DE69207138T2 - Zyklische VIP-Analoge - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft zyklische Peptide, die Analoge zu vasoaktiven Peptiden (VIP) sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die besagte zyklische Peptide enthalten. Die besagten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich für die Behandlung bronchotrachealer konstringierender Erkrankungen.
- Vasoaktive intestinale Peptide (VIP) wurden zum erstenmal in porcinen Eingeweiden nachgewiesen, isoliert und gereinigt. [U.S. Pat. Nr. 3,879,371]. Das Peptid besitzt achtundzwanzig (28) Aminosäuren und zeigt eine ausgesprochene Homologie zu Sekretin und Glukagon. [Carlquist et al., Horm. Metab. Res., 14, 28-29 (1982)]. Die Aminosäuresequenz von VIP lautet folgendermassen:
- VIP wird ein grosses Spektrum biologischer Aktivitäten innerhalb des gastrointestinal Traktes und des Kreislaufsystems zugeschrieben. Im Hinblick auf seine Ähnlichkeiten mit gastrointestinalen Hormonen wurde gefunden, dass VIP die Bauchspeichel- und Gallenblasensekretion, die hepatische Glykogenolyse, die Glukagon- und Insulinsekretion stimuliert und die Freisetzung von pankreatischem Bicarbonat aktiviert. [Kerrins, C. und Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1017 (1972); Domschke, S. et al., Gastroenterology, 73, 478-480 (1977)].
- Neuronen, die VIP enthalten, wurden mittels Immunoassay in Zellen des endokrinen und exokrinen Systems, des Intestinums und der glatten Muskulatur lokalisiert. [Polak, J.M. et al., Gut, 15, 720-724 (1974)]. Es wurde gefunden, dass VIP ein Neuroeffektor ist, der die Freisetzung mehrerer Hormone einschliesslich Prolactin [Frawley, L.S., et al., Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981)], Thyroxin [Ahren, B., et al. Nature 287, 343-345 (1980)] und Insulin und Glukagon verursacht [Schebalin, M., et al., Am. J. Physiology E., 232, 197-200 (1977)]. Es wurde ebenfalls gefunden, dass VIP die Reninfreisetzung aus der Leber in vivo und in vitro stimuliert. [Porter, J.P., et al., Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983)]. VIP wurde nachgewiesen in den Nerven und Nervenenden in Luftwegen verschiedener Tierspezies und des Menschen. [Dey, R.D., und Said, S.I., Fed. Proc., 39,1062 (1980); Said, S.I., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Die kardiovaskulären und bronchopulmonalen Effekte von VIP sind interessant, weil für VIP gefunden wurde, dass es stark vasodilatatorisch und als starkes Muskelrelaxans auf periphere, pulmonale und koronäre Gefässbereiche wirkt. [Said, S.I:, et al., Clin. Res., 20, 29 (1972)]. Für VIP wurden vasodilatatorische Effekte auf cerebrale Blutgefässe nachgewiesen. [Lee, T.J. und Berszin, I., Science, 224, 898, 900 (1984)]. In vitro Studien haben gezeigt, dass vasoaktive intestinale Peptide, falls sie exogen in cerebrale Arterien verabreicht werden, Vasodilatation induzieren, was für VIP eine mögliche Rolle als Transmitter für eine cerebrale Vasodilatation nahelegt. [Lee, T. und Saito, A., Science, 224, 898-901 (1984)]. Es wurde auch gezeigt, dass VIP im Auge ein wirksamer Vasodilatator ist [Nilsson, S.F.E. und Bill, A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-392 (1984)].
- VIP könnte regulatorische Effekte auf das Immunsystem ausüben. O'Dorisio et al. haben gezeigt, dass VIP die Proliferation und Migration von Lymphocyten modulieren kann. [J. Immunol., 135, 7925-7965 (1985)].
- Da eine relaxierende Wirkung von VIP auf glatte Muskulatur nachgewiesen wurde und da es, wie oben erwähnt, normalerweise im Luftröhrengewebe gefunden wird, wurde die Hypothese aufgestellt, dass VIP ein endogener Mediator der Relaxation der bronchialen glatten Muskulatur sein könnte. [Dey, R.D. und Said, S.I., Fed. Proc., 39 1962 (1980)]. Es wurde gezeigt, dass Gewebe von asthmatischen Patienten im Vergleich zu Gewebe von normalen Patenten kein immunoreaktives VIP enthalten. Dies könnte darauf hinweisen, dass ein Verlust von VIP oder VIP enthaltenden Nervenfasern mit der Asthma Erkrankung zusammenhängen könnte. [Ollerenshaw, S. et al., New England J. Med., 320, 1244-1248 (1989)].
- In vitro und in vivo Versuche haben gezeigt, dass VIP tracheale glatte Muskeln relaxiert und gegen bronchokonstrigierende Agentien wie Histamin und Prostaglandin F2a schützt. [Wasserman, M.A. et al., in "Vasoactive Intestinal Peptide", S.I. Said, ed., Raven Press, N.Y., 1982, S. 177-184; Said, S.I. et al., Ann. N.Y.Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Bei intravenöser Verabreichung wurde gefunden, das VIP gegen bonchokonstringierende Agentien wie Histamin, Prostaglandin F2a, Leukotriene und Platelet activating factor schützt, wie auch gegen Antigen-induzierte Bronchokonstriktionen. [Said, S.I., et al., supra, (1982)]. Für VIP wurde auch gefunden, dass es die muköse Sekretion in menschlichem Lufröhrengewebe in vitro inhibiert. [Coles, S.J. et al., Am.Rev. Respir. Dis., 124, 531-536 (1981)].
- Falls es durch intravenöse Infusion an asthmatische Patienten verabreicht wird, verursacht VIP im Menschen ein Anwachsen der "peak expiratory flow raten" und schützt gegen Histamin-induzierte Bronchodilatation. [Morice, A.H. and Sever, P.S., Peptides 7, 279-280 (1986); Morice, A. et al., The Lancet, 11 1225-1227 (1983)]. Die beobachteten pulmonalen Effekte bei dieser intravenösen VIP infusion waren jedoch begleitet von kardiovaskulären Nebeneffekten, am häufigsten von Hypotonie und Tachykardie als auch von Erröten. Wenn VIP in intravenösen Dosen gegeben wird, die keine kardiovaskulären Effekte verursachen, konnte VIP die spezifische Luftröhrenleitfähigkeit nicht ändern. [Palmer, J.B.C., et al., niedrige verabreichte Dosis zurückgeführt und war wahrscheinlich Folge des raschen Abbaus der Verbindung.
- Wenn es als Aerosol an Menschen verabreicht wird, zeigt natives VIP für den Schutz gegen Histamin-induzierte Bronchokonstriktionen nur marginale Effekte. [Altieri et al., Pharmacologist, 25, 123 (1983)]. Es wurde nachgewiesen, dass VIP keinen signifikanten Effekt auf grundlegende Luftröhrenparameter hat, aber einen Schutzeffekt gegen Histamin-induzierte Bronchokonstriktionen, wenn es dem Menschen durch Inhalation zugführt wird. [Barnes, P.J. und Dixon, C.M.S., Am. Rev. Resir. Dis., 130, 162-166 (1984)]. Wie berichtet wurde, zeigt VIP als Aerosol verabreicht keine Tachykardie oder Hypotonie-Effekte in Verbindung mit Bronchdilatation. [Said, S.I. et al., in "Vasoactive Intestinal Peptide", S.I. Said, ed., Raven Press, N.Y., 1928, S. 185-191].
- Wegen der interessanten und potentiell klinisch verwendbaren biologischen Aktivitäten von VIP war die Substanz wie berichtet Gegenstand mehrerer Syntheseprogramme mit dem Ziel, ein oder mehrere Eigenschaften dieses Moleküls zu verstärken. Takeyama et al. berichteten über ein VIP mit einer Glutamatsäuresubstitution für Asparaginsäure an Position 8. Diese Verbindung war weniger aktiv als das native VIP. [Chem. Pharm. Bull., 28, 2265-2269 (1980)]. Wendlberger et al. berichteten über die Herstellung eines VIP Analogen mit einer Norleucinsubstitution anstelle von Methionin an Position 17. [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980)]. Für das Peptid wurde eine mit dem nativen VIP gleiche Fähigkeit beobachtet, radio-iodiertes VIP an Lebermembran-Präparationen zu ersetzen. Watts und Wooton berichteten über eine Reihe von linearen und zyklischen VIP Fragmenten, die zwischen sechs und zwölf Resten aus der natürlichen Sequenz enthielten. [Eur. Pat. Nrs. 184309 und 325044; U. S. Pat. Nos. 4,737,487 und 4,866,039]. Turner et al. berichteten, dass das Fragment VIP(10-28) ein Antagonist von VIP ist. [Peptides, 7, 849-854 (1986)]. Von dem substituierten Analogen [4-Cl-D-Phe&sup6;,Leu¹&sup7;]-VIP wurde ebenfalls berichtet, dass es an den VIP-Rezeptor bindet und antagonistisch gegen die VIP- Aktivität wirkt. [Pandol, S. et al., Gastrointest. Liver Physiol., 13, G553-G557 (1986)]. Gozes et al. berichteten, dass das Analoge [Lys¹,Pro², Arg³,Arg&sup4;,Pro&sup5;,Tyr&sup6;]-VIP ein kompetitiver Inhibitor der VIP-Bindung zu seinem Rezeptor an Glialzellen ist. [Endocrinology, 125, 2945-2949 (1989)]. Robberecht et al. berichteten über mehrere VIP Analoge mit D-Rest-Substitutionen im N-Terminus des nativen VIP [Peptides, 9, 339-345 (1988)]. Alle diese Analogen zeigten eine weniger feste Bindung an den VIP-Rezeptor und eine geringere Aktivität in der c-AMP Aktivierung als das native VIP. Tachibana und Ito betrichteten über meherere VIP Analoge des Vorläufermoleküls. [in Peptide Chem., T. Shiba und S. Sakakibara, Hrsg., Prot. Res. Foundation, 1988, S. 481-486, Jap. Pat. No. 1083012, U.S. Pat. No. 4,822,774]. Diese Verbindungen waren 1- bis 3-fach stärkere Bronchodilatatoren und besassen eine 1- bis 2-fach höhere hypotonische Aktivität. Musso et al. haben auch über mehrere VIP Analoge mit Substitutionen an Positionen 6-7, 9-13, 15-17 und 19- 28 berichtet. [Biochemistry, 27, 8174-8181 (1988); Eur. Pat. Nr. 8271141; U.S. Pat. Nr. 4,835,252]. Diese Verbindungen waren in der Bindung zum VIP-Rezeptor und in der biologischen Reaktion gleich oder weniger aktiv als das native VIP. Bartfai et al. betricheten über eine Serie von mehrfach substituierten [Leu¹&sup7;]-VIP Analogen. [International Patent Application No. WO89/05857].
- Weiterhin wurden synthetische, vasoaktive intestinale Peptidanaloge zum Beispiel in der EP 405242 beschrieben. Hier enthalten lineare Derivate Substitutionen ausgewählter Aminosäuren an bestimmten Positionen der VIP-Moleküle.
- Die vorliegende Erfindung umfasst zyklische vasoaktive Peptidanaloge. Ein zyklisches Peptid ist ein Peptid in dem der Seitenketten-Carboxyterminus einer einzigen Aminosäure in der Peptidkette kovalent mit dem Seitenketten-Aminoterminus einer anderen Aminosäure in der Peptidkette über die Bildung einer Amidbindung gebunden ist. Die kovalente Bindung zwischen den zwei Aminosäuregruppen in der Peptidkette ergibt eine Ringstruktur.
- Die biologische Aktivität eines zyklischen Peptids kann völlig verschieden im Vergleich zu den linearen Ausgangsanalogen sein. Zyklische Peptide sind konformativ gesehen viel rigider; sie besitzen weitaus definiertere Strukturen. Diese Änderungen spiegeln sich in den biologischen Profilen der zyklischen Peptide wieder. Die Zyklisierung eines Peptidanalogen kann zu einer Wirkungsverlängerung als Folge der erhöhten Rigidität führen, die es weniger zugänglich für einen chemischen oder enzymatischen Abbau macht. Die Bioverfügbarkeit von zyklischen Peptiden kann auf Grund der Änderungen der physikalischen Eigenschaften der Peptide als Resultat einer grösseren Rigidität der Struktur erhöht sein. Weiterhin kann die gut definierte Form der zyklischen Peptide im Vergleich zu linearen Peptiden eine grössere Spezifität zum Zielrezeptor ermöglichen und auf diese Weise die Neigung zu unerwünschten biologischen Aktivitäten, die mit den gewünschten einhergehen, reduzieren.
- Die vorliegende Erfingung umfasst neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub8; Asp, Glu oder Lys ist; R&sub1;&sub2; Arg, Lys, Orn oder Asp ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder ein davon abgeleitetes pharmazeutisch geeignetes Salz.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei, X, Y, R&sub8; und R&sub1;&sub2; wie oben für Formel I definiert sind.
- Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub8; Asp oder Asn ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder pharmazeutisch geeignete Salze davon.
- Bevorzugt ist ein Peptid der Formel:
- wobei X und Y die gleiche Bedeutung wie für Formel II haben.
- Die vorliegende Erfinung umfasst auch zyklische neue Peptide der Formel:
- wobei R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist, R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei X und Y die gleiche Bedeutung wie in Formel III haben.
- Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei X und Y die gleiche Bedeutung wie in Formel IV haben.
- Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue zyklische Peptide der Formel
- wobei R&sub1; His oder N-CH&sub3;-Ala ist; R&sub2; Ser oder Ala ist; R&sub6;
- ist, wobei Q Cyclohexyl-nieder-alkyl oder Aryl-nieder-alkyl ist; R&sub8; Asp, Glu oder Ala ist; R&sub1;&sub0; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub6; Gln oder Ala ist; R&sub1;&sub7; Met, Nle oder Ala ist; R&sub1;&sub9; Val oder Ala ist, R&sub2;&sub2; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub2;&sub4; Asn oder Ala ist; R&sub2;&sub6; Ile, Val oder Leu ist; R&sub2;&sub7; Leu oder Lys ist; R&sub2;&sub8; Asn, Thr oder Lys ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist, oder R&sub2;&sub9;-R&sub3;&sub0;-R&sub3;&sub1;-Z; R&sub2;&sub9;
- Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub0; Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub1; Ala, Met, Cys(Acm) oder Thr ist; Z Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon.
- Q ist bevorzugt
- wobei n = 1,2; X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander jeweils Wassserstoff, OH, OCH&sub3;, F, Cl, I, CH&sub3;, CF&sub3;, NO&sub2;, NH&sub2;, N(CH&sub3;)&sub2;, NHCOCH&sub3;, NHCOC&sub6;H&sub5; oder C(CH&sub3;)&sub3; sind.
- Q ist besonders bevorzugt Benzyl, p-Fluorbenzyl, p- Aminobenzyl, p-Hydroxybenzyl, o-Methyl, 1-Methylnaphthyl oder 2-Methylnaphthyl. Ganz besonders bevorzugt ist Q als Benzyl.
- Bevorzugt sind Peptide der Formeln;
- wobei X, Y, R&sub1;, R&sub2;, R&sub6;, R&sub8;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub6;, R&sub1;&sub7;, R&sub1;&sub9;, R&sub2;&sub2;, R&sub2;&sub4;, und R&sub2;&sub7; die wie für Formel V angegebene Bedeutung besitzen.
- Das ganz besonders bevorzugte Peptid ist Ac-[Glu&sup8;,Lys¹², Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;, Lys27,28, Gly29,30,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH&sub2;].
- Die erfindungsgemässen Peptide ergeben eine anhaltende Relaxation der tracheobronchialen glatten Muskulatur ohne kardiovaskuläre Nebeneffekte und sind deshalb zur Behandlung bronchokonstringierender Erkrankungen wie Asthma geeignet.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Analoge des vasoaktiven intestinalen Peptides (VIP), die eine erhöhte, anhaltende bronchodilatatorische Aktivität ohne beobachtbare Nebeneffekte haben.
- Wie hier verwendet, schliesst der Ausdruck "Nieder-alkyl" geradkettig und verzweigtkettige gesättigte und aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen ein, die 1-6 Kohlenstoffatome enthalten. Die bevorzugte Nieder-Alkylgruppe ist Methyl.
- Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Aryl" mononukleare aromatische Kohlenwasserstoffgruppen wie Phenyl, die an einer oder mehreren Positionen unsubstituiert oder mit Nieder-alkyl, Nieder-alkoxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-niederalkylamino, Nieder-alkylamido oder Phenylamido substituiert sein können. "Aryl" bezeichnet auch polynukleare Arylgruppen wie Naphtyl, die mit einem oder mehreren der vorgenannten Gruppen substituiert sein können. Die bevorzugten Arylgruppen sind Phenyl, unsubstituiert oder monosubstituiert mit Fluor oder unsubstituiertes Naphthyl.
- Wie hier verwendet, ist X ein Substituent am Aminostickstoff der amino-terminalen Aminosäure, und Y ein Substituent auf an der Carbonylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure. X kann Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe sein. Y kann Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe sein.
- Im Hinblick auf den Ausdrücke "hydrolisierbare Aminoschutzgruppe" und "hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe" kann jede konventionelle Schutzgruppe, die durch Hydrolyse entfernt werden kann, in Uebereinstimmung mit der Erfindung, benutzt werden. Beispiele solcher Gruppen werden im folgenden genannt. Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind
- wobei X&sub3; Nieder-alkyl oder Halo-nieder-alkyl ist. Von diesen Schutzgruppen sind die Gruppen, bei denen X&sub3; C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Halo-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist, besonders bevorzugt.
- Bevorzugte Carboxyschutzgruppen sind Niederalkylester, NH&sub2; und Niederalkylamide, mit C&sub1;&submin;&sub3; Alkylestern, wobei NH&sub2; und C&sub1;&submin;&sub3; Alkylamide besonders bevorzugt sind.
- Die vorliegende Erfindung beinhaltet neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub8; Asp, Glu oder Lys ist; R&sub1;&sub2; Arg, Lys, Orn oder Asp ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder davon abgeleitete pharmazeutisch geeignete Salze.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei X, Y, R&sub8; und R&sub1;&sub2; die wie für Formel I angegebene Bedeutung haben.
- Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls neue Peptide der Formel:
- wobei R&sub8; Asp oder Asn ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder davon abgeleitete pharmazeutisch geeignete Salze.
- Bevorzugt ist ein Peptid mit der Formel:
- wobei X und Y die obige, für Formel II angegebene Bedeutung besitzen.
- Die vorliegende Erfindung umfasst auch zyklische neue Peptide der Formel:
- wobei R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist, R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolsierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder davon abgeleitete pharmazeutisch geeignete Salze.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei X und Y die obige, für Formel III angegebene Bedeutung besitzen.
- Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzguppe ist; oder davon abgeleitete, pharmazeutisch geeingnete Salze.
- Bevorzugt sind Peptide der Formel:
- wobei X und Y die obigen, für Formel IV angegebene Bedeutung besitzen.
- Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls neue zyklische Peptide der Formel:
- wobei R&sub1; His oder N-CH&sub3;-Ala ist, R&sub2; Ser oder Ala ist; R&sub6;
- ist, wobei Q Cyclohexyl-nieder-alkyl oder Aryl-nieder-alkyl ist; R&sub8; Asp, Glu oder Ala ist, R&sub1;&sub0; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub6; Gln oder Ala ist; R&sub1;&sub7; Met, Nle oder Ala ist; R&sub1;&sub9; Val oder Ala ist; R&sub2;&sub2; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub2;&sub4; Asn oder Ala ist; R&sub2;&sub6; Ile, Val oder Leu ist, R&sub2;&sub7; Leu oder Lys ist; R&sub2;&sub8; Asn, Thr oder Lys ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; R&sub2;&sub9;-R&sub3;&sub0;-R&sub3;&sub1;-Z ist; R&sub2;&sub9; Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub0; Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub1; Ala, Met, Cys (Acm) oder Thr ist; Z Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxylschutzgruppe ist; oder davon abgeleitete, pharmazeutisch geeignete Salze.
- Q ist bevorzugt:
- wobei n = 1, 2 ist; X&sub1; und X&sub2; unabhängig voneinander jeweils Wassserstoff, OH, OCH&sub3;, F, Cl, I, CH&sub3;, CF&sub3;, NO&sub2;, NH&sub2;, N(CH&sub3;)&sub2;, NHCOCH&sub3;, NHCOC&sub6;H&sub5; oder C(CH&sub3;)&sub3; sind.
- Q ist besonders bevorzugt Benzyl, p-Fluorbenzyl, p- Aminobenzyl, p-Hydroxybenzyl, o-Methyl, 1-Methylnaphthyl oder 2-Methylnaphthyl. Ganz besonders bevorzugt ist Q als Benzyl.
- Bevorzugt sind Peptide der Formeln:
- wobei X, Y, R&sub1;, R&sub2;, R&sub6;, R&sub8;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub2;, R&sub1;&sub6;, R&sub1;&sub7;, R&sub1;&sub9;, R&sub2;&sub2;, R&sub2;&sub4;, und R&sub2;&sub7; die für Formel V angegebene Bedeutung haben.
- Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung besagter Peptide, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Peptide enthalten, als auch Methoden zur Verwendung solcher Peptide und ein nicht-toxisches inertes, therapeutisch akzeptables Trägermaterial zur Behandlung bronchotrachealer konstringierender Erkrankungen. Das besagte Verfahren zur Herstellung zyklischer Polypeptide ist gekennzeichnet dadurch, dass
- (a) ein geschütztes und an ein Harz gebundenes Peptid mit der entsprechenden Aminosäuresequenz selektiv zur Bildung einer freien Seitenketten-Aminogruppe und einer freien Seitenketten- Carboxygruppe freigesetzt wird;
- (b) die freie Seitenketten-Aminogruppe und die freie Seitenketten-Carboxygruppe kovalent mit einem geeigneten Amidbildenden Reagenz verbunden werden; und
- (c) Freisetzung und Abspaltung des zyklischen Peptids vom Harz durch Behandlung mit einem geeigneten Freisetzungs- und Abspaltungsreagenz erfolgen, falls gewünscht in Gegenwart weiterer geeigneter Additive als Kationenfänger und, falls gewünscht, dass das zyklische Peptid in ein pharmazeutisch geeignetes Salz umgewandelt wird.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung besagter zyklischer Peptide zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung bronchotrachealer konstringierender Erkrankungen.
- Die Nomenklatur, die zur Definition der Peptide verwendet wird, ist die, die üblicherweise auf dem Gebiet verwendet wird, wobei die Aminogruppe am N-Terminus links und die Carboxygruppe am C- Terminus rechts erscheint. Unter natürlichen Aminosäuren versteht man Aminosäuren, die in Proteinen nachgewiesen wurden, d. h. Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Falls eine Aminosäure isomere Formen aufweist, ist die L-Form gemeint, sofern nichts anderes ausdrücklich vermerkt ist.
- Die folgenden Abkürzungen oder Symbole werden zusätzlich zu den oben beschriebenen zur Darstellung von Aminosäuren verwendet, sowie zur Darstellung von Schutzgruppen, Lösungsmittel, Reagentien und dergleichen Symbol Bedeutung Acetyl Ornithin Norleucin 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl 9-Fluorenylmethyl t-Butyloxycarbonyl Benzyloxycarbonyl Methylenchlorid Acetonitril Dimethylformamid N,N-Diisopropylethylamin Trifluoressigsäure N-Hydroxybenzotriazol N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid N,N'-Diisopropylcarbodiimid Benzotriazol-1-yloxy-tri-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat "Fast-atom-bombardment"-Massenspektroskopie
- Analoge der nativen VIP Peptidsequenzen werden dadurch gekennzeichnet, dass die substituierten Aminosäuren in Klammern vor "VIP" gesetzt werden. Eine Derivatisierung der N-terminalen Aminogruppe, d. h. wie durch das oben genannte X, wird links von den eingeklammerten Substitutionen gekennzeichnet. Sequenznummern, die in Parenthese rechts von "VIP" erscheinen, stellen Aminosäuredeletionen und -additionen bezüglich der nativen Sequenznumerierung dar. Auf diese Weise bezeichnet zum Beispiel Ac-[Lys¹²,Nle¹&sup7;, Gly²&sup9;]-VIP(1-29)-NH&sub2; ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die dem nativen humanen VIP entspricht, in dem Wasserstoff durch eine Acetylgruppe am N-Terminus ersetzt worden ist, ein Lysin durch Arginin an Position 12 und ein Norleucin durch Methionin an Position 17 ersetzt worden ist. Zusätzlich wurde ein Glycin an den Carboxylrest von Asparagin 28 gekoppelt, das mit Position 29 bezeichnet wurde. Die Suffixe "-OH" und "-NH&sub2;", die nach "VIP" oder nach Position 29 folgen, beziehen sich auf die freie Säure bzw. die Amidformen des Polypeptids. In den Fällen, in denen kein Suffix verwendet wird, bedeutet die Darstellung, dass beide Formen umfasst sind.
- Wie oben dargestellt ist ein Peptid, wie hier definiert, ein Peptid, in dem der Seitenketten-Carboxy-Terminus einer Aminosäure kovalent mit einem Seitenketten-N-Terminus einer anderen Aminosäure über die Bildung einer Amidbindung verknüft ist. Mehrere Nomenklaturen und Symbole werden zur Darstellung eines zyklischen Peptids verwendet. Die folgenden sind Beispiele:
- Die obigen drei Strukturen (a - c) und die begleitende Darstellung durch die "SEQ ID NO:" und das unten aufgeführte "Sequence Listing" repräsentieren und definieren jeweils dasselbe Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz entsprechend dem nativen humanen VIP in dem eine Acetylgruppe ein Wasserstoff am N- Terminus ersetzt hat, ein Lysin ein Arginin an Position 12 ersetzt hat, ein Norleucin ein Methionin an Position 17 ersetzt hat, ein Valin ein Isoleucin in Position 26 ersetzt hat und ein Threonin ein Asparagin an Position 28 ersetzt hat. Zusätzlich wurde eine Amidbindung zwischen der Seitenkettencarboxylgruppe der Asparaginsäure an Position 8 und der Seitenkettenamingruppe von Lysin an Position 12 gebildet, um so ein zyklisches Peptidanaloges zu bilden. Die obigen Darstellungen der Peptidstrukturen werden als äquivalent und austauschbar angesehen.
- Wie hier benutzt, sind die Ausdrücke "Rn" für eine Aminosäure an Position n in einer der hier gezeigten Strukturen und "Xaa" für eine Aminosäure an Position n in der korrespondierenden Sequenz im "Sequence Listing" darunter, äquivalent und austauschbar in denjenigen Beispielen, wo Xaa eine Auswahl unter zwei oder mehr Aminosäuren darstellt.
- In den zyklischen Peptiden der vorliegenden Erfindung finden, sofern nicht anders vermerkt, die folgenden Konfigurationen Anwendung. Aminosäure in der Kette Terminus der gebunden Aminosäure zur Herstellung eines zyklischen Peptides ε amino (ε = epsilon) δ amino (δ = delta) β carboxyl (β = beta) γ carboxyl (γ = gamma)
- Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung schliessen Peptide mit der folgenden Aminosäuresequenz ein:
- Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können leicht mittels jeder bekannten Methode zur Bildung von Peptidverknüpfungen zwischen Aminosäuren synthetisiert werden. Solche konventionellen Methoden schliessen beispielsweise alle Lösungsphasenverfahren ein, die eine Kondensation zwischen der freien alpha-Aminogruppe einer Aminosäure oder einem entsprechenden Rest, wobei die Carboxylgruppe oder andere reaktive Gruppen geschützt sind, und einer freien primären Carboxylgruppe einer anderen Aminosäure oder einem entsprechenden Rest davon, wobei deren Aminogruppe oder andere reaktive Gruppen geschützt sind, erlauben.
- Das Verfahren zur Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann gemäss einer Methode durchgeführt werden, nach der jede Aminosäure gemäss der gewünschten Sequenz jeweils sukzessiv nach einer anderen Aminosäure oder nach einem davon abgeleiteten Rest zugegeben wird oder durch ein Verfahren bei dem zur Herstellung des gewünschten Peptids Peptidfragmente mit der gewünscheten Aminosäuresequenz zuerst konventionell synthetisiert und dann kondensiert werden.
- Solche konventionellen Verfahren zur Synthese neuer Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung schliessen zum Beispiel jedes Festphasen-Peptidsyntheseverfahren ein Bei einer solchen Methode wird die Syntese neuer Verbindungen durch sequentiellen Einbau jeweils eines gewünschten Aminosäurerestes in die wachsende Peptidkette gemäss den generellen Prinzipien der Festphasenmethode durchgeführt [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., "The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology", Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)].
- Gebräuchlich in chemischen Peptidsynthesen ist der Schutz reaktiver Seitengruppen verschiedener Aminosäureteilen mit geeigneten Schutzgruppen, die das Stattfinden einer chemische Reaktion an dieser Stelle verhindern, bis die Schutzgruppe letztlich entfernt worden ist. Gewöhnlich ist der Schutz einer alpha- Aminogruppe an einer Aminosäure oder an einem Fragment gebräuchlich, während die Einheit mit der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt von einer selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe um eine nachfolgende Reaktion an dieser Stelle stattfinden zu lassen. Da spezifische Schutzgruppen im Hinblick auf die Festphasen-Synthesemethode aufgeführt sind, sollte festgehalten werden, dass jede Aminosäure durch jede Schutzgruppe geschützt werden kann, die für die entsprechende Aminosäure in der Lösungsphasensynthese überlicherweise gebraucht wird.
- Alpha-Aminogruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe ausgewählt aus den aromatischen Urethan-Typ Schutzgruppen geschützt werden, wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituierte Benzyloxycarbonyle, wie p-Chlorbenyzloxycarbonyl, p- Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Biphenylisoproypyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyl-oxycarbonyl (Fmoc) und p-Methoxybenzyloxy-carbonyl (Moz); und aus den aliphatischen Urethan-Typ Schutzgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethyloxy-carbonyl, Isopropyloxycarbonyl und Allyloxycarbonyl. Boc ist die weitaus bevorzugte Schutzgruppe für den alpha-Aminoschutz.
- Carboxylgruppen können durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, ausgewählt aus aromatischen Estern wie Benzyl (Obzl) oder Benzyl substituiert mit nieder-Alkyl, Halo, Nitro, Thio oder substituiertem Thio, d.h. nieder-Alkyl-(1-7 Kohlenstoffatome)thio; aliphatichen Estern, wie nieder-Alkyl, t-butyl (Ot-Bu), Cyclopentyl, Cyclohexyl (OcHx), Cycloheptyl und 9-Fluorenylmethyl (OFm). OBzl und OFm sind die weitaus bevorzugten für Glutaminsäure (Glu). OcHx, OBzl und OFm sind die weitaus bevorzugten für Asparaginsäure (Asp).
- Hydroxylgruppen können durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, ausgewählt aus Benzyl (Bzl) oder Benzyl substituiert mit nieder-Alkyl, Halo, wie 2,6-Dichlorbenzyl (DCB), Nitro oder Methoxy; t-Butyl (t-Bu), Tetrahydropyranyl und Triphenylmethyl (Trityl). Bzl ist die weitaus bevorzugte Schutzgruppe für Serin (Ser) und Threonin (Thr). Bzl und DCB sind die weitaus bevorzugten für Tyrosin (Tyr).
- Seitenketten-Aminogruppen können durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, ausgewählt aus aromatischen Urethan-Typ-Schutzgruppen wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituierten Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2- Chlorbenzyloxycarbonyl (2-Cl-Z), p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p- Brombenzyloxycarbonyl, p-Biphenylisopropyl-oxycarbonyl, 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und p-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz); aus aliphatischen Urethan-Typ Schutzgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl und Allyloxycarbonyl. Z ist die weitaus bevorzugte Schutzgruppe für Ornithin (Orn). 2-Cl-Z und Fmoc sind die weitaus bevorzugten für Lysin (Lys).
- Guanidingruppen können durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, ausgewählt aus Nitro, p-Toluolsulfonyl (Tos), Z, Adamantyloxycarbonyl und Boc. Tos ist die weitaus bevorzugte Schutzgruppe für Arginin (Arg).
- Seitenkettenamidgruppen können durch Xantyl (Xan) geschützt werden. Bevorzugt ist kein Schutz für Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln).
- Imidazolgruppen können geschützt werden durch geeignete Schutzgruppen ausgewahlt aus p-Toluolsulfonyl (Tos), 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Triphenylmethyl (Trityl), 2,4- Dinitrophenyl (Dnp), Boc und Benzyloxymethyl (Bom). Tos und Bom sind die weitaus bevorzugten Schutzgruppen für Histidin (His).
- Soweit nicht anders vermerkt, sind die unten angegebenen Prozentzahlen für Feststoffe in festen Mischungen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten und Feststoffe in Flüssigkeiten auf wt/wt-, vol/vol- bzw. wt/vol- Basis angegeben. Weiterhin, sofern nicht anders vermerkt, sind die unten genannten Lieferanten von Reagentien und Geräten nicht obligatorisch. Der Fachmann ist in der Lage ähnliche Reagentien oder Geräte anderer Lieferanten auszuwählen.
- Alle Lösungen, Isopropanol (iPrOH), Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) und Dimethylformamid (DMF), wurden von Fisher oder Burdick & Jackson bereitgestellt und ohne weitere Destillation verwendet. Trifluoressigsäure wurde von Halocarbon bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Diisopropylethylamin (DIPEA) wurde von Pfaltz und Bauer geliefert und über CaO und Ninhydrin vor Gebrauch destilliert. Dicylohexylcarbodiimid (DCC) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) wurde von Fluka geliefert und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 1,2-Ethandithiol (EDT) wurde von Sigma Chemical Co. geliefert und ohne weitere Reinigung eingesetzt. Geschützte Aminosäuren besassen generell die L- Konfiguration und wurden kommerziell von Chemical Dynamics Corp. oder Bachem bezogen. Die Reinheit dieser Reagenzien wurde mittels Dünnschichtchromatographie, NMR und Schmelzpunkt vor der Verwendung sichergestellt. Boc-O-Me-Tyr, Boc-2-Nal und Boc-P-F- Phe wurden wie berichtet hergestellt. [Bolin, D.R., U.S. Pat. Appl. No. 374,503]. Boc-Asp(OFm) und Boc-Glu(OFm) wurden wie berichtet hergestellt. [Bolin, D. R., et al., Org. Prep. Proc. Int., 21, 67-74 (1989)]. Benzylhydrylaminharz (BHA) war ein Copolymer aus Styrol - 1% Divinylbenzol (100-200 oder 200-400 mesh) bezogen von Biomega, Bachem, Omni oder Advanced Chemtech. Der Gesamtstickstoffgehalt dieser Harze lag im allgemeinen zwischen 0.3 1.2 meq/g.
- Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an auf Glass gebackenen, vorbeschichteten Silicagel 60 F254 Platten (Merck) unter Verwendung geeigneter Lösungssysteme durchgeführt. Die Detektion der Verbindungen erfolgte durch UV Fluoreszenz Quenching (254 nm Absorption), Jodfärbung oder Ninhydrin-Spray (für primäre und sekundäre Amine).
- Für die Analysen von Aminosäurezusammensetzungen wurden die Peptide in 6 N HCl, das 1 - 4 mg Phenol enthielt, bei 115ºC für 22 - 24 Stunden in verschlossenen, evakuierten Hydrolysegefässen hydrolisiert. Die Analysen wurden entweder mit einem Beckman 121M Aminosäureanalysator oder mit einem Waters auf HPLC- basierenden Aminosäure-Analysesystem unter Verwendung entweder eines Waters Cat Ex Harzes oder einer Pierce AA511 Säule und Ninhydrin-Detektion durchgeführt.
- Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde ausgeführt mittels eines LDC Gerätes bestehend aus Constametric I- und III- Pumpen, einem "Gradient Master Solvent Programmer and Mixer" und einem Spectromonitor III mit variablem Wellenlängen UV Detektor. Analytische HPLC wurde als Umkehrphasen-Verfahren unter Verwendung von Waters µBondapak C&sub1;&sub8; Säulen (0.4 x 30 cm) durchgeführt. Präparative HPLC Trennungen wurden auf Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 Säulen (2 x 25 cm oder 2 x 50 cm) ausgestattet mit einer Waters Guardpak C18 Vorsäule gefahren. Gelchromatographie wurde unter Verwendung einer 2 x 85 cm Säule, einer LKB varioperpex peristaltischen Pumpe und einem IBM variablem Wellenlängen UV Detektor durchgeführt.
- Peptide wurden bevorzugt unter Verwendung der Festphasensynthese wie sie von Merrifield als Methode generell beschrieben wurde, hergestellt [J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)], obwohl auch andere äquivalente chemische Synthesen als die oben erwähnte, die an sich bekannt sind, verwendet werden können. Die Festphasensynthese wird vom C-terminalen Ende des Peptides durch Kupplung einer geschützten alpha-Aminosäure an einen entsprechenden Rest begonnen. Solches Ausgangsmaterial kann durch Verknüpfung einer alpha-Amino geschützten Aminosäure durch eine Esterverbindung zu einem chlormethylierten Harz oder einem Hydroxymethyl-Harz oder durch eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin-Harz (BHA) oder para- Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA) hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethyl-Harzes ist in der Fach weit bekannt. Chlormethylierte Harze sind kommerziell erhältlich und ihre Herstellung in der Fachwelt ebenfalls bekannt. BHA und MBHA Harz- Supports sind kommerziell verfügbar und werden im allgemeinen verwendet, wenn das gewünschte Peptid, das synthetisiert wird, ein unsubstituiertes Amid am C-Terminus besitzt.
- Im allgemeinen wurde die erste Aminosäure, die an das BHA- Harz gekuppelt wurde, als ein Boc-Aminosäure symmetrisches Anhydrid unter Verwendung von 2 - 10 Aequivalenten aktivierter Aminosäure pro Harz-Stickstoff-Aequivalent zugegeben. Nach der Kupplung wurde das Harz gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Beladung der Aminosäure auf das Harz kann mittels Aminosäureanalyse eines Aliquots Boc-Aminosäure-Harzes bestimmt werden. Die Beladungen lagen generell zwischen 0.2 bis 0.4 mmol/g Harz. Alle nichtreagierten Aminogruppen können durch Behandlung des Harzes mit Acetanhydrid und Diisopropylethylamin in Methylenchlorid abgesättigt werden.
- Nach der Addition der Boc-Aminosäure wurden zur sequentiellen Addition von Aminosäuren die Harze mehreren repetitiven Zyklen unterworfen. Der alpha-Amino-Boc Schutz wurde unter sauren Bedingungen entfernt. Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid, HCl in Dioxan oder Ameisensäure/Essigsäure- Mischungen können für diesen Zweck eingesetzt werden. Vorzugsweise wird 50% TFA in Methylenchlorid (v/v) verwendet. Sie kann auch 1 - 5% Volumenanteile EDT oder Dimethylsulfid als t- Butylcarboniumionen-Fänger enthalten. Andere in der Fachwelt bekannte Reagentien können ebenfalls eingesetzt werden.
- Nach der Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe werden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Abfolge angekuppelt, so dass man ein intermediäres geschütztes Peptidharz erhält. Die aktivierenden Reagentien, die für die Kupplung von Aminosäuren in der Festphasensynthese der Peptide benutzt werden, sind in der Fach weit bekannt. Zum Beispiel sind Benzotriazol-1-yloxy-tri-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophospate (BOP), Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) geeignete Reagenzien für solche Synthesen. Die bevorzugten sind hier DCC und DIC. Andere aktivierende Agentien, die eingesetzt werden können, werden von Barany und Merrifield beschrieben [in "The Peptides", Vol. 2, J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, 1979, S. 1-284]. Verschiedene Reagentien wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) und 3,4-Dihydro-3-hyroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (HOOBT) können zu den Kupplungsmischungen gegeben werden, um die Synthesezyklen zu optimieren. Bevorzugt ist hier HOBT.
- Das Protokoll für einen typischen Synthesezyklus sah folgendermassen aus: Protokoll 1 Schritt Reagenz Zeit Kupplung Stunden
- Lösungsmittel für alle Waschungen und Kupplungen wurden auf Volumina von 10 - 40 ml/g Harz bemessen. Kupplungen wurden unter Verwendung von entweder vorgebildeten symmetrischen Anhydriden der Boc-Aminosäuren oder als O-Acyl- Isoharnstoffderivate durchgeführt. Im allgemeinen wurden unter Verwendung von Methylenchlorid als Lösungsmittel 2 - 10 Aequivalente der aktivierten Boc-Aminosäure pro Aequivalent des Aminharzes zugegeben. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) und Boc-His (Bom) wurden in 20 - 25% DMF/CH&sub2;Cl&sub2; gekuppelt. Boc- Asn, Boc-Gln und Boc-His(Bom) wurden als ihre HOBT aktiven Ester gekuppelt, um bekannte Nebenreaktionen zu minimieren.
- Die Peptide wurden im allgemeinen unter Verwendung von in der Fachwelt bekannter Methoden zyklisiert. An den Aminosäureresten innerhalb des Peptids, an denen die Seitenketten verknüpft werden müssen, wurden unterschiedliche Schutzgruppen verwendet. Für die Aminosäuren mit Seitenketten, Lys und Orn, wurden die Nε- und Nδ-Fmoc Derivate in die Peptidkette eingebaut. Für die Aminosäuren mit Carboxyl-Seitenketten, Asp und Glu, wurden die Oβ- und Oγ-Fm Derivate eingebaut. Die Peptide wurden während sie immer noch am Harz gebunden waren, mit 20 - 40% Piperidin in DMF zur selektiven Entfernung der Fmoc und Fm Schutzgruppen behandelt. Die freien Seitenketten Amino- und Carboxylgruppen wurden dann kovalent innerhalb des Moleküls durch Behandlung mit einem geeigneten Amidbildenden Reagenz wie Diphenylposphorylazid (DPPA), DCC, DIC oder BOP verknüpft. Bevorzugt sind hier DCC und BOP.
- Das Protokoll für ein typischen Zyklisierungsverfahren sah folgendermassen aus: Protokoll 2 Schritt Reagenz Zeit Piperidin Piperidin Kupplung Stunden
- Die Kupplungsreaktionen während der gesamten Synthese wurden zur Bestimmung des Ausmasses der Reaktionsvervollständigung mit den Kaiser-Ninhydrin-Tests verfolgt [Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)]. Langsame Reaktionskinetiken wurden für Boc-Arg(Tos), Boc-Asn und Boc-Gln beobachtet. Alle unvollständigen Kupplungsreaktionen wurden endweder mit frisch hergestelltem aktivierten Aminosäuren wieder neu gekuppelt oder das Peptidharz wurde durch Behandlung mit Acetanhydrid wie oben beschrieben geschützt. Die vollständig zusammengesetzten Peptidharze wurden unter Vakuum für mehrere Stunden getrocknet.
- Für jede Verbindung wurden die blockierenden Gruppen entfernt und das Peptid vom Harz gemäss der folgenden Prozedur abgespalten. Im allgemeinen wurden die Peptidharze mit 25 - 100 µl Ethandithiol, 1 ml Anisol und 9 ml flüssigem Fluorwasserstoff pro Gramm Harz bei 0ºC für 45 - 60 min in einem Teflon HF Gerät (Peninsula) behandelt. Alternativ konnte ein modifiziertes zwei- Schritt Spaltungsverfahren verwendet werden, wobei das Peptidharz mit 3 ml Dimethylsulfid und 1 ml Fluorwasserstoff für 2 Stunden bei 0ºC behandelt [Tam et al., Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940 (1982)] und vor einer Behandlung mit 90% HF abgedampft wurde. Verdampfbare Reagentien wurden dann unter Vakuum bei Eisbad- Temperatur entfernt. Der Rückstand wurde jeweils mit zwei oder drei 20 ml Volumina Et&sub2;O und EtOAc gewaschen und filtiert. Die Peptide wurden aus dem Harz durch Waschen mit drei oder vier 20 ml Volumina 10% AcOH extrahiert und filtriert. Die vereinigten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, wobei sich ein Rohprodukt ergab.
- Die Rohpeptide wurden in einem ersten Schritt durch Gelchromatographie über Sephadex G-25 fine Medium gereinigt, um das monomere vom oligomeren Material zu trennen. Die Peptide wurden in einem minimalen Volumen 10% AcOH gelöst und auf die Gelsäule gegeben. Die Säule wurde mit 10% AcOH mit einer Flussgeschwindigkeit von 0.5 - 1.5 ml/min eluiert. Das Eluat wurde bei 254 nm vermessen und die Fraktionen, die die gewünschte Bande enthielten, wurden vereinigt und lyopilisiert, um das semigereinigte Produkt zu erhalten.
- Die Reinigung der semi-gereinigten Peptide wurde im allgemeinen mittels präparativer HPLC durchgeführt. Die Peptide wurden in einem minimalen Volumen an entweder 1% AcOH oder 0.1% TFA auf die Säulen gegeben. Die Gradientenelution wurde im allgemeinen mit 10% Puffer B begonnen, dann 10 - 25% B für 10 Minuten und 25 - 35% B für 3 Stunden mit einer Flussgeschwindigkeit von 8.0 ml/min durchgeführt (Puffer A: 0.1% TFA/H&sub2;0, Puffer B: 0.1% TFA/CH&sub3;CN). Die UV-Detektion erfolgte bei 220 nm. Die Fraktionen wurden in 1.5 - 2.5 Minuten Intervallen gesammelt und mittels analytischer HPLC untersucht. Fraktionen, die als sehr rein eingeschätzt wurden, wurden vereinigt und lyophilisiert.
- Die Reinheit der Endprodukte wurde mittels analytischer HPLC an einer "reversed phase"-Säule wie oben beschrieben überprüft. Im allgemeinen wurde eine Gradientenelution von 20 - 40% B (Puffer A: 0.022% TFA/H&sub2;0, Puffer B: 0.022% TFA/CH&sub3;CN) in 15 Minuten bei 2.0 ml/min durchgeführt. Die UV-Detektion erfolgte bei 210 nm. Die Reinheit aller Produkte wurde auf ungefähr 97 - 99% geschätzt. Aminosäureanalysen wurden für die einzelnen Peptide durchgeführt, wobei die erhaltenen Werte sich in akzeptablen Grenzen bewegten. Generell wurden alle Endprodukte auch der "Fast atom bombardment mass spectrometry" (FAB-MS) unterworfen. Alle Produkte lieferten die erwarteten M+H Stammionen innerhalb akzeptabler Grenzen.
- Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften. Sie besitzen eine tracheal relaxierende Aktivität und sind wirksame Bronchodilatatoren. Die Verbindungen haben ebenfalls keine kardiovaskulären Nebenwirkungen. Die durch die neuen Peptide hervorgerufene Bronchdilatation kann länger als zwei Stunden aufrechterhalten werden. Demnach sind die Verbindungen als hochwirksame Bronchodilatatoren wertvolle pharmazeutische Mittel zur Behandlung bronchokonstringierender Erkrankungen, z. B - Asthma.
- Die neuen Verbindungen der Formeln I - V können mit verschiedenen typischen pharmazeutischen Trägermaterialien kombiniert werden, bevorzugt ist ein nichttoxisches, inertes, therapeutisch akzeptables Trägermaterial zur Bereitstellung von Zusammensetzungen, die für die Verwendung bei der Behandlung von bronchokonstringierenden Erkrankungen wie Asthma geeignet sind. Die Dosierung dieser Verbindungen in der galenischen Darreichungsform hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie die speziell verwendete Verbindung und die besondere Formulierung. Eine effektive Dosierung kann durch einen normalen Fachmann aus hier beschriebenen effektiven Konzentration (EC&sub5;&sub0;) bestimmt werden. Typische Dosierungen im Menschen sollten 0.01 - 100 kg/kg sein. Für Verbindungen mit einem niedrigen ED&sub5;&sub0; Wert, wie 0.1 µg, liegen typische Dosierungen für Menschen bei ungefähr 0.02 - 20 µg/kg.
- Die neuen Verbindungen der Formeln I - V bilden pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze mit einer Vielzahl anorganischer und organischer Säuren wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Salpetersäure, Sulfamidsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Brenztranbensäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Zimtsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure und verwandte Säuren.
- Die vorliegenden Verbindungen können einem Patienten mittels parentaler Applikation entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, oral oder intranasal verabreicht werden. Ein bevorzugter Weg für die parentale Verabreichtung ist die durch Aerosol via oraler oder intranasaler Verabreichung.
- Die vorliegende Erfindung wird im weiteren durch die folgenden Beispiele illustriert.
- Benzhydrylamin-Copolystyrol-1% Divinylbenzol vernetztes Harz (9.5 g, 3.6 mequiv, 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) wurde in 100 ml Methylenchlorid aufgequollen, filtriert und unter Benutzung der Schritte 7 - 8 des Protokolls 1 gewaschen. Boc-Thr(Bzl) (3.35 g, 10.8 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (1.12 g, 5.42 mmol) liess man in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; für 1 Stunde reagieren, dann wurde es abfiltiert und in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; zu dem gequollenen Harz gegeben. Die Mischung wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. DIPEA (630 ml, 3.6 mmol) wurde zugegeben und dann für 1 zusätzliche Stunde geschüttelt, filtiert und anschiessend die Schritte 10 - 14 von Protokoll 1 durchgeführt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Jede nichtabreagierte Amingruppe wurde durch Behandlung des Harzes mit 1 ml Acetanhydrid und 1 ml DIPEA in 50 ml Methylenchlorid für 30 Minuten geschützt und das Harz gemäss den Schritten 13 - 14 des Protokolls 1 filtriert und gewaschen. Das Harz wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet, wobei sich 9.8 g Boc- Thr(Bzl)-BHA-Harz ergaben. Ein Teil dieses Harzes wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen, die eine Beladung von 0.17 mmol Thr/g ergab.
- Das Boc-Thr (Bzl)-BHA Harz (9.8 g, 1.7 mmol) aus Beispiel 1 wurde unter Verwendung des obengenannten Protokolls 1 einer Festphasensynthese unterworfen. Alle Kupplungen wurden unter Verwendung vorgebildeter symmetrischer Anhydride durchgeführt, die aus Boc-Aminosäuren und Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt waren. Boc-Asparagin, Boc-Glutamin und Boc-Histidin- (benzoxymethyl) wurden jeweils als HOBT aktivierte Ester gekuppelt. Die Reaktionszeiten lagen im allgemeinen bei 1 - 18 Stunden für die Vervollständigung eines Kupplungsschrittes. Fünf Kupplungszyklen wurden mit je einem Zyklus mit Boc-Leu (1.5 g, 6.0 mmol), Boc-Val (1.3 g, 6.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1.8 g, 6.0 mmol), Boc- Asn (773 mg, 3.3 mmol) und Boc-Leu (1.5 g, 6.0 mmol) durchgeführt. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei 12.2 g des Boc- Hexapeptidharzes entstanden.
- Ein 8.2 g (1.13 mmol) Anteil dieses Harzes wurde mit sechs Zyklen gekuppelt, mit je einem Zyklus mit Boc-Tyr(2,6-DCB) (1.77 g, 4.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.67 g, 4.0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (1,67 g, 4.0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4.0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4.0 mmol) und Boc-Nle (932 mg, 4.0 mmol), wobei 10.2 g des Boc- Dodecapeptidharzes entstanden.
- Mit einem 1.26 g (0.139 mmol) Anteil dieses Harzes wurden zwei Kupplungszyklen mit Boc-Gln (205 mg, 0.93 mmol) und Boc-Lys (2-Cl-Z) (627 mg, 1.5 mmol) durchgeführt. Eine Hälfte dieses Harzes (0.069 mmol) wurde durch vierzehn Kupplungszyklen mit je einem Zyklus mit Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0.76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0.76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0.76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0.76 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (333 mg, 0.76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0.76 mmol), Boc-Asp (0FM) (311 mg, 0.76 mmol), Boc-Thr (Bzl) (234 mg, 0.76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0.76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0.76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0.76 mmol), Boc-Asp (OcHx) (238 mg, 0.76 mmol), Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0.76 mmol) und Boc-His (Bom) (156 mg, 0.41 mmol) geführt. Das Peptidharz wurde den Stufen 1 - 8 des Protokolls 1 unterworfen und anschliessend mit 1. ml Acetanhydrid und 66 ml DIPEA (0.38 mmol) in 20 ml Methylenchlorid für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10-14 gewaschen.
- Das Harz wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und siebenmal mit DCC (49 mg, 0.24 mmol) und HOBT (32 mg, 0.24 mmol) in 20 ml destillertem DMF für 24 Stunden abreagiert. Der Kaiser-Ninhydrin- Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 von Protokoll 2 gewaschen und anschliesssend unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.72 g ergaben.
- Das Harz wurde mit 6 ml Dimethylsulfid und 2 ml flüssigem HF für 2 Stunden und 0ºC behandelt. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 0.7 ml Anisol und 6 ml flüssigem HF für 45 Minuten bei 0ºC behandelt. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 1 x 15 ml Et&sub2;O und 3 x 15 ml EtOAc gewaschen. Das Harz wurde mit 3 x 20 ml 10 % AcOH extrahiert. Die kombinierten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, wobei 227 mg eines weissen Festkörpers entstanden.
- Das Rohmaterial wurde mittels präparativer HPLC über eine Whatman Magnum-20 ODS-3 Säule (2 x 25 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 - 40 % B (Puffer A: 0.1% TFA/H&sub2;0, Puffer B: 0.1% TFA/CH&sub3;CN) über 4 Stunden eluiert. Der Hauptpeak wurde nach analytischer HPLC-Analyse aus den gesammelten Fraktionen bestimmt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 26.7 mg des semi-reinen Produkts ergaben. Dieses Material wurde wiederum auf eine Magnum-20 ODS-3 Säule gegeben (2 x 50 cm) und mit dem gleichen Gradienten eluiert. Der Hauptpeak wurde ausgeschnitten und lyophilisiert, wobei 9.5 mg eines weissen, amorphen Pulvers entstanden. Diese Verbindung war laut HPLC homogen und ergab eine korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc.. 3277.8, gefunden 3276.1.
- Herstellung von Ac-Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Glu&sup8;TLys¹²) [Ac-(SEQ ID No:21)-NH&sub2;]
- Ein mit Benzylhydrylamin-Copolystyrol-1% Divinylbenzol quervernetztes Harz (17.7g, 2.6 mequiv, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) wurde in 160 ml Methylenchlorid aufgequollen, gefiltert und gemäss den Schritten 7 - 8 des Protokolls 1 gewaschen. Das Harz wurde in 160 ml Methylenchlorid resuspendiert und Boc- Thr(Bzl) (6.25 g, 20.2 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (2.10 g, 10.1 mmol) zugegeben. Diese Mischung wurde für 8 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, dann filtriert und den Schritten 10 - 14 von Protokoll 1 unterworfen. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Nichtabreagierte Amingruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 5 ml Acetanhydrid und 5 ml DIPEA in 150 ml Methylenchlorid für 60 Minuten geschützt, anschliessend wurde filtiert und gemäss den Schritten 13 - 14 gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum über Nacht getrocknet, wobei sich 18.0 g des Boc- Thr(Bzl)-BHA Harzes ergaben. Ein Teil des Harzes wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen, die eine Beladung mit 0.17 mmol Thr/g ergab.
- Das Boc-Thr(Blz)-BHA Harz (18.0 g, 3.06 mmol) wurde einer Festphasensynthese gemäss Protokoll 1 unterworfen. Alle Kupplungen wurden mittels symmetrischer Anhydride hergestellt, die vorher aus Boc-Aminosäuren und Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt worden waren. Boc-Asparagin, Boc-Glutamin und Boc- Histidin(benzyloxymethyl) wurden jeweils als HOBT aktive Ester gekuppelt. Fünf Kupplungszyklen wurden durchgeführt: jeweils ein Zyklus mit Boc-Leu (6.1 g, 24.5 mmol), Boc-Val (5.32 g, 24.5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7.23 g, 24.5 mmol), Boc-Asn (3.13 g, 13.5 mmol) und Boc-Leu (6.1 g, 24.5 mmol). Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei 22.9 g Boc-Hexapeptidharz entstanden.
- Ein 7.48 g (1.0 mmol) Anteil dieses Harzes wurde 10 Kupplungsreaktionen unterworden, jeweils ein Zyklus mit Boc- Tyr(2,6-DCB) (1.76 g, 4.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc-Lys (2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4.0 mmol), Boc-Ala (1.5 g, 8.0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4.0 mmol), Boc-Gln (1.08 g, 4.4 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (1.71 g, 4.0 mmol) und Boc-Leu (998 mg, 4.0 mmol), wobei sich 9.6 g des Boc-Hexadecapeptidharzes ergaben.
- Ein 7.68 g (0.8 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-Lys(Fmoc) (1.5 g, 3.2 mmol) unterworfen, wobei 8.32 g des Boc-Heptapeptidharzes entstanden.
- Ein 6.24 g (0.6 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zwei Kupplungsreaktionen mit je einem Zyklus mit Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol) und Boc-Tyr(2,6-DCB) (1.06 g, 2.4 mmol) unterworfen, wobei 6.28 g Boc-Nonadecapeptidharzes entstanden.
- Ein 2.09 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde neun Kupplungsreaktionen mit je eimem Zyklus mit Boc-Asn (204 mg, 0.88 mmol), Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0.8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0.8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0.8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0.8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0.8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0.8 30 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0.8 mmol) und mit Boc-His(Bom) (330 mg, 0.88 mmol,) unterworfer. Das Peptidharz wurde den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 unterworfen und mit 0.25 ml Acetanhydrid und 70 ml DIPEA in 20 ml Methylenchlorid für 20 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 bis 14 gewaschen.
- Das Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 des Protokoll s 2 deblockiert. Drei Viertel dieses Harzes (0.15 mmol) lies man mit DCC (77 mg, 0.37 mmol) und HOBT (51 mg, 0.37 mmol) in 20 ml destilliertem DMF für 72 Stunden und dann in 20 ml Toluol für 24 Stunden reagieren. Der Kaiser- Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde unter Verwendung der Schritte 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 1.72 g ergaben.
- Ein 1.14 g (0.099 mmol) Anteil dieses Harzes wurde durch die Behandlung wie in Beispiel 2 deblockiert, ausser dass 1 ml Anisol und 9 ml HF im zweiten Schritt eingesetzt wurden. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 1 x 15 ml Et&sub2;0 und 3 x 15 ml EtOAc gewaschen. Das Harz wurde mit 3 x 20 ml 10 % AcOH extrahiert. Die vereinigten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, wobei sich 535 mg eines weissen Festkörpers ergaben.
- Dieses Rohmaterial wurde durch Gelfiltration über Sephadex G- 25 fine (2 x 100 cm Säule) durch Elution mit 10% AcOH gereinigt. Der monomere Peak wurde durch analytische HPLC Analyse aus den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 83.5 mg des semigereinigten Produktes ergaben. Dieses Material wurde mittels präparativer HPLC wie in Beispiel 2 beschrieben weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 20 - 40% über 3 Stunden gefahren wurde. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC Analyse aus den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei 18.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers entstanden. Diese Substanz war in der HPLC Analyse homogen und ergab die richtige Aminosäureanalyse. FAB- MS: MH calc. 3292.0, gefunden: 3291.8.
- Ein 1.55 g (0.15 mmol) Anteil des Boc-Nonadecapeptidharzes aus Beispiel 3 wurde über neun Kupplungsreaktionen mit je einem Zyklus mit Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0.6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0.66 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0.8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0.6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0.6 mmol), Boc-Ala (113 mg, 0.6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0.6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0.6 mmol) und Boc-His(Bom) (248 mg, 0.66 mmol) geführt. Das Peptidharz wurde gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 und für 30 Minuten mit 0.25 ml Essigsäureanhydrid und 70 ml DIPEA in 20 ml Methylenchlorid behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen.
- Das Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und zweimal mit DCC (77 mg, 0.37 mmol) und HOBT (51 mg, 0.37 mmol) in 20 ml destilliertem DMF für 24 und 72 Stunden und zweimal in 20 ml Toluol für 24 und 48 Stunden zur Reaktion gebracht. Der Kaiser- Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 15 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 1.54 g ergaben.
- Ein 1.26 g (0.122 mmol) Anteil dieses Harzes wurde durch Behandlung mit HF wie in Beispiel 2 deblockiert. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 1 x 15 ml Et&sub2;O und 3 x 15 ml EtOAc gewaschen. Das Harz wurde mit 3 x 20 ml 10% AcOH extrahiert. Die vereinigten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, wobei sich 485 mg eines weissen Feststoffs ergaben.
- Dieses Rohmaterial wurde durch Gelfiltration über Sephadex G-25 fine wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt, wobei 83.5 mg des semigereinigten Produktes entstanden. Dieses Material wurde durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 20 - 45% für 3 Stunden gefahren wurde. Der Hauptpeak wurde analytische HPLC Analyse aus den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 11.5 mg eines weissen amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäss HPLC homogen und ergab die korrekte Aminosäureanylse. FAB-MS: MH calc. 3277.8, gefunden 3277.6.
- Ein 1.92 g (0.2 mmol) Anteil des Boc-Hexadecapeptidharzes aus Beispiel 3 wurde über 12 Kupplungsreaktionen geführt mit je einem Zyklus mit Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0.8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1.6 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0.8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0.44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0.8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1.6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0.8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0.8 15 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0.8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0.8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0.8 mmol) und Boc-His(Bom) (330 mg, 0.88 mmol). Das Peptidharz wurde gemäss den Schritten 1 - 8 von Protokoll 1 und mit 0.25 ml Acetanhydrid und 70 ml DIPEA in 20 ml Methylenchlorid für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und über Nacht getrocknet, wobei sich 2.38 g ergaben.
- Ein 1.38 g (0.11 mmol) Anteil dieses Harzes wurde dann selektiv durch Behandung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und mit DCC (55 mg, 0.27 mmol) und HOBT (37 mg, 0.27 mmol) in 20 ml destilleriertem DMF für 24 Stunden in 20 ml Toluol für 24 Stunden und fünfmal in 20 ml destilliertem DMF für 24 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war leicht positiv. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Ein 0.8 g (0.05 mmol) Anteil dieses Harzes wurde durch Behandlung mit HF wie in Beispiel 3 deblockiert. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 1 x 15 ml Et&sub2;0 und 3 x 15 ml EtOAc gewaschen. Das Harz wurde mit 3 x 20 ml 10% AcOH extrahiert. Die vereinigten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, um 429 mg eines gummiartigen Festkörpers zu ergeben.
- Dieses Rohmaterial wurde durch Gelfiltration über Sephadex G- 25 fine wie in Beispiel 3 gereinigt, wobei 107 mg des semigereinigten Produktes anfielen. Dieses Material wurde durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 10 - 40% für 3 Stunden gefahren wurde. Der Hauptpeak wurde mittels analytischer HPLC Analyse aus den gesammelten Fraktionen ausgeschnitten, vereinigt und lyophilisiert, um 17.5 mg eines weissen, amorphen Pulvers zu ergeben. Diese Verbindung war gemäss HPLC homogen und ergab eine korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3263.7,, gefunden 3264.1.
- Ein 1.0 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-Hexadecapeptidharzes aus Beispiel 3 wurde über zwölf Kupplungsreaktionen geführt, mit je einem Zyklus mit Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0.4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0.4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0.4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0.44 mmol), Boc-Lys((Fmoc) (187 mg, 0.4 mmol), Boc- Thr(Bzl) (124 mg, 0.4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0.4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0.4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0.4 mmol), BocAsp(OcHx) (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0.4 mmol) und Boc-His(Bom) (150 mg, 0.4 mmol). Das Peptidharz wurde gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls behandelt und mit 0.5 ml Acetanhydrid und 35 ml DIPEA in 30 ml Methylenchlorid für 30 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und über Nacht getrocknet, wobei 1.2 g erhalten wurden.
- Ein 0.8 g (0.066 mmol) Anteil dieses Harzes wurde dann selektiv gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und mit BOP (58 mg, 0.13 mmol) in 20 ml destilliertem DMF für 24 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Das Harz wurde durch Behandlung mit HF wie in Beispiel 3 deblockiert. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand mit 1 x 15 ml Et&sub2;O und 3 x 15 ml EtOAc gewaschen. Der Rückstand wurde mit 3 x 20 ml 10% AcOH extrahiert. Die vereinigten wässrigen Filtrate wurden lyophilisiert, um einen gummiartigen Festkörper zu ergeben.
- Das Rohmaterial wurde mittels Gelfiltration über Sephadex G-25 fine wie in Beispiel 3 gereinigt, wobei 43.8 mg des semi-gereinigten Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde mittels präparativer HPLC wie in Beispiel 3 weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 10 - 40% für 3 Stunden gefahren wurde. Der Hauptpeak wurde mittels analytischer HPLC Analyse aus den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei 7.5 mg eines weissen, amorphen Puders entstanden. Diese Verbindung war gemäss HPLC homogen und ergab eine korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3277.8, gefunden 3276.4.
- Ein mit Benzhydrylamin-Copolystyrol-1 % Divinylbenzol quervernetztes Harz (25.0 g, 17.5 mequiv. 200-400 ASTM mesh, Bachem) wurde in 160 ml Methylenchlorid aufgequollen, gefiltert und gemäss den Schritten 7 - 8 des Protokolls in Tabelle 1 gewaschen. Das Harz wurde in 160 ml Methylenchlorid resuspendiert und Boc-Thr(Bzl) (16.2 g, 52.5 mmol) und Dicyclohexyl-carbodiimid (5.4 g, 26.2 mmol) zugegeben. Diese Mischung wurde für 6 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, filtriert und dann gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 verfahren. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Nicht abreagierte Amingruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 5 ml Acetanhydrid und 5 ml DIPEA in 150 ml Methylenchlorid für 60 Minuten geschützt, anschliessend wurde gemäss den Schritten 13 - 14 des Protokolls abfiltriert und gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum über Nacht getrocknet, wobei sich 29.6 g des Boc-Thr(Bzl)- BHA-Harzes ergaben. Ein Teil dieses Harzes wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen, die eine Beladung mi t 0.21 mmol Thr/g anzeigte.
- Ein 14.0 g (2.94 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einer Festphasensynthese nach dem obigen Protokoll wie in Beispiel 2 unterworfen. Elf Kupplungsschritte wurden mit je einem Zyklus mit Boc-Leu (5.9 g, 23.5 mmol), Boc-Val (5.1 g, 23.5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6.9 g, 23.5 mmol), Boc-Asn (3.0 g, 13.0 mmol), Boc-Leu (5.9 g, 23.5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (10.3 g, 23.5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9.8 g, 23.5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9.8 g, 23.5 mmol), Boc-Val (5.1 g, 23.5 mmol), Boc-Ala (4.4 g, 23.5 mmol) und Boc-Nle (5.4 g, 23.5 mmol) durchgeführt, wobei 26 g des Boc-Decapeptidharzes entstanden.
- Ein 5.5 g (0.61 mmol) Anteil dieses Harzes wurde über vier Zyklen mit je einem Zyklus mit Boc-Gln (655 mg, 2.7 mmol), Boc- Lys(2-Cl-Z) (2.0 g, 4.8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2.1 g, 4.8 mmol) und Boc-Leu (1.2 g, 4.8 mmol) gekuppelt. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 6.12 g des Boc-Hexadecapeptidharzes ergaben.
- Ein 2.0 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde über zwölf Zyklen mit je einem Zyklus Boc-Orn(Fmoc) (91 mg, 0.2 mmol), Boc- Thr(Bzl) (250 mg, 0.8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0.8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0.44 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0.8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0.8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0.8 mmol), Boc- Val (174 mg, 0.8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0.8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0.8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0.8 mmol) und Boc- His(Bom) (150 mg, 0.4 mmol) geführt. Das Peptidharz wurde den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 unterworfen und mit 0.5 ml Acetanhydrid und 38 ml DIPEA in 30 ml Methylenchlorid über 180 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 2.4 g ergaben.
- Ein 1.15 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und zweimal mit BOP (58 mg, 0.13 mmol) und 400 ml DIPEA in 20 ml destilliertem DMF für 24 und 6 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 1.05 g ergaben.
- Das Harz wurde durch Behandlung mit 9 ml HF, ml Anisol und 100 ml Ethandithiol für 1 Stunde bei 0º C deblockiert. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft und der Rückstand wurde mit 2 x 15 ml Et&sub2;O und 2 x 15 ml EtOAc gewaschen. Das Harz wurde mii 4 x 20 ml 10% AcOH extrahiert. Die vereinigten wässrigen Filuate wurden lyophilisiert, wobei 385 mg eines schwachgelben Festkörpers anfielen.
- Dieses Rohmaterial wurde durch Gelfiltration über Sephadex G- 25 fine wie in Beispiel 3 gereinigt, wobei 134 mg des semigereinigten Produktes anfielen. Dieses Material wurde durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 26 - 36% über 3 Stunden gefahren wurde. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC Analyse in den gesammelten Fraktionen festgestellt, vereinigt und lyophilisiert, wobei 23.2 mg eines weissen, amorphen Pulvers anfielen. Diese Verbindung war gemäss HPLC homogen und ergab eine korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3277.8, gefunden 3276.3.
- Ein mit Benzhydrylamin-Copolystyrol-1% Divinylbenzol quervernetztes Harz (30 g, 21.4 mequiv. 200-400 ASTM mesh, Bachem) wurde wie in Beispiel 22 behandelt, ausser das 19.9 g Boc- Thr(Bzl) (64.3 mmol) und 6.6 g Dicyclohexylcarbodiimid (32.1 mmol) benutzt wurden. Diese Mischung wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und filtriert, anschliessend wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 verfahren. Der Kaiser- Ninhydrin-Test war negativ. Nicht abreagierte Amingruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 8 ml Acetanhydrid und 8 ml DIPEA in 200 ml Methylenchlorid für 60 Minuten geschützt, anschliessend wurde gemäss den Schritten 13 - 14 des Protokolls abfiltriert und gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum über Nacht getrocknet, wobei sich 34.2 g des Boc-Thr(Bzl)-BHA-Harzes ergaben. Ein Teil dieses Harzes wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen, die eine Beladung mit 0.47 mmol Thr/g anzeigte.
- Ein 0.85 g (0.4 mmol) Anteil dieses Boc-Thr(Bzl)-BHA Harzes wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer unterworfen. Alle Kupplungen wurden unter Verwendung von vorgebildeten symmetrischen Anhydriden, die aus Boc-Aminosäuren und Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt worden waren, durchgeführt. Boc-Asparagin, Boc- Glutamin und Boc-Arginin((tosyl) wurden gewöhnlich als die jeweiligen HOBT aktivierten Ester gekuppelt. Elf Kupplungszyklen wurden mit je einem Zyklus mit Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc- Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2- Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol) und Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol) durchgeführt, wobei sich das Boc-Dodecapeptid ergab.
- Dieses Harz wurde dann durch fünf Kupplungszyklen wie in Beispiel 2 geführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0.8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (664 mg, 1.6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1.6 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1.6 mmol) und Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0.8 mmol) durchgeführt wurde. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei 2.12 g des Boc-Heptdecapeptids anfielen.
- Ein 1.06 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und zweimal mit BOP (177 mg, 0.4 mmol) und 200 ml DIPEA in 20 ml destilliertem DMF für 2 und für 8 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war sehr schwach positiv. Nichtabreagierte Amingruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 10 Minuten geschützt, dann wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 abfiltriert und gewaschen. Dieses Harz wurde dann über eine Kupplungsreaktion mit Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1.6 mmol) geführt und dann wie oben zurück auf den Applied Biosystems 430A Peptidsynthesizer gegeben. Zehn Kupplungsreaktionen wurden durchgeführt, mit je einem Zyklus mit Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol). Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 mit 0.5 ml Acetanhydrid und 100 ml DIPEA in 20 ml Methylenchlorid für 30 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Das Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, wobei sich 340 mg des Rohpeptid ergaben. Das Peptid wurde mittels Gelfiltration wie in Beispiel 7 gereinigt, wobei sich 35 mg des semigereinigten Produkts ergaben. Dieses Material wurde mittels präparativer HPLC wie in Beispiel 3 weiter gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 15.6 mg eines weissen, amorphen Pulvers anfielen. Diese Verbindung war gemäss HPLC homogen und ergab eine korrekte Aminosäureanalyse. FAB- MS; MH calc. 3276.6, gefunden 3278.0.
- Ein 0.42 g (0.2 mmol- Anteil des Boc-Thr(Bzl)-Harzes aus Beispiel 8 wurde neun Kupplungszyklen unterzogen mit je einem Zyklus mit Boc-Leu (200 mg, 0.8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0.8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0.8 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0.8 mmol), Boc-Leu (200 mg, 0.8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0.8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0.8 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0.8 mmol) und Boc-Val (174 mg, 0.8 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 selektiv deblockiert und mit BOP (177 mg, 0.4 mmol) und 200 ml DIPEA in 20 mL destilliertem DMF für 6 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ.
- Dieses Harz wurde dann einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 17 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol). Dieses Harz wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-His(Tos) (164 mg, 0.4 mmol) unterzogen und dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit 1 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 1.94 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 265 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 149 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 28.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3278.6, gefunden 3278.8.
- Benzhydrylamin-Copolystyrol-1% Divinylbenzol quervernetztes Harz (5.0 g, 2.6 mequiv, 200-400 ASTM mesh, Vega Biochem) wurden in 50 ml Methylenchlorid aufgequollen, gefiltert und gemäss den Schritten 7 - 8 des Protokolls 1 gewaschen. Das Harz wurde in 60 ml Methylenchlorid resuspendiert und Boc-Thr(Bzl) (2.32 g, 7.5 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (774 mg, 3.75 mmol) zugegeben. Diese Mischung wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt, filtriert, anschliessend wurden die Schritte 10 - 14 des Protokolls 1 durchgeführt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Alle nicht abreagierten Amingruppen wurden durch Behandlung des Harzes mit 5 ml Acetanhydrid und 5 ml DIPEA in 50 ml Methylenchlorid für 60 Minuten geschützt, filtiert und gemäss den Schritten 13 - 14 des Protokolls gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum über Nacht getrocknet, wobei sich 5.8 g of Boc-Thr(Bzl)- BHA Harz ergaben. Ein Teil dieses Harzes wurde einer Aminosäureanalyse unterzogen, die eine Beladung mit 0.276 mmol Thr/g zeigte.
- Ein 1.44 g (0.4 mmol) Anteil dieses Harzes wurde unter Verwendung des obigen Protokolls 1 wie in Beispiel 2 einer Festphasenanalyse unterzogen. Drei Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Leu (399 mg, 1.6 mmol), Boc-Val (348 mg, 1.6 mmol) und Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0.8 mmol). Eine Hälfte dieses Harzes (0.2 mmol) wurde vier Kupplungszyklen mit je einem Zyklus mit Boc-Asn (204 mg, 0.88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0.8 mmol) Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0.8 mmol) und Boc- Lys(Fmoc) (375 g, 0.8 mmol) unterzogen.
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und mit BOP (177 mg, 0.4 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für 2 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ.
- Dieses Harz wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0.8 mmol) unterzogen und dann einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 19 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol) und dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit 1 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 30 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 210 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt wobei 93 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 26.2 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3305.8, gefunden 3305.8.
- Ein 0.4 g (0.1 mmol) Anteil des Benzhydrylaminharzes (100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des oben angegebenen Protokolls unterworfen. Alle Kupplungen wurden mit gleichen Moläquivalenten der Boc- Aminosäuren und Diisopropylcarbodiimid durchgeführt. Boc- Asparagin und Boc-Glutamin wurden als entsprechende aktive Ester durch Zugabe eines 1.5 molaren Ueberschusses an HOBT zur Kupplungsmischung eingebaut. Die Reaktionszeiten lagen im allgemeinen 2 - 18 Stunden für die Vervollständigung des Kupplungsschritts. Neun Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1.0 mmol) Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol), Boc-Val (21) mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0.5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1.0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0.5 mmol) und Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung gemäss den Schritten 1 - 11 des Protokolls 2 deblockiert und mit BOP (88 mg, 0.2 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für 2 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ.
- Neunzehn Kupplungszylken wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1.0 mmol), Boc-Gln (246 mg, 1.0 mmol), Boc-Lys(2- Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol), Boc- Thr(Bzl) (309 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1.0 mmol), Boc-Asn (232 mg 1.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1.0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1.0 mmol), Boc- Val (217 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1.0 mmol) und Boc- His(Tos) (409 mg, 1.0 mmol). Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit 0.5 ml Acetanhydrid in 10 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 304 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 215 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 26 - 36% angelegt wurde, wobei 20.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3277.6, gefunden 3277.7.
- Ein 0.4 g (0.1 mmol) Anteil des Benzhydrylaminharzes (100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 11 unterworfen. Drei Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Met (249 mg, 1. mmol), Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol) und Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol). Neun Kupplungszyklen und die Zyklisierung wurden wie in Beispiel 11 durchgeführt. 19 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 11 durchgeführt, ausser das Boc-Ala im 10. Zyklus durch Boc-Val (217 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) im 19. Zyklus durch Boc-2-Nal (158 mg, 0.5 mmol) ersetzt wurde und Boc-Phe im 23. Zyklus durch Boc- p-F-Phe (142 mg, 0.5 mmoi) ersetzt wurde.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 345 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 215 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 30 - 40% angelegt wurde, wobei 16.4 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3574.7, gefunden 3575.1.
- Ein 0.4 g (0.1 mmol) Anteil des Benzhydrylaminharzes (100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 11 unterworfen. Neun Kupplungszyklen und die Zyklisierung wurden wie in Beispiel 11 durchgeführt, ausser das Boc-Ala im 10. Zyklus durch Boc-Val (217 mg, 1-0 mmol) ersetzt wurde, Boc-Lys(2-Cl-Z) im 17. Zyklus durch Boc-Orn(Z) (366 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurde und Boc-Asp(OcHx) im 21. Zyklus durch Boc- Glu(Bzl) (337 mg, 1.0 mmoi) ersetzt wurde.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 255 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt wobei 200 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 28 - 38% angelegt wurde, wobei 30.7 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3305.8, gefunden 3305.5.
- Benzhydrylaminharz (0.4 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 11 unterworfen. Drei Kupplungszyklen wurden durchgeführt, je ein Zyklus mit Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1.0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol), und Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol). Neun Kupplungszyklen und die Zyklisierung wurden wie in Beispiel 11 durchgeführt, ausser das Boc-Phe im 23. Zyklus durch Boc-p-F-PHe (142 mg, 0.5 mmol) ersetzt wurde.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 268 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 165 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 28.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3584.1, gefunden 3584.0.
- Benzhydrylaminharz (1.5 g, 0.4 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 43DA Peptidsynthesiser wie in Beispiel 11 unterworfen. Acht Kupplungszyklen wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OFm) (822 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol) and Boc-Lys(Fmoc) (938 mg, 2.0 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (356 mg, 0.8 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für zwei Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 1.9 g Boc-octapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.95 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde wiederum einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 11 unterworfen. 18 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc- Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol,), Boc-Tyr(2,6- DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc- Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), and Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), wobei sich 1.54 g des Boc-hexacosapeptid-Harzes ergaben.
- Ein 0.77 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurden einer Festphasensynthese unter Verwendung des obigen Protokolls wie in Beispiel 2 unterworfen. Zwei Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (76 mg, 0.4 mmol) und Boc-His(Tos) (328 mg, 0.8 mmol). Das Peptidharz wurde gemäss den Schritten 1 - 8 des Prokolls 1 bearbeitet und mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 bis 14 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.74 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, wobei 172 mg des Rohpeptids erhalten wurden. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 110 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 22 - 37% angelegt wurde, wobei 40.0 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3261.7, gefunden 3261.8.
- Ein 0.77 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-hexaocosapeptid-Harzes aus Beispiel 15 wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des obigen Protokolls wie in Beispiel 2 unterworfen. Zwei Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Ser(Bzl) (118 mg, 0.4 mmol, und mit Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0.4 mmol). Das Peptidharz wurde nach den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit BOP (442 mg, 1.0 mmol), Essigsäure (57 ml, 1.0 mmol) und DIPEA (523 ml, 3.0 mmol) in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.73 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 191 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 138 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 22 - 37% angelegt wurde, wobei 28.0 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3225.4, gefunden 3225.8.
- Benzhydrylaminharz (4.0 g, 1.08 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. Acht Kupplungszyklen wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Thr(Bzl) (1.34 g, 4.3 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4.3 mmol), Boc-Val (938 mg, 4.3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 mg, 2.1 mmol), Boc-Asn (557 mg, 2.4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4.3 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1.9 g, 4.3 mmol) und Boc-Lys(Fmoc) (1.1 g, 4.3 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (885 mg, 2.0 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für zwei Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen.
- Dieses Harz wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.79 g, 4.3 mmol) unterworfen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 6.3 g Boc-nonapeptid-Harz ergaben.
- Ein 1.89 g (0.3 mmol) Anteil dieses Harzes wurde neun Kupplungszyklen unterworfen mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (227 mg, 1.2 mmol), Boc-Ala (227 mg, 1.2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1.2 mmol), Boc-Gln (325 mg, 1.32 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1.2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1.2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1.2 mmol), Boc-Leu (498 mg, 2.0 mmol) und Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1.2 mmol), wobei sich 2.06 g Boc-octadecapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.68 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zehn Kupplungszyklen unterworfen mit je einem Zyklus mit Boc-2-Nal (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0.44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0.4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0.4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0.4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0.4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0.4 mmol) und Boc-His(Tos) (164 mg, 0.4 mmol). Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.82 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, wobei 261 mg des Rohpeptids erhalten wurden. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 186 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 30 - 40% angelegt wurde, wobei 60.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3296.8, gefunden 3295.6.
- Ein 0.68 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-octadecapeptid-Harzes aus Beispiel 17 wurde zehn Kupplungszyklen wie in Beispiel 17 unterworfen, ausser das Boc-2-Nal im 19. Zyklus durch BocTyr(OMe) (59 mg, 0.2 mmol) ersetzt wurde, wobei 0.61 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 175 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 136 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 28 - 38% angelegt wurde, wobei 42.4 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3276.7, gefunden 3276.0.
- Ein 0.625 g (0.09 mmol) Anteil des Boc-octadecapeptid-Harzes wurde zehn Kupplungszyklen wie in Beispiel 17 unterworfen, ausser das Boc-2-Nal im 19. Zyklus durch Boc-p-NH(Z)-Phe (166 mg, 0.4 mmol) und Boc-Phe im 23. Zyklus durch Boc-p-F-Phe (113 mg, 0.4 mmol) ersetzt wurden, wobei 0.84 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 182 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 160 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 47.2 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3279.7, gefunden 3279.8.
- Benzhydrylaminharz (1.25 g, 1.0 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. Acht Kupplungszykien wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc- Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol), Boc-Leu ( 955 mg, 4.0 mmol), Boc- Asp(OFm) (823 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2.2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1.76 g, 4.0 mmol) und Boc- Lys(Fmoc) (937 mg, 2.0 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (885 mg, 2.0 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für zwei Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und getrocknet.
- Dieses Harz wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-Lys(2-Cl-Z) (1.66 g, 4.0 mmol) unterworfen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 2.7 g Boc-nonapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.54 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterwoffen. 18 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol), wobei sich 1.16 g Bocheptacosapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.54 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol) unterworfen und dann gemäss den Schritlen 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.5 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, ausser das 5 ml HF und 0.5 ml Anisol verwendet wurden, um 127 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 74.6 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 24 - 34% angelegt wurde, wobei 17.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3333.8, gefunden 3333.4.
- Ein 0.58 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-heptacosapeptid-Harzes aus Beispiel 20 wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0.4 mmol) unterworfen und mit BOP (433 mg, 1.0 mmol), Essigsäure (57 ml, 1.0 mmol) und DIPEA (523 ml, 3.0 mmol) in 20 ml DMF 6 Stunden und mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6 % DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.4 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 20 deblockiert, um 165 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 101 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 24 - 34% angelegt wurde, wobei 19.8 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3281.8, gefunden 3281.9.
- Ein 0.54 g (0.2 mmol) Anteil des Boc-nonapeptid-Harzes wurde einer Festphasensynthese auf, einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 18 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg 2.0 mmol), Boc-Boc-Glu(OBzl) (675 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol), wobei sich 0.58 g Boc- heptacosapeptid-Harz ergaben.
- Dieses Harzes wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-His(Tos) (164 mg, 0.4 mmol) unterworfen und dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gernäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.53 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, ausser das 5 ml HF und 0.5 ml Anisol verwendet wurden, um 151 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 110 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 23.5 - 33.5 % angelegt wurde, wobei 22.8 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3347.9, gefunden 3347.0.
- Ein 1.84 g (0.3 mmol) Anteil des Boc-nonapeptid-Harzes aus Beispiel 17 wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), wobei sich 2.2 g des Boc- octadecapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.73 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zehn Kupplungszyklen unterworfen, jeweils ein Zyklus mit Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0.2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0.44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0.4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0.4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0.4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0.4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0.4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0.4 mmol) und Boc-His(Tos) (164 mg, 0.4 mmol). Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 00 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.77 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 187 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 131 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 26 - 36% angelegt wurde, wobei 5.3 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3291.8, gefunden 3291.7.
- Benzhydrylaminharz (1.1 g, 0.5 mmol, 200-400 ASTM mesh, Biomega) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 13 Kupplungszyklen wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2.2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol) und Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (433 mg, 1.0 mmol) in 20 ml 1 % DIPEA/DMF für eine Stunde umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 2.02 g des Boc-tridecapeptid-Harzes ergaben.
- Ein 0.8 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 16 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) 5(830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6- DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc- Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol) und Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), wobei sich 1.2 g Boc-nonacosapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.6 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zwei Kupplungszyklen wie oben unterworfen, jeweils ein Zyklus mit Boc- Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol), wobei sich 0.72 g ergab. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.645 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 280 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 160 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 22 - 32% angelegt wurde, wobei 23.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3561.1, gefunden 3560.8.
- Ein 0.6 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-nonacosapeptid-Harzes aus Beispiel 24 wurde zwei Kupplungszyklen wie oben mit Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol) unterworfen, wobei 0.68 g erhalten wurden. Dieses Harz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.56 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 160 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 70 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 21.8 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3545.1, gefunden 3545.3.
- Ein 1.1 g (0.9 mmol) Anteil des Boc-nonapeptidharzes aus Beispiel 20 wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynethesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 17 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol, Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr (Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol) und Boc-Asp(Oxhx) (630 mg, 2.0 mmol), wobei sich 2.24 g Boc- hexacosapeptid-Harz ergaben.
- Ein 1.1 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zwei Kupplungszyklen mit Boc-Ser(Bzl) (238 mg, 0.8 mmol) und Boc-N- Me-Ala (163 mg, 0.8 mmol unterworfen und dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und mit BOP-Cl (100 mg, 0.2 mmol), Essigsäure (23 ml, 0.2 mmol) und DIPEA (140 ml, 0.4 mmol) in 20 ml DMF für 1 Stunde behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.95 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 245 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 165 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 33.7 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab dies korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3295.8, gefunden 3294.5.
- Benzhydrylaminharz (2.49 g, 2.0 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. Sechs Kupplungszyklen wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Lys(2-Cl-Z) (3.32 g, 8.0 mmol), Boc- Lys(2-Cl-Z) (3.32 g, 8.0 mmol), Boc-Leu (1.85 g, 8.0 mmol), Boc- Asp(OFm) (823 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (1.02 g, 4.4 mmol) und Boc- Leu (1.05 g, 8.0 mmol). Das Harz wurde getrocknet und 0.4 mmol wurden abgenommen. Drei Kupplungsreaktionen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Tyr(2,6-DCB) (2.52 g, 6.4 mmol) und Boc-Lys(Fmoc) (1.87 g, 6.4 mmol) und Boc-Lys(2-Cl-Z) (2.65 g, 6.4 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (1.42 g, 3.2 mmol) in 20 ml 1% DIPEA/DMF für 4.5 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen und getrocknet, wobei sich 6.56 g des Boc-nonapeptid-Harzes ergaben.
- Ein 1.64 g (0.4 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430 A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 13 Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc- Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), wobei sich 2.56 g Boc-docosapeptid-Harz ergaben.
- Ein 0.64 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde sechs Kupplungszyklen unterworfen, jeweils ein Zyklus mit Boc-p-F-Phe (283 mg, 1.0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1.0 mmol) und Boc-His(Tos) (818 mg, 2.0 mmol). Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.69 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 224 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 213 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 70.5 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3365.9, gefunden 3365.6.
- Ein 1.28 g (0.2 mmol) Anteil des Boc-docosapeptid-Harzes aus Beispiel 27 wurde sechs Kupplungszyklen wie in Beispiel 27 unterworfen, ausser das Boc-p-F-Phe im ersten Zyklus durch Boc-1- Nal (315 mg, 1..0 mmol) ersetzt wurde. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 1.41 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 420 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 305 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 66.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3398.0, gefunden 3398.8.
- Ein 1.64 g (0.4 mmol) Anteil des Boc-nonapeptid-Harzes aus Beispiel 27 wurde einer Festphasensynthes auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol) und Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol) , wobei sich 2.2 g des Boc-octadecapeptid-Harzes ergaben.
- Ein 1.1 g (0.2 mmol) Anteil dieses Harzes wurde zehn Kupplungszyklen mit je einem Zyklus mit Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1.0 mmol), Boc-Asn (,512 mg, 2.2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (1.64 g, 4.0 mmol) unterworfen. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 1.45 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 580 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 400 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 22 - 32% angelegt wurde, wobei 60.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3346.9, gefunden 3346.8.
- Ein 1.1 g (0.2 mmol) Anteil des Boc-octadecapeptid-Harzes aus Beispiel 29 wurde zehn Kupplungszyklen wie in Beispie 29 unterworfen, ausser das Boc-p-NH(CBZ)-Phe im ersten Zyklus durch Boc-O-Me-Tyr (148 mg, 0.5 mmol) ersetzt wurde. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 1.45 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 555 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 460 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 152.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3361.9, gefunden 3361.7.
- Ein 1.2 g (0.2 mmol) Anteil des Boc-nonapeptid-Harzes aus Beispiel 17 wurde einer Festphasensynthes auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 13 Kupplungszyklen wurden durchgeführt, mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol) und Boc-Thr(Bzl) (615 mg, 2.0 mmol), wobei sich 1.3 g des Boc-docosapeptid-Harzes ergaben.
- Ein 0.65 g (0.1 mmol) Anteil dieses Harzes wurde sechs Kupplungszyklen wie in Beispiel 27 unterworfen. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.856 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 550 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 225 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 80.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3295.7, gefunden 3296.2.
- Ein 0.65 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-docosapeptid-Harzes aus Beispiel 31 wurde sechs Kupplungszyklen wie in Beispiel 27 unterworfen, ausser das Boc-p-F-Phe im ersten Zyklus durch Boc-1- Nal (315 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurde. Das Peptidharz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.801 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 250 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 188 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 28.0 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3327.8, gefunden 3328.5.
- Benzhydrylaminharz (1.1 g, 0.5 mmol, 200-400 ASTM mesh, Biomega) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 13 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 24 durchgeführt, ausser das Boc-Ala im ersten Zyklus durch Boc- Thr(Bzl) (619 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala im zweiten Zyklkus durch Boc- Gly (350 mg, 2.0 mmol) und Boc Ala im dritten Zyklus durch Boc-Gly (350 mg , 2.0 mmol) ausgetauscht wurden, wobei 2.03 g des Boc- Tridecapeptid-Harzes erhalten wurden.
- Ein 1.22 g (0.33 mmol) Anteil dieses Harzes wurde einer Festphasensynthese auf ein ein Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. 16 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 24 durchgeführt, ausser das Boc-Asp(OcHx) im 11. Zyklus durch Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2.0 mmol) ersetzt wurde, wobei 1.95 g des Boc-nonacosapeptid-Harzes entstanden.
- Ein 0.957 g (0.15 mmol) Anteil dieses Harzes wurde wie oben zwei Kupplungszyklen mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol) und Boc- His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol) unterworfen, wobei sich 1.05 g ergaben. Dieses Harz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.897 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 270 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 150 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 24 - 34% angelegt wurde, wobei 28.7 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3547.1, gefunden 3546.9.
- Ein 0.975 g (0.15 mmol) Anteil des Boc-Nonacosapeptid-Harzes aus Beispiel 33 wurde zwei Kupplungszyklen wie in Beispiel 33 unterworden ausser das Boc-Ala im ersten Zyklus durch Boc- Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) ersetzt wurde, wobei sich 0.915 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 303 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 180 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angejegt wurde, wobei 42.8 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3563.1, gefunden 3562.6.
- Ein 0.27 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-nonapeptid-Harzes aus Beispiel 20 wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neunzehn Kupplungszyklen wurden durchgeführt, mit je einem Zyklus mit Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2.0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2.0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg 2.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc-His(Tos) (818 mg, 2.0 mmol), wobei sich 0.57 g Boc- octacosapeptid-Harz ergaben
- Dieses Harz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.506 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 160 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 100 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angeiegt wurde, wobei 17.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3331.9, gefunden 3332.0.
- Ein 0.6 g (0.1 mmol) Anteil des Boc-nonapeptidharzes aus Beispiel 17 wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A, Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 23 durchgeführt, wobei 0.72 g des Boc-octadecapeptid-Harzes entstanden. Dieses Harz wurde einem Kupplungszyklus mit Boc-p- NH(CBZ)-Phe (166 mg, 0.4 mmol) ausgesetzt, wobei 0.79 g des Boc- nonadecapeptid-Harzes entstanden. Dieses Harz wurde einer Festphasensynthes auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 23 durchgeführt, wobei 0.72 g des Boc-octadecapeptid-Harzes entstanden. Dieses Harz wurde einer Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Model 430A Peptidsynthesizer wie in Beispiel 8 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden durchgeführt, mit je einem Zyklus mit Boc- Asn (464 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc- Thr(Bzl) (618 mg, 2.0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2.0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol) und Boc- His(Tos) (819 mg, 2.0 mmol), wobei 0.91 g entstanden. Dieses Harz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 behandelt und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 20 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten umgesetzt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 0.85 g entstanden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 350 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 138 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 25.2 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3276.8, gefunden 3276.2.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. Neun Kupplungszyklen wurden ausgeführt mit je einem Zylus mit Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1.0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OFm) (212 mg, 0.5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1.1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol), Boc-m-OCH&sub3;-Tyr(Bzl) (80 mg, 0.2 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0.5 mmol) und Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol).
- Dieses Harz wurde dann selektiv durch Behandlung nach den Schritten 1 - 11 von Protokoll 2 deblockiert und mit BOP (132 mg, 0.3 mmol) in 10 ml 1% DIPEA/DMF für 3.5 Stunden umgesetzt. Der Kaiser-Ninhydrin-Test war negativ. Das Harz wurde gemäss den Schritten 13 - 16 des Protokolls 2 gewaschen.
- Neunzehn Kupplungszyklen wurden durchgeführt mit je einem Zyklus mit Boc-Ala(189 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Nle (321 mg, 1.0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1.1 mmol), Boc-Lys(2- Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol) , Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1.0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol), Boc- Thr(Bzl) (310 mg, 1.0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0.5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1.0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1.0 mmol), Boc- Val (217 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1.0 mmol) und Boc- His(Tos) (409 mg, 1.0 mmol)
- Dieses Harz wurde dann gemäss den Schritten 1 - 8 des Protokolls 1 bearbeitet und anschliessend mit 0.5 ml Acetanhydrid in 10 ml 6% DIPEA/Methylenchlorid für 60 Minuten behandelt. Das Harz wurde gemäss den Schritten 10 - 14 des Protokolls 1 gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei sich 0.814 g ergaben.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 265 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 150 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 23 - 33% ange]egt wurde, wobei 8.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3307.8, gefunden 3306.8.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 37 durchgeführt, ausser das Boc-m-OCH&sub3;-Tyr(Bzl) im siebten Zyklus gegen Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0.2 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.754 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 254 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 114 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 15.1 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3295.7, gefunden 3295.5.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 37 durchgeführt, ausser das Boc-Thr(Bzl) im ersten Zyklus gegen Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, Boc-Leu im zweiten Zyklus gegen Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, Boc-Val im dritten Zyklus gegen Boc-Leu (268 mg, 1.0 mmol) und Boc-Asp(OcHx) im 21. Zyklus gegen Boc-Glu(O- Bzl) (337 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.90 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 270 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 155 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 29.6 mg mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3377.9, gefunden 3377.9.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 39 durchgeführt, ausser das Boc-m-OCH&sub3;-Tyr(Bzl) im siebten Zyklus gegen Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) 78 mg, 0.2 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.83 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 240 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 100 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 37.2 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3365.9, gefunden 3365.8.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 39 durchgeführt, ausser das Boc-Asn im fünften Zyklus gegen Boc- Ala (189 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht, Boc-m-OHC&sub3;-Tyr(Bzl) im siebten Zyklus gegen Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1.0 mmol) ausgetaucht und Boc-Glu(OBzl) im 21. Zyklus gegen Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.85 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 255 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 112 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 12.0 mg mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3246.8, gefunden 3246.7.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 41 durchgeführt, ausser das das Boc-Ala im fünften Zyklus gegen Boc-Asn (256 mg, 1.1 mmol ausgetauscht wurde, Boc-Nle im 11. Zyklus gegen Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol ausgetauscht wurde, Boc- Gin im 13. Zyklus gegen Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde und Boc-Ala im 21. Zyklus gegen Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1. mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.80 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 254 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 115 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 20 - 30% angelegt wurde, wobei 32.1 mg mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3248.7, gefunden 3248.3.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 41 durchgeführt, ausser das das Boc-Gln im 13. Zyklus gegen Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.93 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 250 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 100 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 23.6 mg mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3189.9, gefunden 3189.9.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 43 durchgeführt, ausser das das Boc-Nle im 12. Zyklus gegen Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.762 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 240 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 150 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 22 - 32% angelegt wurde, wobei 55.3 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3147.7, gefunden 3148.0.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispie 42 durchgeführt, ausser das das Boc-Ala im 12. Zyklus gegen Boc-Nle (231 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.775 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 203 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 100 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 37% angelegt wurde, wobei 40.0 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3290.8, gefunden 3290.5.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 28 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 43 durchgeführt, ausser das das Boc-Ala im 21. Zyklus gegen Boc- Glu(OBzl) (337 mg, 1.0 mmol) ausgetauscht wurde, wobei 0.837 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 178 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 126 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 20 - 30% angelegt wurde, wobei 24.9 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3205.7, gefunden 3205.2.
- Herstellung von Ac-[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;, Thr²&sup8;,Gly29,30,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID No:65)-NH&sub2;]
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 3 Kupplungszyklen wurden mit je einem Zyklus mit Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1.0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol) und Boc-Gly (175 mg, 1.0 mmol) durchgeführt. 28 Kuplungszyklen wurden wie in Beispiel 37 durchgeführt, ausser das Boc-m-OCH&sub3;-Tyr(Bzl) im 7. Zyklus durch Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1.0 mmol) und Boc-Asp(OcHx) im 21. Zyklus durch Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurden, wobei 0.895 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 440 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 120 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein Iinearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 27.7 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3506.9, gefunden 3205.8.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 31 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 47 durchgeführt, ausser, das Boc-Ala im 13. Zyklus durch Boc-Val (217 mg, 1.0 mmol) und Boc-Phe im 26. Zyklus durch Boc-p-F-Phe (142 mg, 0.5 mmol) ersetzt wurden, wobei 0.754 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 280 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 152 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 27 - 38% angelegt wurde, wobei 53.4 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3553.0, gefunden 3552.2.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 31 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 47 durchgeführt, ausser, das Boc-Thr(Bzl) im vierten Zyklus durch Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu im fünften Zyklus durch Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1.0 mmol), Boc-Val im sechsten Zyklus durch Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol), Boc-Ala im 13. Zyklus durch Boc-Val (217 mg, 1.0 mmol und Boc-Ser(Bzl) im 30. Zyklus durch Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurden, wobei 0.838 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 370 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 196 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 23 - 33% angelegt wurde, wobei 48.4 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3575.1, gefunden 3574.0.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 31 Kupplungszyklen wurden wie in Beispiel 49 durchgeführt, ausser, das Boc-Ala im 30. Zyklus durch Boc- Ser(Bzl) (295 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurde, wobei 0.913 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 378 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 240 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 25 - 35% angelegt wurde, wobei 28.8 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3591.1, gefunden 3590.3.
- Benzhydrylaminharz (0.125 g, 0.1 mmol, 100-200 ASTM mesh, Bachem) wurde einer Festphasensynthese nach Protokoll 1 wie in Beispiel 2 unterworfen. 31 Kupplungszyklen wurden wie in Beispie 47 durchgeführt, ausser, das Boc-Thr(Bzl) im ersten Zyklus durch Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Gly im zweiten Zyklus durch Boc- Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Gly im dritten Zyklus durch Boc-Ala (189 mg, 1.0 mmol), Boc-Thr(Bzl) im vierten Zyklus durch Boc- Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1.0 mmol), Boc-Leu im fünften Zyklus durch Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1.0 mmol), Boc-Val im sechsten Zyklus durch Boc-Leu (249 mg, 1.0 mmol) und Boc-Glu(OBzl) im 24. Zyklus duch Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1.0 mmol) ersetzt wurden, wobei 0.844 g erhalten wurden.
- Dieses Peptidharz wurde wie in Beispiel 7 deblockiert, um 360 mg des Rohpeptids zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel 3 durch Gelfiltration gereinigt, wobei 115 mg des semireinen Produktes erhalten wurden. Dieses Material wurde weiter durch präparative HPLC wie in Beispiel 3 gereinigt, ausser das ein linearer Gradient von 24 - 34% angelegt wurde, wobei 34.7 mg eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Verbindung war homogen gemäss HPLC und ergab die korrekte Aminosäureanalyse. FAB-MS: MH calc. 3547.1, gefunden 3546.0.
- Die relaxierende Wirkung der VIP Analogen wurde unter Verwendung eines Meerschweinchen Trachea-Modells studiert [Wasserman, M.A. et al., in "Vasoactive Intestinal Peptide", S.I. Said, Hrsg., Raven Press, N.Y. 1982, S. 177-184]. Alle Gewebe wurden männlichen Albino-Meerschweinchen mit einem Gewicht von 400 - 600 g entnommen, die mit Harnstoff (2 g/kg, i.p.) anästhetisiert worden waren. Nach Exanguination wurde die Luftröhre entfernt und in vier Ringsegmente geteilt (3 mm Länge). Jeder Ring wurde mittels 30 Gauge rostfreien Stahldrähten in einem 10 ml ummanteltem Gewebebad suspendiert, das via einem 10 ml ummanteltem Gewebebad und verbunden via einem 4-0 Seidenfaden mit einem "Grass force displacement tranducer" (Modell FT03C, Grass Instruments Co., Quincy, MA) für die isometrische Druckaufnahme verbunden war. Die glatte Muskulatur wurde in modifizierter Krebs-Lösung mit folgender Zusammensetzung gebadet: NACl, 120 mM; KCl, 4.7 mM; CaCl&sub2;, 2.5 mM; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 1.2 mM; NaHCO&sub3;, 25 mM; K&sub2;HPO&sub4;, monobasisch, 1.2 mM und Dextrose, 10 mM. Die Gewebebäder wurden bei 37ºC belassen und konstant mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; durchspült. Die Reaktionen wurden auf einem 8 Kanal und einem 4 Kanal Hewlett-Packard Recorder (Modell 77028 bzw. 7754A) aufgenommen. Tracheale Ringe wurden unter einem Ruhedruck von 1.5 g plaziert, der in vorhergehenden Experimenten als nahezu optimal bestimmt worden war. Häufige Wiederangleichungen des Drucks waren wärend der sich anschliessenden 60 minütigen Stabilisierungsperiode notwendig. Die Gewebe wurden in 15 Minuten Intervallen gewaschen.
- Kumulative Konzentrations-Reaktions-Kurven wurden für jedes Gewebe durch sukzessive µl Zunahme der Badkonzentraion an VIP oder VIP Analogen nach der Methode von VanRossum erhalten [Arch. Int. Pharmacodyn., 143, 299-330 (1963)] Nur eine kumulative Dosis-Reaktions-Kurve wurde für ein einzelnes Gewebe erhalten. Um die Varabilität unter den Geweben zu minimieren, wurden die relaxierenden Responsreaktionen als Prozentsatz der erhaltenen maximalen Responsesreaktion im Vergleich zu der mit VIP (10&supmin;&sup6; M = 100%) erhaltenen, das am Ende jedes Konzentrations- Respons-Experimetes zugegeben wurde, ausgedrückt. Die erhaltenen Responsreaktionen aus drei Geweben wurden zusammengefasst und EC&sub5;&sub0; Werte durch lineare Regression bestimmt.
- Die Ergebnisse, die in Tabelle I zusammengefasst sind, zeigen die tracheal relaxierene Aktivität der VIP Analogen im Vergleich zum nativen VIP. TABELLE I Relaxierende Aktivität von VIP Analogen auf die tracheale glatte Muskulatur vom Meerschweinchen Verbindung cyclo cyclo cyclo cyclo cyclo
- Die in vivo bronchodilatorische Aktivität von VIP und VIP Analogen in Meerschweinchen wurde durch Verabreichung über den trachealen Instillationsweg bestimmt. Bei dieser Technik fanden männliche Meerschweinchen (Hartley Stamm, Charles River) Verwendung, die 400 bis 600 g wogen. Die Tiere wurden mit Harnstoff intraperitoneal anästhesiert und eine Polyethylenkanüle wurde in die Halsader für die intravenöse Arzneimittelverabreichung eingebracht.
- Die Tiere wurden tracheotomisiert und dosierte Lösungen an destilliertem Wasser oder Testverbindungen gelöst in desülliertem Wasser in die Luftröhre ungefähr dreiviertel der Distanz zur Carina mittels einer Pipette abgegeben. Die Konzentration der dosierten Lösung wurde so eingestellt dass ein konstantes Volumen von 100 ml abgegeben wurde. Die Tiere wurden für eine Minute auf den Rücken gelegt um die Arzneiabgabe in die Lunge zu erleichtern. Eine Minute später wurde die spontane Atmung durch intravenöse Gabe von Succinylcholinchlorid (1.2 mg/kg) gehemmt und die Tiere mit einem Harvard Model 680 Kleintier Respirator mit 40 Atemzügen/min und 4.0 cm³ Leistungsvolumen ventilliert. Die Tiere wurden mit einer maximalen konstringierenden Dosis an Histamin (50 mg/kg, i.v.) gefordert und der tracheale Druck (cm an Wasser) wurde mit einem Statham Druck Transducer (P 32 AA) aufgenommen.
- Die Aenderung des trachealen Drucks wurde über wenigstens 3 Kontrollen und 3 Arzneimittel behandelte Tiere gemittelt und die prozentuale lnhibition berechnet. Die relative Wirksamkeit der verabreichten Verbindungen über den Instillationsweg wurde durch Verabreichung verschiedener Dosen der Testverbindung und Berechnung der mittleren effektiven Dosis (ED&sub5;&sub0; Wert) bestimmt. Der ED&sub5;&sub0; wurde aus log-Dosis-Respons-Kurven bestimmt, die aus mindestens 3 Dosierungen gebildet wurden, die inhibitorische Effekte zwischen 10% und 90% verursachten. Die Korrelationskoeffizienten für die Regressionslinie jeder Verbindung war immer grösser als 0.95 %.
- Zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Inhibition für verschiedene Verbindungen wurde die Zeit zwischen Verabreichung einer Verbindung und Histamineinwirkung variiert. Der zeitliche Aktivitätsverlauf wurde als Zeitdauer bis zum Inhibitionsabfall auf 40% berechnet.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst und zeigen die in vivo bronchodilatorische Aktivität der VIP Analogen im Vergleich zu natürlichem VIP. TABELLE II Bronchodilatorische Aktivität von VIP Analogen auf MeerschweinchenVerbindung cyclo cyclo cyclo cyclo
Claims (82)
1. Ein zyklisches Peptid der Formel:
wobei R&sub8; Asp, Glu oder Lys ist; R&sub1;&sub2; Arg, Lys, Orn oder Asp ist; R&sub1;&sub7;
Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X
Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y
Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist; oder
pharmazeutisch geeignete Salze davon.
2. Das zyklische Peptid gemäss Anspruch 1, wobei R&sub1;&sub7; Nle, R&sub2;&sub6;
Val, und R&sub2;&sub8; Thr ist.
3. Das Peptid gemäss Anspruch 2, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Asp&sup8;TLys¹²) [Ac-(SEQ ID
NO:20)-NH&sub2;] ist.
4. Das Peptid gemäss Anspruch 2, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Glu&sup8;T)Lys¹²) [Ac-
(SEQ ID NO:21)-NH&sub2;] ist.
5. Das Peptid gemäss Anspruch 2, wobei besagtes Peptid Ac-
[Orn¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys&sup8;TOrn¹²) [Ac-(SEQ ID
NO:23)-NH&sub2;] ist.
6. Das Peptid gemäss Anspruch 2, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys&sup8;,Asp¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys&sup8;TAsp¹²) [Ac-
(SEQ ID NO:24)-NH&sub2;] ist.
7. Das Peptid gemäss Anspruch 2, wobei besagtes Peptid
Ac[Glu&sup8;,Orn¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Glu&sup8;TOrn¹²) [Ac-
(SEQ ID NO:25)-NH&sub2;] ist.
8. Ein zyklisches Peptid der Formel:
wobei R&sub8; Asp oder Asn ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist;
R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare
Aminoschutzgruppe ist; Y eine Hydroxyl- oder eine hydrolisierbare
Carboxyschutzgruppe ist; oder pharmazeutisch geeignete Salze
davon.
9. Ein Peptid gemäss Anspruch 8, wobei besagtes Peptid Ac-
[Asn&sup8;,Asp&sup9;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-V[P cyclo (Asp&sup9;TLys¹²)
[Ac-(SEQ ID NO:22)-NH&sub2;] ist.
10. Ein cyclisches Peptid der Formel:
wobei R&sub1;&sub7; Met oder Nle ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr
ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist;
Y eine Hydroxyl- oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe ist;
oder pharmazeutisch geeignete Salze davon.
11. Das Peptid gemäss Anspruch 10, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Glu¹&sup6;,Nle¹&sup7;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys¹²TGlu¹&sup6;) [Ac-
(SEQ ID NO:26)-NH&sub2;] ist.
12. Ein cyclisches Peptid der Formel:
wobei R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub7; Met oder Nie ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Val
ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Thr ist; X Wasserstoff oder eine hydrolisierbare
Aminoschutzgruppe ist; Y eine Hydroxyl- oder eine hydrolisierbare
Carboxyschutzgruppe ist; oder pharmazeutisch geeignete Salze
davon.
13. Das Peptid gemäss Anspruch 12, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup4;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys²&sup0;TAsp²&sup4;) [Ac-
(SEQ ID NO:27)-NH&sub2;] ist.
14. Ein cyclisches Peptid der Formel:
worin Q ein niederes Alkylcyclohexyl oder niederes Alkylaryl
ist; R&sub8; Asp, Glu oder Ala ist; R&sub1;&sub0; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys
ist; R&sub1;&sub6; Gln oder Ala ist; R&sub1;&sub7; Met, Nle oder Ala ist; R&sub1;&sub9; Val oder Ala
ist; R&sub2;&sub2; Tyr oder R&sub6; ist; R&sub2;&sub4; Asn oder Ala ist; R&sub2;&sub6; Ile, Val oder Leu
ist; R&sub2;&sub7; Leu oder Lys ist; R&sub2;&sub8; Asn, Thr oder Lys ist; X Wasserstoff
eine hydrolisierbare Aminoschutzgruppe ist; Y Hydroxyl, eine
hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe oder R&sub2;&sub9;-R&sub3;&sub0;-R&sub3;&sub1;-Z ist; R&sub2;&sub9;
Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub0; Gly oder Ala ist; R&sub3;&sub1; Ala, Met, Cys (Acm) oder
Thr ist; Z Hydroxyl oder eine hydrolisierbare Carboxyschutzgruppe
ist; oder pharmazeutisch geeignete Salze davon.
15. Das zyklische Peptid gemäss Anspruch 14, wobei Q
Methylcyclohexyl ist.
16. Das zyklische Peptid gemäss Anspruch 14, wobei Q C&sub1;&submin;&sub2;
Alkylaryl ist.
17. Das zyklische Peptid gemäss Anspruch 16, wobei Q C&sub1;&submin;&sub2;
Alkylphenyl ist, in dem der Phenylring unsubstituiert oder mit
einem oder mehreren Substituenten ausgewählt aus OH, OCH&sub3;, F, Cl,
I, CH&sub3;, CF&sub3;, NO&sub2;, NH&sub2;, N(CH&sub3;)&sub2;, NHCOCH&sub3;, NHCOC&sub6;H&sub5; oder C(CH&sub3;)&sub3;
substituiert ist.
18. Das zyklische Peptid gemäss Anspruch 16, wobei Q C&sub1;&submin;&sub2;
Alkylnaphthyl ist, in dem die Naphthylringe unsubstituiert oder mit
einem oder mehreren Substituenten ausgewählt aus OH, OCH&sub3;, F, Cl,
I, CH&sub3;, CF&sub3;, NO&sub2;, NH&sub2;, N(CH&sub3;)&sub2;, NHCOCH&sub3;, NHCOC&sub6;H&sub5; oder C(CH&sub3;)&sub3;
substituiert sind.
19. Das Peptid gemäss Anspruch 14, wobei R&sub2;&sub6; Val und R&sub2;&sub8; Thr
ist [X-(SEQ ID NO:11)-Y].
20. Das Peptid gemäss Anspruch 14, wobei R&sub1;&sub7; Nle, R&sub2;&sub6; Val und
R&sub2;&sub8; Thr ist [X-(SEQ ID NO:12)-Y].
21. Das Peptid gemäss Anspruch 20, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Orn¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;)
[Ac-(SEQ ID NO:31)-NH&sub2;] ist.
22. Das Peptid gemäss Anspruch 20, wobei R&sub1;&sub2; Leu, R&sub1;&sub7; Nle,
R&sub1;&sub9; Ala, R&sub2;&sub6; Val und R&sub2;&sub8; Thr ist [X-(SEQ ID NO:13)-Y].
23. Das Peptid gemäss Anspruch 22, wobei besagtes Peptid Ac-
[2-Na¹&sup0;,Leu¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH&sub2;] ist.
24. Das Peptid gemäss Anspruch 22, wobei besagtes Peptid Ac-
[O-Me-Tyr¹&sup0;,Leu¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo [Ac-
(SEQ ID NO:36)-NH&sub2;] ist.
25. Das Peptid gemäss Anspruch 22, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-F-Phe&sup6;,p-NH&sub2;-Phe¹&sup0;,Leu¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH&sub2;] ist.
26. Das Peptid gemäss Anspruch 20, wobei R&sub1;&sub2; Lys, R&sub1;&sub7; Nle,
R&sub2;&sub6; Val und R&sub2;&sub8; Thr ist [X-(SEQ ID NO:14)-Y].
27. Das Peptid gemäss Anspruch 26, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹², NIE¹&sup7;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-
(SEQ ID NO:28)-NH&sub2;] ist.
28. Das Peptid gemäss Anspruch 26, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-F-Phe&sup6;,2-Nal¹&sup0;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;,Gly29,30,Met³¹]-
VIP (1-31)-NH&sub2; cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH&sub2;] ist.
29. Das Peptid gemäss Anspruch 26 wobei besagtes Peptid Ac-
[p-F-Phe&sup6;,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;,Gly29,30,Thr³¹]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH&sub2;] ist.
30. Das Peptid gemäss Anspruch 20, wobei R&sub1;&sub2; Lys, R&sub1;&sub7; Nle,
R&sub1;&sub9; Ala, R&sub2;&sub6; Val und R&sub2;&sub8; Thr ist [X-(SEQ ID NO:15)-Y].
31. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;)
[Ac-(SEQ ID NO:29)-NH&sub2;] ist.
32. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-FPhe&sup6;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;,Gly29,30,Cys(Acm)³¹]-
VIP (1-31)-NH&sub2; cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH&sub2;] ist.
33. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala²,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH&sub2;] ist.
34. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH&sub2;] ist.
35. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[O-Me-Tyr¹&sup0;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH&sub2;] ist.
36. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-F-Phe&sup6;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH&sub2;] ist.
37. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[1-Nal&sup6;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH&sub2;] ist.
38. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-NH&sub2;-Phe¹&sup0;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH&sub2;] ist.
39. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹², Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,m-OCH&sub3; -Tyr²²,Asp²5,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH&sub2;] ist.
40. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,m-F-L-Tyr²²,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH&sub2;] ist.
41. Das Peptid gemäss Anspruch 30, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Val²&sup6;,Thr²&sup8;,Gly29,30,Thr³¹]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH&sub2;] ist.
42. Das Peptid gemäss Anspruch 14, wobei R&sub2;&sub6; Leu und R&sub2;&sub7; und
R&sub2;&sub8; beide Lys sind [X-(SEQ ID NO:16)-Y].
43. Das Peptid gemäss Anspruch 42, wobei R&sub1;&sub2; Lys, R&sub1;&sub7; Ala,
R&sub1;&sub9; Ala, R&sub2;&sub6; Leu und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; beide Lys sind [X-(SEQ ID
NO:17)-Y].
44. Das Peptid gemäss Anspruch 43, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu,Lys ¹²,Ala16,17,19,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH&sub2;] ist.
45. Das Peptid gemäss Anspruch 43, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala&sup8;,Lys¹²,Ala16,17,19,Ala²&sup4;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH&sub2;] ist.
46. Das Peptid gemäss Anspruch 43, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Ala16,17,19,Ala²&sup4;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH&sub2;] ist.
47. Das Peptid gemäss Anspruch 42, wobei R&sub1;&sub2; Lys ist, R&sub1;&sub7; Nle
ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; beide Lys sind [X-(SEQ ID NO:18)-
Y].
48. Das Peptid gemäss Anspruch 47, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala²,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28, Gly29,30,Thr³¹]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH&sub2;] ist.
49. Das Peptid gemäss Anspruch 47, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28, Gly29'30,Thr³¹]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH&sub2; ist.
50. Das Peptid gemäss Anspruch 47, wobei R&sub1;&sub2; Lys ist, R&sub1;&sub7; Nle
ist R&sub1;&sub9; Ala ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; beide Lys sind [X-(SEQ
ID NO:19)-Y].
51. Das Peptid gemäss Anspruch 50, wobei R&sub1;&sub2; Lys ist, R&sub1;&sub2; Gln
ist, R&sub1;&sub7; Nle ist, R&sub1;&sub9; Ala ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; beide Lys
sind [X-(SEQ ID NO:70)-Y].
52. Das Peptid gemäss Anspruch 51, wobei R&sub2; Ser ist, R&sub1;&sub2; Lys
ist, R&sub1;&sub6; Gin ist, R&sub1;&sub7; Nle ist, R&sub1;&sub9; Ala ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8;
beide Lys sind [X-(SEQ ID NO:71)-Y].
53. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH&sub2;] ist.
54. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;, Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH&sub2;] ist.
55. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Ilys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5; ,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH&sub2;] ist.
56. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid
Ac[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28, Ala²&sup9;&supmin;³¹]-VIP
cyclo [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH&sub2;] ist.
57. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[N-Me-Ala¹,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²5,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH&sub2;] ist.
58. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[p-F-Phe&sup6;,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH&sub2;] ist.
59. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[1-Nal&sup6;,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH&sub2;] ist.
60. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,p-NH&sub2;-Phe¹&sup0;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH&sub2;] ist.
61. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,O-Me-Tyr¹&sup0;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH&sub2;] ist.
62. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;, Lys27,28,Gly29,30,Thr³¹]-
VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH&sub2;] ist.
63. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,m-OCH&sub3;-Tyr²²,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH&sub2;] ist.
64. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,m-F-L-Tyr²²,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,L27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH&sub2;] ist.
65. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Ala²&sup4;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH&sub2;] ist.
66. Das Peptid gemäss Anspruch 52, wobei besagtes Peptid Ac-
[Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28,
Ala²&sup9;&supmin;³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH&sub2;] ist.
67. Das Peptid gemäss Anspruch 51, wobei R&sub2; Ala ist, R&sub1;&sub2; Lys
ist, R&sub1;&sub6; Gln ist, R&sub1;&sub7; Nle ist, R&sub1;&sub9; Ala ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8;
beide Lys sind [X-SEQ ID N0:72)-Y].
68. Das Peptid gemäss Anspruch 67, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala²,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,L ys27,28,Ala²&sup9;&supmin;³¹]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH&sub2;] ist.
69. Das Peptid gemäss Anspruch 67, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala²,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28,Gly29,30,
Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH&sub2;] ist.
70. Das Peptid gemäss Anspruch 67, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala²,Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH&sub2;] ist.
71. Das Peptid gemäss Anspruch 50, wobei R&sub1;&sub2; Lys ist, R&sub1;&sub6; Ala
ist, R&sub1;&sub7; Nle ist, R&sub1;&sub9; Ala ist, R&sub2;&sub6; Leu ist und R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; beide Lys
sind [X-SEQ ID NO:73)-Y].
72. Das Peptid gemäss Anspruch 71, wobei besagtes Peptid Ac-
[Ala&sup8;,Lys¹²,Ala¹&sup6;,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Ala²&sup4;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP
cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH&sub2;] ist.
73. Das Peptid gemäss Anspruch 71, wobei besagtes Peptid Ac-
[Glu&sup8;,Lys¹²,Ala¹&sup6;,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28]-VIP cyclo
(Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH&sub2;] ist.
74. Ein zyklisches Peptid wie in einem der Ansprüche 1, 8, 10,
12 oder 14 als therapeutisches Mittel.
75. Ein zyklisches Peptid wie in einem der Ansprüche 1, 8, 10,
12 oder 14 als Bronchodilator.
76. Ein zyklisches Peptid Ac-[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,
Asp²&sup5;,Leu²&sup6;,Lys27,28, Gly29,30,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;)
[Ac-(SEQ ID NO:52)-NH&sub2;] als therapeutisches Mittel.
77. Ein zyklisches Peptid Ac-[Glu&sup8;,Lys¹²,Nle¹&sup7;,Ala¹&sup9;,Asp²&sup5;,
Leu²&sup6;,Lys27,28, Gly29,30,Thr³¹]-VIP cyclo (Lys²¹TAsp²&sup5;) [Ac-
(SEQ ID NO:52)-NH&sub2;] als Bronchodilator.
78 Ein Verfahren zur Herstellung eines zyklischen Peptids wie
in einem der Ansprüche 1, 8, 10, 12 oder 14 beansprucht, dadurch
gekennzeichnet, dass
a) ein geschütztes und an ein Harz gebundenes Peptid mit einer
entsprechenden Aminosäuresequenz selektiv zur Bildung
einer freien Seitenketten-Aminogruppe und einer freien
Seitenketten-Carboxygruppe freigesetzt wird;
b) die freie Seitenketten-Aminogruppe und die freie
Seitenketten-Carboxygruppe kovalent mit einem geeigneten
Amid-bildenden Reagenz verbunden werden; und
c) Freisetzung und Abspaltung des zyklischen Peptids vom
Harz durch Behandlung mit einem geeigneten
Freisetzungsund Abspaltungsreagenz erfolgen, falls gewünscht in
Gegenwart weiterer geeigneter Additive als Kationenfänger
und, falls gewünscht, das zyklische Peptid in ein
pharmazeutisch geeignetes Salz umgewandelt wird.
79. Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein
zyklisches Peptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 73 beansprucht
und ein nicht toxisches inertes, pharmazeutisch geeignetes
Trägermaterial.
80. Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung
bronchotrachealer konstringierender Krankheiten, wobei eine solche
Zusammensetzung eine wirksame Menge eines zyklischen Peptids
wie in einem der Ansprüche 1 bis 73 beansprucht und einen nicht
toxischen pharmazeutisch geeigneten flüssigen oder festen Träger
enthält.
81. Die Verwendung eines zyklischen Peptids wie in einem der
Ansprüche 1 bis 73 beansprucht zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung
unterschiedlicher Krankheiten.
82. Die Verwendung eines zyklischen Peptids wie in einem der
Ansprüche 1 bis 73 beansprucht zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung
bronchotrachealer konstringierender Krankheiten.
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