ES2344657T3 - Procedimiento de intercambio de contraion para peptidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar un péptido por intercambio de contraión en el que el contraión del péptido se intercambia con un contraión farmacéuticamente aceptable, que comprende: a) cargar un péptido en una columna de RP-HPLC; b) lavar la columna con una solución acuosa de una sal del contraión farmacéuticamente aceptable; y c) eluir el péptido de la columna con una mezcla disolvente de un disolvente orgánico y un ácido del contraión farmacéuticamente aceptable, en el que la solución acuosa presenta un pH de por lo menos 6 y el péptido es atosiban o lanreótido.
Description
Procedimiento de intercambio de contraión para
péptidos.
La invención comprende la purificación de
péptidos utilizando un procedimiento de intercambio de
contraión.
Es conocido que la somatostatina posee un
potencial terapéutico muy amplio y puede administrarse en una amplia
variedad de aplicaciones clínicas. La vida media en el plasma de la
somatostatina es sumamente breve, reduciendo por consiguiente el
número potencial de posibles aplicaciones de este polipéptido. Se
realizó investigación con el fin de desarrollar análogos de
somatostatina que presentan mayor estabilidad y eficacia. Una serie
de compuestos que se evaluó como análogos potencialmente útiles de
somatostatina fueron los octapéptidos cíclicos. La evaluación del
octapéptido cíclico, octreotida, demostró que el compuesto
presentaba excelente actividad biológica, tanto in vitro
como in vivo (Pless J., Metabolism 41,
5-6 (1992)). La octreotida presenta la fórmula
básica siguiente:
(SEC. ID. nº 1) en la que los átomos de azufre
de los restos de Cys en las posiciones 2 y 7 están unidos por un
puente disulfuro. El grupo carboxílico del aminoácido
C-terminal, treonina (Thr) se reduce al resto del
alcohol Thr-ol (treoninol).
La presencia de D-fenilananina
(D-Phe) en el extremo N-terminal y
de un aminoalcohol en el extremo C-terminal, junto
con el resto D-triptófano (D-Trp) y
el puente disulfuro, hacen a la molécula muy resistente a la
degradación metabólica. La octreotida permite una incubación de 24
horas en medios agresivos, tales como los jugos gástricos o en la
mucosa intestinal.
La octreotida inhibe a la hormona de crecimiento
durante un periodo prolongado, inhibe la secreción del glucagón en
menor grado e inhibe la secreción de insulina solamente de manera
temporal. Por lo tanto la octreotida es más selectiva que otros
análogos de somatostatina en la regulación de las concentraciones de
la hormona de crecimiento en el cuerpo y por consiguiente,
actualmente está indicada en la acromegalia para controlar y
reducir los niveles en el plasma de dicha hormona. Además la
octreotida es útil en el tratamiento de alteraciones celulares de
origen gastroenteropancreático endocrino y de determinados tipos de
tumores.
La síntesis de octreotida y de sus derivados ha
sido descrita por dos métodos de síntesis general. El primer método
es un procedimiento en fase de solución, basado en la condensación
del fragmento, como describe Bauer et al. solicitud de
patente europea nº 29.579 (1981) y la patente US nº 4.395.403. El
procedimiento comprende generalmente separar un grupo protector de
un resto de hexapéptido protegido; enlazar dos unidades peptídicas
mediante un enlace amida, en el que uno comprende un resto de
hexapéptido; convertir un grupo funcional en el extremo terminal N-
o C- del polipéptido resultante; y oxidar el polipéptido. El
procedimiento conlleva mucho tiempo, la síntesis en multietapa y
presenta problemas adicionales durante la separación de la
octreotida de las mezclas de reacción porque todas las etapas de
síntesis se realizan en fase de solución.
El segundo procedimiento para la síntesis de
octreotida sintetiza la cadena peptídica completa utilizando la
síntesis de péptidos en fase sólida, partiendo de la síntesis en el
resto de treoninol. Este método requiere que el resto de treoninol
esté protegido.
El segundo procedimiento de síntesis utiliza una
resina de aminometilo en la que el resto de treoninol se incorpora
con las dos funciones alcohólicas protegidas en forma de acetal.
Mergler et al., "Peptides: Chemistry an
Biology", Proceedings of the 12th American Peptide
Symposium, Poster 292 Presentation (Smith, J.A. y Rivier J.E.,
Eds ESCOM, Leiden) (1991). La síntesis se lleva a cabo siguiendo un
esquema de protección Fmoc/t-Bu; formando el puente
disulfuro en una resina mediante oxidación de los grupos tiol de los
restos de cisteína previamente desprotegidos; y liberando y
desprotegiendo el péptido con una mezcla al 20% de TFA/DCM.
Alsina et al. describieron la
incorporación de un resto de treoninol en las resinas de carbonato
activas en las que el grupo amino está protegido por un grupo Boc y
la cadena lateral está protegida por un grupo Bzl. Alsina et
al., Tetrahedron Letters, 38, 883-886 (1997).
Después, la síntesis continuó utilizando una estrategia Boc/Bzl. La
formación del puente disulfuro se llevó a cabo directamente en
resina utilizando yodo, y el péptido se escindió de la resina y sus
grupos protectores de la cadena lateral se separaron simultáneamente
con HF/anisol (9/1). Al final de la etapa el grupo formilo se
separó con una solución de piperidina/DMF. Neugebauer et al.
describieron una síntesis lineal con un rendimiento de solamente el
7%. Neugebauer et al. PEPTIDES: CHEMISTRY, STRUCTURE AND
BIOLOGY, Pág. 1017 (Marshal G.R. y Rivier J.E., Eds ESCOM, Leiden,
1990).
Edwards et al. dieron a conocer una
aproximación de tipo fase sólida mediante la síntesis paso a paso
del péptido
D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(t-Bu)-Cys(Acm)-HMP-resina
(SEC. ID. nº 1). Edwards et al., J. Med Chem. 37,
3749-3757 (1994). Posteriormente, se preparó el
disulfuro sobre la resina, y el producto resultante se liberó de la
resina por medio de aminolisis con treoninol. El rendimiento total
obtenido fue solamente del 14%.
Arano et al. realizaron otro método en
fase sólida para DTPA-octreotida. Arano et al.,
Bioconjugate Chem., 8, 442-446 (1997).
La oxidación con yodo del DTPA-péptido produjo
DTPA-D-Phe^{1}-octreotida
con un rendimiento total del 31,8% referido a la
Fmoc-Thr(tBu)-ol-resina
de partida.
Wu et al. desarrollaron un método de
síntesis para la octreotida, en el que el enlace disulfuro se formó
por oxidación utilizando una solución diluida de octreotida con aire
durante 48 horas. Wu et al., Tetrahedron Letters, 39,
1783-1784 (1998). Lee et al. llevaron a cabo
recientemente un nuevo método para anclar Thr(ol) (o
Thr-ol) a una resina de síntesis en fase sólida para
la preparación de la octreotida. Véase, la patente US nº 5.889.146.
Se cargó el Fmoc-Thr
(ol)-tereftal-acetal en la resina y
tras la construcción de las cadenas peptídicas que utiliza la
química Fmoc, se obtuvo la ciclación del péptido en la resina por
oxidación con yodo. La escisión del péptido-resina
con ácido trifluoracético, produjo la octreotida con un rendimiento
global >70% a partir de la
Fmoc-Thr(ol)-tereftal-acetal-resina
de partida. Todos estos procedimientos completaron la ciclación de
la octreotida en el péptido totalmente desprotegido o en la
resina.
Más análogos cíclicos, cíclicos con puente y de
cadena lineal de somatostatina y procedimientos para su preparación
se describen en las patentes US nº 4.310.518 y nº
4.235.886; las memorias de patente europea
EP-A-1295; nº 70.021; nº 113.209;
nº 215.171; nº 203.031; nº 214.872 y nº 143.307; y la
memoria de la p atente belga
BE-A-900.089.
La purificación del péptido puede eliminar las
impurezas producida por la modificación de la cadena lateral, las
secuencias de eliminación o adición o los productos de racemización.
Los contraiones introducidos durante la síntesis de péptido son
también una fuente de impurezas. Los péptidos que contienen por lo
menos una función básica en su secuencia (cadenas laterales de Lys
o Arg, o el grupo amino N-terminal) aparecen como
sales y no como base libre durante la síntesis y la purificación.
Los contraiones del péptido por lo general comprenden ácido
trifluoracético (ATF) o fosfatos, entre otros. El acetato es un
contraión farmacéuticamente aceptable y con frecuencia la selección
para reemplazar los contraiones se utiliza durante la síntesis o la
purificación de ingredientes farmacéuticamente activos (API). Por
lo tanto, en algún momento durante la síntesis del péptido debe
reemplazarse el contraión.
Generalmente, las columnas de intercambio iónico
reemplazan contraiones en las sales de polipéptidos; sin embargo,
el procedimiento requiere con frecuencia etapas de purificación
adicionales y un sistema adicional de purificación. La
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC) mejora significativamente la purificación
de péptido sintéticos (Andersson L et al., Biopolymers, 2000,
55, 227-250). Sin embargo, la selección del sistema
disolvente continúa siendo difícil ya que los péptidos se comportan
de manera diferente para los mismos disolventes o combinaciones de
disolventes. Aunque es conocido que puede utilizarse
RP-HPLC para realizar intercambio iónico, un
inconveniente de este método es la necesidad de mayores volúmenes de
disolvente. Otro inconveniente es la dificultad para reducir la
cantidad de contraiones residuales no deseados a un nivel
suficientemente bajo.
A pesar de las mejoras para la purificación de
péptidos, algunos péptidos purificados contienen todavía cantidades
indeseadas de contraiones inaceptables. Los contraiones residuales
con frecuencia son difíciles de eliminar sin etapas de purificación
adicionales. La invención proporciona un método alternativo para
reducir la cantidad de contraiones utilizando intercambio iónico en
RP-HPLC.
Una forma de realización de la invención
comprende un procedimiento para purificar un péptido por intercambio
del contraión en el que el contraión del péptido se intercambia con
un contraión farmacéuticamente aceptable que comprende cargar un
péptido en una columna de RP-HPLC; lavar la columna
con una solución acuosa con una sal del contraión farmacéuticamente
aceptable; y eluir el péptido de la columna con una mezcla
disolvente de un disolvente orgánico y un ácido del contraión
farmacéuticamente aceptable, en la que la solución acuosa tiene un
pH de por lo menos aproximadamente 6. El péptido puede ser cíclico o
acíclico. El péptido es atosiban o lanreótido.
En una forma de realización, la sal del
contraión farmacéuticamente aceptable es el acetato de amonio,
citrato de amonio o pamoato de amonio. El pH de la solución acuosa
puede ser aproximadamente 8. El pH de la solución acuosa puede
ajustarse mediante por lo menos una base en la que la base es
amoniaco, hidróxido de amonio, metilamina, etilamina, dimetilamina,
dietilamina, metiletilamina, trimetilamina o trietilamina.
Preferentemente, la base es el hidróxido de amonio.
En otra forma de realización todavía, la mezcla
de disolvente tiene un pH inferior a aproximadamente 6. El
disolvente orgánico puede ser por lo menos uno de entre
acetonitrilo, metanol, etanol, isopropanol o THF. Preferentemente,
el disolvente orgánico es acetonitrilo. El ácido del contraión
farmacéuticamente aceptable puede ser ácido acético, ácido cítrico
o ácido pamoico.
La invención comprende procedimientos para
purificar el atosiban o el lanreótido utilizando una columna de
intercambio de contraiones y HPLC en fase inversa
(RP-HPLC). El procedimiento comprende purificar el
péptido por intercambio iónico, donde el contraión del péptido se
intercambia con un contraión farmacéuticamente aceptable. Después,
se recoge el péptido eluyendo el péptido de la columna. El
procedimiento comprende cargar un péptido en una columna
RP-HPLC; lavar la columna con una solución acuosa de
un contraión farmacéuticamente aceptable; y eluir el péptido de la
columna con una mezcla disolvente de un disolvente orgánico y un
ácido del contraión farmacéuticamente aceptable, en la que la
solución acuosa tiene un pH de por lo menos aproximadamente 6.
El proceso se basa en parte en determinar una
fase móvil adecuada para el sistema HPLC, porque la elución de cada
péptido dependerá de la solución utilizada. En particular, la fase
móvil es una combinación de disolventes acuosos y orgánicos en
varios porcentajes. La elución puede ser en condiciones de gradiente
o isocráticas.
Los péptidos son atosiban o lanreótido. El
péptido puede estar en forma de ácido libre o de sal del
correspondiente ácido. Los contraiones adecuados utilizados en las
sales peptídicas, pero no se limitan a, TFA, TEAP, fluorhídrico,
bromhídrico o contraiones fosfato adecuados.
Durante la etapa de carga el péptido puede
cargarse como solución que comprende un péptido y un disolvente. La
solución del péptido por lo general comprende el péptido diluido con
agua. Sin embargo, el péptido puede cargarse puro, es decir sin
dilución.
Por lo general, las columnas de HPLC utilizadas
en el procedimiento incluyen las columnas HPLC convencionales tales
como modificadas a base de sílice con cadenas de carbono
oligoméricas. Las columnas HPLC incluyen, pero no se limitan a,
columnas C4, octadecilsílice (C18) o columnas unidas con octilsílice
(C8). Los péptidos de pequeño a medio tamaño, es decir los péptidos
con 5 a 50 restos se purifican utilizando columnas unidas con
octadecilsílice (C18) u octilsilice (C8). Péptidos más o menos
hidrófobos se purifican con columnas C4. Aún más preferentemente,
la columna utilizada es la columna C_{18}
RP-HPLC.
La solución acuosa utilizada en la etapa de
lavado podría reemplazar al contraión del péptido por un contraión
farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión "contraión farmacéuticamente aceptable"
se refiere a contraiones que producen las formas salinas
farmacéuticamente aceptables de los péptidos. Los ejemplos de
contraiones farmacéuticamente aceptables comprenden de manera no
limitativa, acetato, ascorbato, bencenosulfonato, benzoato,
bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, camsilato, carbonato,
citrato, dihidrocloruro, metansulfonato, etansulfonato,
p-toluensulfonato, ciclohexilsulfamato, quinato,
edetato, edisilato, estolato, esilato, fumaxato, gluconato,
glutamato, glicerofosfatos, hidrobromuro, hidrocloruro,
hidroxinaftoato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato,
mandelato, mesilato, mucato, napsilato, nitrato,
n-metilglucamina, oleato, oxalato, palmoatos,
pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, perclorato,
fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato,
succinato, sulfato, sulfamato, subacetato, tanato, tartrato,
tosilato o valerato. Preferentemente, el contraión
farmacéuticamente aceptable es acetato, citrato o pamoato.
Las soluciones salinas de contraiones
farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse en la etapa de
lavado. Las sales de contraión preferidas farmacéuticamente
aceptables comprenden de manera no limitativa acetato de amonio,
citrato de amonio o pamoato de amonio. Preferentemente, se utiliza
un gradiente de tampón. Además puede utilizarse cualquier sal de un
ácido orgánico o inorgánico para reemplazar al contraión. Así mismo,
puede utilizarse cualquier otro catión a parte del catión amonio.
Los ácidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no
se limitan a, ácido acético, ácido cítrico o ácido pamoico.
Por lo general la solución acuosa de la etapa de
lavado puede tener una concentración desde aproximadamente 0,1 M a
aproximadamente 2 M. Preferentemente, la solución acuosa de la etapa
de lavado tiene una concentración de aproximadamente 0,2 M y 1 M
y más preferentemente una concentración de aproximadamente 0,5
M.
Durante la etapa de lavado, el pH de la solución
acuosa generalmente es por lo menos de aproximadamente 6. Cuando se
utiliza un pH inferior, el intercambio iónico es menos eficaz y
tarda mucho más tiempo y emplea el volumen de base móvil requerido.
Preferentemente el pH de la solución acuosa durante la etapa de
lavado es aproximadamente 8. Para las columnas que no utilizan
columnas de gel de sílice o RP de sílice modificada, se prefiere un
intervalo de pH mayor en lugar del pH indicado para las columnas de
gel de sílice normales, tal como un pH de 10. Por ejemplo, la
columna adsorbente Luna (Phenomenex) es estable a un pH de
aproximadamente 10. El pH para las columnas basadas en el polímero
RP, tales como la columna PLRP-S, (de Polymer
Laboratories) puede ser aproximadamente 10 o aún superior
dependiendo de la estabilidad del péptido específico.
El pH de la solución acuosa en la etapa de
lavado puede ajustarse utilizando una base, para evitar etapas de
purificación adicionales que eliminen bases no volátiles, resulta
preferido ajustar el pH utilizando por lo menos una base volátil.
Los ejemplos de bases volátiles comprenden de manera no limitativa
por lo menos una de entre amoniaco, hidróxido de amonio,
metilamina, etilamina, dimetilamina, dietilamina, metiletilamina,
trimetilamina o trietilamina. Preferentemente la base es el
hidróxido de amonio. Las sales de bases volátiles pueden utilizarse
solas o con la base volátil. Por ejemplo, las sales de bases
volátiles incluyen, pero no se limitan a, acetato de amonio.
Alternativamente, el pH puede ajustarse, con bases inorgánicas o
sales de las mismas, tal como sodio, potasio, etc.
La etapa de elución se lleva a cabo utilizando
un sistema disolvente que puede retirar el péptido de la columna.
Con poca o ninguna experimentación un experto en la materia puede
determinar fácilmente la relación de los disolventes que dependen
del péptido especifico y el objeto de la elución. El eluyente
utilizado en la etapa de elución comprende por lo menos un
disolvente orgánico y un ácido del contraión farmacéuticamente
aceptable. El eluyente puede ser una mezcla de disolvente orgánico
y del ácido en varias proporciones. Por ejemplo, si el disolvente
orgánico es el acetonitrilo, entonces puede utilizarse una
concentración de aproximadamente 50% si el propósito es retirar el
péptido de la columna. Alternativamente, puede utilizarse un
gradiente de acetonitrilo y ácido acuoso si el objetivo es además
purificar más el péptido. Se utiliza preferentemente un gradiente
de tampón del eluyente. Preferentemente, el pH del eluyente durante
la etapa de elución a inferior a aproximadamente 6.
El disolvente orgánico comprende de manera no
limitativa por lo menos uno de entre acetonitrilo, metanol, etanol,
isopropanol o THF. El disolvente orgánico más preferido es el
acetonitrilo. El ácido del ión farmacéuticamente aceptable es el
ácido de cualquiera de los contraiones farmacéuticamente aceptables
descritos anteriormente. La selección del ácido depende del
contraión farmacéuticamente aceptable utilizado.
Los ejemplos de sistemas utilizados en HPLC
incluyen los que conllevan un sistema ATF (acetonitrilo/agua 0,1%
de ATF) y un sistema más de emparejamiento de iones que conlleva el
sistema de fosfato de trietilamonio (acetonitrilo/TEAP tamponado a
un pH específico).
El procedimiento proporciona un péptido que
tiene un contraión residual de no más de aproximadamente 0,25% en
peso. Alternativamente, el procedimiento de purificación proporciona
un péptido que contiene el contraión residual y no más de
aproximadamente 200 partes por millón. Preferentemente el contraión
es el ATF.
La concentración de contraión residual puede
determinarse por un método de cromatografía iónica (CI), tal como
nota de aplicación 115 de DIONEX, o por otros métodos conocidos
tales como HPLC o GC. Tal como se utiliza en la presente memoria,
la expresión "contraión residual" es el contraión del péptido
utilizado durante la síntesis o purificación del péptido y presente
en la etapa de carga, que se reemplaza posteriormente por un
contraión farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 de
Referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink (50 g). Después de
la separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el
primer aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una
etapa de acoplamiento normal para proporcionar la carga de
aproximadamente 0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar
el grupo protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Arg(Pbf)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan diisopropiletilamina o
colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La terminación
del acoplamiento está indicada por la prueba de la ninhidrina. Tras
el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en la
\alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Tyr(tBu), Arg(Pbf),
Cys(Acm) y Cys(Trt). En el grupo amida se utilizan
Asn y Gln desprotegidos. Se utilizan tres equivalentes de los
aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al final
de la síntesis el péptido-resina se lava con DMF,
seguido de DCM y se seca al vacío para obtener 110 g de
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente se separa de la resina junto con la eliminación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener 36 g
de producto. TFA residual <0,25%.
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Ejemplo 2 de
Referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El péptido en bruto
H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Arg-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 2) (36 g, preparado tal como se describe en el Ejemplo
1) se purifica en columna C_{18} RP-HPLC de
preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto puro
se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1 g/l.
Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con mezcla
intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo
se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La
solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen trifluoroacetato de vasopresina con una pureza
>98,5%. Las fracciones se tratan para reemplazar el ión ATF por
acetato, se recogen y se liofilizan para obtener el péptido seco
final, 11 g (>99,0%. puro).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 de
Referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink tal como se
describe en el ejemplo 1. Todos los aminoácidos utilizados están
protegidos con Fmoc-N^{\alpha}. Los aminoácidos
trifuncionales están protegidos en la cadena lateral de la forma
siguiente: Lys(Boc), Thr(tBu), His(Trt),
Ser(tBu), Tyr(tBu), Arg(Pbf), Cys(Acm)
y Cys (Trt). En el grupo amida se utilizan Asn y Gln desprotegidos o
como Trt protegido. Se emplean tres equivalentes de los aminoácidos
activados en las reacciones de acoplamiento. Al final de la síntesis
el péptido-resina se lava con DMF, seguido de DCM y
se seca al vacío para obtener péptido-resina
seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter (MTBE), se filtra y se seca al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 de
Referencia
El péptido en bruto semiprotegido, preparado tal
como se describe en el Ejemplo 3, se purifica en columna
C_{18}RP-HPLC de preparación. Las fracciones que
contienen >95% de producto puro se combinan y se diluyen a
concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añade una cantidad
equimolar de yodo en ácido acético con mezcla intensa a temperatura
ambiente y posteriormente el exceso de yodo se neutraliza mediante
una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La solución resultante se
carga en una columna C_{18} RP-HPLC y se purifica
para obtener las fracciones que contienen trifluoroacetato de
Pramlintida con una pureza >97,5%. Las fracciones se tratan
para reemplazar el ión ATF por acetato, se recogen y se liofilizan
para obtener el acetato de Pramlintida final. ATF residual
<0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 de
Referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina
2-Cl-Trt. El primer aminoácido
(Fmoc-Phe) se carga en la resina en una etapa
preliminar para proporcionar la carga de aproximadamente 0,7
mmoles/g. Después del lavado de la resina se elimina el grupo Fmoc
mediante tratamiento con solución de piperidina/DMF y se introduce
el segundo aminoácido (Fmoc-Gly) para iniciar la
primera etapa de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc
se activan in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan diisopropiletilamina o
colidina como base orgánica durante el acoplamiento. La terminación
del acoplamiento está indicada por la prueba de la ninhidrina. Tras
el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en la
\alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena lateral
de la forma siguiente: Tyr(tBu), Arg(Pbf),
Ser(tBu), Cys(Trt) y Cys(Acm). En las
reacciones de acoplamiento se emplean tres equivalentes de los
aminoácidos activados. Al final de la síntesis el
péptido-resina se lava con DMF, seguido de DCM y se
seca al vacío para obtener péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se separa de la resina acompañado de desprotección
simultánea de grupos protectores de ácido lábil utilizando una
solución de 95% de ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a
temperatura ambiente. El producto se precipita mediante la adición
de 10 volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 de
Referencia
El péptido
H-Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys(Acm)-Gly-Phe-OH
(SEC. ID. nº 8) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 5, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente
1 g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen péptido con una pureza >98,5%. Las fracciones se
recogen y se liofilizan para obtener el péptido anhidro final. ATF
residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 de
Referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina
2-Cl-Trt. El primer aminoácido
(Fmoc-Cys(Acm)) se carga en la resina en una
etapa preliminar para proporcionar la carga de aproximadamente 0,7
mmoles/g. Después del lavado de la resina se elimina el grupo Fmoc
mediante tratamiento con solución de piperidina/DMF y se introduce
el segundo aminoácido (Fmoc-Ser(tBu)) para
iniciar la primera etapa de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos
por Fmoc se activan in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan
diisopropiletilamina o colidina como base orgánica durante el
acoplamiento. La terminación del acoplamiento está indicada por la
prueba de la ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo
protector Fmoc en la \alpha-amina se retira con
piperidina al 20% en DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten
cada vez con otro aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los
aminoácidos utilizados están protegidos con
Fmoc-N^{\alpha}. Los aminoácidos trifuncionales
están protegidos en la cadena lateral de la forma siguiente:
Lys(Boc), Thr(tBu), Ser(tBu), Cys(Trt) y
Cys(Acm). En las reacciones de acoplamiento se emplean tres
equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la síntesis
el péptido-resina se lava con DMF, seguido de DCM y
se seca al vacío para obtener péptido-resina
seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se separa de la resina acompañado de desprotección
simultánea de grupos protectores de ácido lábil utilizando una
solución de 95% de ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a
temperatura ambiente. El producto se precipita mediante la adición
de 10 volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 de
Referencia
El péptido
H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH
(SEC. ID. nº 10) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 7, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen péptido con una pureza >98,5%. Después del
tratamiento para reemplazar el contraión por acetato se recogen las
fracciones y se liofilizan para obtener el péptido anhidro final.
ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Thr(tBu)) en la resina en
una etapa de acoplamiento normal para proporcionar la carga de
aproximadamente 0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar
el grupo protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Cys(Acm)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan diisopropiletilamina o
colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La terminación
del acoplamiento está indicada por la prueba de la ninhidrina. Tras
el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en la
\alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Tyr(tBu), Lys(Boc),
Thr(tBu), Cys(Acm) y Cys(Trt). Se utilizan
tres equivalentes de los aminoácidos activados en las reacciones de
acoplamiento. Al final de la síntesis el
péptido-resina se lava con DMF, seguido de DCM y se
seca al vacío para obtener péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El péptido
H-D-Naph-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH_{2}
(SEC. ID. nº 11) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 9, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen péptido con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión por acetato, se recogen y se
liofilizan para obtener el péptido anhidro final. ATF residual
<0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Orn(Boc)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan diisopropiletilamina o
colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La terminación
del acoplamiento está indicada por la prueba de la ninhidrina. Tras
el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en la
\alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Orn(Boc), Thr(tBu),
Cys(Acm) y Mpa(Trt). Se utilizan tres equivalentes de
los aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al
final de la síntesis el péptido-resina se lava con
DMF, seguido de DCM y se seca al vacío para obtener
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
El péptido
Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 3) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 11, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen Atosiban con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión, se recogen y se liofilizan
para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 de
referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Lys(Boc)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizan diisopropiletilamina o
colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La terminación
del acoplamiento está indicada por la prueba de la ninhidrina. Tras
el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en la
\alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Lys(Boc), Tyr(tBu),
Cys(Acm) y Cys(Trt). Se utilizan tres equivalentes de
los aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al
final de la síntesis el péptido-resina se lava con
DMF, seguido de DCM y se seca al vacío para obtener
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14 de
referencia
El péptido
H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 4) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 13, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen Terlipresina con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión, se recogen y se liofilizan
para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15 de
referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Lys(Boc)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se utiliza
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento está indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Lys(Boc), Cys(Acm) y
Cys(Trt). Se utilizan tres equivalentes de los aminoácidos
activados en las reacciones de acoplamiento. Al final de la síntesis
el péptido-resina se lava con DMF, seguido de DCM y
se seca al vacío para obtener péptido-resina
seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter (MTBE), se filtra y se seca al vacío para obtener
el producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
H-Cys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 5) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 15, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen Felipresina con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión, se recogen y se liofilizan
para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 de
referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Orn(Boc)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se utiliza
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento está indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Orn(Boc), Tyr(tBu),
Cys(Acm) y Cys(Trt). Se utilizan tres equivalentes de
los aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al
final de la síntesis el péptido-resina se lava con
DMF, seguido de DCM y se seca al vacío para obtener
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 6) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 17, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen Ornipresina con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión, se recogen y se liofilizan
para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 19 de
referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se carga el primer
aminoácido (Fmoc-Trp) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introduce el segundo aminoácido
(Fmoc-Cys(Acm)) para iniciar la segunda etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se utiliza
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento está indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retira con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repiten cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados están protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Lys(Boc), Tyr(tBu),
Cys(Acm) y Cys(Trt). Se utilizan tres equivalentes de
los aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al
final de la síntesis el péptido-resina se lava con
DMF, seguido de DCM y se seca al vacío para obtener
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escinde de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipita mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtra y se seca al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 20 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys(Acm)-Trp-NH_{2}
(SEC. ID. nº 9) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo 19, se purifica en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contienen >95% de producto
puro se combinan y se diluyen a concentraciones de aproximadamente 1
g/l. Se añade una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con
mezcla intensa a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de
yodo se neutraliza mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico.
La solución resultante se carga en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purifica para obtener las fracciones
que contienen Vapreótido con una pureza >98,5%. Se tratan las
fracciones para reemplazar el contraión, se recogen y se liofilizan
para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 21 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso partiendo de la resina
Thr(t-Bu)-ol-2-Cl-Trt
(250 g, carga de 0,07 mmoles en 1 g de resina precargada). Después
del lavado de la resina se introdujo el segundo aminoácido
(Fmoc-Cys(Acm)) para iniciar la primera
etapa de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se
activaron in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se
acoplaron a la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se
utilizó diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento fue indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retiró con piperidina al 20%
en DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados estaban protegidos con Fmoc-N^{\alpha}
excepto el último aminoácido de la secuencia,
Boc-D-Phe. Los aminoácidos
trifuncionales estaban protegidos en la cadena lateral de la forma
siguiente: Thr(t-Bu), Cys(Trt),
Cys(Acm) y Lys(Boc). Se utilizaron tres equivalentes
de los aminoácidos activados en las reacciones de acoplamiento. Al
final de la síntesis el péptido-resina se lavó con
DMF, seguido de DCM y se secó al vacío para obtener 510 g de
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina utilizando una solución de
95% de ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipitó mediante la adición de 10
volúmenes de éter (MTBE), se filtró y se secó al vacío para obtener
201,7 g del polvo. Se identificó por LC/MS como
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 22 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol
(SEC. ID. nº 1) en bruto, preparado tal como se describe en el
Ejemplo (21) se purificó en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contenían >95% de producto
puro se combinaron y se diluyeron a concentraciones de
aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad equimolar de yodo en
ácido acético con mezcla intensa a temperatura ambiente y
posteriormente el exceso de yodo se neutralizó mediante una pequeña
cantidad de ácido ascórbico. La solución resultante se cargó en una
columna C_{18} RP-HPLC y se purificó para obtener
las fracciones que contienen trifluoroacetato de octreótido con una
pureza >98,5%. Después del tratamiento para reemplazar el
trifluoroacetato, las fracciones se recogieron y se liofilizaron
para obtener el péptido anhidro final (130 g). ATF residual
<0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 23 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso partiendo de la resina
2-Cl-Trt (50 g). El primer
aminoácido (Fmoc-Cys(Acm)) se cargó en la
resina en una etapa preliminar para proporcionar aproximadamente
0,7 mmoles/g. Tras el lavado de la resina, se introdujo un segundo
aminoácido (Fmoc-Pro) para iniciar la primera etapa
de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activaron
in situ utilizando TBTU/HOBt y posteriormente se acoplaron a
la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se utilizó
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento fue indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retiró con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron cada vez con
otro aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados estaban protegidos con Fmoc-N^{\alpha}
excepto el último bloque de construcción en la secuencia,
Trt-Mpa. Los aminoácidos trifuncionales estaban
protegidos en la cadena lateral de la forma siguiente:
Asp(tBu), Har(Pbf) y Cys(Acm). Se utilizaron
tres equivalentes de los aminoácidos activados en las reacciones de
acoplamiento. Al final de la síntesis el
péptido-resina se lavó con DMF, seguido de DCM y se
secó al vacío para obtener 80 g de péptido-resina
seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina utilizando una solución de
1% de ATF en DCM. La solución resultante se neutralizó mediante la
adición de DIPEA y se concentró hasta aproximadamente 10% de
contenido en péptido. La amidación del terminal C se consiguió por
activación del terminal carboxi con DCC/HOBt y acoplamiento con
solución de amoniaco en IPA. Tras la eliminación del disolvente el
péptido protegido se precipitó en éter y se secó. Se eliminaron los
grupos protectores utilizando una solución de 95% de ATF, 2,5% de
TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura ambiente. El
producto se precipitó mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtró y se secó al vacío para obtener 30 g
de producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 24 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH_{2}
(SEC. ID. nº 12) en bruto (30 g, preparado tal como se describe en
el Ejemplo 23) se purificó en columna C_{18}
RP-HPLC de preparación. Las fracciones que contenían
>95% de producto puro se combinaron y se diluyeron a
concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad
equimolar de yodo en ácido acético con mezclado intenso a
temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo se
neutralizó mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La
solución resultante se cargó en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purificó para obtener las fracciones
que contienen trifluoroacetato de eptifibatido con una pureza
>98,5%. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para
obtener 6,9 g del péptido anhidro final (>98,5% puro). ATF
residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 25 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS paso a paso normal partiendo de la resina
amídica Rink (200 g). Después de la separación del grupo protector
Fmoc de la resina se cargó el primer aminoácido
(Fmoc-Gly) en la resina por un procedimiento de
acoplamiento normal. Después del lavado de la resina se introdujo
el segundo aminoácido
(Fmoc-D-Arg(Pbf)) para
continuar el alargamiento de la secuencia. Los aminoácidos
protegidos por Fmoc se activaron in situ utilizando TBTU/HOBt
y posteriormente se acoplaron a la resina durante 50 minutos. Como
base orgánica se utilizó diisopropiletilamina o colidina durante el
acoplamiento. La terminación del acoplamiento estaba indicada por
la prueba de la ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo
protector Fmoc en la \alpha-amina se retiró con
piperidina al 20% en DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron
cada vez con otro aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los
aminoácidos utilizados estaban protegidos con
Fmoc-N^{\alpha} excepto el último bloque de
construcción en la secuencia, TrT-Mpa. Los
aminoácidos trifuncionales estaban protegidos en la cadena lateral
de la forma siguiente: Gln(Trt),
D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) y
Cys(Acm). En las reacciones de acoplamiento se utilizaron
tres equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la
síntesis el péptido-resina se lavó con DMF, seguido
de DCM y se secó al vacío para obtener 460 g de
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina utilizando una solución de
89% de ATF, 5,0% de fenol, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT y 2,5% de agua
durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El producto se precipitó
mediante la adición de 10 volúmenes de éter, se filtró y se secó al
vacío para obtener 115,0 g en polvo. Se identificó por LC/MS como
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 26 de
referencia
La síntesis del péptido se lleva a cabo por un
procedimiento de "síntesis en solución" paso a paso normal. El
segundo aminoácido
(Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH)
se disuelve en DMF y se preactiva mediante la adición de TBTU/HOBt
en presencia de DIPEA. El primer aminoácido
(Gly-NH_{2}) se disuelve en DMF, se añade, y la
reacción continúa durante aproximadamente 1 h a temperatura
ambiente. Se elimina la DMF a presión reducida y se disuelve el
residuo en acetato de etilo. La solución orgánica se lava varias
veces con HCl acuoso (1 N), agua y NaHCO_{3} (5%). Después se
seca la solución sobre Na_{2}SO_{4}, se evapora el disolvente
para obtener
Fmoc-D-Arg(Pbf)-Gly-NH_{2}.
El grupo Fmoc se elimina por disolución en piperidina/DMF (20%). Se
concentra la solución y se precipita el dipéptido en bruto en éter
frío. Por un procedimiento similar se añaden sucesivamente los
aminoácidos restantes para obtener el péptido lineal protegido
final. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activan in situ
utilizando TBTU/HOBt y posteriormente se acoplan a la cadena de
péptido en crecimiento. Como base orgánica se utiliza
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento se determina por análisis HPLC o TLC.
Estas etapas se repitien cada vez con otro aminoácido según la
secuencia peptídica. Todos los aminoácidos utilizados estaban
protegidos con Fmoc-N^{\alpha} excepto el último
bloque de construcción en la secuencia, TrT-Mpa.
Los aminoácidos trifuncionales estaban protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Gln(Trt),
D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) y
Cys(Acm).
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, es desprotegido de sus grupos protectores ácido lábil
utilizando una solución de 91,5% de ATF, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT y
5,0% de agua durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El producto
en bruto
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH_{2},
se precipita mediante la adición de 10 volúmenes de éter, se filtra
y se seca al vacío para obtener un polvo fino. El producto se
identifica por LC/MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 27 de
referencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido
Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 13) en bruto (115 g, preparado tal como se describe en
el Ejemplo 25) se purificó en columna C_{18}
RP-HPLC de preparación. Las fracciones que
contenían >95% de producto puro se combinaron y se diluyeron a
concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad
equimolar de yodo en ácido acético con mezclado intenso a
temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo se
neutralizó mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La
solución resultante se cargó en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purificó para obtener las fracciones
que contienen trifluoroacetato de desmopresina con una pureza
>98,5%. Tras el intercambio del contraión las fracciones se
recogieron y se liofilizaron para obtener 37,2 g del péptido anhidro
final. El péptido tenía una pureza >99,5% (por HPLC). ATF
residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 28 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink (200 g). El primer
aminoácido (Fmoc-Pro) se cargó en la resina por un
procedimiento de acoplamiento normal tras la eliminación del grupo
Fmoc procedente de la resina. Tras el lavado de la resina, se
introdujo un segundo aminoácido
(Fmoc-Thr(tBu)) para continar la
prolongación de la secuencia. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se
activaron in situ utilizando TBTU/HOBt y posteriormente se
acoplaron a la resina durante 60 minutos. Como base orgánica se
utilizó diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento fue indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retiró con piperidina al 20%
en DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados estaban protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales estaban protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Cys(Trt), Ser(tBu),
Asn(Trt), Gln(Trt), Thr(tBu), Glu(tBu),
His(Trt), Lys(Boc), Arg(Pbf), Tyr(tBu),
y Cys(Acm). Se emplearon tres equivalentes de los aminoácidos
activados en las reacciones de acoplamiento. Al final de la
síntesis el péptido-resina se lavó con DMF, seguido
de DCM y se secó al vacío para obtener 670 g de
péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina utilizando una solución de
94% de ATF, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT, 2,5% de agua durante 1,5 horas
a temperatura ambiente. El producto se precipitó mediante la
adición de 10 volúmenes de éter, se filtró y se secó al vacío para
obtener 345,0 g de polvo. Se identificó por LC/MS como
Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 29 de
referencia
El péptido
Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH_{2}
(SEC. ID. nº 14) en bruto (345 g, preparado tal como se describe en
el Ejemplo 28) se purificó en columna C_{18}
RP-HPLC de preparación. Las fracciones que contenían
>95% de producto puro se combinaron y se diluyeron a
concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad
equimolar de yodo en ácido acético con mezclado intenso a
temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo se
neutralizó mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La
solución resultante se cargó en una columna C_{18}
RP-HPLC y se purificó para obtener las fracciones
que contienen trifluoroacetato de calcitonina con una pureza
>98,5%. Tras el intercambio del contraión a acetato las
fracciones se recogieron y se liofilizaron para obtener 64 g del
péptido anhidro final. El péptido tenía >99,5% de pureza (por
HPLC). ATF residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 30 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina amídica Rink. Después de la
separación del grupo protector Fmoc de la resina se cargó el primer
aminoácido (Fmoc-Gly) en la resina en una etapa de
acoplamiento normal para proporcionar la carga de aproximadamente
0,7 mmoles/g. Después de lavar la resina y eliminar el grupo
protector Fmoc se introdujo el segundo aminoácido
(Fmoc-Leu) para iniciar la segunda etapa de
acoplamiento. Los aminoácidos protegidos por Fmoc se activaron
in situ utilizando TBTU/HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Como base orgánica se utilizó
diisopropiletilamina o colidina durante el acoplamiento. La
terminación del acoplamiento fue indicada por la prueba de la
ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo protector Fmoc en
la \alpha-amina se retiró con piperidina al 20% en
DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron cada vez con otro
aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos
utilizados estaban protegidos con Fmoc-N^{\alpha}.
Los aminoácidos trifuncionales estaban protegidos en la cadena
lateral de la forma siguiente: Tyr(tBu), Cys(Acm) y
Cys(Trt). Se utilizaron tres equivalentes de los aminoácidos
activados en las reacciones de acoplamiento. Al final de la síntesis
el péptido-resina se lavó con DMF, seguido de DCM y
se secó al vacío para obtener péptido-resina
seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina junto con la separación de
grupos protectores de ácido lábil utilizando una solución de 95% de
ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a temperatura
ambiente. El producto se precipitó mediante la adición de 10
volúmenes de éter, se filtró y se secó al vacío para obtener el
producto en bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 31 de
referencia
El péptido
H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH_{2}
(SEC. ID. nº 15) en bruto preparado tal como se describe en el
Ejemplo 30 se purificó en columna C_{18} RP-HPLC
de preparación. Las fracciones que contenían >95% de producto
puro se combinaron y se diluyeron a concentraciones de
aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad equimolar de yodo en
ácido acético con mezclado intenso a temperatura ambiente y
posteriormente el exceso de yodo se neutralizó mediante una pequeña
cantidad de ácido ascórbico. La solución resultante se cargó en una
columna C_{18} RP-HPLC y se purificó para obtener
las fracciones que contenían oxitocina con una pureza >98,5%. Se
trataron las fracciones para reemplazar el contraión, se recogieron
y se liofilizaron para obtener el péptido anhidro final. ATF
residual <0,25%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 32 de
referencia
La síntesis del péptido se llevó a cabo por un
procedimiento Fmoc SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) paso
a paso normal partiendo de la resina
2-Cl-Trt. El primer aminoácido
(Fmoc-His(Trt)) se cargó en la resina en una
etapa preliminar para proporcionar la carga de aproximadamente 0,3
mmoles/g. Después del lavado de la resina se eliminó el grupo Fmoc
mediante tratamiento con solución de piperidina/DMF y se introdujo
el segundo aminoácido (Fmoc-Arg(Pbf)) para
iniciar la primera etapa de acoplamiento. Los aminoácidos protegidos
por Fmoc se activaron in situ utilizando TBTU y HOBt
(N-hidroxibenzotriazol) y posteriormente se acoplan
a la resina durante 50 minutos. Se utilizaron
diisopropiletilamina o colidina como base orgánica durante el
acoplamiento. La terminación del acoplamiento fue indicada por la
prueba de la ninhidrina. Tras el lavado de la resina, el grupo
protector Fmoc en la \alpha-amina se retiró con
piperidina al 20% en DMF durante 20 min. Estas etapas se repitieron
cada vez con otro aminoácido según la secuencia peptídica. Todos los
aminoácidos utilizados estaban protegidos con
Fmoc-N^{\alpha}. Los aminoácidos trifuncionales
estaban protegidos en la cadena lateral de la forma siguiente:
Lys(Boc), Arg(Pbf), Ser(tBu), Asp(tBu),
Hys(Trt), Cys(Trt) y Cys(Acm). En las
reacciones de acoplamiento se emplearon tres equivalentes de los
aminoácidos activados. Al final de la síntesis el
péptido-resina se lavó con DMF, seguido de DCM y se
seca al vacío para obtener péptido-resina seco.
El péptido, preparado como se describió
anteriormente, se escindió de la resina acompañado de desprotección
simultánea de grupos protectores de ácido lábil utilizando una
solución de 95% de ATF, 2,5% de TIS y 2,5% de EDT durante 2 horas a
temperatura ambiente. El producto se precipitó mediante la adición
de 10 volúmenes de éter, se filtró y se secó al vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 33 de
referencia
El péptido
H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-
Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH (SEC. ID. nº 16) en bruto preparado tal como se describe en el Ejemplo 32, se purificó en columna C_{18} RP-HPLC de preparación. Las fracciones que contenían >95% de producto puro se combinaron y se diluyeron a concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con mezclado intenso a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo se neutralizó mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La solución resultante se cargó en una columna C_{18} RP-HPLC y se purificó para obtener las fracciones que contenían péptido con una pureza >98,5%. Tras el tratamiento para reemplazar el contraión a citrato se recogieron las fracciones y se liofilizaron para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH (SEC. ID. nº 16) en bruto preparado tal como se describe en el Ejemplo 32, se purificó en columna C_{18} RP-HPLC de preparación. Las fracciones que contenían >95% de producto puro se combinaron y se diluyeron a concentraciones de aproximadamente 1 g/l. Se añadió una cantidad equimolar de yodo en ácido acético con mezclado intenso a temperatura ambiente y posteriormente el exceso de yodo se neutralizó mediante una pequeña cantidad de ácido ascórbico. La solución resultante se cargó en una columna C_{18} RP-HPLC y se purificó para obtener las fracciones que contenían péptido con una pureza >98,5%. Tras el tratamiento para reemplazar el contraión a citrato se recogieron las fracciones y se liofilizaron para obtener el péptido anhidro final. ATF residual <0,25%.
Claims (12)
1. Procedimiento para purificar un péptido por
intercambio de contraión en el que el contraión del péptido se
intercambia con un contraión farmacéuticamente aceptable, que
comprende:
- a)
- cargar un péptido en una columna de RP-HPLC;
- b)
- lavar la columna con una solución acuosa de una sal del contraión farmacéuticamente aceptable; y
- c)
- eluir el péptido de la columna con una mezcla disolvente de un disolvente orgánico y un ácido del contraión farmacéuticamente aceptable,
en el que la solución acuosa presenta un pH de
por lo menos 6 y el péptido es atosiban o lanreótido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sal del contraión farmacéuticamente aceptable es el
acetato de amonio, el citrato de amonio o el pamoato de amonio.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el pH de la solución acuosa es 8.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que por lo menos una base ajusta el pH de la solución acuosa.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la base es amoniaco, hidróxido de amonio, metilamina,
etilamina, dimetilamina, dietilamina, metiletilamina, trimetilamina
o trietilamina.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la base es el hidróxido de amonio.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla disolvente presenta un pH inferior a 6.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el disolvente orgánico es por lo menos uno de entre
acetonitrilo, metanol, etanol, isopropanol o THF.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el disolvente orgánico es el acetonitrilo.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ácido del contraión farmacéuticamente aceptable es el
ácido acético, el ácido cítrico o el ácido pamoico.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el péptido eluido presenta no más de 0,25% en peso de
contraión residual.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el péptido eluído presenta no más de 200 partes por millón
de contraión residual.
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