JPH10500969A - カルジオジラチンフラグメントの調製方法、高度に精製されたカルジオジラチンフラグメント及びそれらの調製のための中間生成物類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、カルジオジラチンフラグメントの調製方法、高く精製されたカルジオジラチンフラグメント及び前記フラグメントの調製のための適切な中間体に関する。さらに、本発明は細管電気泳動に基づいて、ペプチド不純物を有さず、そして単一の移動ピークを示す高く精製されたカルジオジラチンフラグメント、及びその調製のための適切な方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 カルジオジラチンフラグメントの調製方法、高度に精製されたカルジオジラチン フラグメント及びそれらの調製のための中間生成物類 本発明は、カルジオジラチンフラグメントの調製方法、高度に精製されたカル ジオジラチンフラグメント及び前記フラグメントの調製のための適切な中間体類 に関する。 本発明は、下記一般式（Ｉ）： Ｒ¹−ANP(105−121)−Ｒ² （Ｉ） 〔式中、ANP(105−121)はアミノ酸配列〔配列番号１〕を表わし、 Ｒ¹は配列ANP(90−104)〔配列番号２〕のアミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸 の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、 Ｒ²は配列ANP(122−126)〔配列番号３〕のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸 の鎖長を有するそのフラグメントを表わす〕で表わされる、17〜37個のアミノ酸 の鎖長を有するカルジオジラチンフラグメントの調製方法に向けられ、ここで合 成は少なくとも３個の部分的フラグメントの縮合を通してもたらされ、そして式 Ｉのカルジオジラチンフラグメントを得るためのその部分的フラグメントの縮合 はアミノ酸位置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹、及びアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹間で実施され ることを特徴とする。 カルジオジラチンはナトリウム利尿亢進性ペプチド類のペプチドである。それ らのペプチドは、身体における塩及び水のバランスを調節することにおいて重要 な役割を演じる。ナトリウム利尿亢進性ホルモンの原型がカルジオジラチンであ り、これはまた、心房性ナトリウム利尿亢進性ペプチド(CDD/ANP)としても文献 に言及されている。カルジオジラチンの単離及びカルジオジラチンの生物学的活 性フラグメントの調製は、US−PS4,751,284（W．G．Forssmannなど.，Klin，Woc henschr．1986，64(Suppl．VI)，4-12)から知られている。カルジオジラチン及 びそのフラグメントの単離及び特性決定、並びにそれらの生理学的性質に対する 総説は、Eur．J．Clin．Invest．1986，16；439-451(W．G．Forssmann)に公開さ れている。EP 0,349,545から、32個のアミノ酸の鎖長を有する特定のカルジオジ ラチンフラグメントが知られている。他方、このフラグメントはまた、ウロジラ チン（INN：ウラリチド）としても文献に言及されている。さらに、US 5,354,90 0（サントリー）は、α−hANPとして知られている、28個のアミノ酸の鎖長を有 する生理学的活性フラグメントを記載する。さらなる生物学的活性カルジオジラ チンフラグメント又はそれらの誘導体類がEP 0,180,615に記載されている。そこ では、特に、Ｎ末端でのアミノ酸位置Arg¹⁰²で始まり、そしてＣ末端でのアミノ 酸位置Arg¹²⁵又はArg¹²⁶で終結するカルジオジラチンフラグメントが記載されて いる。名称カルジオジラチンの代わりに、文献はしばしば、名称“心房性ナトリ ウム利尿亢進性ペプチド”(ANP)を用いている。以下に使用されるカルジオジラ チンアミノ酸の配列の番号づけにおいては、EP 0,349,545においてANF／CDD(１ −126)ペプチド(＝ANP)について使用される命名法が用いられる。 すべてのこれまで知られている生物学的活性カルジオジラチンフラグメントの 共通する構造特徴は、17個のアミノ酸の安定した環をもたらす、アミノ酸Cys¹⁰⁵ とCys¹²¹との間でのジスルフィド架橋の形成である。この環の形成は、カルジオ ジラチン誘導体類の生物学的活性を実質的に担当すると思われる。位置Cys¹⁰⁵で 、カルジオジラチンフラグメントは、０〜15個のアミノ酸の鎖長を有するアミノ 酸鎖Ｒ¹により置換され、そして位置Cys¹²¹で、０〜５個のアミノ 酸の鎖長を有する鎖Ｒ²により置換される。〔配列番号１〕において、その中央 の領域ANP(105−121)は、線状化された形で表わされる。 INN 名称ウラリチドに関してのカルジオジラチンフラグメントANP(95−126)は 、利尿活性、及び平滑血管筋に対しての弛緩効果を有する、特に安定し且つ生物 学的活性のヒトペプチドであり、これは32個のアミノ酸から形成され、そして下 記配列を有し、ここでペプチドにおける位置11及び27でのシステインアミノ酸は ジスルフィド架橋を形成している： ウロジラチンはヒト尿に見出される。EP 0,349,545はアルギン酸を用いて尿か らウロジラチンを回収するための方法を記載しており、ここでアルギン酸に吸着 されるペプチドが溶出され、その溶出物が従来の精製方法に従って分別され、そ して活性画分が平滑筋に対するウロジラチンの弛緩効果の試験に基づく試験を用 いて回収される。 さらに、EP 0,349,545は、Boc 手段に続いてABI 標準プログラムに従って固相 で、Merrifield法（J．Am．Chem．Soc．1963，85；2149-2156）を用いてのウロ ジラチンの段階的な化学合成を記載する。さらに、この特許明細書は、部分的フ ラグメントANP(99−126)からのウロジラチンの調製を記載している。このフラグ メントは、固相に結合され、そして第２の部分的フラグメント、すなわちテトラ ペプチド Boc-Thr(But)-Ala-Pro-Arg(Tos)と反応せしめられる。縮 合から得られるペプチドANP(95−126)が支持体から除去され、保護基の除去の後 、環化にゆだねられ、そして続いて、それ自体既知の手段に従って処理され、そ して精製される。 同様に、EP 0,180,615は、固体支持体を用いての化学合成を記載しており、こ こでＮ末端の方向にＣ末端から開始する、そこに記載されるカルジオジラチンフ ラグメントの形成が好結果を伴ってもたらされている。ここで、部分的フラグメ ントを通しての縮合は記載されていない。 しかしながら、文献に記載される方法に従って調製されるカルジオジラチンフ ラグメントは、合成により、ペプチド不純物が、続く精製方法によってさえ除去 され得ないで最終生成物中に導入されているので、臨床研究のために及び医薬製 品としての公認のために必要な純度を有さなかった。それらの免疫原性質のため に、不純物は、患者に投与される場合、不所望の副作用を生ぜしめ、その結果、 治療的な適用は危険性を包含する。さらに、その合成は適切な技術的入力下で小 規模でのみ達成され、そして大規模な製造のためには経済的に適切ではなかった 。さらに、合成のための既知の方法のもう１つの欠点は存在する可能性あるラセ ミ化の危険性であり、これのために、低い純度、低い生物学的活性及び不十分な 収率を伴って、ウロジラチンが得られた。存在する合成によりときどき生じる生 成物のラセミ化は、最終生成物の不十分な光学的不純性をもたらし、そしてそれ らの不純物は時々、除去され得ず、又はひじょうに高い技術的な入力によっての み除去され得る。 従って、上記欠点を含まないカルジオジラチンフラグメントの化学合成のため の改良された方法を開発することが本発明の目的である。 本発明の目的は、ペプチドフラグメントの特異的選択を用いてMe rrifield法に基づいてカルジオジラチンフラグメントの合成を実施することによ って達成される。 驚くべき事には、合成の進行は、カルジオジラチンフラグメントが３個の部分 的フラグメントを用いて形成される場合、最適であることが見出され、そして式 Ｉのカルジオジラチンフラグメントをもたらす前記部分的フラグメントの縮合は 、その形成が部分的フラグメントの縮合、及びアミノ酸位置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹、及 びアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹間での結合形成を通してもたらされるような態様 で実施される。この方法は、式Ｉのカルジオジラチンフラグメントが、従来から 知られている合成法に比較して、高い収率及び高い純度で得られる点において好 都合である。 式Ｉのカルジオジラチンフラグメントの合成は、最初、配列Ｒ¹−ANP(105−10 8)，ANP(109−120)、及びANP(121)−Ｒ²を有する３個の部分的フラグメントがMe rrifield法に従って調製されるような手段でもたらされる。次に、好ましくは、 式Ｉのカルジオジラチンフラグメントを提供する３個の部分的フラグメントの縮 合は、２つの部分的な段階でもたらされ、それによれば、第１段階において、部 分的フラグメントANP(109−120)、及びCys¹²¹−Ｒ²のアミノ酸位置Gly¹²⁰及びCy s¹²¹間での縮合がもたらされ、そして中間体フラグメントANP(109−121)−Ｒ²が 形成される。次に、続く第２段階において、このようにして得られたフラグメン トANP（109−121)−Ｒ²と第３の部分的フラグメントＲ¹−ANP(105−108)との縮 合がもたらされ、式Ｉの所望のカルジオジラチンフラグメントが形成される。本 発明の方法を用いる場合、カルジオジラチンフラグメントの収率は、出発材料と して使用される個々のカルジオジラチン部分的フラグメントの量に基づいて、15 〜20％である。 配列Ｒ¹−ANP(105-108)，ANP(109-120)、及びANP(121)− Ｒ²を有する３個の部分的フラグメントがMerrifield法に従って調製され、ここ で、前記配列に存在する官能基（ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、又はメルカ プト基）を有するアミノ酸は、適切な保護基により置換される。たとえば、適切 な保護基として、次の基が可能である： ヒドロキシ基のための保護基：Boc（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、tBu（ｔ −ブチルエーテル）； アミノ官能基のための保護基：Fmoc（９−フルオレニルメトキシカルボニル） 、Pbf（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホ ニル）、Pmc（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル） 、Trt（トリチル）； カルボキシ基のための保護基：OtBu（ｔ−ブチルエステル）； メルカプト基のための保護基：Acm（アセトアミドメチル）又はTrt。 ここで、次の保護基が次のアミノ酸のために好ましい：アミノ酸Thr，Asn，Ty r 又はSer のためにtBu；アミノ酸Arg のためにPbf又はPmc；アミノ酸Cys のた めにAcm；アミノ酸Asp のためにOtBu；アミノ酸Gln，Asn又はCys のためにTrt。 Fmoc法(B．Rinikerなど.，Tetrahedron 1993，49；9307-9320)を用いる場合、 保護された部分的フラグメントANP(109−120)，Ｒ¹−ANP(105−108)、及びANP（ 121）−Ｒ²が固体支持材料上に形成される。Merrifield合成に一般的に使用され るすべての材料は、固体支持材料として作用できる。支持材料としては、アミノ メチル又はベンズヒドリルアミノ化合物などにより官能化されたポリスチレンが 好ましい。４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸リンカ ーによる樹脂へのペプチドフラグメントの過酸−感受性結合は、側鎖保護を妨げ ないでそれらの除去を可能にする 。前記フラグメントは、種々の溶媒による消化により精製される。従って、３個 の出発フラグメントANP(109−120)，Ｒ¹−ANP（105−108)、及びANP（121）−Ｒ² は、Ｃ−末端遊離カルボキシル基を伴ってそして良好な純度で得られる。支持 樹脂上にペプチドを形成する場合、１つのアミノ酸の付加のいずれの１段階でも 収率はほぼ定量的であり、そして約97〜99％である。 図１における流れ図は、例としてウロジラチンANP(95−126)に関する合成の原 理を示す。ここで、フラグメントＨ−15−32−OtBu（５）〔ANP(109−121)−Ｒ² （ここで、Ｒ²＝ANP(122−126)）のANP 命名に対応する〕とフラグメント Boc− １−14−OH（１）〔この命名はフラグメントＲ¹−ANP(105−108)（ここで、Ｒ¹ ＝ANP(95−104)）の一般名称に対応する〕との縮合がもたらされる。このフラグ メント（５）は、フラグメントFmoc−15−26−OH（２）〔ANP(109−120)のANP命 名に対応する〕及びＨ−27−32−OtBu（3c）〔ANP（121）−Ｒ²のANP命名に対応 する〕から合成される。図２は、保護基により合成され、そして変性されたフラ グメントを表わす。 次の段階においては、フラグメント（3a）のカルボキシル基がｔ−ブチルエス テル（3b）に転換される(Rinikerなど.，22nol Europ．Peptide Symposium Inte rlakem，September 1992(L7))。フラグメント（3b）からのFmoc基の続く除去は 、生成物（3c）を導びく。これはフラグメント（２）と融合され、フラグメント （４）がもたらされる。Fmoc保護基の除去及び得られたフラグメント（５）とフ ラグメント（１）との縮合は、十分に保護されたウロジラチン（６）を導びく。 スカベンジャーとしてのトリフルオロ酢酸及び１，３−プロパンジチオールによ る処理による保護基の除去は、ヨウ素溶液による酸化により粗ウロジラチン（８ ）に環化される線状ペプ チド（７）を付与する。これは脱塩され、精製され、そして続いて、凍結乾燥せ しめられ得る。他のカルジオジラチンフラグメントの合成は、類似する態様で行 なわれる。 前記部分的フラグメントANP(109−120)，Ｒ¹−ANP(105−108)及びANP（121） −Ｒ²を包含する本発明の合成は、式Ｉのすべてのカルジオジラチンフラグメン トに適用され得る。特に、Ｒ¹が配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖又は０〜15個の アミノ酸を有するそのフラグメントを表わすカルジオジラチンフラグメントが可 能である。１〜15又は３〜10個のアミノ酸の鎖長、特に配列ANP(95−104)，ANP( 99−104)及びANP(102−104)がＲ¹のために好ましい。特に、基Ｒ²は配列ANP(122 −126)の鎖長又は１〜５個のアミノ酸を有するそのフラグメントを表わす。しか しながら、好ましくは、配列ANP(122−126)及びANP(122−125)がＲ²のために可 能である。 好ましくは、カルジオジラチンフラグメントANP(95−126)，ANP(99−126)及び ANP(102−126)が本発明の方法に従って調製され得る。本発明の方法により調製 されるカルジオジラチンフラグメント並びに縮合のために必要とされる部分的フ ラグメントは、約96〜99.9％、特に約98〜99％の範囲の高い光学純度を有する。 同様に、合成は、ヒトANP の配列における１又は複数のアミノ酸が他のアミノ 酸により置換されている、カルジオジラチンフラグメントのすべての他の誘導体 類のために適切である。ここで、アミノ酸の置換は、アミノ酸の対応する置換、 欠失又は挿入を包含する。たとえば、単一又は複数のアミノ酸がその対応するＤ −アミノ酸により置換され得る（EP 0,180,615）。同様に、類似する構造及び15 〜20個のアミノ酸の対応する環状の塩基性構造を有するペプチドがこの手段で調 製され得る。そのようなペプチドの例は、BNP（脳ナトリウム利尿亢進性ペプチ ド）又はCNP（Ｃ−タイプのナトリウム利尿 亢進性ペプチド）である。それらのペプチドの構造は、J．Hypertension 1994， 12；329-336（N．C．Davidson and A．D．Struthers）に記載されている。 同様に、本発明は、本発明の方法に従っての式Ｉのカルジオジラチンフラグメ ントの調製のために使用される、ANP の新規部分的フラグメントに向けられる。 さらに特定には、対応するペプチドフラグメントは、タイプＲ¹−ANP(105−10 8)（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸の鎖 長を有するそのフラグメントを表わす）のもの、及び保護基により変性されたそ れらの誘導体類である。ここで、特に、Ｒ¹は上記意味を有する。もう１つの新 規のペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ANP(109−120)を有するフラグメン ト、並びに保護基により変性されたその誘導体類であり、これは部分的フラグメ ントANP（121）−Ｒ²との縮合において出発材料として使用される。同様に、そ の対応するANP（121）−Ｒ²タイプのペプチドフラグメントは、本発明の新規性 及び対象物、並びに保護基により変性されたそれらの誘導体類を表わし、ここで Ｒ²は配列ANP(122−126)のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそ のフラグメントを表わす。特に、Ｒ²は前で言及された意味を有する。さらに、 本発明は、第１反応段階においてもたらされた部分的フラグメントANP(109−120 )及びANP（121）−Ｒ²の縮合反応から形成される中間体ANP(109−121)−Ｒ²にも 向けられる。 さらに、本発明は、高い純度の式Ｉのカルジオジラチンフラグメントの調製方 法にも関する。カルジオジラチンフラグメントに対する従来の合成方法及び続く 精製方法は、多くの場合、単に97〜98％の範囲のペプチド純度が達成される欠点 を有した。 EP 0,349,545は、ウロジラチンの場合、約98％の純度レベルを記 載しており；そこにおいて、調製されるウロジラチンの量は数mgの範囲での小さ な実験室規模に単に基づかれていた。そこにおいて例５に記載される精製方法は 、LHカラムクロマトグラフィー（溶離剤：１％ AcOH，１％ TFEtOH)及び続くTSK カラムクロマトグラフィー(Fractogel TSK-HW 40)（ここで、10％ AcOH 及び１ ％ TFEtOH の水溶液が溶離剤として使用されている）に基づかれている。最終精 製段階においては、分離用HPLCを用いての精製がもたらされ、溶離剤に対するさ らなる指摘はされていない。臨床試験を実施するために数グラムの範囲での多量 のウロジラチンの調製に対するのちの実験の範囲内では、複数の精製段階にもか かわらず、合成された材料は98％以上の純度レベル以上には精製されていないこ とが決定された。 比較できる情況が、EP 0,180,615に記載されるカルジオジラチンフラグメント の事例をもたらした。たとえば、ここにおいては、タイプG25F Sephadex カラム クロマトグラフィーによるフラグメントANP(102−126)（例III．Ａ．３において は、hANVP(127−151)として言及されている）の精製が記載されており、ここで 0.5ＭのAcOHが溶離剤として使用されていた。0.01ＭのNH₄OAc／300mM のNH₄OAc ，pH4.5 の溶媒グラジエントを用いてのCM Sepharose又はCM Celluloseイオン交 換クロマトグラフィーによる続く精製段階においては、ペプチドは約97％の純度 で得られる。同様に、この達成された純度は、薬剤製剤にかける必要条件のため には満足のいくものではない。 驚くべきことには、粗生成物が逆相HPLCカラムを用いて精製され、そしてカル ジオジラチンフラグメントがトリエチルアンモニウムホスフェート（TEAP）及び アセトニトリルを含む緩衝システムを用いて溶出される場合、高い純度の式Ｉの カルジオジラチンフラグメ ントが調製され得ることが見出された。ここで、好ましくは、溶出緩衝液のpH値 は２〜５、より特定には２〜３の値に調節される。好ましくは、タイプ₁₈カラム 、たとえばYMC Ｃ₁₈により充填されたBiotage モジュールタイプが逆相HPLCカラ ムとして使用される。このカラムは、精製されるべきカルジオジラチンフラグメ ントを負荷する前、トリエチルアンモニウムホスフェート緩衝液により平衡化さ れる。たとえば、10〜200mM のTEAP、好ましくは50mMのTEAPの溶液が適切な緩衝 溶液として使用される。カラム平衡化のための緩衝液の量はカラムサイズに依存 し、そしてこれはまた、精製されるべきペプチドの量にも依存する。経験によれ ば、75×300mm(直径×長さ)のカラム体積が、３〜８ｇの粗ペプチド中のペプチ ドの量を精製するために必要とされる。この場合、50mMのTEAP緩衝溶液約300ml が平衡化のために必要とされる。続いて、カルジオジラチンフラグメントの濃縮 された粗生成物の溶液が適用される。たとえば、溶媒として、10％酢酸が適切で ある。その後、ペプチドが、溶離剤（２：３の体積比での10〜200mM のTEAP水溶 液及びアセトニトリルの混合物）の連続した充填により連続したグラジエントで 溶離される。ペプチドの溶出は、溶離剤の連続したグラジエントが適用される場 合に特に好都合であり、ここで、22〜28％の溶媒グラジエントが90分間にわたっ て使用され、続いて28％の溶媒グラジエントが10分間、そして最後に、28〜40％ のグラジエントが20分間使用される。好ましくは、流速は100〜200ml/分、より 特定には約140ml/分である。本発明の精製方法においては、１：３〜２：１（ｖ ／ｖ）、より特定には約２：３（ｖ／ｖ）の混合比での水中、トリエチルアンモ ニウムホスフェート及びアセトニトリルの緩衝液混合物が溶出緩衝液として使用 される。緩衝溶液のpH値は、２〜５、好ましくは２〜３及びより特定には約2.25 である。TEAPは、10〜200mM、好まし くは20〜100mM、及びより特定には約50mMの濃度で使用され得る。本発明によれ ば、50mMのTEAP（pH2.25）を用いてカラムを平衡化し、そして２：３の比で50mM のTEAP（pH2.25）及びアセトニトリルを含む緩衝液によりペプチドを溶離するこ とによって、逆相HPLCにおいて、最適な分離が達成される。 たとえば、水性の 0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を用いての従来の精製方法は 、ウロジラチンの例において図５に示されるように、粗生成物に含まれる極性不 純物をさらに分離することができない（図６）。対照的に、本発明で使用される 溶離剤の場合、両不純物の有意な分離が存在する（図５を参照のこと）。さらに 、本発明の溶離剤の使用は、HPLCクロマトグラムにおける基線が絶対的に定常な 進路を取り、ところがTFA の場合、強いドリフトが観察されることにおいて好都 合である。さらに、TFA の使用は、高い背圧がHPLCカラム上に形成する欠点を有 するが、これは本発明の溶離剤の場合、存在しない。 本発明の方法を用いる場合、高純度の式Ｉのカルジオジラチンフラグメントが 少なくとも99％そして好ましくは99.9％までの純度で得られる。場合によっては 、カルジオジラチンフラグメントは続いて、それらの生理学的に許容できる塩、 たとえば酢酸塩又はクエン酸に転換され得る。得られるカルジオジラチンフラグ メントは、逆相HPLCが単一のピークを示すのみならずまた、細管電気泳動（CE） のより感度の高い方法が単一の移動ピークを提供するよう、ペプチド不純物を実 質的に有さない。ウロジラチンの場合、後者は、MS分析において3505.9±１の質 量を示し、副生成物は検出されない。細管電気泳動の使用は、従来技術に従って 得られるカルジオジラチンフラグメントと本発明のカルジオジラチンフラグメン トとの間の差異の卓越した例示を可能にする。図３は、従来技術に従って生成さ れたウロジラチン生成バッチのCEクロマトグラムを示す。ここで、生成物はまだ 不純物を含むことが明白に見られる。対照的に、図４は本発明の方法に従って生 成され、そして相応して精製されたウロジラチン生成バッチのCEクロマトグラム を示す。その生成は、他のペプチド不純物を実質的に含まず、そして細管電気泳 動において単一の移動ピークを示すことが明白に明らかである。 従って、本発明は、高純度の式Ｉのカルジオジラチンフラグメントが細管電気 泳動及びMS分析により検出できる実質的なペプチド不純物を含まず、そして細管 電気泳動を用いての純度分析が単一の移動ピークを示すことにおいて注目すべき である前記高純度のペプチドフラグメントに向けられる。 同様に、本発明の精製方法はまた、類似する高純度のペプチド化合物、たとえ ばBNP（脳ナトリウム利尿亢進性ペプチド）、CNP（Ｃ−タイプのナトリウム利尿 亢進性ペプチド）又はその誘導体の調製のためにも適切である。ANP の環状構造 は、17個のアミノ酸の環状の環を形成する、アミノ酸配列内の２つのシステイン 残基の酸化に基づかれている。15〜20個のアミノ酸、特に17個のアミノ酸の特徴 的な環状構造をまた形成する他のペプチド、たとえばBNP 又はCNP は、本発明の 精製方法を用いて同じ態様で高純度形に転換され得る。 次の態様においては、本発明が選択された代表的なカルジオジラチンフラグメ ントANP(95−126)，ANP(99−126)及びANP(102−126)を用いて示されるであろう 。例１ Merrifield 方法に従っての固相合成の一般的な方法 ａ）支持樹脂上での固相合成 合成されるべきペプチドのＣ−末端から開始して、Ｎ−末端でFmoc基により保 護された第１アミノ酸（AA）を、支持樹脂に結合する （Fmoc−OHMPB−支持樹脂）。0.66ｍモルの標準バッチにより、続いて、Fmoc保 護基を、ピペリジン及びＮ−メチルピロリジンの溶媒混合物（１：４ｖ／ｖ）10 0ml を添加することによって除去する。次に、樹脂緩衝液を10分間撹拌し、続い て濾過し、そして再び、ピペリジン及びNMP 溶媒混合物100ml を添加する。次に 、この懸濁液を、10分間撹拌し、濾過し、そして続いて、NMP 及びイソプロパノ ールにより洗浄し、そして反応の完全性をKaiser試験を用いて調ベる。 その後、次のアミノ酸を樹脂に結合する。初めに、NMP 中、ジイソプロピルエ タニルアミン(DIPEA)の 0.5Ｍ溶液20ｍモルを樹脂に添加し、次にNMP中、１−ヒ ドロキシベンゾトリアゾール（OHBT）の 0.5Ｍ溶液 2.5ｍモル、続いてNMP 25ml に結合されるべきアミノ酸10ｍモルを添加する。その後、NMP 中、TBTU（２−（ 1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウ ムテトラフルオロボレート）の0.25Ｍ溶液11ｍモルを添加し、そして10分間撹拌 する。反応の完結性をKaiser試験を用いて調べる。続いて、樹脂を濾過し、そし てNMP により洗浄する。 この方法を、所望の鎖長のアミノ酸のペプチド鎖が樹脂上に形成されるまで、 同じ手段で続ける。合成が完結した場合、樹脂を40℃で一定重量に乾燥せしめる 。 ｂ）支持樹脂からの保護されたペプチドの除去 10個の吸引漏斗の各々を、メタノール75ml及びピリジン３mlにより充填する。 段階ａ）に従って調製された支持樹脂50ｇを、吸引漏斗上で１分間、無水塩化メ チレン中、１％ TFAの溶液250ml と共に10度撹拌し、そしてそれぞれの吸引漏斗 中に直接的に濾過する。それらの10個の濾液を薄層クロマトグラフィーを用いて 調べる。生成物を含む画分を組合し、そして蒸発乾燥せしめる。樹脂を脱イオン 水と共に粉砕し、そして結晶性残留物を濾過し、そして乾燥せしめる。例２ フラグメントANP(109−120)の調製 例１の一般方法に従って、及びFmoc−Gly −OHMPB−支持樹脂 273ｇ（130ｍモ ルに対応する）から出発して、十分に保護されたカルジオジラチンフラグメント ANP（109−120）170.3ｇを得る。例３ フラグメントANP(121−126)の調製 例１の一般方法に従って、及びFmoc−Tyr −OHMPB −支持樹脂 264ｇ（115ｍ モルに対応する）から出発して、十分に保護されたカルジオジラチンフラグメン トANP（121−126）150.7ｇを得る。ここで、そのフラグメントのＮ−末端はFmoc 基により保護されている。 続いて、前記フラグメントのＣ−末端での末端ヒドロキシ基を、OtBu保護基に 転換する。エステル化のために、十分に保護されたフラグメント 149ｇを、トリ フルオロエタノール 500ml及びクロロホルム 4.1ｌに溶解する。これに、続いて TBTA（ｔ−ブチル−２，２，２−トリクロロアセトイミデート）141mlを添加し 、そしてその溶液を還流下で１時間加熱する。反応が完結した後、その溶液を濃 縮し、結晶性−油状性残留物を得、ジイソプロピルエーテル 6.8ｌを添加し、そ してその懸濁液を室温で14時間撹拌する。生成物を濾過し、そして一定の質量に 乾燥せしめる。図２に示されるフラグメント3b（136.7ｇ）を得る。 続いて、フラグメントのＮ−末端でのFmoc保護基を除去し、そして図２に示さ れるフラグメント3cへの転換をもたらす。そのためには、 DMF 1.8ｌ／及びジエ チルアミン74ml中、フラグメント3b(135.7ｇ)の溶液を、室温で３時間撹拌する 。その溶液を真空下で蒸発 し、完全に乾燥せしめる。残留物を脱イオン水 1.4ｌにより消化し、そして濾過 する。湿った生成物をMTBE（メチルｔ−ブチルエーテル）３ｌに取る。その溶液 を飽和Nacl溶液(２×100ml)により抽出し、そして有機相を硫酸ナトリウムによ り乾燥せしめる。溶液を500ml の体積に濃縮する。イソプロピルエーテル1.5ｌ の添加に続いて、２時間の撹拌をもたらす。生成物を濾過し、そして乾燥せしめ る。収量は、図２に示されるフラグメント3c(104.6ｇ)である。例４ フラグメントANP(121−125)の調製 例３に記載されるのと類似する態様で、Fmoc−Arg（Pbf）−OHMPB −支持樹脂 264ｇから出発し、そして前記方法に従って、カルジオジラチンフラグメントAN P（121−125）115.1ｇを得る。例５ フラグメントANP(95−108)の調製 例１の一般方法に従って、及びFmoc−GLy −OHMPB −支持樹脂 210ｇから出発 して、十分に保護されたカルジオジラチンフラグメントANP(95−108)151.5ｇを 得る。例６ フラグメントANP(99−108)の調製 例１の一般方法に従って、及びFmoc−GLy −OHMPB −支持樹脂 190ｇから出発 して、十分に保護されたカルジオジラチンフラグメントANP(99−108)145.1ｇを 得る。例７ フラグメントANP(102−108)の調製 例１の一般方法に従って、及びFmoc−GLy −OHMPB −支持樹脂 220ｇから出発 して、十分に保護されたカルジオジラチンフラグメントANP（102−108）165.3ｇ を得る。例８ 中間生成物への部分的フラグメントの縮合 フラグメントANP(109−120)を、次の一般方法に従って、Ｃ−末端フラグメン トANP（121）−Ｒ²との縮合により中間フラグメントANP(109−121)−Ｒ²に転換 する。 フラグメントANP(109−120)（このアミノ末端はFmoc基により保護される）を 、Ｎ−メチルピロリドンに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾ ール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボ レート）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエチルアミン を、前記溶液に撹拌しながら、室温で添加する。その後、Ｃ−末端で適切な保護 基を付与され、そしてＮ−メチルピロリドンに溶解されたフラグメントANP（121 ）−Ｒ²を前記溶液に添加する。次に、反応を薄層クロマトグラフィーによりモ ニターする。約２時間後、反応は完結する。次に、その反応混合物を、撹拌しな がらジイソプロピルエーテル上に滴下し、そして続いて約30分間、撹拌する。沈 殿物を硬質フィルター上の磁製吸引漏斗上で濾過し、そしてジイソプロピルエー テルにより２度洗浄する。その後、残留物をアセトニトリルに懸濁し、そして撹 拌しながら室温で消化する。続いて、生成物を磁製吸引漏斗上で濾過し、アセト ニトリルにより再洗浄し、そして40℃で真空チャンバーにおいて一定重量に乾燥 せしめる。このようにして得られた粗生成物は、Fmoc保護基によりアミノ末端で 保護されたカルジオジラチンフラグメントFmoc−ANP(109−121)−Ｒ²を表わす。 その後、Fmoc基を既知の方法に従って除去し、中間生成物Ｈ−ANP（109−121） −Ｒ²を得る。例９ フラグメントANP(109−120)とANP(121−126)との縮合によるANP (109-126) の生成 例８に記載される一般方法に従って、Fmoc−ANP(109−120)21.6ｇをＮ−メチ ルピロリドン 650mlに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾール −１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー ト） 3.2ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 1.5ｇ及びジイソプロピルエ チルアミン 3.5mlを、室温で撹拌しながら前記溶液に添加する。その後、Ｎ−メ チルピロリドン 150mlに溶解されたＨ−ANP（121−126）−OtBuの溶液を添加す る。続いて、その反応を薄層クロマトグラフィーによりモニターする。約２時間 後、反応は完結する。次に、その反応混合物を、ジイソプロピルエーテル４ｌ上 に撹拌しながら滴下し、そして続いて、約30分間、撹拌する。沈殿物を、硬質フ ィルター上の磁製吸引漏斗上で濾過し、そしてジイソプロピルエーテル 500mlに より２度洗浄する。その後、残留物をアセトニトリル 600mlに懸濁し、そして室 温で撹拌しながら消化する。続いて、生成物を磁製吸引漏斗上で濾過し、アセト ニトリル 300mlにより再洗浄し、そして40℃で真空チャンバーにおいて一定重量 に乾燥せしめる。続いて、32.3ｇの量でこのようにして得られた粗生成物Fmoc− ANP(109−126)を、ジエチルアミンの添加により、保護されていないANP(109−12 6)に転換する。その収量は30.2ｇである。例10 フラグメントANP(109−120)とANP(121−125)との縮合によるANP(109−125)の生 成 例８に記載される一般方法に従って、Fmoc−ANP(109−120)18.6ｇをＮ−メチ ルピロリドン 600mlに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾール −１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー ト）3.0ｇ、１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール 1.2ｇ及びジイソプロピルエチルアミン3.0mlを、室温で 撹拌しながら前記溶液に添加する。その後、Ｎ−メチルピロリドン 150mlに溶解 されたＨ−ANP(121−125)−OtBuの溶液を添加する。続いて、その反応を薄層ク ロマトグラフィーによりモニターする。約２時間後、反応は完結する。次に、そ の反応混合物を、ジイソプロピルエーテル４ｌ上に撹拌しながら滴下し、そして 続いて、約30分間撹拌する。沈殿物を、硬質フィルター上の磁製吸引漏斗上で濾 過し、そしてジイソプロピルエーテル 450mlにより２度洗浄する。その後、残留 物をアセトニトリル 500mlに懸濁し、そして室温で撹拌しながら消化する。続い て、生成物を磁製吸引漏斗上で濾過し、アセトニトリル 250mlにより再洗浄し、 そして40℃で真空チャンバーにおいて一定重量に乾燥せしめる。続いて、29.1ｇ の量でこのようにして得られた粗生成物Fmoc−ANP(109−125)を、ジエチルアミ ンの添加により、保護されていないANP(109−125)に転換する。その収量は28.2 ｇである。例11 部分的フラグメントの縮合による最終生成物の生成 中間ANP(109−121)−Ｒ²を、次の一般方法に従って、アミノ末端フラグメント Ｒ¹−ANP(105−108)との縮合により最終生成物Ｒ¹−ANP(105−121)−Ｒ²に転換 する。 Ｒ¹−フラグメントANP(105−108)（このアミノ末端は適切な保護基により保護 される）を、Ｎ−メチルピロリドンに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベン ゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラ フルオロボレート）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びジイソプロピルエ チルアミンを、前記溶液に撹拌しながら、室温で添加する。その後、Ｃ−末端で 適切な保護基を付与され、そしてＮ−メチルピロリドンに溶解さ れたフラグメントANP(109−121)−Ｒ²を前記溶液に添加する。次に、反応を薄層 クロマトグラフィーによりモニターする。約２時間後、反応は完結する。次に、 その反応混合物を、撹拌しながらジイソプロピルエーテル上に滴下し、そして続 いて約30分間、撹拌する。沈殿物を硬質フィルター上の磁製吸引漏斗上で濾過し 、そしてジイソプロピルエーテルにより２度洗浄する。その後、残留物をアセト ニトリルに懸濁し、そして撹拌しながら室温で消化する。続いて、生成物を磁製 吸引漏斗上で濾過し、アセトニトリルにより再洗浄し、そして40℃で真空チャン バーにおいて一定重量に乾燥せしめる。このようにして得られた粗生成物は、適 切な保護基によりアミノ末端及びＣ−末端で保護されたカルジオジラチンフラグ メントＲ¹−ANP(105-121)−Ｒ²を表わす。その後、保護基を既知の方法に従って 除去し、中間生成物Ｈ−ANP(109−121)−Ｒ²を得る。保護基の完全な除去に続い て、その得られるカルジオジラチンフラグメントを、酸化により及び既知の方法 に従って、たとえばヨウ素を用いて、環化された誘導体に転換する。例12 フラグメントANP(109−126)とANP(95−108)との縮合によるANP(95−126)の生成 ａ）ANP(95−126)の調製 例11に記載される一般方法に従って、Boc＋ANP(95−108)20.6ｇをＮ−メチル ピロリドン 400mlに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾール− １−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート ）2.7ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 1.3ｇ及びジイソプロピルエチル アミン 2.7mlを、室温で撹拌しながら前記溶液に添加する。その後、Ｎ−メチル ピロリドン 400mlに溶解されたＨ−ANP(109−126)−OtBu 29.4ｇ の溶液を添加する。続いて、その反応を薄層クロマトグラフィーによりモニター する。約２時間後、反応は完結する。次に、その反応混合物を、ジイソプロピル エーテル 6.5ｌ上に撹拌しながら滴下し、そして続いて、約30分間、撹拌する。 沈殿物を、硬質フィルター上の磁製吸引漏斗上で濾過し、そしてジイソプロピル エーテル500mlにより２度洗浄する。その後、残留物をアセトニトリル 600mlに 懸濁し、そして室温で撹拌しながら消化する。続いて、生成物を磁製吸引漏斗上 で濾過し、アセトニトリル 500mlにより再洗浄し、そして40℃で真空チャンバー において一定重量に乾燥せしめる。続いて、42.5ｇの量でこのようにして得られ た粗生成物 Boc−ANP(95−126)−OtBuを、保護されていないANP(95−126)に転換 する。その収量は27.5ｇである。 ｂ）保護された線状ANP(95−126)の環化 保護されていないANP(95−126)60ｇを、脱イオン水中、５％酢酸16ｌ（ｖ／ｖ ）に溶解し、そして0.02Ｍのメタノール性ヨウ素溶液 570mlの添加により酸化す る。反応は５分後に完結する。過剰のヨウ素を、0.1Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶 液の添加により破壊する。得られる環化溶液を、さらなる処理に直接的にゆだね る。例13 フラグメントANP(109−126)とANP(99−108)との縮合によるANP(99−126)の生成 例12に記載される方法に従って、 Boc−ANP(99−108)22.5ｇをＮ−メチルピロ リドン 400mlに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート） 2 .9ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 1.4ｇ及びジイソプロピルエチルアミ ン 2.8mlを、室温で撹拌しながら前記溶液に添加する。その後、Ｎ−メチルピロ リドン 400mlに溶解されたＨ−ANP(109−126)−OtBu 30.6ｇの溶液を添加する 。続いて、その反応を薄層クロマトグラフィーによりモニターする。約２時間後 、反応は完結する。次に、その反応混合物を、ジイソプロピルエーテル 6.5ｌ上 に撹拌しなから滴下し、そして続いて、約30分間、撹拌する。沈殿物を、硬質フ ィルター上の磁製吸引漏斗上で濾過し、そしてジイソプロピルエーテル 500mlに より２度洗浄する。その後、残留物をアセトニトリル 600mlに懸濁し、そして室 温で撹拌しながら消化する。続いて、生成物を磁製吸引漏斗上で濾過し、アセト ニトリル 500mlにより再洗浄し、そして40℃で真空チャンバーにおいて一定重量 に乾燥せしめる。続いて、44.7ｇの量でこのようにして得られた粗生成物 Boc− ANP(99−126)−OtBuを、保護されていないANP(99−126)に転換する。その収量は 28.1ｇである。例14 フラグメントANP(109−126)とANP(102−108)との縮合によるANP(102−126)の生 成 例12に記載される方法に従って、Boc−ANP(102−108)20.4ｇをＮ−メチルピロ リドン 360mlに溶解する。続いて、TBTU（２−（1H−ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート） 2 .7ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール 1.4ｇ及びジイソプロピルエチルアミ ン 2.6mlを、室温で撹拌しながら前記溶液に添加する。その後、Ｎ−メチルピロ リドン 400mlに溶解されたＨ−ANP(109−126)−OtBu 30.1ｇの溶液を添加する 。続いて、その反応を薄層クロマトグラフィーによりモニターする。約２時間後 、反応は完結する。次に、その反応混合物を、ジイソプロピルエーテル 6.5ｌ上 に撹拌しながら滴下し、そして続いて、約30分間、撹拌する。沈殿物を、硬質フ ィルター上 の磁製吸引漏斗上で濾過し、そしてジイソプロピルエーテル 500mlにより２度洗 浄する。その後、残留物をアセトニトリル 600mlに懸濁し、そして室温で撹拌し ながら消化する。続いて、生成物を磁製吸引漏斗上で濾過し、アセトニトリル 5 00mlにより再洗浄し、そして40℃で真空チャンバーにおいて一定重量に乾燥せし める。続いて、41.2ｇの量でこのようにして得られた粗生成物 Boc−ANP(102−1 26)−OtBuを、保護されていないANP(102−126)に転換する。その収量は26.9ｇで ある。例15 ANP(95 −126)の精製及び高純度形の調製 ａ）環化されたウロジラチン〔ANP(95-126)〕の濃縮 環化溶液（脱イオン水中、５％ AcOH 約17ｌ（ｖ／ｖ）は約60ｇの環化された ウロジラチンを含む）を、緩衝液A3（脱イオン水中、 0.1％のTFA（ｖ／ｖ）100 0mlにより平衡化されたガラス製カラム（直径：70mm、長さ：900mm，Vydac 218 TPB 2030により充填される）に適用する（流速 130ml／分）。 ポンプによる適用が終った後すぐに、ペプチドを、連続したグラジエント（40 分間、０％の緩衝液Ｂ；90分間、15〜35％の緩衝液Ｂ；10分間、35％の緩衝液Ｂ ；流速 130ml／分）での緩衝液B3（脱イオン水中、0.1％の TFA／ACN,２：３， ｖ／ｖ）の連続的充填により溶出する。 HPLC分析によるモニターに基づいて75％以上の純度を示すウロジラチン画分を 一緒にする。それらの一緒にされた画分を、１体積当量の脱イオン水により希釈 し、そして 300mlの緩衝液A3により平衡化されたBiotage モジュール（直径：75 mm、長さ：300mm，YMC Ｃ₁₈により充填される、120A，10μｍ）上に適用する（ 流速 140ml／分）。 続いて、濃縮されたペプチドを、100％の緩衝液B3によるカラムの洗浄により 溶出し、そしてアセトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 90％以上の純度を有するウロジラチン17〜20ｇを得る。 ｂ）濃縮されたウロジラチンの精製 濃縮されたウロジラチン 4.5ｇを、脱イオン水中、10％ AcOH（ｖ／ｖ）250ml に溶解し、そして 300mlの緩衝液A4（脱イオン水中、50mMのTEAP，pH2.25）に より平衡化されたBiotage モジュール（直径：75mm、長さ：300mm，YMC Ｃ₁₈に より充填される、120A，10μｍ）上に適用する。 ペプチドを、連続的グラジエント（90分間、22〜28％のＢ；10分間、28％のＢ ；20分間、28〜40％のＢ；流速 140ml／分）での緩衝液B4（脱イオン水中、50mM のTEAP（pH2.25）／ACN,２：３，ｖ／ｖ）の連続的充填により溶出する。 HPLC分析によるモニターに基づいて99％以上の純度及び 0.5％よりも低い不純 物を示すウロジラチン画分を一緒にする。それらの一緒にされた画分を、１体積 当量の脱イオン水により希釈し、そして1000mlの緩衝液B3により前もって清浄さ れ、そして続いて 300mlの緩衝液A3により平衡化されたBiotage モジュール上に ポンプで適用する。 純粋な生成物を、1500mlの緩衝液B3によるカラムの洗浄により溶出し、そして アセトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、 2.3〜2.7 ｇの高純度のウロジラチンである。 ｃ）ウロジラチン×TFA のウロジラチンアセテートへの再塩化 2.5ｇの高純度ウロジラチン×TFA 塩を、脱イオン中、５％のAcOH 80ml（ｖ／ ｖ）に溶解し、そして５％ AcOH により洗浄されたク ロマトグラフィーカラム（直径：20mm、長さ：300mm，40ml のMerck イオン交換 体IIIアセテート形により充填される）に適用する。５％ AcOH 40mlによる洗浄 を行なう。約 125mlの溶離剤を、同じイオン交換カラムにさらにもう１度適用す る。５％ AcOH 55mlによる洗浄を行なう。溶離剤約 180mlを、ポリスルホン膜（ 直径47mm， 0.2μｍ）上で濾過する。その溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、2.05〜2.30ｇの高純度ウロジラチンアセテートである。例16 ANP(99 −126)の精製及び高純度形の調製 ａ）環化されたカルジオジラチンフラグメントANP(99−126)の濃縮 例15ａ）と同様に、環化溶液（約50ｇのペプチド含有量を有する、脱イオン水 中、５％ AcOH 約15ｌ（ｖ／ｖ）を、1000mlの緩衝液A3（脱イオン水中、 0.1％ のTFA（ｖ／ｖ））により平衡化されたガラス製カラム上に適用する（流速 130m l／分）。ポンプによる適用の完結後すぐに、ペプチドを、連続的グラジエント （40分間、０％の緩衝液Ｂ；90分間、15〜35％の緩衝液Ｂ；10分間、35％の緩衝 液Ｂ；流速 130ml／分）での緩衝液B3（脱イオン水中、 0.1％の TFA／ACN,２： ３，ｖ／ｖ）の連続的な充填により溶出する。HPLC分析によるモニターに基づい て75％以上の純度を示すペプチド画分を一緒にする。それらの一緒にされた画分 を、１体積当量の脱イオン水により希釈し、そして 300mlの緩衝液A3により平衡 化されたBiotage モジュール上に適用する（流速 140ml／分）。続いて、濃縮さ れたペプチドを、100％の緩衝液B3によるカラムの洗浄により溶出し、そしてア セトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、90％以上の純度を有するカルジオジラチンフラグメ ントANP(99−126)14〜17gである。 ｂ）濃縮されたANP(99−126)の精製 例16ａ）に従って濃縮されたカルジオジラチンフラグメント3.5ｇを、脱イオ ン水中、10％ AcOH（ｖ／ｖ）200ml に溶解し、そして 300mlの緩衝液A4（脱イ オン水中、50mMのTEAP，pH2.25）により平衡化されたBiotage モジュール上に適 用する（流速 140ml／分）。ペプチドを、連続的グラジエント（90分間、22〜28 ％のＢ；10分間、28％のＢ；20分間、28〜40％のＢ；流速 140ml／分）での緩衝 液B4（脱イオン水中、50mMのTEAP（pH2.25）／ACN,２：３，ｖ／ｖ）の連続的充 填により溶出する。 HPLC分析によるモニターに基づいて、99％以上の純度及び 0.5％よりも高くな い不純物を示すペプチド画分を一緒にする。それらの一緒にされた画分を、１体 積当量の脱イオン水により希釈し、そして1000mlの緩衝液B3により前もって清浄 され、そして続いて、300mlの緩衝液A3により平衡化されたBiotageモジュール上 にポンプで適用する。 純粋な生成物を、1500mlの緩衝液B3によるカラムの洗浄により溶出し、そして アセトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、1.7〜2.2 ｇの高純度カルジオジラチンフラグメントANP(99−126 )である。例14ｃ）に記載される方法に類似して、このフラグメントを、その対 応する酢酸塩に転換する。その結果は、 1.3〜1.7 ｇの高純度ANP(99−126)酢酸 塩である。例17 ANP(102 −126)の精製及び高純度形の調製 ａ）環化されたカルジオジラチンフラグメントANP(102−126)の濃縮 例15ａ）と同様に、環化溶液（約65ｇのペプチド含有量を有する、脱イオン水 中、５％ AcOH 約18ｌ（ｖ／ｖ））を、1000mlの緩衝液A3（脱イオン水中、 0.1 ％のTFA（ｖ／ｖ））により平衡化されたガラス製カラム上に適用する（流速 13 0ml／分）。ポンプによる適用の完結後すぐに、ペプチドを、連続的グラジエン ト（40分間、０％の緩衝液Ｂ；90分間、15〜35％の緩衝液Ｂ；10分間、35％の緩 衝液Ｂ；流速 130ml／分）での緩衝液B3（脱イオン水中、 0.1％の TFA／ACN,２ ：３，ｖ／ｖ）の連続的な充填により溶出する。HPLC分析によるモニターに基づ いて75％以上の純度を示すペプチド画分を一緒にする。それらの一緒にされた画 分を、１体積当量の脱イオン水により希釈し、そして 300mlの緩衝液A3により平 衡化されたBiotage モジュール上に適用する（流速 140ml／分）。続いて、濃縮 されたペプチドを、 100％の緩衝液B3によるカラムの洗浄により溶出し、そして アセトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、90％以上の純度を有するカルジオジラチンフラグメントANP(102 −126)19〜23ｇである。 ｂ）濃縮されたANP(102−126)の精製 例17ａ）に従って濃縮されたカルジオジラチンフラグメント 4.8ｇを、脱イオ ン水中、10％ AcOH（ｖ／ｖ）200ml に溶解し、そして 300mlの緩衝液A4（脱イ オン水中、50mMのTEAP，pH2.25）により平衡化されたBiotage モジュール上に適 用する（流速 140ml／分）。ペプチドを、連続的グラジエント（90分間、22〜28 ％のＢ；10分間、28％のＢ；20分間、28〜40％のＢ；流速 140ml／分）での緩衝 液B4（脱イオン水中、50mMのTEAP（pH2.25）／ACN,２：３，ｖ／ｖ）の連続的充 填により溶出する。 HPLC分析によるモニターに基づいて、99％以上の純度及び 0.5％ よりも高くない不純物を示すペプチド画分を一緒にする。それらの一緒にされた 画分を、１体積当量の脱イオン水により希釈し、そして1000mlの緩衝液B3により 前もって清浄され、そして続いて、300mlの緩衝液A3により平衡化されたBiotage モジュール上にポンプで適用する。 純粋な生成物を、1500mlの緩衝液B3によるカラムの洗浄により溶出し、そして アセトニトリルを蒸発する。残る溶液を凍結乾燥せしめる。 その結果は、 1.9〜2.4 ｇの高純度カルジオジラチンフラグメントANP(102−1 26)である。例14ｃ）に記載される方法に類似して、このフラグメントを、その 対応する酢酸塩に転換する。その結果は、1.5〜1.9 ｇの高純度ANP(99−126)酢 酸塩である。例18 ANP(95 −126)の例を用いての分析用HPLC試験 ａ）TEAP緩衝液（pH2.25）による溶出 ANP(95−126)50μｇを、分析用HPLCカラム上に注入する。20分間の25〜45％の 緩衝液Ｂの線状グラジエント（緩衝液Ａ：50mMのTEAP，pH2.25；緩衝液Ｂ：２： ３の体積比でのＡ及びアセトニトリルの混合物）が溶離剤として作用した。図５ におけるクロマトグラムは、使用される溶離剤による分離され得る２つの極性不 純物を含むことを示す。図５に関する説明： 20分で25〜45％ 緩衝液Ａ：50mMのTEAP，pH2.25 緩衝液Ｂ：Ａ：ACN（２：３） 215nm 1.0ml／Ｃ−Nr． 4040465Ｃ Ｍ＋Ｎ 250／１／４°／３ Nuc 300 A5 ｕ Ｃ18 Ｄ−2500 方法：50μｇ；TAG243 CH：１；ピーク不良：5000 ファイル：１；計算方法：領域％；表：０；濃度：領域 ｂ） 0.1％ TFA（トリフルオロ酢酸）による溶出 例18ａ）に類似して、同じ生成バッチのANP(95−126)50μｇを、分析用HPLCカ ラム上に適用する。20分間の30〜50％の緩衝液Ｂの線状グラジエント（緩衝液Ａ ：水中、 0.1％ TFA；緩衝液Ｂ：２：３の体積比でのＡ及びアセトニトリルの混 合物）が溶離剤として作用した。図６におけるクロマトグラムは、この溶離剤に よる含まれる不純物の分離がもたらされないことを示す。例ａ）におけるクロマ トグラムと比較する場合、主要ピークは広く、そして単離された生成物は、図５ のクロマトグラムにおいて認識され得る極性不純物の両者を含む。図６に関する説明： 20分で30〜50％ 緩衝液Ａ：水中、 0.1％ TFA 緩衝液Ｂ：Ａ：ACN（２：３） 215nm 1.0ml／Ｃ−Nr． 4011079Ｃ Ｍ＋Ｎ 250／１／４°／３ Nuc 300 LA 5u Ｃ18 Ｄ−2500 方法：50μｇ；TAG 142；CH：１；ピーク不良：5000 ファイル：２；計算方法：領域％；表：０；濃度：領域 例19 細管電気泳動による純度調べ 例15〜17のカルジオジラチンフラグメントの最終生成物の凍結乾燥されたサン プルを、１mg／mlの濃度で水に溶解し、そしてすぐに分析する。細管電気泳動を 、次の条件下でBeckman P/ACE 2100システムを用いて行なった。 細管：Supelco による融合シリカ、分離の長さ50cm、内径75μｍ 検出皮長：200nm 注入期間：１秒 分離緩衝液：100mM のリン酸ナトリウム、pH2.5；0.02％のヒドロ キシプロピルメチルセルロース 分離パラメーター：25℃，80μＡ，30分 図３は、従来技術のウロジラチンについて得られたクロマトグラムを示す。 図４は、例15に従って得られた高純度ウロジラチンについてのクロマトグラム を示す。 両クロマトグラムの比較は、本発明のウロジラチンが従来技術のウロジラチン とは有意に異なることを示す。本発明のウロジラチンは、ペプチド不純物を含ま ない。 略語の見出し アミノ酸 Ala Ｌ−アラニン Asn Ｌ−アスパラギン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Arg Ｌ−アルギニン Cys Ｌ−システイン Gln Ｌ−グルタミン Gly グリシン Ile Ｌ−イソロイシン Leu Ｌ−ロイシン Met Ｌ−メチオニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Ser Ｌ−セリン Thr Ｌ−トレオニン Tyr Ｌ−チロシン 保護基 Boc ｔ−ブチルオキシカルボニル Fmoc ９−フルオレニルメトキシカルボニル OtBu ｔ−ブチルエステル Pbf ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾ フラン−５−スルホニル Pmc ２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６− スルホニル tBu ｔ−ブチルエーテル Acm アセトアミドメチル Trt トリチル 試薬／溶媒 ACN アセトニトリル TFA トリフルオロ酢酸 TEAP トリエチルアンモニウムホスフェート

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月１０日 【補正内容】 請求の範囲 １．下記一般式（Ｉ）： Ｒ¹−ANP(105−121)−Ｒ² （Ｉ） 〔式中、ANP(105−121)はアミノ酸配列〔配列番号１〕を表わし、 Ｒ¹は配列ANP(90−104)〔配列番号２〕のアミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸 の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、 Ｒ²は配列ANP(122−126)〔配列番号３〕のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸 の鎖長を有するそのフラグメントを表わす〕で表わされる、17〜37個のアミノ酸 の鎖長を有するカルジオジラチンフラグメントの調製方法であって、合成が少な くとも３個の部分的フラグメントの縮合を通して行われ、ここで式Ｉのカルジオ ジラチンフラグメントを得るための前記部分的フラグメントの縮合がアミノ酸位 置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹、及びにアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹間で実施され、そして部 分フラグメントANP(109−120)を介して行われることを特徴とする方法。 ２．（ａ）第１段階において、前記部分的フラグメントの縮合が、部分的フラ グメントANP(109−120)とCys¹²¹−Ｒ²からのアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹との間 でもたらされ、そして （ｂ）第２段階において、前記部分的フラグメントの縮合が、段階（ａ）に従 って得られた部分的フラグメントANP(109−121)−Ｒ²と部分的フラグメントＲ¹ −ANP(105−108)からのアミノ酸位置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹との間でもたらされる請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．前記Ｒ²がアミノ酸配列ANP(122−126)を表わし、第１段階において、フラ グメントANP(109−126)−OtBuが、Merrifieldの方法に従って固体支持相上に合 成され、そしてそれから除去されるフ ラグメントFmoc−ANP(109−120)−OHとフラグメントＨ−ANP(121−126)−OtBuと の縮合により調製され、そして続いて、Fmoc保護基がその得られるフラグメント Fmoc−ANP(109−126)−OtBuから除去されることを特徴とする請求の範囲第１又 は２項記載の方法。 ４．前記Ｒ¹がアミノ酸配列ANP(95−104)を表わし、前記式Ｉのカルジオジラ チンフラグメントが、Merrifieldの方法に従って固体支持相上に合成され、そし てそれから除去されるフラグメント Boc−ANP(95−108)−OHとフラグメントＨ− ANP(109−126)−OtBuとの縮合により調製され、そして続いて、前記保護基がそ の得られるフラグメント Boc−ANP(95−126)−OtBuから除去されることを特徴と する請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。 ５．３種の部分的フラグメントＲ¹−ANP(105−108)、ANP(109−120)又はANP（ 121）−Ｒ²をMerrifieldの方法に従って形成する場合、固体支持材料への結合が 過酸−感受性リンカーによりもたらされることを特徴とする請求の範囲第１〜４ のいづれか１項記載の方法。 ６．前記アミノ及びヒドロキシ保護基が、得られる十分に保護されたカルジオ ジラチンフラグメントＲ¹−ANP(105−121)−Ｒ²から除去され、Cys¹⁰⁵で保護基 Ａcmにより保護されたフラグメントが形成され、そして続いて、前記保護基Ａcm が、そのようにして得られたフラグメントから除去され、そしてその後、カルジ オジラチンフラグメントが酸化により環化されることを特徴とする請求の範囲１ 〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記Ｒ¹がANP(95-104)，ANP(99−104)及びANP(102-104)の群から選択され たアミノ酸配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第１〜６のいづれか１項記 載の方法。 ８．前記Ｒ²がANP(122−125)及びANP(122−126)の群から選択 されたアミノ酸を表わすことを特徴とする請求の範囲第１〜７のいづれか１項記 載の方法。 ９．合成17〜37個のアミノ酸の鎖長を有するカルジオジラチンフラグメントＲ¹ −ANP(105−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖又は０〜 15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、そしてＲ²は配列ANP (122−126)のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメン トを表わす）の調製方法であって、粗生成物の精製が逆相HPLCカラムを用いて行 なわれ、そして前記カルジオジラチンフラグメントがトリエチルアンモニウムホ スフェート及びアセトニトリルを含む緩衝システムにより溶出されることを特徴 とする方法。 10．前記溶出が、２〜５、より特定には２〜３のpH値で実施されることを特徴 とする請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記逆相HPLCカラムがトリエチルアンモニウムホスフェート緩衝液により 平衡化され、その後、カルジオジラチンフラグメントの濃縮された粗生成物が適 用され、そして続いて、カルジオジラチンフラグメントが、連続的なグラジエン トで、水中、トリエチルアンモニウムホスフェート及びアセトニトリル（２：３ ｖ／ｖ）の緩衝混合物の連続的な充填により溶出されることを特徴とする請求の 範囲第９又は10項記載の方法。 12．合計17〜37個のアミノ酸の鎖長を有するカルジオジラチンフラグメントＲ¹ −ANP(105−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖又は０〜 15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、そしてＲ²は配列ANP (122−126)のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメン トを表わす）であって、カルジオジラチンフラグメントが少なくとも99％の純度 を有しそして細管電気泳動を用いての純度分析において単一 の移動ピークを示すことを特徴とする高純度のカルジオジラチンフラグメント。 13．前記Ｒ¹がANP(95−104)，ANP(99−104)及びANP(102-104)の群から選択さ れたアミノ酸配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第12項記載の高純度のカ ルジオジラチンフラグメント。 14．前記Ｒ²がANP(122−125)及びANP(122−126)の群から選択されたアミノ酸 配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第12又は13項記載の高純度のカルジオ ジラチンフラグメント。 15．ANP(95−126)，ANP(99−126)，ANP(102−126)及びANP(103−126)の群から 選択される請求の範囲第12〜14のいづれか１項記載の高純度のカルジオジラチン フラグメント。 16．請求の範囲第12〜15のいづれか１項記載の高純度のカルジオジラチンフラ グメント及び生理学的に許容できるアジュバント又は添加剤を含む医薬製剤。 17．アミノ酸配列Ｒ¹−ANP(105−108)（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のア ミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わす）を 有するペプチドフラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体の、請求 項１〜８のいづれか１項に記載のカルジオジラチンフラグメントの製造方法にお ける使用。 18．アミノ酸配列ANP(109−120)を有するペプチドフラグメント、及び保護基 により変性されたその誘導体。 19．アミノ酸配列ANP(109−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ²は配列ANP(122−126)のア ミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わす）を 有するペプチドフラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体の、請求 項１〜８のいづれか１項に記載のカルジオジラチンフラグメントの製造における 使用。 20．アミノ酸配列Cys¹²¹−Ｒ²（ここで、Ｒ²は配列ANP(122− 126)のアミノ酸鎖又は３〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを有 するペプチドフラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体の、請求項 １〜11のいづれか１項に記載のカルジオジラチンフラグメントの製造のための使 用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 アデルマン，クヌート ドイツ連邦共和国，デー−30177 ハノー ファー，シュライデンシュトラーセ ５ (72)発明者 クレッセン，クリスチャン ドイツ連邦共和国，デー−67742 ラウテ レケン，ハウプトシュトラーセ 26

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記一般式（Ｉ）： Ｒ¹−ANP(105−121)−Ｒ² （Ｉ） 〔式中、ANP(105−121)はアミノ酸配列〔配列番号１〕を表わし、 Ｒ¹は配列ANP(90−104)〔配列番号２〕のアミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸 の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、 Ｒ²は配列ANP（122−126）〔配列番号３〕のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ 酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わす〕で表わされる、17〜37個のアミノ 酸の鎖長を有するカルジオジラチンフラグメントの調製方法であって、合成が少 なくとも３個の部分的フラグメントの縮合を通してもたらされ、式Ｉのカルジオ ジラチンフラグメントを付与するための前記部分的フラグメントの縮合がアミノ 酸位置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹、及びアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹間で実施されることを 特徴とする方法。 ２．（ａ）第１段階において、前記部分的フラグメントの縮合が、部分的フラ グメントANP(109−120)とCys¹²¹−Ｒ²からのアミノ酸位置Gly¹²⁰とCys¹²¹との間 でもたらされ、そして （ｂ）第２段階において、前記部分的フラグメントの縮合が、段階（ａ）に従 って得られた部分的フラグメントANP(109−121)−Ｒ²と部分的フラグメントＲ¹ −ANP(105−108)からのアミノ酸位置Gly¹⁰⁸とArg¹⁰⁹との間でもたらされる請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．前記Ｒ²がアミノ酸配列ANP(122−126)を表わし、第１段階において、フラ グメントANP(109−126)−OtBuが、Merrifieldの方法に従って固体支持相上に合 成され、そしてそれから除去されるフラグメントFmoc−ANP(109−120)−OHとフ ラグメントＨ−ANP(121 −126)−OtBuとの縮合により調製され、そして続いて、Fmoc保護基がその得られ るフラグメントFmoc−ANP(109−126)−OtBuから除去されることを特徴とする請 求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４．前記Ｒ¹がアミノ酸配列ANP(95−104)を表わし、前記式Ｉのカルジオジラ チンフラグメントが、Merrifieldの方法に従って固体支持相上に合成され、そし てそれから除去されるフラグメント Boc−ANP(95−108)−OHとフラグメントＨ− ANP(109−126)−OtBuとの縮合により調製され、そして続いて、前記保護基がそ の得られるフラグメント Boc−ANP(95−126)−OtBuから除去されることを特徴と する請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。 ５．３種の部分的フラグメントＲ¹−ANP(105−108)、ANP(109−120)又はANP（ 121）−Ｒ²をMerrifieldの方法に従って形成する場合、固体支持材料への結合が 過酸−感受性リンカーによりもたらされることを特徴とする請求の範囲第１〜４ のいづれか１項記載の方法。 ６．前記アミノ及びヒドロキシ保護基が、得られる十分に保護されたカルジオ ジラチンフラグメントＲ¹−ANP(105−121)−Ｒ²から除去され、Cys¹⁰⁵で保護基 Ａcmにより保護されたフラグメントが形成され、そして続いて、前記保護基Ａcm が、そのようにして得られたフラグメントから除去され、そしてその後、カルジ オジラチンフラグメントが酸化により環化されることを特徴とする請求の範囲１ 〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記Ｒ¹がANP(95−104)，ANP(99−104)及びANP(102-104)の群から選択さ れたアミノ酸配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第１〜６のいづれか１項 記載の方法。 ８．前記Ｒ²がANP(122−125)及びANP(122−126)の群から選択されたアミノ酸 を表わすことを特徴とする請求の範囲第１〜７のい づれか１項記載の方法。 ９．合成17〜37個のアミノ酸の鎖長を有する高純度のカルジオジラチンフラグ メントＲ¹−ANP(105−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖 又は０〜15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、そしてＲ² は配列ANP(122−126)のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するその フラグメントを表わす）の調製方法であって、粗生成物の精製が逆相HPLCカラム を用いて行なわれ、そして前記カルジオジラチンフラグメントがトリエチルアン モニウムホスフェート及びアセトニトリルを含む緩衝システムにより溶出される ことを特徴とする方法。 10．前記溶出が、２〜５、より特定には２〜３のpH値で実施されることを特徴 とする請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記逆相HPLCカラムがトリエチルアンモニウムホスフェート緩衝液により 平衡化され、その後、カルジオジラチンフラグメントの濃縮された粗生成物が適 用され、そして続いて、カルジオジラチンフラグメントが、連続的なグラジエン トで、水中、トリエチルアンモニウムホスフェート及びアセトニトリル（２：３ ｖ／ｖ）の緩衝混合物の連続的な充填により溶出されることを特徴とする請求の 範囲第９又は10項記載の方法。 12．合計17〜37個のアミノ酸の鎖長を有する高純度のカルジオジラチンフラグ メントＲ¹−ANP(105−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のアミノ酸鎖 又は０〜15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わし、そしてＲ² は配列ANP(122−126)のアミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するその フラグメントを表わす）であって、それが細管電気泳動を用いての純度分析にお いて、ペプチド不純物を実質的に有さず、そして単一の移動ピークを示すことを 特徴とする高純度のカルジオジラチンフラグメン ト。 13．前記Ｒ¹がANP(95-104)，ANP(99−104)及びANP(102-104)の群から選択され たアミノ酸配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第12項記載の高純度のカル ジオジラチンフラグメント。 14．前記Ｒ²がANP(122−125)及びANP(122−126)の群から選択されたアミノ酸 配列を表わすことを特徴とする請求の範囲第12又は13項記載の高純度のカルジオ ジラチンフラグメント。 15．ANP(95−126)，ANP(99−126)，ANP(102−126)及びANP(103−126)の群から 選択される請求の範囲第12〜14のいづれか１項記載の高純度のカルジオジラチン フラグメント。 16．請求の範囲第12〜15のいづれか１項記載の高純度のカルジオジラチンフラ グメント及び生理学的に許容できるアジュバント又は添加剤を含む医薬製剤。 17．アミノ酸配列Ｒ¹−ANP(105−108)（ここで、Ｒ¹は配列ANP(90−104)のア ミノ酸鎖又は０〜15個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わす）を 有するペプチドフラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体。 18．アミノ酸配列ANP(109−120)を有するペプチドフラグメント、及び保護基 により変性されたその誘導体。 19．アミノ酸配列ANP(109−121)−Ｒ²（ここで、Ｒ²は配列ANP(122−126)のア ミノ酸鎖又は０〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを表わす）を 有するペプチドフラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体。 20．アミノ酸配列Cys¹²¹−Ｒ²（ここで、Ｒ²は配列ANP(122−126)のアミノ酸 鎖又は３〜５個のアミノ酸の鎖長を有するそのフラグメントを有するペプチドフ ラグメント、及び保護基により変性されたその誘導体。