。例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照すると、流れは、アミノ酸を含むリザーバ（例えば、１００、２１０）から始まって、第１の流れ（例えば、１３０、２５０）を形成してもよく、流れは、塩基を含む別のリザーバ（例えば、１０５、２１５）から始まって、第２の流れ（例えば、１３５、２５５）を形成してもよく、流れは、異なるリザーバ（例えば、１１０、２２０）から始まって、第３の流れ（例えば、１４５、２６０）を形成してもよい。一部の実施形態では、第３の流体流の前縁が、混合領域（例えば、１４０、２７０）で互いに約１０ｍｓ以内に合いまたは別の手法で到達したとき、活性化試薬の２つまたはそれよりも多くのモル比（例えば、アミノ酸と塩基、および／または塩基と活性化剤）は、アミノ酸活性化のための所望の比、ならびに／または、反応器内のアミノ酸および／もしくは固定化ペプチドの副反応を防止するための（例えば、カップリング中）所望の比と、実質的に同じであってもよい。いくつかのそのような場合、混合流体流中の２つまたはそれよりも多くのモル比（例えば、第１の活性化試薬と第２の活性化試薬、第１の活性化試薬と第３の活性化試薬、および／または第２の活性化試薬と第３の活性化試薬）は、３つまたはそれよりも多くの活性化試薬流体流の前縁および／または僅かにずれた（約１０ｍｓ未満ずれた）前縁から反応器内への混合流体流の導入に至る混合領域で混合流体流が形成されたときに比べ、著しく変化しない（例えば、１０％以下、５％以下）。一部のそのような実施形態では、第１の活性化試薬、第２の活性化試薬、および第３の活性化試薬のうち少なくとも１種（例えば、それらの少なくとも２種）が反応器に最初に到達したとき、混合領域での混合流体流中の第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸）と第２の活性化試薬（例えば、塩基）、第１の活性化試薬（例えば、アミノ酸）と第３の活性化試薬（例えば、活性化剤）、および／または第２の活性化試薬（例えば、塩基）と第３の活性化試薬（例えば、活性化剤）とのモル比は、反応器でのモル比（単数または複数）の１０％以内（例えば、５％）である。例えば、一部の実施形態では、混合流体の前縁が反応器に進入したとき、混合流体の前縁でのモル比（単数または複数）は、混合領域でのモル比（単数または複数）の１０％以内（例えば、５％）である。一部の実施形態では、反応器への進入口でのモル比（単数または複数）は、前縁が反応器に進入する時間から少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒後の時点まで、約１０％未満（例えば、５％）変化してもよい。
一部の実施形態では、混合領域での混合流体流中の２つまたはそれよりも多くのモル比（例えば、第１の活性化試薬と第２の活性化剤、第１の活性化試薬と第３の活性化剤、および／または第２の活性化試薬と第３の活性化剤）は、３種またはそれよりも多くの活性化試薬流体流の前縁および／または僅かにずれた（例えば、約１０ｍｓ未満ずれた）前縁からその後のある時点（例えば、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒後）に至る混合領域で混合流体流が形成されたときに比べて著しく変化しない（例えば、１０％以下、５％以下）。例えば、前縁から混合領域で混合流体流が形成されたときの、混合領域でのモル比は、混合流体流が形成されてから少なくとも約１０ｍｓ（例えば、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒）後の混合領域でのモル比の１０％以内（例えば、５％、２％、１％、０．５％）であってもよい。
ある特定の実施形態では、固相ペプチド合成のための方法は、１種または複数の添加剤を含む第４の流体流を、混合領域（例えば、接合部）で、第１、第２、および第３の流体流の１つまたは複数と合流させることであって、上記の混合流体流を形成することを含んでいてもよい。例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照すると、流れは、１種または複数の添加剤を含む任意選択のリザーバ（例えば、１２０、２２５）から始まって、第４の流体流（例えば、１５５、２６５）を形成し、混合領域（例えば、１４０、２７０）に至ってもよい。いくつかの場合、第４の流体流の前縁を、混合領域（例えば、接合部）で第１、第２、および第３の流体流の前縁と合流させてもよい。そのような場合、活性化試薬（例えば、アミノ酸、活性化剤、塩基）のモル比は、上記のように第４の流体流を添加することによって実質的に変化しなくてもよい（５％以下）。
一部の実施形態では、合流プロセス中、２つまたはそれよりも多くの流体流（例えば、第１および第２の流体流；第１、第２、および第３の流体流；第１、第２、第３、および第４の流体流、全て）の前縁が、互いに比較的短い期間内に混合領域に到達してもよい。例えば２つまたはそれよりも多くの（例えば、３つまたはそれよりも多い、４つまたはそれよりも多い）流体流が、互いに約２５ｍｓ以内、約２２ｍｓ以内、約２０ｍｓ以内、約１８ｍｓ以内、約１５ｍｓ以内、約１０ｍｓ以内、約９ｍｓ以内、約８ｍｓ以内、約７ｍｓ以内、約６ｍｓ以内、約５ｍｓ以内、または約４ｍｓ以内に混合領域に到達してもよい。一部の実施形態では、流体流が混合領域に到達するのにかかる時間は、混合領域に隣接する各活性化試薬流体流上に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器、ならびに混合領域の下流におよび隣接して位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器を使用して決定されてもよい。流体が流れ始めると、検出器は、混合領域の下流に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器で混合流体を示す信号が測定されるまで、経時的に連続測定を行う。ＵＶ−ｖｉｓ測定値から作成した吸光度対時間の曲線を、互いに重ね合わせる。流体の検出間の時間の差を使用して、２つまたはそれよりも多くの流体が混合領域に到達するまでの時間を決定する。各ＵＶ−ｖｉｓ検出器は、関連する流体流を測定するのに適切な波長に設定されることに留意すべきである。
ある特定の実施形態では、流体流が合流した後に、反応器および／または固定化ペプチドを、比較的短い時間にわたって混合流体流に曝してもよい。例えば、ある特定の実施形態では、反応器および／または固体支持体上に固定化されたペプチドは、混合流体流が形成されるように、流体流の合流後（例えば、第１および第２の流体流；第１、第２、および第３の流体流；第１、第２、第３、および第４の流体流）、約３０秒以内（または約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、約１秒以内、約０．１秒以内、または約０．０１秒以内）にわたり混合流体に曝されてもよい。一部の実施形態では、混合領域（例えば、接合部）から反応器への混合流体流の滞留時間は、少なくとも約０．１秒かつ約３０秒未満、少なくとも約０．１秒かつ約２５秒未満、少なくとも約０．１秒かつ約２０秒未満、少なくとも約０．１秒かつ約１５秒未満、少なくとも約０．１秒かつ約１０秒未満、少なくとも約１秒かつ約３０秒未満、少なくとも約１秒かつ約２５秒未満、または少なくとも約１秒かつ約１５秒未満である。本明細書で使用される滞留時間は、流体流が混合領域から反応器の進入口まで移行するのに要する合計時間を指す。
ある特定の実施形態では、流体流が合流した後であるが反応器に導入される前に、混合流体流の少なくとも一部が、混合領域（例えば、接合部）と反応器との間に位置決めされた混合器に流入してもよい。混合器は、能動的および／または受動的混合を促進させることによって、均質流体流の形成を容易にすることができる。一般に、任意の適切な混合器を使用してもよく、当業者なら能動的混合器および受動的混合器について精通しているであろう。
一部の実施形態では、混合領域での２種の活性化試薬（例えば、アミノ酸と塩基、塩基と活性化剤、アミノ酸と活性化剤）間のモル比と、反応器での同様のモル比との差、および／または、第１の時間での混合領域での２種の活性化試薬間のモル比と、後の時点（例えば、第２の時間）での混合領域での同様のモル比との差は、約１０％未満もしくはそれに等しく、約８％未満もしくはそれに等しく、約６％未満もしくはそれに等しく、約５％未満もしくはそれに等しく、約４％未満もしくはそれに等しく、約２％未満もしくはそれに等しく、約１％未満もしくはそれに等しく、約１０％未満もしくはそれに等しく、約１０％未満もしくはそれに等しく、または約０．５％未満もしくはそれに等しい。例えば、一部の実施形態では、２種の活性化試薬間のモル比（例えば、アミノ酸と塩基、塩基と活性化剤、アミノ酸と活性化剤）は、前縁からおよび／または僅かにずれた（例えば、約１０ｍｓ未満ずれた）前縁から反応器内への混合流体流の導入に至る混合領域で、かつ／または混合領域の第１の時点から混合領域の後の時点まで混合流体流が形成されたときから、１０％以下（例えば、８％以下、６％以下、５％以下、４％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下）変化する。
一部の実施形態では、反応器への進入口でのモル比は、前縁が反応器に進入したときから、少なくとも約１０ｍｓ、少なくとも約１５ｍｓ、少なくとも約２５ｍｓ、少なくとも約５０ｍｓ、少なくとも約７５ｍｓ、少なくとも約１００ｍｓ、または少なくとも約１秒後の時点まで、約１０％未満もしくはそれに等しく、約８％未満もしくはそれに等しく、約６％未満もしくはそれに等しく、約５％未満もしくはそれに等しく、約４％未満もしくはそれに等しく、約２％未満もしくはそれに等しく、約１％未満もしくはそれに等しく、約１０％未満もしくはそれに等しく、約１０％未満もしくはそれに等しく、または約０．５％未満もしくはそれに等しく変化してもよい。
２つの値間の差のパーセンテージを計算するとき（本明細書で他に指示しない限り）、パーセンテージの計算は、基本的にその大きさがより大きい値を使用して行われる。例示すると、第１の値がＶ１であり第２の値がＶ２（Ｖ１よりも大きい）である場合、Ｖ１とＶ２と間の差のパーセンテージ（Ｖ％Ｄｉｆｆ）は
として計算され得る。
第１および第２の値は、Ｖ％ＤｉｆｆがＸ％未満である場合、互いにＸ％以内にあると言うことができる。第１および第２の値は、Ｖ％ＤｉｆｆがＸ％またはそれよりも大きい場合、少なくともＸ％異なると言うことができる。
一部の実施形態では、ある活性化試薬と別の活性化試薬とのモル比（例えば、塩基と活性化剤、アミノ酸と塩基、アミノ酸と活性化剤）は、少なくとも約１：０．７かつ約２：１未満であってもよい。例えば、第１の活性化試薬と第２の活性化試薬とのモル比（例えば、アミノ酸と塩基、塩基と活性化剤、活性化剤と塩基）は、少なくとも約１：０．７かつ約２：１未満（例えば、少なくとも約１：０．８かつ約２：１未満、少なくとも約１：０．９かつ約２：１未満、少なくとも約１：１かつ約２：１未満、少なくとも約１：０．７かつ約１．９：１未満、少なくとも約１：０．７かつ約１．８：１未満、少なくとも約１：０．７かつ約１．６：１未満、少なくとも約１：０．７かつ約１．５：１未満、少なくとも約１：０．７かつ約１．４：１未満、約１：０．７から約１．２：１の間、約１：０．７から約１：１の間）であってもよい。一部の実施形態では、第１の活性化試薬（例えば、活性化剤）と第２の活性化試薬（例えば、塩基）とのモル比は、少なくとも１：１であってもよい。一部の実施形態では、モル比は、混合試薬に隣接して各活性化試薬流体流上に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器、混合領域の下流に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器、および反応器の進入口に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器を使用して決定されてもよい。流体が流れ始めると、検出器は、混合流を示す信号が混合領域の下流におよび隣接して位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器で測定されるまで、連続測定を行う。混合流体を示す信号が、混合領域の下流に位置決めされたＵＶ−ｖｉｓ検出器で測定された場合、ＵＶ−ｖｉｓ測定は、混合流体流中の各流体の濃度を決定するのに必要な波長で２５ｍｓごとに行われる。ＵＶ−ｖｉｓ測定値から作成した吸光度対時間の曲線を、互いに重ね合わせる。それぞれ関連する場所での各活性化試薬の濃度を、曲線から決定する。
一般に、流れは、当業者に公知の任意の適切な技法を使用して合流させてもよい。一部の実施形態では、流れは、流体流（例えば、第１、第２、第３、および／または第４）を実質的に同時に流して単一の流れにすることにより（例えば、流れが内部を流れるチャネルを合流させることによって）、合流させてもよい。例えば、図２Ａおよび２Ｂを参照すると、任意選択の流量制御器（例えば、ポンプ）１０１、１０２、１０３、１０４、２０１、２０２、２０３、および２０４を使用して、それぞれ流体流１３０、１３５、１４５、１５５、２５０、２５５、２６０、および２６５の流量および到達時間を制御してもよい。流れ制御器の少なくとも一部は、本明細書に記載されるように合流が可能になるよう構成されてもよい。そのような場合、ポンプは、揚程の死容積と上流のフルイディクスとが実質的に同じ（例えば、同一）であるように構成されてもよい。いくつかの場合、図２Ａおよび２Ｂの１３０、１３５、１４５、２５０、２５５、または２６０の長さを、内容積の差を補正するように調節してもよい。次いでポンプを、互いにある特定の時限内で始動させる（例えば、約１００ｍｓ以内、約８０ｍｓ以内、約６０ｍｓ以内、約５０ｍｓ以内、約４０ｍｓ以内、約２５ｍｓ以内、約１０ｍｓ以内、約５ｍｓ以内）。２つまたはそれよりも多くのポンプを、そのような手法で一緒に連結してもよい。
本明細書に記載されるように、アミノ酸活性化のための方法およびシステムは、以下により詳細に記載される固相ペプチド合成で使用してもよい。一般に、固相ペプチド合成は、脱保護反応、カップリング反応、任意選択の試薬除去（例えば、洗浄）ステップを含むアミノ酸付加サイクルを繰り返すことを含む。一部の実施形態では、活性化試薬流の合流を、固相ペプチド合成の以下により詳細に記載されるような１つまたは複数のアミノ酸付加サイクルで使用してもよい。例えば、アミノ酸を含む第１の流体流および塩基を含む第２の流体流を合流させて、活性化アミノ酸を、固体支持体上に固定化されたペプチドに曝す前の約３０秒以内に、混合流体流を形成してもよい。固相ペプチド合成中に１よりも多くのアミノ酸付加サイクルが行われる一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸付加サイクル（例えば、第１および第２のアミノ酸付加サイクル）が、アミノ酸を含む第１の流体流と塩基を含む第２の流体流とを合流させて、固体支持体にアミノ酸を曝す前の約３０秒以内に混合流体流を形成することを含んでいてもよい。
例示的なアミノ酸付加サイクルおよびペプチド合成について、ここでより詳細に記載する。一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、脱保護試薬を固定化ペプチドに曝して、保護基の少なくとも一部を固定化ペプチドの少なくとも一部から除去することを含む。脱保護試薬曝露ステップは、ある特定の実施形態では、Ｎ末端保護基が除去されながら側鎖保護基が保存されるように構成することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドを保護するのに使用される保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む。一部のそのような実施形態では、ピペリジンを含む脱保護試薬（例えば、ピペリジン溶液）を固定化ペプチドに曝して、Ｆｍｏｃ保護基が固定化ペプチドの少なくとも一部から除去されるようにしてもよい。一部の実施形態では、ペプチドを保護するのに使用される保護基は、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。一部のそのような実施形態では、トリフルオロ酢酸を含む脱保護試薬を固定化ペプチドに曝して、Ｂｏｃ保護基が固定化ペプチドの少なくとも一部から除去されるようにしてもよい。いくつかの場合、保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、即ち、Ｂｏｃ）をペプチドのＮ末端に結合してもよい。
一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、脱保護試薬の少なくとも一部を除去することを含む。一部の実施形態では、脱保護ステップ中に形成されていてもよい任意の反応副生成物（例えば、除去された保護基）の少なくとも一部を除去することができる。いくつかの場合、脱保護試薬（ある特定の実施形態では、副生成物）は、ペプチド、固体支持体、および／または周囲の領域を、例えば任意選択のリザーバ１２５内に保存された流体（例えば、水性または非水性溶媒、超臨界流体、および／または同様のものなどの液体）で洗浄することによって除去されてもよい。いくつかの場合、脱保護試薬および反応副生成物の除去は、後続のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することによって）。ある特定の実施形態では、後続のステップの性能は、脱保護試薬および／または反応副生成物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。いくつかのそのような場合、除去ステップは任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態では、除去ステップは、削減（例えば、除去ステップの時間の削減、除去ステップで使用される溶媒の量の低減）および／または除外してもよい。１つまたは複数の除去ステップの削減は、全サイクル時間を削減することができる。任意選択の除去ステップが削減されまたは除外された場合、付加サイクル中の後続のステップは、例えばシステム内の流体流に起因して、脱保護試薬および／または反応生成物の少なくとも一部を除去する役割を果たし得ることを、理解すべきである。
固定化ペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、ある特定の実施形態では、活性化アミノ酸を固定化ペプチドに曝して、活性化アミノ酸の少なくとも一部が固定化ペプチドに結合されることにより新たに結合されたアミノ酸残基が形成されるようにすることを含む。例えば、ペプチドを、ペプチドの脱保護Ｎ末端と反応する活性化アミノ酸に曝してもよい。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、以下により詳細に論じるように、アミノ酸含有流と活性化剤流とを混合することにより、脱保護ペプチドとの反応に向けて活性化することができる。いくつかの場合、アミノ酸の付加によって保護Ｎ末端を持つ固定化ペプチドが得られるように、活性化アミノ酸のアミン基を保護してもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、固定化ペプチドの脱保護側鎖と反応する活性化アミノ酸に曝されてもよい。
一部の実施形態では、アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加するプロセスは、固定化ペプチドに結合しない活性化アミノ酸の少なくとも一部を除去することを含む。一部の実施形態では、活性化アミノ酸曝露ステップ中に形成され得る反応副生成物の少なくとも一部を、除去してもよい。いくつかの場合、活性化アミノ酸および副生成物は、例えば任意選択のリザーバ１２５内に保存された流体（例えば、水性または非水性溶媒、超臨界流体、および／または同様のものなどの液体）で、ペプチド、固体支持体、および／または周囲の領域を洗浄することによって除去されてもよい。いくつかの場合、活性化アミノ酸および反応副生成物の少なくとも一部を除去することにより、後続のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することによって）。ある特定の実施形態では、後続のステップの性能は、活性化アミノ酸および／または反応副生成物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。いくつかのそのような場合、除去ステップは任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態では、除去ステップは、削減（例えば、除去ステップの時間の削減、除去ステップで使用される溶媒の量の低減）および／または除外してもよい。１つまたは複数の除去ステップの削減または除外は、全体のサイクル時間を削減してもよい。任意選択の除去ステップが削減されまたは除外された場合、付加サイクル中の後続のステップは、例えばシステム内の流体流に起因して、活性化アミノ酸および／または反応副生成物の少なくとも一部を除去する役割を果たし得ることを、理解すべきである。
上記言及されたステップは例示的であり、アミノ酸付加サイクルは、上記言及されたステップの全てを必ずしも含む必要はないことを、理解すべきである。例えばアミノ酸付加サイクルは、脱保護試薬除去ステップおよび／または活性化アミノ酸除去ステップを含まなくてもよい。一般に、アミノ酸付加サイクルは、ペプチドへのアミノ酸残基の付加をもたらす任意の一連のステップを含む。
ある特定の実施形態では、アミノ酸付加ステップ中、アミノ酸を付加する結果、単一の付加アミノ酸残基を組み込んだペプチドを得ることができる（即ち、単一のアミノ酸残基は、付加ステップ後に所与のペプチドが単一の付加アミノ酸残基を含むように、固定化ペプチドに付加することができる）。一部のそのような実施形態では、後続のアミノ酸付加ステップは、所望のペプチドが合成されるまでアミノ酸残基を個々に付加することによってペプチドを構築するのに使用することができる。一部の実施形態では、１つよりも多くのアミノ酸残基（例えば、ペプチドの形態の）を、固体支持体上に固定化されたペプチドに付加してもよい（即ち、複数のアミノ酸残基を含むペプチドを、所与の固定化ペプチドに付加することができる）。固定化ペプチドへのペプチドの付加は、当業者に公知のプロセス（例えば、フラグメント縮合、化学ライゲーション）を通して実現することができる。即ち、アミノ酸付加ステップ中、固定化ペプチドへのアミノ酸の付加は、単一アミノ酸残基を固定化ペプチドに付加すること、または複数のアミノ酸残基（例えば、ペプチドとして）を固定化ペプチドに付加することを含むことができる。
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸付加ステップ（および／または後続のアミノ酸付加ステップ）は、比較的高い収率でアミノ酸を付加してもよい。例えば、ある特定の実施形態は、アミノ酸残基が固定化ペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％に付加されるように、アミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸残基が固定化ペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％に付加されるように、アミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含んでいてもよい第２の（一部の実施形態では、第３、第４、第５、および／または後続の）アミノ酸付加サイクルを行うことができる。ある特定の実施形態では、本発明のプロセスの使用およびシステムは、高い反応収率を維持しながら、固定化ペプチドへの１つよりも多くのアミノ酸の付加を比較的迅速に（上記開示されたまたは本明細書のその他の箇所に開示された時間範囲のいずれか以内を含む）行うことが可能になるようにしてもよい。
ある特定の実施形態では、二重の組込みをほとんどまたは全く行わずに、１つまたは複数のアミノ酸付加ステップを行うことができる（即ち、単一付加ステップ中に所望のアミノ酸（例えば、単一のアミノ酸残基またはペプチド）の複数の複製物を付加する）。例えば、ある特定の実施形態では、所望のアミノ酸の複数の複製物を、第１（および／または第２、第３、第４、第５、および／または後続）のアミノ酸付加ステップ中に、固定化ペプチドの約１％よりも少ない（または約０．１％よりも少ない、約０．０１％よりも少ない、約０．００１％よりも少ない、約０．０００１％よりも少ない、約０．００００１％よりも少ない、または実質的にない）程度まで結合させる。
一部の実施形態では、複数のアミノ酸付加サイクルを行うことができる。複数のアミノ酸付加サイクルを行うことにより、ペプチドに付加された１つよりも多くの単一アミノ酸残基（または１つよりも多くのペプチド、ならびに／または少なくとも１つの単一アミノ酸残基、および少なくとも１つのペプチド）を得ることができる。ある特定の実施形態では、１つよりも多くのアミノ酸を固定化ペプチドに付加するためのプロセスは、第１のアミノ酸付加サイクルを行って第１のアミノ酸を付加すること、および第２のアミノ酸付加サイクルを行って第２のアミノ酸を付加することを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、第３、第４、第５、および後続のアミノ酸付加サイクルを行って、任意の所望の長さの固定化ペプチドを生成してもよい。一部の実施形態では、少なくとも約１０のアミノ酸付加サイクル、少なくとも約５０のアミノ酸付加サイクル、または少なくとも約１００のアミノ酸付加サイクルを行い、その結果、固定化ペプチドに、少なくとも約１０個のアミノ酸残基、少なくとも約５０個のアミノ酸残基、または少なくとも約１００個のアミノ酸残基が付加される。ある特定のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を高収率（例えば、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、または実質的に１００％）で行うことができる。一部のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を、例えば上記指定されたまたは本明細書のその他の箇所に指定された時間範囲のいずれか以内で迅速に行うことができる。一部のそのような実施形態では、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、そのようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を、限られた状態または二重の組込みがない状態で、例えば上記指定されたまたは本明細書のその他の箇所に指定された二重組込み範囲のいずれか内で行うことができる。
一部の実施形態では、固相ペプチド合成は、反応器に到達する前であるが反応器に到達するまでの短い時間内で流れを加熱することを含んでいてもよい。反応器に加熱流を供給することにより、反応器内で引き起こされるプロセスの動態を変化させてもよい。例えば、固定化ペプチド、固体支持体、またはその他の合成成分を加熱流に曝すことにより、アミノ酸付加プロセスの反応速度および／または拡散速度を変化させてもよい。例えば、活性化アミノ酸を含む加熱流にペプチドを曝すことにより、アミノ酸がペプチドに付加される速度が増大してもよい。一部の実施形態では、反応器に到着する前であるが反応器に到達するまでの短い時間内で流れを加熱することにより、補助熱（即ち、１つまたは複数の予熱流からのものではない熱）を反応器に供給する必要性が実質的に低減または除外されてもよい。いくつかの場合、反応器に供給される熱のほとんどまたは実質的に全ては、予熱流由来である。例えば一部の実施形態では、予熱流（単数または複数）由来の、反応器を加熱するのに使用される熱エネルギーのパーセンテージは、約５０％よりも大きいまたはそれに等しく、約６０％よりも大きいまたはそれに等しく、約７０％よりも大きいまたはそれに等しく、約８０％よりも大きいまたはそれに等しく、約９０％よりも大きいまたはそれに等しく、約９５％よりも大きいまたはそれに等しく、あるいは約９９％よりも大きいまたはそれに等しくてもよい。一部のそのような実施形態では、このようにシステムを加熱することにより、反応器、固定化ペプチド、固体支持体、活性化アミノ酸、脱保護試薬、洗浄流体、および／またはその他の合成成分を、所望の反応温度まで加熱するのに必要な時間を削減することができる。
一部の実施形態では、アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスは、活性化アミノ酸の温度が少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）上昇するように、活性化アミノ酸を含む流れを加熱し、その後、加熱されたアミノ酸を固定化ペプチドに曝すことを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、任意のその他の成分（例えば、洗浄剤、脱保護剤、または任意のその他の成分）を含む流れは、流れの内容物の温度が少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）上昇するように加熱し、その後、流れの内容物を固定化ペプチドに曝してもよい。いくつかの場合、加熱ステップ（例えば、固定化ペプチドに輸送される流れの中の活性化アミノ酸および／または任意のその他の成分の加熱）は、流れの内容物（例えば、加熱された活性化アミノ酸）を固定化ペプチドに曝してから約３０秒以内（または約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、約１秒以内、約０．１秒以内、または約０．０１秒以内）に行ってもよい。一部のそのような実施形態では、そのような加熱は、固定化ペプチドの上流の位置を加熱することによって実現されてもよい。一部のそのような実施形態では、アミノ酸の加熱は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す少なくとも約０．１秒前、少なくとも約１秒前、少なくとも約５秒前、または少なくとも約１０秒前に開始する。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す少なくとも約０．１秒前、少なくとも約１秒前、少なくとも約５秒前、または少なくとも約１０秒前に、少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃、および／または約１００℃未満もしくはそれに等しく、および／または約７５℃未満もしくはそれに等しく）加熱される。
一部の実施形態では、アミノ酸の加熱、ならびにアミノ酸と塩基および／または活性化剤との合流は、共に、アミノ酸が固定化ペプチドに接触する前および接触してから比較的短い時間内に行うことができる。アミノ酸の加熱は、流れを合流させる前、最中、および／または後に行ってもよい。
一般に、当業者に公知の任意の保護基を使用することができる。保護基（例えば、ｎ末端保護基）の非限定的な例には、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、カルボキシベンジル、および光解離性保護基が含まれる。ある特定の実施形態では、固定化ペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む。一部の実施形態では、固定化ペプチドは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む。
本明細書に記載されるように、塩基は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す前に、アミノ酸を活性化するのにまたは活性化を完了するのに使用されてもよい。任意の適切な塩基を使用してもよい。ある特定の実施形態では、塩基はルイス塩基である。一部の実施形態では、塩基は、保護されたペプチドに対して非反応性でありまたは保護されたペプチドとゆっくり反応して保護基を除去する、トリイソプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ある特定の第３級アミン、またはコリジンなどの非求核塩基である。一般に、塩基は、アミノ酸からカルボン酸への脱プロトン化を可能にするのに十分なｐＫａを有していてもよい。
他に記載されるように、活性化剤は、カップリング反応およびアミド結合の形成が容易になるように、アミノ酸のＣ末端と結合を形成するのに使用されてもよい。活性化剤は、アミノ酸を固定化ペプチドに曝す前に活性化アミノ酸を形成するのに使用されてもよい。任意の適切な活性化剤を使用してもよい。一部の実施形態では、活性化剤は、カルボジイミド、グアニジニウム塩、ホスホニウム塩、およびウロニウム塩からなる群から選択される。活性化剤は、一部の実施形態では、カルボジイミド、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および同様のものを含む。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ウロニウム活性化剤、例えばＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）；２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）；１−［（１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）；および同様のものを含む。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ホスホニウム活性化剤、例えば（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）を含む。
他に記載されるように、ペプチドは固体支持体上に固定化されてもよい。一般に、任意の固体支持体は、本明細書に記載される付加サイクルのいずれかと共に使用してもよい。固体支持材料の非限定的な例には、ポリスチレン（例えば、微孔質ポリスチレン樹脂、メソ多孔質ポリスチレン樹脂、マクロ多孔質ポリスチレン樹脂などの樹脂形態の）、ガラス、多糖（例えば、セルロース、アガロース）、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール、またはコポリマー樹脂（例えば、ポリエチレングリコール、ポリスチレンなどを含む）が含まれる。
固体支持体は、任意の適切な形状因子を有していてもよい。例えば固体支持体は、ビーズ、粒子、繊維の形態、または任意のその他の適切な形状因子にあるものとすることができる。
一部の実施形態では、固体支持体は多孔質であってもよい。例えば一部の実施形態では、マクロ多孔質材料（例えば、マクロ多孔質ポリスチレン樹脂）、メソ多孔質材料、および／または微孔質材料（例えば、微孔質ポリスチレン樹脂）を固体支持体として用いてもよい。「マクロ多孔質」、「メソ多孔質」、および「微孔質」という用語は、ペプチド合成用の固体支持体に関連して使用される場合には当業者に公知であり、本明細書では、the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Compendium of Chemical Terminology、２．３．２版、２０１２年８月１９日（「Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ」として非公式に公知である）におけるそれらの記載と矛盾のない状態で使用される。一般に微孔質材料は、約２ナノメートル未満の断面直径を持つ細孔を有するものを含む。メソ多孔質材料は、約２ナノメートルから約５０ナノメートルの断面直径を持つ細孔を有するものを含む。マクロ多孔質材料は、約５０ナノメートルよりも大きくかつ１マイクロメートル程度の大きさの断面直径を持つ細孔を有するものを含む。
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、当技術分野における通常の意味を有し、慣用的な水の損失がある状態で、一方のカルボニル炭素から別の窒素原子への共有結合の形成によって２個またはそれよりも多くのアミノカルボン酸分子（同じまたは異なる）から誘導されたアミドを指してもよい。「アミノ酸残基」も、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ペプチド、別のアミノ酸、またはアミノ酸残基と組み合わされた後のアミノ酸の組成物（単一のアミノ酸としてまたはペプチドの部分として）を指す。一般に、アミノ酸が別のアミノ酸またはアミノ酸残基と組み合わされると水が除去され、アミノ酸の残りをアミノ酸残基と呼ぶ。「アミノ酸」という用語も、当技術分野におけるその通常の意味を有し、タンパク新生および非タンパク新生アミノ酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アミノ酸は、カルボキシレート形態であってもよい。一部の実施形態では、アミノ酸はカルボン酸形態であってもよい。
本明細書で使用される「保護基」という用語には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。保護基は、保護基によって保護された基が反応するのを防止しまたはその他の手法で阻止するように、分子（例えば、ペプチド）内の反応性基（即ち、保護された基）に付着したまたは付着するように構成された化学的部分を含む。保護は、保護基を分子に付着することによって生じてもよい。脱保護は、例えば保護基を除去する化学変換によって、保護基が分子から除去されるときに生じてもよい。
下記の実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示することを意図するものであり、本発明の全範囲を例示するものではない。
（実施例１）
図３に示されるデバイスは、流体流が１点で合流する流体マニホールドの下流に接続された３つのポンプを含む。３つのポンプの１つは、多くのリザーバの１つからアミノ酸を選択するためのマニホールドの上流に接続した。第２のポンプは、多くのリザーバの１つから活性化剤を選択するためのマニホールドの上流に接続される。第３のポンプは、塩基を含有するリザーバ、または多くのリザーバの１つから塩基を選択するためのマニホールドの上流に接続した。
図３に示されるデバイスは、流体流が１点で合流する流体マニホールドの下流に接続された３つのポンプを含む。３つのポンプの１つは、多くのリザーバの１つからアミノ酸を選択するためのマニホールドの上流に接続した。第２のポンプは、多くのリザーバの１つから活性化剤を選択するためのマニホールドの上流に接続される。第３のポンプは、塩基を含有するリザーバ、または多くのリザーバの１つから塩基を選択するためのマニホールドの上流に接続した。
後続の実施例に記載されるカップリングステップを行うには、所望の活性化剤、アミノ酸、および塩基を選択するように弁を切り換えた。次いでポンプを作動させて、３つの流体流の前縁が同時に合流点で合うようにする。このポンピングサイクルは、オペレータまたはソフトウェアが、カップリングを停止させて弁を洗浄溶媒に交換しようとする時点まで継続した。次いでポンプを作動させて、流体流の後縁が一致するようにした。
（実施例２）
（実施例２）
この実施例は、実施例１に記載される合流技法を使用したペプチド合成と、従来の方法を使用したペプチド合成とについて記載する。
簡単に言うと、図３Ｂに示される配列、ＥＥＴＩ−ＩＩは、実施例１の活性化法を使用して合成した。対照として、流体流の先端が同時に合流しない方法を使用して、同じペプチドを合成した。どちらのペプチドも、ＨＢＴＵを、７０℃で、２０ｍＬ／分の合計流量で用いて、標準の合成パラメータを使用して合成した。
対照合成において、流体流中の活性化剤の比は、実質的に同時の合流が生じなかったので所望の比（単数または複数）であり、図３Ｂ（前）に示される粗製ペプチドのＬＣ−ＭＳの軌跡には、有意な切断部が観察された。切断部は、反応器に導入された未反応の活性化剤のスラッグに該当した。図３Ｃに示されるように、活性化試薬が、別の活性化試薬の前に混合領域に到達した場合、活性化試薬のモル比は流体流中で変わる。流体流の濃度プロファイルを、実施例１に記載された方法を使用して一致させた後、粗製ペプチドは切断部を持たず、図３Ｂ（後）に示されるように、さらにより容易に精製された。
（実施例３）
（実施例３）
この実施例は、アミノ酸を活性化させるための、流体流の実質的に同時の合流に対するポンプタイピングの影響について記載する。ポンプタイミングの不整合は、副反応をもたらした。
簡単に言うと、ペプチドＡＣＰは、ポンプタイミングが不整合である固相ペプチド合成器を使用して流量を変えることにより合成し、したがって活性化試薬は同時に接合部に到達しなかった。ポンプタイピングの不整合により、試薬流の差は、高い流量でより誇張されるようになる。このことは、図４Ａの矢印で示される切断生成物、（ＴＭＧ）−ＡＡＩＤＹＩＮＧの存在によって具体化された。切断部は、非混合活性化剤と固定化ペプチドとの間のカップリングの結果であった。流量が増大するにつれ、得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける切断生成物の割合が増大したが、欠失副生成物は比較的一定のままである。
（実施例４）
（実施例４）
この実施例は、実施例１に記載された合流技法を使用するペプチド合成について記載する。
アミド結合形成反応は、治療剤の小分子、ペプチド、およびタンパク質の合成で広く用いられている。１２８種の最近調査された小分子薬候補の中で、６５％はアミドの形成が必要であった。小分子に加え、糖尿病治療のためのＧＬＰ−１アゴニストを含めたペプチドは、最大で４０のアミド結合の形成を必要とする。がん治療の最前線である個別化されたペプチドワクチンは、各患者ごとのカスタム合成を必要とする。しかし、これらのペプチドの研究、開発、および生産は、合成速度により制限され、典型的には各アミノ酸付加および脱保護サイクルに数分から数時間かかる。この実施例において、本発明者らは、７秒でのアミド結合の形成による、固相ポリペプチド合成に対する完全に自動化された流動化学手法について報告し、４０秒での完全サイクル時間について記載する。粗製ペプチドの品質および単離された収率は、標準のバッチ式固相ペプチド合成と同等であった。フル操業で、この機械は、年当たり２５，０００個の３０量体個別ペプチドを合成することができ、その重量は合わせて２５キログラムであった。
ペプチドおよびタンパク質は、新しい治療剤の探索に重要である。基礎を支えるペプチドおよびタンパク質の研究は、新しい機能的変種を設計しかつこれらの設計を迅速に繰り返す必要性である。ペプチドの生物学的発現は、速くすることができかつ規模を縮小拡大することができ−リボソームは、秒当たり１５のペプチド結合の速さでペプチドを合成する−しかし２０の天然に生ずるアミノ酸以外では難しくなる。一方、増大した数のモノマーにも関わらず、化学的ペプチド合成は比較的遅いままである。この実施例では、リボソームの速度に近付く化学合成の柔軟性を持つ方法である、自動化流動ペプチド合成（Automated Flow Peptide Synthesis：ＡＦＰＳ）について記載する。ＡＦＰＳは、アミド結合形成ステップを７秒まで低減させ、各アミノ酸付加に関する全サイクルを４０秒まで低減させ、それと共に化学的性質の高レベルの制御を維持する。ＵＶモニタリングおよび使い捨て反応器によって、収率の定量と高速自動化切換えが可能になる。
自動化流動ペプチド合成器は、図５Ａ〜５Ｂに示される５つのモジュールからなる。カップリング反応中、機械は、試薬を貯蔵モジュールから引き出し、次いで所望のアミノ酸を、アミン塩基（ジイソプロピルエチルアミン、ＤＩＥＡ）および活性化剤（例えば、ＨＡＴＵまたはＰｙＡＯＰ）と、混合モジュール内で混合する。この混合物は、活性化モジュール、電気的に加熱されたプラグ流反応器であって、９０℃まで迅速に加熱される反応器内を流れる。活性化の２秒以内に、活性化アミノ酸はカップリングモジュール、ペプチド合成樹脂の充填床内を流れ、そこでアミド結合の形成が７秒以内に完了する。樹脂は、容易に除去されるように６ｍＬの使い捨てシリンジカートリッジに収容される。ＡＦＰＳは、時間の関数として反応器流出物の吸光度を記録することにより、各サイクルごとにＦｍｏｃ除去をモニタリングする。Ｆｍｏｃ除去吸光度クロマトグラムにより、脱保護効率、カップリング収率、およびペプチジル樹脂内を通る材料流束の速さを推論することが可能になり、これにより樹脂上ペプチド凝集の特定が可能になる。
ＡＦＰＳは、図５Ｄに示されるように、試験ペプチドＡＬＦＡＬＦＡおよびアシル担体タンパク質の断片（ＡＣＰ６５〜７４）を合成することによって最初に検証した。これらのペプチドを、高収率で、副生成物が低レベルの状態で合成した。次いで比較研究を、図６Ａ〜６Ｂに示されるように、ＡＦＰＳ、バッチ合成、および信頼の置けるカスタムペプチドベンダーによって生成された、より長いペプチドの間で行った。標準のバッチ法に比べ、高温での高速連続流活性化を使用したペプチド合成では、長いポリペプチドの同等のまたはより高い品質の合成を僅かな時間で可能にした。さらに、図６Ｃに示されるように、プロセス内ＵＶモニタリングは、各ステップの合成収率に関する情報を与えた。インスリンＢ鎖に関して観察されたピーク面積の定常的な減少は、連鎖停止副反応から得られた。これらの副生成物は、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおける主ピークの周囲の一連の不純物として現れた。
次いで高温流活性化によるＣｙｓおよびＨｉｓのエピマー化を評価した。活性化されると、ＣｙｓおよびＨｉｓは、Ｃα位で立体化学的性質を失う可能性がある。この問題は、特に高温でのバッチ合成技法を複雑にするが、それは活性化、カップリング、および分解の全てが同じ槽内で同時に起こるからである。バッチ式マイクロ波合成器では、ＨＢＴＵおよびＤＩＥＡを用いたマイクロ波照射の下での９０℃で１．５分間にわたるＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）のカップリングによって、望ましくないＤ−Ｃｙｓ生成物１６．７％が形成されることが見出された。対照的に、連続流では、図７Ａに示されるシステムの加熱ゾーン内での時間の長さによって、活性化プロセスが制御可能になることが見出された。これを探るため、そのジアステレオマーを分離することができかつＬＣ−ＭＳにより定量することができる２つのモデルペプチドＦＨＬおよびＧＣＦを使用した。流量を増大させることにより、したがって活性化Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）の温度での滞留時間を低減させることにより、ジアステレオマー形成は、ＡＦＰＳ法Ｂに関して、ＦＨＬでは０．５％におよびＧＣＦでは３％に限定された。このレベルのジアステレオマー形成は、最適化された室温バッチ合成プロトコールに一致する。
この実施例に記載される方法は、手動式流動合成、熱加速式バッチ合成、およびその他の連続流ペプチド合成法に勝る、数多くの利点を提供する。第１に、様々なものを巧く組み合わせた（mix-and-match）フォーマットでの混合およびアミノ酸の加熱、混合、および活性化の全プロセスの自動化は、残基ごとに化学的性質を調整する無限の可能性をもたらす。第２に、精密なポンプおよび弁の動作によるこれらの試薬のライン内混合によって、化学量論、滞留時間、およびアミノ酸エピマー化の制御が可能になり、合成の再現性を非常に高くする。
図５Ａは、自動化流動固相合成器の写真を示し、異なるシステムモジュールおよびプロセス流れ図を強調している。アミノ酸、活性化剤、およびＤＩＥＡは、３つのＨＰＬＣポンプによって一緒に合流する。一連の多位置弁は、アミノ酸および活性化剤の選択を制御する。アミノ酸活性化は、カラム切換え弁の位置によって決定されるいくつかの加熱された流路の１つを通る流れにより、引き起こされる。次いで活性化アミノ酸は、加熱されたジャケットにより覆われた６ｍＬのフリットポリプロピレンシリンジに収容されたペプチジル樹脂２００ｍｇを含有する樹脂床上を流れる。廃棄流出物はＵＶ−可視分光計を通過し、次いで廃棄される。図５Ｂは、各ステップの持続時間、混合後の各ステップ中の溶液組成、および各ステップで使用される試薬の合計体積を示す、サイクル図を示す。図５Ｃは、４４％の単離収率で合成された、方法Ｂを使用するアシル担体タンパク質（６５〜７４）合成の粗製生成物についての、ＬＣ−ＭＳデータを示す。この合成では、出発ペプチジル樹脂２００ｍｇは、乾燥樹脂３１４ｍｇをもたらした。この研究の全体を通して、単離された粗製ペプチドの収率は、樹脂の名目上の負荷をベースにする。図５Ｄは、１つのカップリングおよび脱保護サイクルについてのＵＶ吸光度データの例を示す。
図６Ａは、異なる方法を介して合成された成長ホルモン放出ホルモンの、ＬＣ−ＭＳデータを示す。成長ホルモン放出ホルモンを、（ｉ）方法Ａにより４０分で、５８％の単離収率で合成し、（ｉｉ）手動式バッチ技法を使用した３０時間での、６０％の単離収率と比較した。このペプチドはまた、６週間のリードタイムで２つのベンダー（ｉｉｉ、ｉｖ）から購入した。これらペプチジル樹脂のそれぞれの２００ｍｇの切断は、自動化および手動合成と同等の量の、７６ｍｇおよび９０ｍｇをもたらした。図６Ｂは、異なる方法を使用して合成されたインスリンＢ鎖についてのＬＣ−ＭＳデータを示す。インスリンＢ鎖は、方法Ｂを使用して２０分で、５３％の単離収率で合成し、手動式バッチ技法による３０時間および４５％の収率と比較した。図６Ｃは、ＧＨＲＨおよびインスリンＢ鎖についての合成の各サイクルごとのＦｍｏｃ脱保護ＵＶデータのプロットを示す。ピーク面積、半値全幅、およびピーク最大値を、カップリング数の関数としてプロットする。液体クロマトグラフィおよびＥＳＩ−ＭＳを、６５２０ ＱＴＯＦ質量分光計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣで行った。各試料を、０．１％のギ酸を含む５％のアセトニトリル水溶液で予備平衡させたＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラムに注入した。４分保持した後、アセトニトリル濃度は６０分にわたって６５％に上昇した。
図７Ａは、自動化流動ペプチド合成器の加熱部分の図を示す。図７Ｂは、モデルペプチドＧＣＦのジアステレオマー分析を示し、方法Ｂを使用した流動合成からの代表的な試料（上）と、真正のＣｙｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とを示している。図７Ｃは、方法Ｂを使用した流量（ｍｌ／分）の関数としてのＣｙｓジアステレオマー形成のパーセンテージを示す。図７Ｄは、流動活性化中のＨｉｓエピマー化を調査するために、モデルペプチドＦＨＬについての図７Ｂと同じ分析を示す。方法Ｂを使用して合成されたモデルペプチドＦＨＬ（上部パネル）と、真正Ｈｉｓジアステレオマーの５０／５０混合物（下）とのＬＣ−ＭＳである。図７Ｅは、流量（ｍｌ／分）の関数としての、ヒスチジンジアステレオマー形成のパーセンテージを示す。
（実施例５）
（実施例５）
この実施例は、実施例４で使用した材料、方法、および機器構成について記載する。
材料：全ての試薬を購入し、受け取ったままの状態で使用した。Ｆｍｏｃアミノ酸は、Ｃｒｅｏ Ｓａｌｕｓから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＯ−（７−アゾベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）は、ＣｈｅｍＩｍｐｅｘから購入した。ＯｍｎｉｓｏｌｖグレードのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＤＸ１７２６−１）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、カタログ番号３８７６４９）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、アセトニトリル、および１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｈ−ＲｉｎｋアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘポリエチレングリコール樹脂は、Ｐｃａｓ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（カタログ番号１７４４）から購入した。
試薬保存および流体マニホールド：試薬保存システムは、試薬を収容するための２つの異なる槽：大量向けのＣｈｅｍｇｌａｓｓ３つ口５００ｍＬスピナーフラスコ（ＣＬＳ−１４０１−５００）、およびより少量向けの５０ｍＬポリプロピレンシリンジ管（部品＃ＡＤ９３０−Ｎ、ＡＤ９５５−Ｎ）を使用した。ガラス瓶の全てに、ＵＶ耐性マットスプレー塗料（Ｋｒｙｌｏｎ １３０９）を塗って試薬のＵＶ分解を低減させ、これらの瓶は、アルゴン圧力下での動作のために緑色保護安全ネットを有していた。アルゴン圧力は、Ｓｗａｇｅｌｏｋ圧力調節器（部品＃ＫＣＰ１ＣＦＢ２Ｂ７Ｐ６００００）により５ｐｓｉの圧力で維持した。試薬引出しラインは、ポンプ、逆止め弁、およびラインが任意の試薬の結晶化または不純物によって詰まるのを防ぐために、２０ｕｍポリプロピレンフィルター（部品＃ＪＲ−３２１７８）を備えていた。
９個のアミノ酸の瓶およびシリンジの各列は、ＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ １０位置弁（Ｖｉｃｉ部品＃Ｃ２５−３１８０ＥＵＨＡ）に供給され、第１０の位置はＤＭＦであった。それらの弁は全て、主要なＶｉｃｉ Ｖａｌｃｏ １０位置弁に供給された。この主要な弁は、アミノ酸ポンプに供給した。ＨＡＴＵ、その他のカップリング剤、４０％ピペリジン、およびＤＭＦを含有する瓶は、個別の１０位置弁に供給された。この弁を、カップリング剤ポンプに接続した。ＤＩＥＡは、第３のポンプに直接供給される。
ポンピングおよび混合：ＡＦＰＳは、３つのＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ポンプで動作した。第１のポンプはアミノ酸またはＤＭＦのいずれかを送出した。第２のポンプは、カップリング剤、４０％ピペリジン溶液、またはＤＭＦのいずれかを送出した。第３のポンプはＤＩＥＡを送出した。カップリング剤およびアミノ酸ポンプは、５０ｍｌ／分のステンレス鋼揚程（ｐｕｍｐ ｈｅａｄ）を有していた（Ａｇｉｌｅｎｔ部品＃５０−ＷＳＳ）。ＤＩＥＡポンプは、５ｍｌ／分の揚程（Ａｇｉｌｅｎｔ部品＃５−Ｔｉ）を有していた。３つのポンプの出口は、３つの入口逆止め弁（ＩＤＥＸ部品＃ＣＶ−３３２０）とのクロス部（ＩＤＥＸ部品＃Ｐ−７２２）で合流して、クロス部と揚程との間での拡散を防止した。ＰＥＥＫのクロス部と、ポンプの全てとの間のＰＥＥＫ管材（１／１６”ＯＤ、０．０２０”ＩＤ）の長さは、一致した体積を有していた。クロス部の後の、ある長さのＦＥＰ管材（１／１６”ＯＤ、０．０３０”ＩＤ）を、１／２インチのシリンダの周りに２２回、コイル状に巻いて、高いディーン数（＞３０００）の静止混合器を形成して、試薬混合を容易にした。
活性化およびカップリング反応器：混合後、試薬流は、ＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ ６位置カラム切換え弁（Ｖｉｃｉ部品＃ＡＣＳＴ６ＵＷ−ＥＵＴＡ）を使用して選択された熱交換器に進行した。これらの熱交換器は、アルミニウムのスプールに巻き付けられかつ絶縁のためシリコーンで被覆された、ある長さのステンレス鋼管材からなるものであった。スプールを、２つの抵抗カートリッジ加熱器（Ｏｍｅｇａ部品＃ＣＳＳ−１０２５０／１２０Ｖ）で加熱した。ペプチド合成法Ａについて、３ｍ（１０ｆｔ、１．３６８ｍｌ）の熱交換器ループを９０℃で使用し；ペプチド合成法Ｂについて、１．５ｍ（５ｆｔ、０．６８４ｍｌ）の熱交換器ループを７０℃で使用した。
Ａｒｄｕｉｎｏ上での試作：最初に、制御システムをＡｒｄｕｉｎｏ Ｍｅｇａで試作した。ポンプおよび弁をデイジーチェーン接続し、ＲＳ２３２ ＭＡＸ３２３２ ＳｐａｒｋＦｕｎ Ｔｒａｎｓｃｅｉｖｅｒ Ｂｒｅａｋｏｕｔ（ＢＯＢ−１１１８９）を使用してＡｒｄｕｉｎｏ上でＴＴＬシリアルポートを分離した。
ポンプおよび弁とのシリアル通信：標準のＲＳ−４８５シリアルプロトコールを使用して、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ２１０ポンプおよびＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ弁と通信を行った。ポンプ通信は、１９２００ボー、８ビット、偶数パリティであり、１ストップビットであった。弁通信は、９６００ボーであり、パリティはなく、１ストップビットであった。
加熱および温度制御：全ての加熱器を、８チャネルＷａｔｌｏｗ ＥＺ−Ｚｏｎｅ ＲＭ制御器（部品番号ＲＭＨＦ−１１２２−Ａ１ＡＡ）で制御した。この制御器は、基板上にＰＩＤ制御を集積する。温度を、Ｗａｔｌｏｗにより提供されたソフトウェアを使用して、ＲＳ−２３２シリアルポートを通してソフトウェア内に読み取った。全ての熱電対を、摂氏０度での１点較正を使用して較正した。
プロセスデータ収集：ソフトウェアは、各合成中に、温度、質量流量、圧力、およびＵＶ吸光度を記録した。上記のＷａｔｌｏｗ ＰＩＤ制御ユニットを使用して、温度データを獲得した。質量流量データの場合、Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ Ｃｏｒｉｏｌｉｓ質量流量計を使用し（部品＃Ｍ１４−ＸＡＤ−１１−０−５）、流体密度のモニタリングも可能にした。反応器の両端の差圧を、２つのＤＪ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＨＰＬＣ貫通孔チタン圧力センサ（部品＃ＤＦ２−０１−ＴＩ−５００−５Ｖ−４１”）を使用してモニタリングした。これらのセンサを、１００ｐｓｉで、摂氏９０度で１点較正した。
３１２ｎｍでのＵＶモニタリングは、Ｓｕｐｅｒ Ｐｒｅｐ ２重経路長フローセル（名目上の経路長が４ｍｍおよび０．１５ｍｍ）を備えたＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２３０ ＵＶ−Ｖｉｓ出器を使用することによって実現した。この二重経路長フローセル装置は、高いダイナミックレンジの吸光度測定を可能にし−大きいフローセルの線形範囲を超えて吸光度が増大したときはいつでも、この機器は、より小さいフローセルを通して吸光度を記録するよう切り換わった。フローセルの切換え中に正確な測定を確実にするために、Letters in Peptide Science、９巻：２０３〜２０６頁、２００２年に記載されるように調製されたジベンゾフルベンの標準溶液を使用して、経路長の比を較正した。
温度および質量流量のデータを、Ｗａｔｌｏｗ ＰＩＤおよびＢｒｏｎｋｈｏｒｓｔ流量計とのシリアル通信を通して獲得した。圧力およびＵＶデータについての電圧測定値は、ＮＩ ９２０５ ３２−チャネルアナログ入力カード（部品番号７７９３５７−０１）を備えたＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＮＩ ｃＤＡＱ−９１８４（部品番号７８２０６９−０１）を使用した機器から得た。データ点を、平均して５０ｍｓごとに記録した。ＵＶ検出器では、信号応答時間を１０ｍｓに設定し、全電圧スケールは１００ｍｖであった。
ソフトウェアは、アミノ酸、活性化剤、カップリングおよび脱保護ステップの温度、カップリングおよび脱保護ステップの流量、ならびに使用される試薬の量（ポンプストロークの数）のカスタマイゼーションを可能にした。これらは、システムが動作中に修正することができ：例えば、凝集を提示したＵＶに応答して、温度、使用されるアミノ酸の量、または活性化剤を変更することができた。
合成器を、イーサネット（登録商標）、およびＬａｂ Ｖｉｅｗ ＶＩ搭載のウィンドウズ（登録商標）コンピュータのＵＳＢで制御した。ＶＩは、ユーザが所望のペプチドのレシピを容易に作成できるよう、グラフィカルインターフェースを有する。レシピによって、ユーザは、流量、使用されるアミノ酸の量、活性化剤、活性化の温度および滞留時間、脱保護滞留時間、および合成の各ステップごとの脱保護試薬の量を、制御することができる。ユーザは、所望のレシピを作成したら、レシピをマシンキューに出し、「Ｒｕｎ」を押す。合成中、レシピは、任意の後続のカップリングステップに向けて実行中に修正することができる。「Ｒｕｎ」を押すと、ソフトウェアは、ユーザが選択したアミノ酸、流量、温度、試薬の量、および活性化試薬のタイプを用いて、各アミノ酸ごとに事前に定義されたルーチンを生成する。
コードは、ポンプ、弁、またはモータのいずれかで行われる操作からなるものであった。各操作は、ひと組の入力および休止時間からなるものであった。弁は、弁ＩＤおよび弁位置を受け取り；ポンプはポンプＩＤおよびポンプ流量を受け取り；モータはモータＩＤおよびモータ位置を受け取る。ステップが完了した後、次のステップを実行する前に休止時間が完了するまで、プログラムを待機させた。＃変数により表された休止時間を、レシピ入力を使用して実行中に演算する。例えば、ステップ１２でポンプを動作させた後の休止時間は、レシピ中の「ＣＰＬ ＮＳｔｒｋ」（カップリングストロークの数）パラメータにより決定する。
分析ペプチド切断および側鎖保護基の除去：ペプチジル樹脂約１０ｍｇを、１．５ｍＬのエッペンドルフ管に加えた。切断溶液（９４％ＴＦＡ、１％ＴＩＰＳ、２．５％ＥＤＴ、２．５％水）２００μＬを管に加え、６０℃で５分間インキュベートした。切断の完了後、２００μＬ ＴＦＡを管に加えて樹脂を濯ぎ、可能な限り多くの液体を、ピペットチップを使用し樹脂を回避して別の管に移した。切断溶液の管に、８００μＬの冷ジエチルエーテルを加えた。管を振盪させ−目に見える蝋状沈殿物が形成され、遠心分離によって収集した。上澄みエーテルを注ぎ込み、さらに２回のエーテル洗浄を行った。
最後に、窒素ガスの流れの下で、蝋状固体を簡単に乾燥させた。５０％のアセトニトリル水溶液５００μＬを管に加え、完全に混合した。この溶液を、遠心分離バスケットフィルターに通して濾過し、０．１％のＴＦＡを含む５０％のアセトニトリル水溶液に入れて１：１０に希釈し、液体クロマトグラフィ分析を行った。
分取ペプチド切断：合成後、ペプチジル樹脂をジクロロメタンで洗浄し、真空チャンバ内で乾燥し、秤量した。樹脂を、１５ｍＬの円錐ポリプロピレン管に移した。切断溶液（９４％ＴＦＡ、１％ＴＩＰＳ、２．５％ＥＤＴ、２．５％水）約７ｍＬを管に加えた。より多くの切断溶液を加えて、完全な浸漬を確実にした。管にキャップをし、反転させて半時間ごとに混合し、室温で２時間進行させた。
次いで樹脂スラリーを、１０ｍＬのＴｏｒｖｉｑシリンジに嵌め込まれた１０μｍのポリエチレン膜ディスクに通して濾過した。樹脂を１ｍＬのＴＦＡでさらに２回濯ぎ、濾液を５０ｍＬのポリプロピレン円錐管に移した。３５ｍＬの氷冷ジエチルエーテルを濾液に加え、３０分間静置して、ペプチドを沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、３５ｍＬの冷ジエチルエーテルでさらに２回磨砕した。上澄みを廃棄した。
最後に、残留エーテルを蒸発させ、ペプチドを５０％のアセトニトリル水溶液に溶解した。ペプチド溶液を凍結させ、乾燥するまで凍結乾燥し、秤量した。
ペプチド試料の分析液体クロマトグラフィ分析：希釈ペプチド試料１μＬを、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ粒度）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０ ＬＣ−ＭＳで分析した。図６Ａ〜６Ｃの試料について、０．１％のギ酸添加剤を含む水中でのアセトニトリルの勾配を使用した。勾配は、５％のアセトニトリルで開始して、分当たり１％のアセトニトリルの速度で６５％のアセトニトリルまで上昇した。完全な方法は、勾配の合計時間と共に１％で保持時間を含んでいた。
初期合成条件およびシステムの特徴付け：２０ｍＬ／分の合計システム流量および７０℃で、２０％ピペリジンによる処理は２０秒になるように選択され、先に示された条件は完全Ｆｍｏｃ除去に十分になるように選択された。ＤＭＦ洗浄は、３０秒になるように選択された。洗出し時間は、Ｆｍｏｃアミノ酸を反応器内に導入し、ＤＭＦ洗浄後にいかなるＵＶ活性材料もシステムから確実に取り除かれるようＵＶ検出器を使用して、検証した。
活性化剤およびアミノ酸の流体流をライン内混合するためのスキームは、カップリングに使用される条件の多様性を可能にした。しかし、Ｆｍｏｃ合成におけるアミノアシル化で伝統的に使用されてきた条件からの、逸脱を必要とした。典型的には、試薬は、それらの溶解限度、Ｆｍｏｃアミノ酸およびウロニウムカップリング剤については０．４Ｍ程度で使用される。しかし、これらの試薬はＡＦＰＳ上で別々に保存されかつカップリングでは２種の濃縮溶液を混合するので、最初にアミノアシル化に使用される最終溶液は、０．２Ｍのアミノ酸および活性化剤で構成された。典型的なカップリングでは、このカップリング溶液を合計で９．６ｍＬ使用して、完全なカップリングを確実にした。これらの条件を、短いポリペプチド、ＡＬＦＡＬＦＡの合成に関して最初に試験した。
合成サイクルの最適化：診断「困難」配列として典型的に使用される１０残基ペプチド、ＡＣＰを、同じ体積のカップリング剤を各実験で使用して、２０、４０、および６０ｍＬ／分の合計流量で７０℃で合成した。より高い流量では、連鎖停止副生成物の形成の増大−グルタミンカップリング中のテトラメチルグアニジル切断の増大が、観察された。このことは、高流量での不完全な活性化に起因すると仮定され：活性化剤およびアミノ酸の量がほぼ等しい場合、成長するペプチジル鎖のＮ末端をグアニジニル化することができる、残留ＨＡＴＵが存在することができた。活性化剤の濃度を０．３４Ｍに低減させ、それと共に揚程の完全同期化を確実にすることにより、この副反応はほとんどの場合になくなり、８０ｍＬ／分でＡＣＰを定量的収率で合成することが可能になる。その他のペプチドにおけるＦｍｏｃ−Ａｒｇカップリングでは、これらの切断部が依然として観察され、したがってＰｙＡＯＰを、これらのカップリングの活性化剤として使用した。
脱保護に対する温度の影響の調査：２０％のピペリジンを含むＦｍｏｃ−グリシン官能化ペプチジル樹脂の、７０、８０、および９０℃での脱保護を、検査した。３つの全ての場合に、バッチ式カップリング法を使用して、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙをＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋアミド樹脂２００ｍｇに室温で連結した。次いで樹脂を自動化流動合成に写し、２０％ピペリジンの単一の処理を、７０、８０、または９０℃のいずれかで行った。３つの全ての場合に、Ｆｍｏｃ除去ピークの積分面積は同じであり、完全なＦｍｏｃ除去を示唆している。しかし、より高い温度ではピーク最大値が初期に生じ、樹脂から出て行くＦｍｏｃ−ジベンゾフルベン付加物の、より高速の脱保護およびより高速の拡散のいずれか、またはその両方を示唆している。
自動化流動ペプチド合成器でペプチドを合成するための代表的なプロトコール：ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ ＰＥＧ Ｒｉｎｋアミド樹脂２００ｍｇを、フリットの上部に追加の７〜１２μｍ Ｐｏｒｅｘ ＵＨＭＷＰＥ（ＸＳ−ＰＯＲ−７４７４）膜を備えた６ｍＬのＴｏｒｖｉｑフリットシリンジに投入した。樹脂をＤＭＦで５分間予備膨潤させ、その後、大きい樹脂凝集物を、シリンジプランジャを挿入することによって手動で破壊した。シリンジにＤＭＦを満たし、流体入口に投入し、９０℃の加熱チャンバ内に投入した。合成器を、図５Ａに示されるように設定し、全ての試薬は、８０ｍＬ／分の合計流量でポンプ送出されるが、クロスマニホールド、混合器、および１０ｆｔのステンレス鋼は、９０℃でループを加熱し、その後、樹脂上にポンプ送出される。３つのＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ ＨＰＬＣポンプを使用し、２つは、アミノ酸および活性化剤に関して５０ｍＬ／分の揚程を有し、１つは、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）に関して５ｍＬ／分の揚程を有していた。５０ｍＬ／分の揚程は、ポンプストローク当たり４００μＬの液体をポンプ送出し；５ｍＬ／分の揚程は、ポンプストローク当たり４０μＬの液体をポンプ送出した。
使用される標準合成サイクルは、高温で２０秒間、８０ｍＬ／分で樹脂を予備洗浄する第１のステップを含んでいた。カップリングステップ中、３つのＨＰＬＣポンプを使用し：５０ｍＬ／分の揚程は、活性化剤（典型的には、０．３４Ｍ ＨＡＴＵ）をポンプ送出し、第２の５０ｍＬ／分の揚程は、アミノ酸（０．４Ｍ）をポンプ送出し、５ｍＬ／分の揚程は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を送出した。最初の２つのポンプは、ＤＩＥＡポンプが始動する前にカップリング剤およびアミノ酸をプライム処理するために、５回のポンピングストロークを始動させた。次いで３つのポンプを、７回のポンピングストローク期間にわたり一緒に作動させ、その後、ＤＭＦが選択されるように回転弁を使用して、活性化剤ポンプおよびアミノ酸ポンプを切り換えた。３つのポンプを、最終的な５回のポンピングストロークにわたって一緒に作動させ、その後、ＤＩＥＡポンプを遮断し、その他２つのポンプは、さらに１６回のポンプストロークにわたって樹脂を洗浄し続けた。
脱保護ステップ中、２つのＨＰＬＣポンプを使用した。回転弁を使用することにより、１つのＨＰＬＣポンプは４０％のピペリジンを選択し、その他はＤＭＦを選択する。ポンプを、１３回のポンプストロークにわたり作動させた。混合後、ピペリジンの最終濃度は２０％である。次に回転弁は、両方のＨＰＬＣポンプに関してＤＭＦを選択し、樹脂は、さらに１６回のポンプストロークにわたり洗浄された。カップリング／脱保護サイクルを、全ての追加のモノマーに関して繰り返した。
アスパルチミド形成および高温ＧＨＲＨ合成：７０℃および９０℃でのＧＨＲＨ合成について調査した。この合成を９０℃で行う場合、７０℃とは対照的に、サイン−１８Ｄａ質量およびシフトした滞留時間を持つ、アスパルチミド副生成物の形成が認められた。この副反応は、高温および特定のＡｓｐ含有ペプチドの両方で起こることが公知である。この副反応に対するピペラジン、より穏和な塩基の影響を、調査した。脱保護のために、２０％ピペリジンの代わりに２．５％ピペラジンを使用することにより、ＬＣ−ＭＳで測定したときにこの副生成物の量が著しく低減したが、アミノ酸欠失の量は増加し、特にＡｌａおよびＬｅｕに関して増加した。０．１Ｍ ＨＯＢｔを２．５％ピペラジン脱保護カクテルに加えた結果、ほぼ同じ合成品質が得られた。したがって、アスパルチミド形成が疑われるＡｓｐ含有ペプチドの場合、低下した温度、低下した強度の脱保護カクテルのいずれか、またはこれらの両方を使用することが有利である。
インスリンＢ鎖およびＧＨＲＨの手動合成：これらのペプチドを、Kentら、Org Lett. ２０１５年、１７巻（１４号）、３５２１頁に従い合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ−アミド樹脂（０．１ｍｍｏｌ；０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）を使用した。まず、カップリングさせるアミノ酸０．５５ｍｍｏｌを１．２５ｍＬの０．４Ｍ ＨＢＴＵ／０．４Ｍ ＨＯＢＴに溶解し、次いでＤＩＥＡ １２２μＬ（０．７ｍｍｏｌ）を加えることによって、アミノ酸を３０秒間活性化した。３０秒後、溶液を樹脂に加えた。カップリングを、断続的に撹拌しながら３０分間進行させた。
各カップリングステップ後、４５ｍＬのＤＭＦ流洗浄を行った。次いで３ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを樹脂に加え、撹拌し、５分間インキュベートさせた。このプロセスを１回繰り返した。各脱保護の後、４５ｍＬの流動洗浄を行い、その後、ＤＭＦによる１分間のバッチ処理を行った。
ＣｙｓおよびＨｉｓエピマー化の決定：ＣｙｓおよびＨｉｓエピマー化を、２種のモデルペプチドＧＣＦおよびＦＨＬをそれぞれ使用して測定した。各合成ごとに、ＣおよびＨカップリングについての流量を変化させ、フランキング残基（ＧＣＦに関してはＧおよびＦ；ＦＨＬに関してはＦおよびＬ）についてのカップリング条件を、９０℃および８０ｍＬ／分の合計流量で一定に保った。各モデルペプチドの合成後、切断を上記のように行った。
切断された生成物のＬＣ−ＭＳ分析を行った。それぞれの場合に形成されたＤ−エピマーの量を決定するために、２つの立体異性体の、抽出されたイオンクロマトグラムを得た：ＧＣＦについて３４２．５〜３２９．０Ｄａ、およびＦＨＬについて４９４．９〜４１７．６Ｄａ。各エピマーに該当するピークを積分した。真正標準を調製し、各エピマーの滞留時間を検証するために同じ方法で分析した。
本発明のいくつかの実施形態について本明細書に記載し例示してきたが、当業者なら、機能を発揮しかつ／または結果および／もしくは本明細書に記載される利点の１つもしくは複数を得るための、様々なその他の手段および／または構造を容易に想像するであろうし、そのような変形例および／または修正例のそれぞれは、本発明の範囲内にあると考える。より一般的には、当業者なら、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示（単数または複数）が使用される特定の１つまたは複数の適用例に依存することになることを、容易に理解するであろう。当業者なら、通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識しまたは確認できるであろう。したがって、前述の実施形態は単なる例として提供され、添付される特許請求の範囲内およびその均等物の範囲内で、特に記載されておりかつ特許請求されるもの以外に本発明を実施してもよいことを理解されたい。本発明は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法のそれぞれを対象とする。さらに、２つまたはそれよりも多くのそのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組合せは、そのような特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾していない場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書でおよび特許請求の範囲で使用される不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、反対の内容が明示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
本明細書でおよび特許請求の範囲で使用される「および／または」という文言は、そのように連合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきであり、即ち要素は、場合によっては共同的に存在し、その他の場合には離接的に存在する。その他の要素は、反対の内容が明示されない限り、特に特定されたそれらの要素に関連しても関連していなくても、「および／または」という節によって特に特定された要素以外で任意選択で存在していてもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」と言う場合には、「含む」などの非限定言語と併せて使用されるとき、一実施形態ではＢのないＡ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＡのないＢ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択で、その他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「または」は、上記定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈するものとし、即ち、いくつかの要素または要素のリスト、および任意選択で追加の列挙されていない項目の、少なくとも１つを含むが１つよりも多くのものも含むものとする。「〜の１つのみ」または「〜のまさに１つ」、あるいは特許請求の範囲で使用される場合の「〜からなる」などの、反対の内容を明示する用語のみは、いくつかの要素または要素のリストのまさに１つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「〜のまさに１つ」などの排他性の用語が先行するときには、排他的代替例（即ち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すとして単に解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるようなその通常の意味を有するものとする。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「少なくとも１つ」という文言は、１つまたは複数の要素のリストに言及する場合、要素のリスト中の要素のいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に特に列挙されたそれぞれおよび全ての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組合せを排除しないことを理解すべきである。この定義によれば、要素は、特に特定された要素に関係していても関係していなくても、「少なくとも１つ」という文言が指す要素のリスト内で特に特定される要素以外が任意選択で存在していてもよいことも可能になる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等しく「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等しく「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＡであってＢが存在しないこと（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＢであってＡが存在しないこと（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＡと、任意選択で１つよりも多くを含む少なくとも１つのＢ（任意選択で、その他の要素を含む）などを指すことができる。
特許請求の範囲において、ならびに上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運ぶ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「関わる（involving）」、および「保持する（holding）」などの全ての移行句は、オープンエンドであると理解され、即ち、含むがそれらに限定されないことを意味すると理解されたい。「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみは、the United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures、Section 2111.03に記載されているように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。
Claims (45)
- ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
活性化剤を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、
塩基を含む第２の流体流を前記混合領域に流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される前記活性化剤と前記塩基とのモル比が、前記前縁が前記反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、前記反応器への進入口での前記混合流体流中の前記活性化剤と前記塩基とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、
塩基を含む第２の流体流を前記混合領域に流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記前縁が前記反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、前記反応器への進入口での前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比の１０％以内である、方法。 - 前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記前縁が前記反応器に進入してから少なくとも約５０ｍｓ後、少なくとも約１００ｍｓ後、または少なくとも約１秒後の時点での、前記反応器への進入口での前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁が前記混合領域から出て行くときに前記前縁で測定される前記活性化剤と前記塩基とのモル比が、前記前縁が前記混合領域から出てから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、前記混合流体流が前記混合領域から出て行くときの前記混合流体流中の前記活性化剤と前記塩基とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流を第１の試薬リザーバから混合領域に流し始めること、
塩基を含む第２の流体流を第２の試薬リザーバから前記混合領域に流し始めることであって、前記第１の流体流と前記第２の流体流とが互いに約１０ｍｓ以内に前記混合領域に到達するようにすること、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すこと
を含む方法。 - ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
活性化剤を含む第１の流体流を第１の試薬リザーバから混合領域に流し始めること、
塩基を含む第２の流体流を第２の試薬リザーバから前記混合領域に流し始めることであって、前記第１の流体流と前記第２の流体流とが互いに約１０ｍｓ以内に前記混合領域に到達するようにすること、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すこと
を含む方法。 - 活性化剤を含む第３の流体流を流すことを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- アミノ酸を含む第３の流体流を流すことを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記第１、第２、および第３の流体流を、前記混合領域で合流させることをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- カオトロピック塩、共溶媒、および界面活性剤からなる群から選択される添加剤を含む、第４の流体流を流すことを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記第１、第２、第３、および第４の流体流を前記混合領域で合流させることをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される、前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記混合領域での前記混合流体流中の前記塩基と前記活性化剤とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される、前記塩基と前記活性化剤とのモル比が、前記混合領域での前記混合流体流中の前記塩基と前記活性化剤とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される、前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記前縁が前記反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、前記反応器への進入口での前記混合流体流中の前記活性化剤と前記塩基とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁が前記反応器に進入するときに前記前縁で測定される、前記塩基と前記活性化剤とのモル比が、前記前縁が前記反応器に進入してから少なくとも約１０ｍｓ後の時点での、前記反応器への進入口での前記混合流体流中の前記活性化剤と前記塩基とのモル比の１０％以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記混合流体流中のアミノ酸と塩基とのモル比が、約１：１よりも高い、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記活性化剤が、カルボジイミド、グアニジニウム塩、ホスホニウム塩、およびウロニウム塩からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記第１の流体流の前縁が、前記第２の流体流の前縁から１０ｍｓ以内に前記混合領域に到達する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ペプチド合成システムを操作する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流および塩基を含む第２の流体流を接合部で合流させて混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を前記接合部から反応器に流すことと、前記混合流体流を前記反応器に導入することを含み、前記接合部から前記反応器への前記混合流体流の滞留時間が少なくとも約０．１秒かつ約３０秒未満であり、
前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記混合流体流の形成から前記混合流体流の前記反応器への導入まで１０％以下で変化する、方法。 - ペプチド合成システムを操作する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流を流すこと、
塩基を含む第２の流体流を流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記混合領域での前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記反応器での前記アミノ酸と前記塩基とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムを操作する方法であって、
活性化剤を含む第１の流体流を流すこと、
塩基を含む第２の流体流を流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記混合領域での前記混合流体流中の前記塩基と前記活性化剤とのモル比が、前記反応器での前記塩基と前記活性化剤とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムを操作する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流を流すこと、
塩基を含む第２の流体流を流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、アミノ酸および塩基のうち少なくとも１種が最初に前記反応器に到達する時点から開始するある期間にわたり、前記混合領域での前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記反応器での前記アミノ酸と前記塩基とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムを操作する方法であって、
活性化剤を含む第１の流体流を流すこと、
塩基を含む第２の流体流を流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、塩基および活性化剤のうち少なくとも１種が最初に前記反応器に到達する時点から開始するある期間にわたり、前記混合領域での前記混合流体流中の前記塩基と前記活性化剤とのモル比が、前記反応器での前記塩基と前記活性化剤とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
アミノ酸を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、
塩基を含む第２の流体流を前記混合領域に流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記前縁が前記反応器に進入するときに測定される前記アミノ酸と前記塩基とのモル比が、前記混合領域での前記混合流体流中の前記アミノ酸と前記塩基とのモル比の１０％以内である、方法。 - ペプチド合成システムの操作を開始する方法であって、
活性化剤を含む第１の流体流を混合領域に流すこと、
塩基を含む第２の流体流を前記混合領域に流すこと、
前記第１および第２の流体流を混合領域で合流させることであって、前縁を有する混合流体流を形成すること、ならびに
前記混合流体流を反応器に流すことを含み、前記前縁が前記反応器に進入するときに測定される前記塩基と前記活性化剤とのモル比が、前記混合領域での前記混合流体流中の前記塩基と前記活性化剤とのモル比の１０％以内である方法。 - 前記塩基がルイス塩基である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記塩基が非求核塩基である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記混合流体流が、反応器に到達する前に熱源からの熱に曝されない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記混合流体流が、前記混合領域と前記反応器への進入口との間で熱源からの熱に曝されない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記混合流体流の温度が、前記反応器の進入口での前記前縁の温度の１０℃以内である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記前縁の温度が、前記混合領域から前記反応器の進入口まで１０℃未満変化する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記反応器が、固体支持体上に固定化された複数のアミノ酸を含まない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記反応器が、固体支持体上に固定化された複数のペプチドを含まない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記反応器が、固体支持体上に固定化された複数のペプチドを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記アミノ酸を前記固定化ペプチドに曝すことであって、前記アミノ酸の少なくとも一部が前記固定化ペプチドに結合されて長いペプチドを形成するようにすることを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固定化ペプチドの約９９％よりも多くがそれぞれ、曝すステップ中に単一アミノ酸分子に結合されるようになる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に収容される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体が樹脂を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体が、微孔質ポリスチレン樹脂、微孔質ポリエチレングリコール樹脂、および／または微孔質コポリマー樹脂を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 各ペプチドが固体支持体上に固定化されている、保護基を含む複数のペプチドを提供することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 脱保護試薬を前記固定化ペプチドに曝すことであって、前記保護基を前記固定化ペプチドの少なくとも一部から除去すること、および前記脱保護試薬の少なくとも一部を除去することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 活性化アミノ酸を前記固定化ペプチドに曝すことであって、前記活性化アミノ酸の少なくとも一部が前記固定化ペプチドに結合されることにより新たに結合されたアミノ酸残基を形成することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固定化ペプチドに結合しない活性化アミノ酸の少なくとも一部を除去することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記保護基がフルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記保護基がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
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