DE19513784A1 - Hochreines Urodilatin und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft hochreines Urodilatin mit einer Reinheit von mindestens 99% und ein Verfahren zur Herstellung dieses hochreinen Peptids. Gegenstand der Erfindung sind auch neue Peptidfragmente und deren Verwendung zur Herstellung von Urodilatin und verwandten pharmakologisch wirksamen Cardiodilatinfragmenten.

Urodilatin ist ein Humanpeptid mit diuretischer Wirkung und relaxierender Wirkung auf die glatte Gefäßmuskulatur, das aus 32 Aminosäuren aufgebaut ist und folgende Sequenz besitzt:

Urodilatin ist ein biologisch aktives Fragment des Peptidhormons Cardiodilatin. Cardiodilatin besteht aus 126 Aminosäuren und wird auch als Gamma-hANP (ANP/CDD-1- 126) bezeichnet (EP 0 349 545). Nach dieser Nomenklatur entspricht Urodilatin dem Fragment ANP/CDD-95-126.

Urodilatin kommt im menschlichen Urin vor. EP 0 349 545 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Urodilatin aus dem Urin mittels Alginsäure, in dem die an der Alginsäure adsorbierten Peptide eluiert werden, das Eluat nach üblichen Reinigungsmethoden fraktioniert und die aktive Fraktion mittels eines Tests, der auf der relaxierenden Wirkung des Urodilatins auf die glatte Muskulatur basiert, gewonnen wird. Das so gewonnene Urodilatin besitzt nicht die für klinische Studien notwendige Reinheit und die gewonnenen Mengen sind für klinische Studien unzureichend.

EP 0 349 545 beschreibt weiterhin die stufenweise Synthese von Urodilatin an fester Phase gemäß dem ABI-Standard- Programm nach der Boc-Strategie. Daneben wird in dieser Patentschrift die Herstellung von Urodilatin aus dem Cardiodilatinfragment ANP/CDD-99-126 beschrieben. Dieses Fragmente liegt entweder an eine Festphase gebunden vor und wird mit dem Tetrapeptid Boc-Thr(But)-Ala-Pro-Arg(Tos) umgesetzt das entstandene Peptid vom Träger abgespalten und nach Abspaltung der Schutzgruppen cyclisiert sowie in an sich bekannter Weise aufbereitet und gereinigt. Zum anderen kann die Urodilatinsynthese aus dem Peptidfragment ANP/CDD-99-126 auch erfolgen, indem man das Fragment in einem Lösungsmittel auflöst, das Tetrapeptid Boc-Thr(But)- Ala-Pro-Arg(Tos) zusammen mit Aktivierungsmitteln zugibt und nach Abspaltung der Schutzgruppen chromatographiert und weiter reinigt.

Die beiden letztgenannten Verfahren bergen den Nachteil eines potentiellen Racemisierungsrisikos in sich, wodurch das Urodilatin in geringerer Reinheit, geringerer biologischer Aktivität und ungenügender Ausbeute erhalten wird.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von Urodilatin zu entwickeln, mit dem das Peptid in mindestens 99%iger Reinheit und hoher Aktivität auf effektive Weise und in guten Ausbeuten hergestellt werden kann.

Diese Aufgabe der Erfindung wird gelöst, indem die Urodilatinsynthese basierend auf dem Merrifield-Verfahren über eine spezielle Auswahl von Peptidfragmenten durchgeführt wird, und die Reinigung des Rohproduktes mittels Umkehrphasen-HPLC mit ausgewählten Lösungsmitteln und Puffersystemen erfolgt.

Die erfindungsgemäße Synthese basiert auf der Kondensation des Fragments Boc-1-14-OH (1) mit dem Fragment H-15-32-OtBu (5), wobei letzteres aus den Fragmenten Fmoc-15-26-OH (2) und H-27-32-OtBu (3c) synthetisiert wird.

Das Fließschema in Abb. 1 verdeutlicht das Synthese­ prinzip, und Abb. 2 gibt die synthetisierten, geschützten Fragmente wieder.

Die geschützten Fragmente (1), (2) und (3a) werden auf einem festen Trägermaterial mittels Fmoc-Strategie aufgebaut (B. Riniker et al., Tetrahedron 1993, 49: 9307-9320). Als feste Trägermaterialien können alle in der Merrifield-Synthese gewöhnlich verwendeten Materialien dienen. Als Trägermaterial bevorzugt ist Polystyrol, welches als Aminomethyl- oder Benzhydrylverbindung funktionalisiert ist. Die supersäurelabile Bindung der Peptidfragmente an das Harz über den 4-(4-Hydroxymethyl-3- Methoxy-phenoxy)-buttersäure-Linker gestattet deren Abspaltung ohne Beeinträchtigung des Seitenkettenschutzes.

Die Fragmente werden durch Digerieren mit verschiedenen Lösungsmitteln gereinigt. Die drei Ausgangsfragmente (1), (2) und (3a) mit endständiger Carboxylgruppe werden so in guter Reinheit erhalten.

Im nächsten Schritt wird die Carboxylgruppe des Fragments (3a) in den t-Butylester (3b) überführt (siehe Riniker et al., 22nd Europ. Peptide Symposium, Interlaken, September 1992, (L 7)). Die nachfolgende Abspaltung der Fmoc-Gruppe aus dem Fragment (3b) führt zum Produkt (3c). Dieses wird mit dem Fragment (2) kondensiert und ergibt das Fragment (4). Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe und Kondensation des erhaltenen Fragments (5) mit Fragment (1) führt zum vollgeschützten Urodilatin (6). Die Abspaltung der Schutzgruppen durch Behandlung mit Trifluoressigsäure und 1,3-Propandithiol als Scavenger ergibt das lineare Peptid (7), das durch Oxidation mit Jodlösung zum rohen Urodilatin (8) cyclisiert wird. Dieses wird entsalzt und mit herkömmlichen, für Humanpeptide üblichen Reinigungsmethoden gereinigt, vorzugsweise wird es mittels Umkehrphasen-HPLC angereichert, durch Umkehrphasen-HPLC in einem zweiten System feingereinigt und zuletzt gegebenenfalls lyophilisiert. Es können die in der Umkehrphasen-HPLC für Peptide/Proteine üblichen Laufmittelsysteme angewandt werden.

Als ausgewählte Laufmittelsysteme kommen z. B. TFA/Acetonitril, NaH₂PO₄/Acetonitril und TEAP/Acetonitril zum Einsatz. Insbesondere sind als Puffersysteme 50 mM TEAP mit pH zwischen 2-5 geeignet, 0,1% TFA und Kombinationen aus diesen Puffern mit Acetonitril.

Eine optimale Trennung wird erfindungsgemäß in der Umkehrphasen-HLPC durch Equilibrieren der Säule mit 50 mM TEAP pH 2,25 und Eluieren des Peptides mit einem Puffer bestehend aus 50 mM TEAP pH 2,25 und Acetonitril im Verhältnis 2 : 3 erreicht.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird hochreines Urodilatin mit einer Reinheit von mindestens 99% erhalten. Das erhaltene Urodilatin ist frei von Peptid­ verunreinigungen, so daß nicht nur die Umkehrphasen-HPLC einen Einzelpeak aufweist, sondern auch die weit empfindlichere Methode der Kapillarelektrophorese (CE) einen Einzel-Migrationspeak ergibt. Er zeigt in der MS-Analyse eine Masse von 3505,9 +/-1 ohne Detektion von Nebenprodukten. Es zeigte sich, daß es mittels Kapillarelektrophorese hervorragend möglich ist, die Unterschiede zwischen dem nach dem Stand der Technik erhaltenen Urodilatin und dem erfindungsgemäßen Urodilatin deutlich zu machen.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb hochreines Urodilatin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es keine durch Kapillarelektrophorese und MS-Analyse nachweisbaren Peptidverunreinigungen enthält und die Reinheitsanalyse mittels Kapillarelektrophorese einen Einzel-Migrationspeak aufweist (Abb. 4).

Racemisierungen sind nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht möglich.

Die Ausbeute an hochreinem Urodilatin beträgt erfindungs­ gemäß zwischen 15 und 20%.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die als Zwischenprodukte synthetisierten neuen Peptidfragmente 1-5 der Abb. 2, die nicht nur zur Herstellung des erfindungsgemäßen hochreinen Urodilatins, sondern auch zur Herstellung verwandter pharmakologisch wirksamer Cardiodilatinfragmente im Merrifield-Verfahren eingesetzt werden können. Hierbei entspricht Fragment 1 der Aminosäuresequenz 95-108 des Urodiliatins, Fragment 2 der Aminosäuresequenz 109-120, die Fragmente 3 der Aminosäuresequenz 121-126 und Fragmente 4 und 5 der Aminosäuresequenz 109-126 des Urodilatins.

Anstelle der Pbf-Schutzgruppen können diese Fragmente erfindungsgemäß auch die Pmc-Schutzgruppe aufweisen.

Ausführungsbeispiele 1. Reinigung des rohen Urodilatins a) Aufkonzentrierung des cyclisierten Urodilatins

Die Cyclisationslösung (ca. 17 l 5% AcOH, in deionisiertem Wasser VV, enthält ca. 60 g cyclisiertes Urodilatin) wird auf eine mit 1000 ml Puffer A3 (0,1% TFA in deionisiertem Wasser VV) equilibrierte Glassäule (⌀ 70 mm, Länge 900 mm, gefüllt mit Vydac 218 TPB 2030) aufgetragen (Flußrate 130 ml/Min.).

Nach beendetem Aufpumpen wird das Peptid durch kontinuierliches Zudosieren von Puffer B3 (0,1% TFA in deionisiertem Wasser/ACN 2 : 3 VV) in einem kontinuierlichen Gradienten eluiert (0% Puffer B während 40 Min.; 15-35% Puffer B in 90 Min.; 35% B während 10 Min.; Flußrate 130 ml/Min.).

Urodilatin-Fraktionen, die beim Monitorieren mittels analytischer HPLC eine Reinheit größer 75% zeigen, werden vereinigt.

Diese vereinigten Fraktionen werden mit einem Volumenäquivalent deionisiertem Wasser verdünnt und auf ein mit 300 ml Puffer A3 equilibriertes Biotage­ Modul (⌀ 75 mm, Länge 300 mm, gefüllt mit YMC C₁₈, 120 A, 10 µm) aufgetragen (Flußrate 140 ml/Min.).

Anschließend wird das konzentrierte Peptid durch Spülen der Säule mit 100% Puffer B3 eluiert und das Acetonitril abgedampft. Die verbleibende Lösung wird lyophilisiert.

Es resultieren zwischen 17 und 20 g Urodilatin mit einer Reinheit größer 90%.

b) Reinigung des aufkonzentrierten Urodilatins

4,5 g des aufkonzentrierten Urodilatins werden in 250 ml 10% AcOH, in deionisiertem Wasser VV, gelöst und auf ein mit 300 ml Puffer A4 (50 mM TEAP pH 2,25 in deionisiertem Wasser) equilibriertes Biotage-Modul (⌀ 75 mm, Länge 300 mm, gefüllt mit YMC C₁₈, 120 A, 10 µm) aufgetragen (Flußrate 140 ml/Min.)
Das Peptid wird durch kontinuierliches Zudosieren von Puffer B4 (50 mM TEAP pH 2,25 in deionisiertem Wasser /ACN 2 : 3 VV) in einem kontinuierlichen Gradienten eluiert (22-28% B in 90 Min.; 28% B während 10 Min.; 28-40% B in 20 Min.; Flußrate 140 ml/Min.).

Urodilatin-Fraktionen, die beim Monitorieren mittels analytischer HPLC eine Reinheit größer 99% und dabei keine Verunreinigung größer 0,5% zeigen, werden vereinigt.

Diese vereinigten Fraktionen werden mit einem Volumenäquivalent deionisiertem Wasser verdünnt und auf das zuvor mit 1000 ml Puffer B3 gereinigte und anschließend mit 300 ml Puffer A3 equilibrierte Biotage-Modul aufgepumpt.

Zur Entsalzung wird mit 1200 ml Puffer A3 gespült.

Das Reinprodukt wird durch Spülen der Säule mit 1500 ml Puffer B3 eluiert und das Acetonitril abgedampft. Die verbleibende Lösung wird lyophilisiert.

Es resultieren zwischen 2,3 und 2,7 g hochreines Urodilatin.

c) Umsalzung von Urodilatin x TFA zu Urodilatin-Acetat

2,5 g hochreines Urodilatin x TFA-Salz werden in 80 ml 5% AcOH, in deionisiertem Wasser VV, gelöst und auf eine mit 5% AcOH gespülte Chromatographiesäule (⌀ 20 mm, Länge 300 mm, gefüllt mit 40 ml Merck Ionenaustauscher III Acetat-Form) aufgetragen.

Es wird mit 40 ml 5% AcOH gewaschen.

Das Eluat, ca. 125 ml, wird noch einmal auf die gleiche Ionenaustauschersäule appliziert.

Es wird mit 55 ml 5% AcOH gewaschen.

Das Eluat, ca. 180 ml, wird über eine Polysulfonmembran (⌀ 47 mm, 0,2 µm) klarfiltriert.

Die Lösung wird lyophilisiert.

Es resultieren zwischen 2,05 und 2,30 g hochreines Urodilatin-Acetat.

2. Prüfung der Reinheit von Urodilatin durch Kapillarelektrophorese

Lyophilisierte Proben aus Beispiel 1b werden mit Wasser zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und sofort analysiert.

Die Kapillarelektrophorese wurde mit dem System P/ACE 2100 von Beckmann unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Kapillare: Fused Silica von Supelco, Trennlänge 50 cm, Innendurchmesser 75 µm
Detektionswellenlänge: 200 nm
Injektionszeit: 1 s
Trennpuffer: 100 mM Natriumphosphat, pH 2,5; 0,02% Hydroxypropylmethylcellulose
Trennparameter: 25°C, 80 µA, 30 min

Zum Vergleich wurde nach dem Verfahren des Standes der Technik (EP 0 349 545) hergestelltes und gereinigtes Urodilatin mittels Kapillarelektrophorese unter den gleichen Bedingungen untersucht.

Abb. 3 zeigt das erhaltene Chromatogramm für Urodilatin des Standes der Technik, Abb. 4 zeigt das Chromatogramm für erfindungsgemäßes Urodilatin.

Aus dem Vergleich der beiden Chromatogramme geht her­ vor, daß sich das erfindungsgemäße Urodilatin von dem Urodilatin des Standes der Technik deutlich unter­ scheidet. Das erfindungsgemäße Urodilatin ist frei von Peptidverunreinigungen.

Abkürzungsverzeichnis Aminosäuren

Ala L-Alanin
Asn L-Asparagin
Asp L-Asparaginsäure
Arg L-Arginin
Cys L-Cystein
Gln L-Glutamin
Gly Glycin
Ile L-Isoleucin
Leu L-Leucin
Met L-Methionin
Phe L-Phenylalanin
Pro L-Prolin
Ser L-Serin
Thr L-Threonin
Tyr L-Tyrosin

Schutzgruppen

Boc tert. Butyloxycarbonyl
Fmoc 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
OtBu tert. Butylester
Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl
tBu tert. Butylether
Acm Acetamidomethyl
Trt Trityl

Reagenzien/Lösungsmittel

ACN Acetonitril
TFA Trifluoressigsäure
TEAP Triethylammoniumphosphat

Claims (14)

1. Hochreines Urodilatin der Aminosäuresequenz dadurch gekennzeichnet, daß es keine durch Kapillar­ elektrophorese und MS-Analyse nachweisbaren Peptid­ verunreinigungen enthält und die Reinheitsanalyse mittels Kapillarelektrophorese einen Einzel- Migrationspeak aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung von hochreinem Urodilatin der Aminosäuresequenz basierend auf dem Merrifield-Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man das an der festen Phase synthetisierte und davon abgespaltene Fragment Boc-1-14-OH (1) gemäß Abb. 2 mit dem Fragment H-15-32-OtBu (5) gemäß Abb. 2 kondensiert, aus dem erhaltenen vollgeschützten Urodilatin Boc-1-32-OtBu (6) gemäß Abb. 2 die Schutzgruppen abspaltet, das lineare Peptid H-1-32-OH (7) gemäß Abb. 2 zum rohen Urodilatin cyclisiert, dieses mit in der Peptid- Chemie herkömmlichen Methoden reinigt und seine Reinheit mittels Kapillarelektrophorese bestimmt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fragment H-15-32-OtBu (5) gemäß Abb. 2 herstellt durch Kondensation des an der festen Phase synthetisierten und davon abgespaltenen Fragments Fmoc- 15-26-OH (2) gemäß Abb. 2 mit dem Fragment H-27- 32-OtBu (3c) gemäß Abb. 2 und Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppe aus dem entstandenen Fragment Fmoc-15-32- OtBu (4) gemäß Abb. 2.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fragment H-27-32-OtBu (3c) gemäß Abb. 2 herstellt durch Synthese des Fragments Fmoc-27-32-OH (3a) gemäß Abb. 2 an der festen Phase, Abspaltung des Fragments, Veresterung der freien Carboxylgruppe zu Fragment Fmoc-27-32-OtBu (3b) gemäß Abb. 2 und nachfolgender Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe.

5. Verfahren gemäß Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangsfragmente (1), (2) und (3a) gemäß Abb. 2 auf einem festen Trägermaterial mittels Fmoc-Strategie aufbaut, wobei die supersäurelabile Bindung der Fragmente an das Trägermaterial über den 4- (4-Hydroxymethyl-3-Methoxy-phenoxy) -buttersäure-Linker deren Abspaltung ohne Beeinträchtigung des Seitenkettenschutzes gestattet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als festes Trägermaterial Polystyrol dient, das als Aminomethyl- oder Benzhydrylverbindung funktionalisiert ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung des Rohproduktes mittels Umkehrphasen-HPLC mit ausgewählten Lösungsmitteln und Puffersystemen erfolgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des Urodilatins durch Puffersysteme wie 50 mM TEAP mit pH zwischen 2-5 durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß 50 mM TEAP pH 2,25 und 50 mM TEAP pH 2,25/Acetonitril eingesetzt werden.

10. Peptidfragment mit der Aminosäuresequenz 95-108 des Urodilatins gemäß der Formel Boc-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser- Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-OH.

11. Peptidfragment mit der Aminosäuresequenz 109-120 des Urodilatins gemäß der Formel Fmoc-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly- Leu-Gly-OH.

12. Peptidfragmente mit der Aminosäuresequenz 121-126 des Urodilatins gemäß der Formel R¹-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-O-R²in der
R¹ Fmoc oder Wasserstoff bedeutet und
R² OtBu oder Hydroxy bedeutet.

13. Peptidfragmente mit der Aminosäuresequenz 109-126 des Urodilatins gemäß der Formel R³-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly- Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OtBuin der R³ Fmoc oder Wasserstoff bedeuten.

14. Verwendung der Peptidfragmente aus den Ansprüchen 10 bis 13 zur Herstellung von Urodilatin und verwandten pharmakologisch wirksamen Cardiodilatinfragmenten nach dem Merrifield-Verfahren.