CZ281818B6

CZ281818B6 - Cyklické vasoaktivní peptidy

Info

Publication number: CZ281818B6
Application number: CS923086A
Authority: CZ
Inventors: David Robert Bolin; Margaret O`Donnell
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1997-02-12
Also published as: FI20002041A; KR970001580B1; EP0536741A3; CN1153785A; JPH05213996A; SK279399B6; ES2082317T3; BG61125B2; HU211534A9; CA2080272C; US5677419A; CN1152579A; RU2095368C1; CN1225473C; ATE132165T1; UY23488A1; UY25084A1; SK308692A3; NZ244644A; EP0536741A2

Abstract

Analogy vasoaktivního peptidu VIP, v nichž je karboxylový konec postranního řetězce jedné aminokyseliny v peptidovém řetězci kovalentně připojen k aminovému konci postranního řetězce jiné aminokyseliny v peptidovém řetězci, za vzniku amidové vazby. Kovalentním spojením mezi dvěma aminokyselinovými zbytky v peptidovém řetězci vzniká kruhová struktura. Farmaceutické přípravky na bázi těchto peptidů jsouvhodné pro léčbu bronchotracheálníách konstrikčních poruch.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká cyklických peptidů, které jsou analogy vasoaktivních peptidů (VIP) a farmaceutických přípravků obsahujících tyto cyklické peptidy. Tyto farmaceutické přípravky se hodí pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních poruch.

Dosavadní stav techniky

Vasoaktivní střevní peptid (VIP) byl poprvé objeven, izolován a purifikován ze střev vepře (U. S. patent č. 3 879 371). Tento peptid obsahuje dvacetosm (28) aminokyselin a vykazuje v rozsáhlé míře homologii vůči sekretinu a glukagonu [Carlquist a další, Horm. Metab. Res., 14, 28-29 (1982)]. VIP má následující sekvenci aminokyselin

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-LeuArg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-IleLeu-Asn NH₂ [(SEQ ID NO:1)-NH₂]

Je známo, že VIP vykazuje široké spektrum biologických účinností v gastrointestinálním traktu a oběhovém systému. Díky tomu, že je VIP podobný gastrointestinálním hormonům, jak bylo zjištěno, stimuluje sekreci slinivky břišní a žlučníku, glykogenolýzu v játrech, sekreci glukagonu a insulinu a aktivuje uvolňování hydrogenuhličitanu ve slinivce břišní [Kerrins. C. a Said, S. I., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1017 (1972); Domschke, S. a další, Gastroenterology, 73, 478-480 (1977)].

Neurony obsahující VIP byly lokalizovány imunostanovením v buňkách endokrinního a exokrinního systému, střev a hladkého svalstva. [Polák J. M. a další, Gut, 15, 720-724 (1974)]. Zjistilo se, že VIP je neurofaktorem, který způsobuje uvolňování několika hormonů, včetně prolaktinu [Frawley L. S. a další, Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981)], thyroxinu [Ahren B. a další, Nátuře, 287, 343-345 (1980) a insulinu a glukagonu [Schebalin M. a další, Am. J. Physiology E., 232, 197-200 (1977)]. Také se zjistilo, že VIP stimuluje uvolňování reninu z ledvin in vivo a in vitro [Porter J. P. a další, Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983)]. Bylo zjištěno, že VIP je přítomen v nervech a nervových zakončeních dýchacích cest různých druhů zvířat a člověka [Dey R. D. a Said S. I., Fed. Proč., 39, 1062 (1980); Said S. I. a další, Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)].

Kardiovaskulární a bronchopulmonární účinky VIP jsou předmětem zájmu, poněvadž se zjistilo, že VIP je silný vasodilatant a účinný relaxant hladkého svalu, který působí na periferní pulmonární a koronární vaskulární lože [Said S. I. a další, Clin, Res., 20, 29 (1972)]. Zjistilo se, že VIP má vasodilatační účinek na mozkové cévy [Lee T. J. a Berszin I., Science, 224, 898-900 (1984)]. Studie in vitro ukázaly, že vasoaktivní střevní peptid aplikovaný exogenním způsobem na mozkové tepny indukuje v asodilataci, což ukazuje, že VIP je možným mediátorem (transmiterem) cerebrální vasodilatace [Lee T. a Saito A., Science, 224, 898-901 (1984)]. Také v oku se VIP ukázal být silným vasodilatan

-1CZ 281818 B6 tem. [Nilson S. F. E. a Bili A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-392 (1984)].

VIP snad má také regulační účinky na imunitní systém. 0'Dorisio a další ukázali, že VIP může modulovat proliferací a migraci lymfocytů [J. Immunol., 135 792s-796s (1985)].

Jelikož VIP způsobuje relaxaci hladkého svalu a je normálně přítomen ve tkáních dýchacích cest, jak již bylo uvedeno výše, byla postavena hypotéza, že je endogenním mediátorem relaxace bronchiálního hladkého svalu [Dey R. D. a Said S. I. Fed. Proč., 39, 1962 (1980)]. Potvrdilo se, že tkáně astmatických pacientů neobsahují žádný imunoreaktivní VIP, ve srovnání s tkání normálních pacientů. To může ukazovat na ztrátu VIP nebo VlP-ergických nervových vláken, spojenou s onemocněním astma [Ollerensahw S. a další New England J. Med., 320, 1244-1248 (1989)]. Při zkoušení in vitro a in vivo se ukázalo, že VIP relaxuje tracheální hladký sval a poskytuje ochranu před bronchokonstrikčními činidly, jako je histamin a prostaglandin F_2a [Wasserman M. A. a další v Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said, red., Raven Press, N. Y., 1982, str. 177-184; Said S. I. a další Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Při intravenózním podávání poskytuje VIP ochranu proti bronchokonstrikčním činidlům, jako je histamin, prostaglandin F_2a, leukotrieny, faktor aktivující krevní destičky a proti bronchokonstrikcím, které jsou vyvolány antigenem [Said S. I. a další viz výše (1982)]. Bylo také prokázáno, že VIP inhibuje in vitro sekreci slizu v tkáních dýchacích cest člověka [Coles S. J. a další, Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531-536 (1981)].

Při podání ve formě intravenózní infuze humánním astmatickým pacientům způsobuje VIP zvýšení maximálního průtoku při výdechu a zajišťuje ochranu před bronchokostrikci vyvolanou histaminem [Morice A. H. a Sever P. S., Peptides, 7, 279-280 (1986); Morice A. a další, The Lancet, II 1225-1227 (1983)]. Pulmonární účinky pozorované při této intravenózní infuzi VIP jsou však doprovázeny kardiovaskulárními vedlejšími účinky, zejména hypotenzi a tachykardií a také zčervenáním obličeje. Při podávání ve formě intravenózních dávek, které nezpůsobovaly kardiovaskulární účinky, nebyl VIP schopen měnit specifickou průchodnost dýchacích cest [Palmer J. B. D. a další, Thorax, 41, 663-666 (1986)]. Chybějící účinnost byla vysvětlována nízkou úrovní podané dávky a pravděpodobně rychlou degradací sloučeniny.

Při podání ve formě aerosolu člověku je nativní VIP jen málo účinný při ochraně proti bronchokostrikci vyvolané histaminem (Altieri a další, Pharmacologist, 25, 123 (1983)]. Bylo zjištěno, že VIP nemá podstatný účinek na základní parametry dýchacích cest, ale naproti tomu vykazuje ochranný účinek proti bronchokonstrikci vyvolané histaminem, při inhalačním podání lidem [Barnes P. J. a Dixon C. M. S., Am. Rev. Respir. Dis., 130, 162-166 (1984)]. Při podávání ve formě aerosolu VIP údajně nezpůsobuje tachykardii ani hypotenzi ve spojení s bronchodilatací [Said S. I. a další v Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said. red., Raven Press, N. Y., 1928, str. 185-191].

-2CZ 281818 B6

Vzhledem k zajímavým a potenciálně klinicky využitelným biologickým účinnostem VIP, stala se tato látka cílem několika publikovaných syntetických programů, jejichž cílem bylo posílit jednu nebo více vlastností této molekuly. Takeyama a další publikovali analog VIP, v němž je v poloze 8 kyselina aspartová nahrazena kyselinou glutamovou. Bylo zjištěno, že tato látka je méně účinná než nativní VIP [Chem. Pharm. Bull., 28, 2265-2269 (1980)]. Wendlberger a další popsali přípravu analogu VIP, v němž je v poloze 17 methionin nahrazen norleucinem [Peptide, Proč. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980)]. Bylo zjištěno, že tento peptid je stejně účinný jako nativní VIP, poněvadž je schopen vytěsňovat VIP značený radioisotopem jodu z preparátů jaterní membrány. Watts a Wooton publikovali sérii lineárních a cyklických fragmentů VIP, které obsahují 6 až 12 zbytků nativní sekvence (EP 184 309, EP 325 044, US 4 73 7487 a US 4 866 039). Turner a další oznámili, že fragment VIP (10-28) je antagonistou VIP [Peptides, 7, 849-854 (1986)]. Také u substituovaného analogu [4-Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]-VIP bylo zjištěno, že se váže k receptorům VIP a antagonizuje účinnost VIP [Pandol S. a další, Gastrointest. Liver Physiol, 13, G553-G557 (1986)]. Gozes a další oznámili, že analog [Lys¹, Pro², Arg³, Arg⁴, Pro⁵, Tyr⁶]-VIP je kompetitivním inhibitorem VIP, který se váže k jeho receptorům na gliových buňkách. [Endocrinology, 125, 2945-2949 (1989)]. Robberecht a další publikovali několik analogů VIP s D-zbytky substituovanými v N-konci nativního VIP [Peptides, 9, 339-345 (1988)]. Všechny tyto analogy se vážou méně pevné k receptorům VIP a vykazují nižší účinnost než nativní VIP při c-AMP aktivaci. Tachibana a Ito publikovali několik analogů VIP prekursorové molekuly v Peptide Chem., T. Shiba a S. Sakakibara, red., Prot. Res. Foundation, 1988, str. 481-486, JP 1 083 012, US 4 822 774]. Bylo zjištěno, že tyto sloučeniny jsou jedno- až trojnásobně silnější bronchodilatanty než VIP a vykazují jedno- až dvojnásobně vyšší úroveň hypotensni účinnosti. Musso a další také publikovali několik analogů VIP se substitucemi v polohách 6-7, 9-13, 15-17 a 19-28 [Biochemistry, 27, 8174-8181 (1988); EP 8 271 141, US 4 835 252] . U těchto sloučenin byla zjištěna stejná nebo nižší účinnost než u VIP při vazbě na receptory VIP a při biologické odpovědi. Bartfai a další publikovali sérii několikanásobně substituovaných analogů [Leu¹⁷]-VIP [WO 89/05 857].

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou cyklické vasoaktivní peptidové analogy. Po označením cyklický peptid se rozumí peptid, v němž je karboxylový konec v postranním řetězci jedné aminokyseliny v peptidovém řetězci kovalentně vázán k aminovému konci postranního řetězce jiné aminokyseliny v peptidovém řetězci, za vzniku amidové vazby. Kovalentním spojením dvou zbytků aminokyselin v peptidovém řetězci vzniká kruhová struktura.

Biologická účinnost cyklických peptidů se může podstatně lišit od účinnosti rodičovských lineárních analogů. Cyklické peptidy jsou z hlediska konformace rigidnější a obsahují více dobře definovaných struktur. Tyto změny se odrážejí v biologickém profilu cyklických peptidů. Cyklizace peptidového analogu může prodloužit dobu účinnosti peptidů díky zvýšené rigiditě, která

-3CZ 281818 B6 jej činí méně citlivým vůči chemické a enzymatické degradaci. Také biologická dostupnost cyklických peptidů se může zvýšit díky změnám fyzikálních vlastností peptidu, které jsou důsledkem zpevnění struktury. Dobře definovaný tvar cyklického peptidu může také zvýšit specifičnost pro cílový receptor, ve srovnání se specifičnosti lineárního peptidu a tím se může snížit sklon k nežádoucím biologickým účinnostem, které doprovázejí žádoucí účinnost.

Předmětem vynálezu jsou nové cyklické peptidy obecného vzorce I

I I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-R₁₂(I) Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:2)-Y] Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R_2g-Y kde Rg představuje Asp, Glu, nebo Lys; R₁₂ představuje Arg, Lys, Orn nebo Asp; R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Přednost se při tom dává peptidům obecného vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:3)-Y] Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y kde X, Y, R_g a R₁₂ mají stejný význam, jako v obecném vzorci I.

Předmětem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce II

I------------------------------------------------------------------------1

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R_fl-Asp-Tyr-Thr-Lys(II) Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:4)-Y] Leu-Asp-Ser-R₂6“Leu-R₂g-Y kde Rg představuje Asp nebo Asn; R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R_2g představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Přednost se přitom dává peptidu obecného vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Thr-Lys-4CZ 281818 B6

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID N0:5)-Y] Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y kde X a Y mají stejný význam, jako v obecném vzorci II.

Předmětem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce III i

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysI

Leu-Arg-Lys-Glu-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (III) [X-(SEQ ID NO:6)-Y] Leu-Asp-Ser-R₂g-Leu-R₂g-Y kde R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Přednost se přitom dává peptidům obecného vzorce i----------------------------------X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys|

Leu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:7)-Y] Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y kde X a Y mají stejný význam, jako v obecném vzorci III.

Předmětem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce IV

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R₁₂i

Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr(IV) [X-(SEQ ID NO:)-Y] i

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y kde R₁₂ představuje Arg nebo Lys; R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R_2Q představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Přednostními peptidy tohoto typu jsou peptidy vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys-5CZ 281818 B6

I---------------------------------------------------------------Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyrl------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y [X-(SEQ ID N0:9)-Y] kde X a Y mají stejný význam, jako v obecném vzorce IV.

Předmětem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce V

X-R₁-R₂“Asp-Ala-Val-R₆-Thr-Rg-Asn-R₁₀-Thr-R₁2i------------------------------------------------Leu-Arg-Lys-R₁₆-R₁₇-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂2Leu-R₂₄-Asp-R₂₆-R₂7-R₂8“Y (V) [X-(SEQ ID N0:10)-Y] kde R-j_ představuje His, N-CH₃-Ala; R₂ představuje Ser nebo Ala; Rg představuje

H

II O kde Q představuje cyklohexyl-nižší alkyl nebo aryl-nižší alkyl; R₈ představuje Asp, Glu nebo Ala; R₁₀ představuje Tyr nebo R_g; R₁₂ představuje Arg nebo Lys; R₁₆ představuje Gin nebo Ala; R₁₇představuje Met, Nle nebo Ala; R₁₉ představuje Val nebo Ala; R₂₂představuje Tyr nebo R₆; R₂₄ představuje Asn nebo Ala; R₂₆ představuje Ile, Val nebo Leu; R₂₇ představuje Leu nebo Lys; R₂₈ představuje Asn, Thr, nebo Lys; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; nebo skupinu vzorce ^R29”^R30~^R31”^z' kde R_2g představuje Gly nebo Ala; R₃₀ představuje Gly nebo Ala; R₃₁ představuje Ala, Met, Cys(Acm); nebo Thr; Z představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Symbol Q představuje přednostně skupinu vzorce

-6CZ 281818 B6 kde n představuje číslo 1 nebo 2 a každý ze symbolů a X₂ nezávisle představuje vodík nebo skupinu vzorce OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, CH₂, N(CH₃)₂, NHCOCH₃, NHCOCgHg nebo C(CH₃)₃·

Výhodně představuje Q benzyl, p-fluorbenzyl, p-aminobenzyl,

p-hydroxybenzyl, o-methyl, 1-methylnaftyl Nejvýhodněji představuje Q benzyl.

nebo 2-methylnaftyl.

Přednostními peptidy jsou peptidy obecných vzorců:

X-R₁-R₂~Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R_g-Asn-R₁Q-Thr-R₁2

Leu-Arg-Lys ~^Riq^-Ri7-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R_{2 2}- 1

[X-(SEQ ID NO:11)-Y]

Leu-R_{2 4}-Asp-Val-R_{2 7}-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R_1Q-Thr-R₁₂-

Leu-Arg-Lys-R₁g-Nle-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂₂- 1----------------—----------------

[X-(SEQ ID NO:12)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Val-R₂₇-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-Leu·

Leu-Arg-Lys-R₁g-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂- 1---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

[X-(SEQ ID NO:13)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Val-R₂₇-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-Lys-

Leu-Ar g-Ly s-R ₆ -Ni e - AI a-R g ~Ly s-Ly s -R _{2 2} - 1-----------------—----------------

[X-(SEQ ID NO:14)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Val-R₂₇-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-Lys

Leu-Arg-Lys-R₁₆-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂- 1-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

[X-(SEQ ID NO:15)-Y]

Leu-R 24-Asp-Va1-R _{2 7}-Thr-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R₁Q-Thr-R₁₂-

Leu-Arg-Lys-R₁g-R₁₇-Ala-R_ig-Lys-Lys-R₂₂- 1

[X-(SEQ ID NO:16)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁₀-Thr-Lys-

Leu-Arg-Lys-R₁₆-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂- 1

[X-(SEQ ID NO:17)-Y]

Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

-7CZ 281818 B6

X-R₁-R2“Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-LysI

Leu-Arg-Lys-R₁₆-Nle-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂₂l----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-R 2 4-Asp-Leu-Lys-Lys- Y [X-(SEQ ID N0:18)-Y]

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁Q-Thr-Lysi-------------------------------Leu-Arg-Lys-R₁₆-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-(SEQ ID N0:19)-Y]

X-R-j_-R₂-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-R₆-Asn-R₁₀-Thr-LysI

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂I------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID N0:70-Y]

X-R-L-Ser-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁₀-Thr-Lys~

Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂2“ í

Leu-R_{2 4}-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ

ID N0:71-Y]

X-R^-Ala-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁₀-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-N1e-Ala-Ala-Lys-Lys-R_{2 2}l----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-R₂₄-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ

ID NO:72-Y]

X-R₁-R₂~Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Rg-Asn-R₁₀-Thr-LysI

Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R₂₂~

I-----------------------------------------------------------------------------------------Leu-R_{2 4}-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:73-Y]

Vůbec nejvýhodnějsi cyklický peptid podle vynálezu má strukturu Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷,²⁸, Gly²⁹,³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂].

Peptidy podle vynálezu tracheobronchiálního hladkého vedlejších účinků, a proto jsou čnich poruch, jako je asthma.

poskytují prodlouženou relaxaci svalu bez kardiovaskulárních účinné při léčbě bronchokonstrik-8CZ 281818 B6

Předmětem vynálezu jsou nové analogy vasoaktivního intestinálního peptidu (VIP), které vykazují zvýšenou a prodlouženou bronchodilatačni aktivitu, aniž by měly pozorovatelné vedlejší účinky.

Pod označením nižší alkyl se v tomto popisu rozumějí alifatické uhlovodíkové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které obsahují 1 až 6 atomů uhlíku. Přednostní nižší alkylskupinou je methyl.

Pod označením aryl se v tomto popisu rozumějí jednojaderné aromatické uhlovodíkové skupiny, jako je fenyl, které mohou být nesubstituované nebo substituované v jedné nebo více polohách nižší alkylskupinou, nižší alkoxyskupinou, aminoskupinou, nitroskupinou, mono- nebo di-nižší alkylaminoskupinou, nižší alkylamidoskupinou nebo fenylamidoskupinou. Pod označením aryl se také rozumějí vícejaderné arylové skupiny, jako je naftyl, které jsou popřípadě substituovány jedním nebo více výše uvedených zbytků. Přednostní arylskupinou je fenyl, který je popřípadě substituován jedním atomem fluoru, nebo nesubstituovaný naftyl.

Symbolem X je v tomto popisu označován substituent na aminickém dusíku amino-terminální aminokyseliny a symbolem Y substituent na karbonylové skupině karboxy-terminálni aminokyseliny. X může představovat atom vodíku nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny. Y může představovat hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny.

Jako hydrolýzovatelné chránící skupiny aminoskupiny a hydrolýzovatelné chránící skupiny karboxyskupiny se může používat jakýchkoliv konvenčních chránících skupin, které lze odštěpovat hydrolýzou. Jako příklady takových skupin, kterých lze podle vynálezu použít, je možno uvést následující skupiny.

Přednostními chránícími skupinami aminoskupiny jsou skupiny vzorce

O kde X₃ představuje nižší alkylskupinu nebo halogenovanou nižší alkylskupinu. Z těchto chránících skupin se dává přednost zejména skupinám, v nichž X₃ představuje alkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo halogenalkylskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku.

Přednostními chránícími skupinami karboxyskupiny jsou skupiny nižších alkylesterů, skupina NH₂ a skupiny nižších alkylamidú. Přednost se dává zejména alkylesterovým skupinám s 1 až 3 atomy uhlíku, skupině NH₉ a alkylamidovým skupinám s 1 až 3 atomy uhlíku.

-9CZ 281818 B6

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby výše definovaných peptidů, farmaceutické přípravky na bázi těchto peptidů a použití těchto peptidů v kombinaci s netoxickým inertním terapeuticky vhodným nosičem pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních poruch.

Způsob výroby cyklických polypeptidů podle vynálezu se vyznačuje tím, že se

a) chráněný peptid s odpovídající sekvencí aminokyselin, který je vázán k pryskyřici, selektivně zbaví chránících skupin, za vzniku volné aminoskupiny v postranním řetězci a volné karboxyskupiny v postranním řetězci;

b) volná aminoskupina v postraním řetězci a volná karboxyskupina v postranním řetězci se spojí kovalentní vazbou za použiti vhodného amidotvorného činidla; a

c) cyklizovaný peptid se zbaví chránících skupin a odštěpí od pryskyřice za použití vhodného deprotekčního a štěpícího činidla, popřípadě za přítomnosti dalších vhodných přísad, jako jsou látky zachycující kationty a získaný cyklický peptid se popřípadě převede na farmaceuticky vhodnou sůl.

Předmětem vynálezu je také použití těchto cyklických peptidů při výrobě farmaceutického přípravku, který se hodí pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních poruch.

V tomto popisu se používá běžného názvosloví z oboru peptidů, při němž se aminoskupina na N-konci znázorňuje nalevo a karboxyskupina na C-konci, napravo. Pod pojmem přírodní aminokyseliny se rozumějí aminokyseliny, které se vyskytují v přírodních proteinech, tj. Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Pokud se může aminokyselina vyskytovat v isomerních formách, rozumí se, že znázorněná aminokyselina je v L-formě, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Kromě výše uvedených zkratek se v tomto popisu pro označení aminokyselin, chránících skupin, rozpouštědel, reakčních činidel apod. používá následujících zkratek.

symbol	význam
Ac	acetyl
Orn	ornithin
Nle	norleucin
Fmoc	9-fluorenylmethyloxykarbonyl
Fm	9-fluorenylmethyl
Boc	t-butyloxykarbonyl
Bom	benzyloxymethyl
ch₂ci₂	methylenchlorid
ch₃cn	acetonitril
DMF	dimethylformamid
DIPEA	N,N-diisopropylethylamin
TFA	trifluoroctová kyselina
HOBT	N-hydroxybenzotriazol

-10CZ 281818 B6

symbol	význam
DCC DIC BOP	N,N’-dicyklohexylkarbodiimid N,N'-diisopropykarbodiimid benzotriazol-l-yloxy-tri(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát

N-Me-Ala

2-Nal

p-F-Phe

FAB-MS = hmotnostní spektrometrie Fast Atom Bombardment

Analogy nativní peptidové sekvence VIP se označují tak, že se před označením VIP uvede v závorkách nahrazená aminokyselina. Derivatizace N-terminální aminoskupiny, tj. derivatizace, která se projevuje ve významu symbolu X, je označována nalevo od substitucí vyznačených v závorkách. Sekvenční čísla, která jsou uvedena v závorkách napravo od označení VIP označují delece a adice aminokyselin a uvádějí se vzhledem k číslování nativní sekvence. Tak například,. Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Gly²⁹]-VIP(l-29)-NH₂označuje polypeptid, jehož sekvence aminokyselin odpovídá sekvenci nativního humánního VIP, v níž však byla acetylskupinou nahrazen atom vodíku na N-konci, lysinem byl nahrazen arginin v poloze 12 a norleucinem byl nahrazen methionin v poloze 17. Kromě toho, karboxyskupina asparaginu v poloze 28 byla kondenzována s glycinem, za vzniku polohy 29. Označení -0H a -NH₂, které následuje po výrazu VIP nebo po výrazu v závorkách, se vztahuje k volné kyselinové nebo amidové formě polypeptidu. V případě, že tato označení chybějí, rozumí se, že výraz zahrnuje obě tyto formy.

-11CZ 281818 B6

Jak již bylo uvedeno výše, cyklickým peptidem podle vynálezu je peptid, v němž je karboxy-konec jedné aminokyseliny v postranním řetězci peptidu kovalentně vázán k amino-konci jiné aminokyseliny v postranním řetězci peptidu, za vzniku amidové vazby. Pro znázornění cyklického peptidu se používá několik názvoslovných variant a několika symbolů. Jejich příklady jsou uvedeny dále.

ii

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-a.

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH₂ [Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (8—>12)b.

[Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂] Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²)c.

[Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂]

Tři struktury uvedené výše (a - c) a doprovodná reprezentace používající identifikačního čísla sekvence (SEQ ID NO:) a odvolávající se na dále uvedený seznam sekvencí, všechny představují a definují stejný polypeptid, jehož sekvence aminokyselin odpovídá sekvenci nativního humáního VIP, v níž však byl atom vodíku na N-konci substituován acetylskupinou, v poloze 12 byl arginin nahrazen lysinem, v poloze 17 byl methionin nahrazen norleucinem, v poloze 26 byl isoleucin nahrazen valinem a v poloze 28 byl asparagin nahrazen threoninem. Kromě toho byla mezi postranní karboxyskupinou aspartové kyseliny v poloze 8 a postranní aminoskupinou lysinu v poloze 12 vytvořena amidová vazba, za vzniku cyklického peptidového analogu. Výše uvedené reprezentace struktury peptidu se považují za ekvivalentní a vzájemně zaměnitelné.

Označení R_n pro aminokyselinu v poloze n v jedné z uvedených struktur a označení Xaa pro aminokyselinu v poloze n v odpovídající sekvenci v seznamu sekvencí, uvedeném dále, jsou ekvivalentní a vzájemně zaměnitelné v těch případech, kdy Xaa představuje výběr ze dvou nebo více aminokyselin.

V cyklických peptidech podle vynálezu platí následující konfigurace, pokud není uvedeno jinak:

Aminokyselina v řetězci Vázaný konec aminokyseliny pro vytvoření cyklického peptidu

Lys e-amino (e = epsilon)

Orn δ-amino (δ = delta)

Asp β-karboxy (β = beta)

Glu τ-karboxy (t = gamma)

-12CZ 281818 B6

Reprezentativní sloučeniny podle vynálezu zahrnují peptidy s následujícími sekvencemi aminokyselin:

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂]

Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂]

Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Asp⁸—>Orn¹²) [AC-(SEQ ID NO:23)-NH₂]

Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Glu⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:28)-NH₂]

Ac-rLys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹·³⁰,

Met³¹J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:30)-NH₂J

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰, Cys (Acm)³¹J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:33)-NH₂]

Ac-EN-Me-Ala¹, Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]

Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵)

-13CZ 281818 B6 [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]

Ac-[O-CH₃-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰ ,Leu¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>

Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂]

Ac-CN-Me-Ala¹, Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:39)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ —>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂]

Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys ²¹—>Asp ^{2 5}) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Ala²⁹ ³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]

Ac-EN-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,p-NH₂~Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac-EGlu⁸,O-CH₃-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP

-14CZ 281818 B6 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰,

Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸,Gly²⁹·³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys ²¹—>Asp ^{2 5}) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:55)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:56)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:57)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:60)-NH₂]

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP

-15CZ 281818 B6 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹>³⁰,Thr³¹]- VIP cyklo (Lys ²¹—>Asp ^{2 5}) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹·³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys ²¹—>Asp ^{2 5}) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]

Sloučeniny podle vynálezu je možno snadno syntetizovat jakýmkoliv konvenčním postupem, který se hodí pro tvorbu peptidové vazby mezi aminokyselinami. Takové konvenční postupy zahrnují například všechny postupy prováděné v roztoku, které umožňují kondenzaci volné α-aminoskupiny aminokyseliny nebo jejího zbytku, v níž nebo v němž je karboxyskupina nebo jiná reaktivní skupina chráněna, s volnou primární karboxyskupinou jiné aminokyseliny nebo jejího zbytku, v níž nebo v němž je aminoskupina nebo jiná reaktivní skupina chráněna.

Způsob syntetizace sloučenin podle tohoto vynálezu se může provádět postupem, při němž se každá aminokyselina v požadovaném sledu přidává po jedné postupně k jiné aminokyselině nebo jejímu zbytku nebo postupem, při němž se nejprve konvenčním způsobem syntetizují peptidové fragmenty s požadovanou sekvencí aminokyselin a potom se tyto fragmenty kondenzují, za vzniku požadovaného peptidu.

-16CZ 281818 B6

Takové konvenční postupy syntetizace nových sloučenin podle vynálezu zahrnují také například všechny postupy syntézy peptidů prováděné v pevné fázi. Při takových postupech se nové sloučeniny podle vynálezu mohou syntetizovat tak, že se k rostoucímu peptidovému řetězci postupně, po jednom, vážou požadované zbytky aminokyselin, v souladu s obecnými principy metod syntézy v pevné fázi [Merrifield R. B., J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963), Barany a další, The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, sv. 2, Gross E. a Meinhofer J. vyd. Academie Press 1-284 (1980)].

Pro různé chemické způsoby syntézy peptidů je společná ochrana postranních reaktivních skupin různých zbytků aminokyselin vhodnými chránícími skupinami, které zabraňují aby na těchto místech proběhla chemická reakce, dokud nejsou tyto chránící skupiny nakonec odstraněny. Obvyklá je také ochrana a-aminoskupiny na aminokyselině nebo jejím fragmentu, v průběhu reakce této kyseliny nebo fragmentu, která probíhá na karboxylové skupině. Po ní následuje selektivní odstranění chránící skupiny a-aminoskupiny, čímž se umožni, aby následující reakce probíhala na tomto místě. Při postupech prováděných syntézou v pevné fázi byly sice publikovány specifické chránící skupiny, je však třeba zdůraznit, že každá aminokyselina může být chráněna chránící skupinou běžně používanou pro tuto aminokyselinu při syntetických postupech prováděných v roztokové fázi.

α-aminoskupiny se mohou chránit vhodnými chránícími skupinami, které jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího chránící skupiny, které vytvářejí s aminoskupinou seskupení typu aromatického urethanu, jako je benzyloxykarbonyl (Z) a subtituovaný benzyloxykarbonyl, jako je p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl, p-bifenylisopropyloxykarbonyl, 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) a p-methoxybenzyloxykarbonyl (Moz); chránící skupiny typu alifatického urethanu, jako je terč, butyloxykarbonyl (Boc), diisopropylmethyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl a allyloxykarbonyl. Z chránících skupin a-aminoskupiny se největší přednost dává Boc.

Karboxylové skupiny mohou být chráněny vhodnou chránící skupinou, která je zvolena ze souboru aromatických esterových skupin, jako je benzylesterová (OBzl) nebo benzylesterová skupina, substituovaná nižší alkylskupinou, halogenem, nitroskupinou, thioskupinou nebo substituovanou thioskupinou, například alkylthioskupinou obsahující 1 až 7 atomů uhlíku v alkylovém řetězci; alifatických esterových skupin, jako je nižší alkylesterová, terč, butylesterová (Ot-Bu), cyklopentylesterová, cyklohexylesterová (OcHx), cyklopentylesterová a 9-fluorenylmethylesterová skupina (OFm). Pro glutamovou kyselinu (Glu) se největší přednost dává skupině OBzl a OFm a pro aspartovou kyselinu (Asp) se dává největší přednost skupině OChx, OBzl a OFm.

Hydroxylové skupiny mohou být chráněny vhodnou chránící skupinou, která je zvolena ze souboru skupin, které s hydroxyskupinou vytvářejí etherové seskupení, jako je například benzyl (Bzl) nebo benzyl substituovaný nižší alkylskupinou, halogenem [jako je 2,6-dichlorbenzyl (DCB)], nitroskupinou nebo methoxyskupinou, terč.butyl (t-Bu), tetrahydropyranyl a trifenylmethyl (trityl). U šeřinu (Ser) a threoninu (Thr) se dává největší před

-17CZ 281818 B6 nost skupině Bzl a u tyrosinu (Tyr) se dává největší přednost skupinám Bzl a DCB.

Postranní aminoskupiny je možno chránit vhodnými chránícími skupinami, které jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího chránící skupiny, které s aminoskupinou vytvářejí seskupení typu aromatického urethanu, jako je benzyloxykarbonyl (Z) a subtituovaný benzyloxykarbonyl, jako je p-chlorbenzyloxykarbonyl, 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2-C1-Z), p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl, p-bifenylisopropyloxykarbonyl, 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) a p-methoxybenzyloxykarbonyl (Moz); nebo seskupení typu alifatického urethanu, jako je terč.butyloxykarbonyl (Boc), diisopropylmethyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl a alyloxykarbonyl. U ornithinu (Orn) se dává největší přednost skupině Za u lysinu (Lys) se dává největší přednost skupině 2-C1-Z a Fmoc.

Guanidinoskupiny mohou být chráněny vhodnou chránící skupinou, která je zvolena ze souboru zahrnujícího nitro, p-toluensulfonyl (Tos), Z, adamantyloxykarbonyl a Boc. U argininu (Arg) se dává největší přednost dává skupině Tos.

Postranní amidoskupiny mohou být chráněny xantylovou skupinou (Xan). U asparaginu (Asn) a glutaminu (Gin) se přednostně nepoužívá žádné ochrany.

Imidazolové skupiny mohou být chráněny vhodnou chránící skupinou, zvolenou ze souboru zahrnujícího p-toluensulfonyl (Tos), 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc), trifenylmethyl (trityl), 2,4-dinitrofenyl (Dnp), Boc a benzyloxymethyl (Bom). U histidinu se dává největší přednost skupinám Tos a Bom.

Pokud není uvedeno jinak, jsou procentické údaje u pevných látek v pevných směsích uváděny v procentech hmotnostních, u kapalných látek v kapalných směsích v procentech objemových a u pevných látek v kapalných směsích v procentech hmotnost/objem, která po vynásobení faktorem 10 odpovídají koncentračním údajům gram/litr. Pokud není uvedeno jinak, rozumí se také, že dodavatelé reakčních činidel a přístrojů, kteří jsou uvedeni dále, nejsou obligatorní a odborníci v tomto oboru si mohou zvolit obdobná reakční činidla nebo přístroje od jiných dodavatelů.

Všechna rozpouštědla, tj.isopropylalkohol (iPrOH), methylenchlorid (CH2CI2) a dimethylformamid (DMF) byly zakoupeny od firmy Fisher nebo Burdick & Jackson a bylo jich používáno bez přídavné destilace. Kyselina trifluoroctová byla zakoupena od firmy Halocarbon a bylo jí používáno bez dalšího čištěni. Diisopropylethylamin (DIPEA) byl zakoupen od firmy Pfaltz a Bauer a před použitím byl předestilován za přítomnosti oxidu vápenatého a ninhydrinu. Dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a diisopropylkarbodiimid (DIC) byly zakoupeny od firmy Fluka a bylo jich používáno bez dalšího čištění. Hydroxybenzotriazol (HOBT) a 1,2-ethandithiol (EDT) byly zakoupeny od firmy Sigma Chemical Co. a bylo jich používáno bez dalšího čištěni. Chráněné aminokyseliny byly obecně v konfiguraci L a byly zakoupeny od firmy Chemical Dynamics Corp. nebo Bachem.

-18CZ 281818 B6

Čistota těchto látek byla před použitím potvrzena chromatografii na tenké vrstvě, NMR a teplotou tání. Sloučeniny Boc-O-Me-Tyr, Boc-2-Nal a Boc-p-F-Phe byly připraveny podle citace Bolin D. R., US patentová přihláška č. 374 503. Sloučeniny Boc-Asp(OFm) a Boc-Glu(OFm) byly připraveny podle citace Bolin D. R. a další, Org. Prep. Proč. Int., 21, 67-74 (1989). Benzhydrylaminová pryskyřice (BHA) je kopolymerem styrenu s 1 % divinylbenzenu (o zrnění 100 až 200 nebo 200 až 400 mesh, tj. 75 až 150 nebo 38 až 75 μπι) a byla zakoupena od firmy Biomega, Bachem, Omni nebo Advanced Chemtech. Celkový obsah dusíku v těchto pryskyřicích byl obvykle v rozmezí od 0,3 do 1,2 mekv./g.

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) byla prováděna na skleněných deskách s nánosem silikagelu (desky 60 F254 od firmy Měrek), za použití vhodných rozpouštědlových systémů. Detekce sloučenin byla prováděna pomocí UV-fluorescence (absorpce při 254 nm), barvení jodem nebo postřikem ninhydrinem (v případě primárních a sekundárních aminů).

Při analýze složení aminokyselin se peptidy hydrolýzují v 6N kyselině chlorovodíkové obsahující 1 až 4 mg fenolu, při teplotě 115 °C, po dobu 22 až 24 hodin, v uzavřené evakuované hydrolytické trubce. Analýzy se provádějí bud za použití analyzátoru aminokyselin Beckman 121M, nebo analytického systému pro aminokyseliny na bázi HPLC (Waters), přičemž se používá bud pryskyřice Waters Cat Ex, nebo sloupce Pierce AA511 a ninhydrinové detekce.

Vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC) se provádí za použití zařízení LDC, které obsahuje čerpadla Constametric I a III, programovací zařízení pro řízení složení rozpouštědla Gradient Master a mixeru a detektoru s měnitelnou vlnovou délkou UV záření Spectromonitor III. Analytická HPLC se provádí na reversní fázi, za použití sloupců Waters μBondapak C₁₈ (0,4 x 30 cm). Preparativní separace pomocí HPLC se provádějí na kolonách Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 (2 x 25 cm nebo 2 x 50 cm), které jsou vybaveny předkolonou Waters Guard-Pak C₁₈. Gelová chromatografie se provádí na koloně o rozměrech 2 x 85 cm, za použití peristaltického čerpadla LKB varioperpex a detektoru s měnitelnou vlnovou délkou UV záření (IBM).

Peptidy se přednostně připravují syntetickým postupem v pevné fázi, za použití metody, kterou obecně popsal Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), i když je možno použít, jak bylo uvedeno výše, jiných ekvivalentních syntetických metod, které jsou známé v tomto oboru. Syntéza v pevné fázi se zahajuje na C-konci peptidu kondenzací chráněné α-aminokyseliny s vhodnou pryskyřicí. Takovou výchozí látku je možno připravit připojením α-amino-chráněné aminokyseliny esterovou vazbou k chlormethylované pryskyřici nebo hydroxymethylované pryskyřici nebo amidovou vazbou k benzhydrylaminové pryskyřici (BHA) nebo p-methylbenzhydrylaminové pryskyřici (MBHA). Příprava hydroxymethylované pryskyřice je dobře známá v tomto oboru. Chlormethylované pryskyřice jsou obchodné dostupné a jejich výroba je v tomto oboru také dobře známa. Nosičové pryskyřice BHA a MBHA jsou obchodné dostupné a obvykle se jich používá, když má požadovaný syntetizovaný peptid na C-konci skupinu nesubstituovaného amidu.

-19CZ 281818 B6

První aminokyselina, která se má kondenzovat s pryskyřici BHA, se obvykle přidává ve formě symetrického anhydridu Boc-aminokyseliny, za použití dvou až deseti ekvivalentů aktivované aminokyseliny na ekvivalent dusíku pryskyřice. Po kondenzaci se pryskyřice promyje a za vakua vysuší. Zakotvení aminokyseliny na pryskyřici se může stanovit analýzou alikvotního vzorku Boc-aminokyselina-pryskyřice na aminokyselinu. Stupeň navázání aminokyseliny na pryskyřici činí obvykle 0,2 až 0,4 mmol/g. Všechny nezreagované aminoskupiny je možno blokovat reakcí pryskyřice s acetanhydridem a diisopropylethylaminem v methylenchloridu.

Po adici Boc-aminokyseliny se pryskyřice podrobí několika opakovaným cyklům, při nichž se postupně adují aminokyseliny. Chránící skupina Boc α-aminoskupiny se odstraní za kyselých podmínek. K tomuto účelu se může použít kyseliny trifluoroctové (TFA) v methylenchloridu, kyseliny chlorovodíkové v dioxanu nebo směsí kyseliny mravenčí s kyselinou octovou. Přednostně se používá roztoku kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu o koncentraci 50 % objemových. Tento roztok může také obsahovat 1 až 5 % objemových EDT nebo dimethylsulfidu, jako látky zachycující terč, butylkarboniové ionty. Může se také použít jiných standardních štěpících činidel, která jsou známa v tomto oboru.

Po odstranění chránící skupiny α-aminoskupiny se postupně kondenzací připojují další chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí, aby se získal meziprodukt, kterým je kondenzační produkt chráněného peptidu a pryskyřice. Aktivační činidla, kterých se používá při kondenzaci aminokyselin syntetickým postupem pro výrobu peptidů v pevné fázi, jsou dobře známá v tomto oboru. Jako vhodných reakčních činidel pro takové syntézy je například možno použit benzotriazol-l-yloxytri(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfátu (BOP), dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a diisopropylkarbodiimidu (DIC). Přednostně se používá DCC a DIC. Jiná aktivační činidla, kterých lze použít, jsou popsána v citaci Barany a Merrifield, The Peptides, sv. 2, J. Meienhofer, vyd. Academie Press, 1979, str. 1 - 284. Pro optimalizaci syntetických cyklů se mohou ke kondenzačním směsím přidávat různá činidla, jako je 1-hydroxybenzotriazol (HOBT), N-hydroxysukcinimid (HOSu) a 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin (HOOBT). Přednost se dává HOBT.

Předpis pro typický syntetický cyklus lze popsat následujícím způsobem:

Předpis 1

stupeň	reakční činidlo	doba
1	ch₂ci₂	2 x 30 s
2	50% TFA/CH₂C1₂	1 min
3	50% TFA/CH₂C1₂	15 min
4	ch₂ci₂	2 x 30 s
5	ÍPřOH	2 x 30 s

-20CZ 281818 B6

Předpis 1 - pokračování

stupeň	reakční činidlo	doba
6	CH₂C1₂	4 x 30 s
7	6% DIPEA/CH₂C1₂	3x2 min
8	ch₂ci₂	3 x 30 s
9	kondenzace	10 min - 18 h
10	CH₂ ^c12	2 x 30 s
11	iPrOH	1 x 30 s
12	ch₂ci₂	1 X 30 S
13	DMF	2 X 30 S
14	CH₂ ^C1 ₂	3 x 30 s

Rozpouštědel pro všechny promývací a kondenzační (kopulační) stupně se používá v množství 10 až 40 ml/g pryskyřice. Kondenzace se provádějí bud za použití předem vytvořených symetrických anhydridů Boc-aminokyselin, nebo derivátů O-acylisomočoviny. Obvykle se přidává 2 až 10 ekvivalentů aktivované Boc-aminokyseliny na ekvivalent aminopryskyřice, za použití methylenchloridu, jako rozpouštědla. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) a Boc-His(Bom) se kondenzuji ve 20 až 25% dimethylformamidu v dichlormethanu. Boc-Asn, Boc-Gln a Boc-His(Bom) se kondenzují ve formě HOBT-aktivovaných esterů, za účelem minimalizace známých vedlejších reakcí.

Peptidy se obvykle cyklizují za použití známých metod v tomto oboru, následujícím způsobem. Na místech aminokyseliny v peptidů, kde mají být připojeny postranní řetězce, se používá různých chránících skupin. Pro aminokyseliny s aminovým místem, Lys a Orn, se do peptidového řetězce zabudují N e - a N δ -Fmoc-deriváty. Pro aminokyseliny s karboxylovým místem, Asp a Glu, se zabudují O β - a 0 τ -Fm-deriváty. Na peptid, který je stále ještě vázán k pryskyřici, se působí 20 až 40% piperidinem v dimethylformamidu, aby se selektivně odstranily chránící skupiny Fmoc a Fm. Volná postranní aminoskupina a karboxyskupina se potom intramolekulárné kovalentné spojí působením vhodného amidotvorného činidla, jako je difenylfosforylazid (DPPA), DCC, DIC nebo BOP. Přednost se dává použití DCC a BOP.

Předpis pro typický cyklizační postup zahrnuje následující stupně:

Předpis 2 stupeň reakční činidlo doba

1	DMF	1 X 30 S
2	20-40% piperidin/DMF	1 min
3	DMF	1 X 30 S
4	20-40% piperidin/DMF	20 min
5	iPrOH	1 x 30 s
6	DMF	1 x 30 s

-21CZ 281818 B6

Předpis 2 - pokračování

stupeň	reakční činidlo	doba
7	iPrOH	2 x 30 s
8	DMF	2 x 30 s
9	6% DIPEA/CH₂C1₂	2x2 min
10	ch₂ci₂	1 x 30 s
11	DMF	1 x 30 s
12	kondenzace	1 - 24 h
13	iPrOH	1 x 30 s
14	ch₂ci₂	1 x 30 s
15	DMF	2 x 30 s
16	ch₂ci₂	3 X 30 S

Kondenzační reakce se v průběhu syntézy monitorují Kaiserovým ninhydrinovým testem, aby se zjistil stupeň konverze [Kaiser a další, Anal. Biochem., 34, 595-598 (1970)]. U Boc-Arg(Tos), Boc-Asn a Boc-Gln byla pozorována pomalá reakční kinetika. Pokud je kondenzace neúplná, provede se bud nová kondenzace s čerstvě připravenou aktivovanou kyselinou, nebo se reakční produkt blokuje působením acetanhydridu na kondenzační produkt peptidu s pryskyřicí, jak to bylo popsáno výše. Úplně sestavené produkty peptid-pryskyřice se několik hodin suší za vakua.

V případě každé sloučeniny se odstraňování blokovacích skupin a odštěpování.peptidu od pryskyřice provádí následujícím způsobem. Obvykle se na 1 g produktu peptid pryskyřice působí 25 až 100 μΐ ethandithiolu, 1 ml anisolu a 9 ml kapalného fluorovodíku, při 0 ’C po dobu 45 až 60 minut v zařízení pro práci s fluorovodíkem, které je zhotoveno z teflonu (Peninsula). Alternativně se používá modifikovaného dvoustupňového štěpícího postupu [Tam a další, Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940 (1982)], při němž se na produkt peptid-pryskyřice působí 3 ml dimethylsulfidu a 1 ml fluorovodíku, po dobu 2 hodin při 0 °C, potom se těkavé látky odpaří a na produkt se působí 90% fluorovodíkem. Těkavé látky se za vakua odpaří při teplotě ledové lázně. Zbytek se promyje 2 nebo 3 20ml dávkami jednak diethyleetheru a jednak ethylacetátu a potom se odfiltruje. Peptidy se oddělí od pryskyřice promytím produktu 3 nebo 4 20ml dávkami 10% kyseliny octové, po němž se promývací louhy přefiltrují. Spojené vodné filtráty se lyofilizují, čímž se získá surový produkt.

Surové peptidy se nejprve přečistí gelovou chromatografií na náplni Sephadex G-25 fine, aby se oddělily monomerní látky od oligomerních látek. Peptidy se rozpustí v minimálním objemu 10% kyseliny octové a nanesou na sloupec gelu. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou při průtoku 0,5 až 1,5 mml/min. Eluát se monitoruje při 254 nm a frakce obsahující požadovaný pás se spojí a lyofilizují. Tak se získají zpola přečištěné produkty.

Čištěni zpola přečištěných peptidů se obvykle provádí preparativní HPLC. Peptid se nanáší na sloupec v minimálním objemu bud 1% kyseliny octové nebo 0,1% kyseliny trifluoroctové. Gradientová eluce se zahájí s 10% pufrem B v pufru A, gradient od 10% do 25% pufru B trvá 10 minut a gradient od 25% do 35% pufru B trvá 3

-22CZ 281818 B6 hodiny (pufr A: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodé, pufr B: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu). Průtoková rychlost při eluci je 8,0 ml/min. Detekce UV zářením se provádí při 220 nm. Frakce se odebírají v intervalech 1,5 až 2,5 minuty a jejich složení se kontroluje analytickou HPLC. Frakce o vysoké čistotě se spojí a lyofilizují.

Čistota výsledných produktů se kontroluje analytickou HPLC na sloupci s reversní fází (viz výše). Obvykle se používá gradientově eluce s gradientem od 20% do 40% pufru B v pufru A (pufr A: 0,022% kyselina trifluoroctová ve vodě, pufr B: 0,022% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu) v trvání 15 minut, při průtoku 2,0 ml/min. Detekce UV zářením se provádí při 210 nm. Čistota všech produktů je přibližně 97 až 99 %. Provedou se analýzy aminokyselin v jednotlivých peptidech a naměřené hodnoty leží v přijatelném rozmezí. Všechny konečné produkty se také obvykle podrobí hmotnostní spektrometrii FAB-MS. Všechny produkty vykazují očekávaný rodičovský Μ + H ion v přijatelných mezích.

Nové sloučeniny podle vynálezu vykazují cenné farmakologické vlastnosti. Mají tracheální relaxační účinek a jsou silnými bronchodilátory. Tyto sloučeniny také nemají žádný vedlejší kardiovaskulární účinek. Účinnost těchto nových peptidů při bronchodilataci může být delší než 2 hodiny. Díky těmto účinným vlastnostem představují sloučeniny podle vynálezu farmaceuticky cenné látky pro léčbu bronchokonstrikčních poruch, například asthma.

Nové sloučeniny obecného vzorce I až V je možno mísit s různými typickými farmaceutickými nosiči, přednostně netoxickými inertními terapeuticky vhodnými nosičovými látkami, za vzniku přípravků, které se hodí pro léčbu bronchokonstrikčních poruch, jako je asthma. Dávkování těchto sloučenin v galenických aplikačních formách je závislé na konkrétně použité sloučeniny a dávku mohou odbornici v tomto hodnot účinné různých faktorech, jako je druh druh použitého přípravku. Účinnou oboru určit na základě uvedených koncentrace (EC₅₀). Typické dávkování u humánních pacientů leží v rozmezí od 0,01 do 100 μg/kg. U sloučenin s nízkou hodnotou ED₅₀, jako například 0,1 μg, leží typické dávkování u humánních pacientů v rozmezí od asi 0,02 do asi 20 ůg/kg.

Nové sloučeniny obecného vzorce I až V tvoří farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami s různými anorganickými a organickými kyselinami, jako je kyselina sírová, fosforečná, chlorovodíková, bromovodiková, jodovodiková, dusičná, amidosulfonová, citrónová, mléčná, pyrohroznová, šťavelová, maleinová, jantarová, vinná, skořicová, octová, trifluoroctová, benzoová, salicylová, glukonová, askorbová apod.

Sloučeniny podle vynálezu je možno pacientům podávat parenterálně, bud intravenosné, subkutánně, intramuskulárně, orálně, nebo intranasálně. Přednostní způsob parenterálního podávání spočívá v podávání aerosolu orální nebo intranasální cestou.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

-23CZ 281818 B6

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Příprava produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice

Zesíťovaná benzhydrylaminová pryskyřice na bázi kopolymeru styrenu s 1 % divinylbenzenu (9,5 g, 3,6 mekv. o zrnění 200 - 400 mesh, tj. 38 až 75 μπι, výrobek firmy Vega Biochem) se nabotná ve 100 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použiti stupňů 7 až 8 předpisu 1. V 50 ml dichlormethanu se nechá reagovat Boc-Thr(Bzl) (3,35 g, 10,8 mmol) s dicyklohexylkarbodiimidem (1,12 g, 5,42 mmol), po dobu 1 hodiny, směs se přefiltruje a v 50 ml dichlormethanu přidá k zbotnalé pryskyřici. Vzniklá směs se 18 hodin třepe při teplotě místnosti. Potom se přidá DIPEA (630 ml, 3,6 mmol) a směs se další 1 hodinu třepe, potom se přefiltruje a provedou se stupně 10 až 14 podle předpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Případné nezreagované aminoskupiny se blokují 30minutovým působením 1 ml acetanhydridu a 1 ml DIPEA v 50 ml dichlormethanu na pryskyřici. Pryskyřice se odfiltruje a provedou se promývací stupně 13 a 14 podle předpisu 1. Pryskyřice se za vakua suší přes noc. Získá se 9,8 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice. Vzorek této pryskyřice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjistí se, že se navázalo 0,17 mmol Thr na 1 g pryskyřice.

Příklad 2

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice (9,8 g, 1,7 mmol) z příkladu 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití předpisu 1, uvedeného výše. Všechny kondenzace se provádějí za použití symetrických anhydridů, které byly připraveny z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-histidin(benzyloxymethyl) se kondenzují ve formě příslušných HOBT-aktivovaných esterů. Reakční doba pro dokončení kondenzačního stupně je obvykle 1 až 18 hodin. Provede se celkem 5 kondenzačních cyklů, postupně s 5 aminokyselinami, Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol) a Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol). Potom se pryskyřice za vakua vysuší. Tak se získá 12,2 g produktu Boc-hexapeptid-pryskyřice.

8,2 g (1,13 mmol) této pryskyřice se postupně v 6 cyklech kondenzuje se 6 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol) a Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol). Získá se 10,2 g produktu Boc-dodekapeptid-pryskyřice.

1,26 g (0,139 mmol) této pryskyřice se podrobí dvěma kondenzačním cyklům, a to za použití jednak Boc-Gln (205 mg, 0,93 mmol) a jednak Boc-Lys(2-C1-Z) (627 mg, 15 mmol). Jedna polovina této pryskyřice (0,069 mmol) se postupně podrobí 14 kondenzačním

-24CZ 281818 B6 cyklům za použití 14 aminokyselin: Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OFm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,76 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) a Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyřice se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a potom se na něj působí 1,0 ml acetanhydridu a 66 ml DIPEA (0,38 mmol) ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minut. Potom se pryskyřice promyje (stupně 10 až 14).

Potom se pryskyřice selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2) a nechá 7 x reagovat s DCC (49 mg, 0,24 mmol) a HOBT (32 mg, 0,24 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v průběhu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje (stupně 13 až 16 podle předpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 0,72 g produktu.

Na pryskyřici se působí 6 ml dimethylsulfidu a 2 ml kapalného fluorovodíku po dobu 2 hodin při 0 ’C. Reakční směs se odpaří a ke zbytku se přidá 0,7 ml anisolu a 6 ml kapalného fluorovodíku, načež se reakční směs 45 minut udržuje při 0 °C. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a třikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 227 mg bílé pevné látky.

Tato surová látka se přečistí preparativní HPLC na sloupci Whatman Magnum-20 ODS-3 (2 x 25 cm), přičemž eluce se provádí lineárním gradientem 10% až 40% pufru B v pufru A (pufr A: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě, pufr B: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu) po dobu 4 hodin. Látka hlavního píku se oddělí analytickou HPLC a po spojení vhodných frakcí a lyofilizaci se získá 26,7 mg poločistého produktu. Tato látka se znovu nanese na sloupec Magnum-20 ODS-3 (2 x 50 cm) a eluuje stejným koncentračním gradientem. Látka hlavního píku se oddělí a lyofilizuje. Získá se 9,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,1.

Přiklad 3

Příprava Ac-Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo(Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂] á pryskyřice na bázi kopolymeru 17,7 g, 2,6 mekv. o zrnění 200 výrobek firmy Vega Biochem) odfiltruje se za ve 9/ u s 1 % divinylbenzenu mesh, tj. 38 až 75 um, á ve 160 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje í stupňů 7 až 8 předpisu 1. Pryskyřice se resuspenduje dichlormethanu a nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (6,25 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidem (2,10 g, 10,1 mmol). á směs se 8 hodin třepe při teplotě místnosti, potom se .truje a provedou se stupně 10 až 14 podle předpisu 1.

-25CZ 281818 B6

Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Případné nezreagované aminoskupiny se blokují 60minutovým působením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA ve 150 ml dichlormethanu na pryskyřici. Pryskyřice se odfiltruje a provedou se promývací stupně 13 a 14 podle předpisu 1. Pryskyřice se za vakua suší přes noc. Získá se 18,0 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice. Vzorek této pryskyřice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjistí se, že se navázalo 0,17 mmol Thr na 1 g pryskyřice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice (18,0 g, 3,06 mmol) z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití předpisu 1, uvedeného výše. Všechny kondenzace se provádějí za použití symetrických anhydridů, které byly připraveny z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-histidin(benzyloxymethyl) se kondenzují ve formě příslušných HOBT-aktivovaných esterů. Provede se celkem 5 kondenzačních cyklů, postupně s 5 aminokyselinami, Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) a Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). Potom se pryskyřice za vakua vysuší. Tak se získá 22,9 g produktu Boc-hexapeptid-pryskyřice.

7,48 g (1,0 mmol) této pryskyřice se postupně v 10 cyklech kondenzuje se 10 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1- Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 40 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) a Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol). Získá se 9,6 g produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyřice.

7,68 g (0,8 mmol) této pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačními cyklu za použití Boc-Lys(Fmoc) (1,5 g, 3,2 mmol). Získá se 8,32 g produktu Boc-heptadekapeptid-pryskyřice.

6,24 g (0,6 mmol) této pryskyřice se podrobí dvěma kondenzačním cyklům za použití jednak Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol) a jednak Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol). Získá se 6,28 g produktu Boc-nonadekapeptid-pryskyřice.

2,09 g (0,2 mmol) této pryskyřice se podrobí 9 kondenzačním cyklům, při nichž se postupné jednotlivě použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyřice se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a potom se na něj působí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 20 minut. Potom se pryskyřice promyje (stupně 10 až 14).

Potom se pryskyřice selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2). Tři čtvrtiny této pryskyřice (0,15 mmol) se nechají reagovat s DCC (77 mg, 0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v průběhu 72 hodin a potom ve 20 ml toluenu, v průběhu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promy

-26CZ 281818 B6 je (stupně 13 až 16 podle předpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,72 g produktu.

1,14 g (0,099 mmol) část této pryskyřice se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 2, s tím rozdílem, že se ve druhém stupni použije 1 ml anisolu a 9 ml fluorovodíku. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a třikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 535 mg bílé pevné látky.

Tato surová látka se přečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine (kolona o rozměrech 2 x 100 cm) za použití eluce 10% kyselinou octovou. Monomer hlavního píku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a po spojení vhodných frakcí a lyofilizaci se získá 83,5 mg poločistého produktu. Tato látka se přečistí preparativní HPLC, způsobem popsaným v příkladu 2, s tím rozdílem, že se použije 20 až 40% gradientu v průběhu 3 hodin. Látka hlavního píku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 18,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 292,0; nalezeno 3 291,8.

Příklad 4

Příprava Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂)

Část produktu Boc-nonadekapeptid-pryskyřice (1,55 g, 0,15 mmol) z příkladu 3 se podrobí devíti kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě používá Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0,66 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc-Ala (113 mg, 0,6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) a Boc-His(Bom) (248 mg, 0,66 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyřice se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a potom se na něj působí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minut. Potom se pryskyřice promyje (stupně 10 až 14).

Potom se pryskyřice selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2) a nechá reagovat dvakrát s DCC (77 mg, 0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, po dobu 24 hodin a 72 hodin a potom dvakrát ve 20 ml toluenu po dobu 24 hodin a 48 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje (stupně 13 až 15 podle předpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,54 g produktu.

1,26 g (0,122 mmol) část této pryskyřice se zbaví chránících skupin pomocí fluorovodíku způsobem popsaným v příkladu 3. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a třikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 485 mg bílé pevné látky.

-27CZ 281818 B6

Tato surová látka se přečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 83,5 mg poločistého produktu. Tato látka se přečistí preparativní HPLC, způsobem popsaným v příkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 20 až 45% gradientu v průběhu 3 hodin. Látka hlavního píku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizuji. Získá se 11,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 277,6.

Příklad 5

Příprava Ac-[0rn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VlP cyklo (Asp⁸—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]

1,92 g (0,2 mmol) část produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyřice z příkladu 3 se podrobí 12 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyřice se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a potom se na něj působí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minut. Potom se pryskyřice promyje (stupně 10 až 14) a suší přes noc. Získá se 2,38 g produktu.

1,38 g (0,11 mmol) této pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2) a nechá reagovat s DCC (55 mg, 0,27 mmol) a HOBT (37 mg, 0,27 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, po dobu 24 hodin a potom ve 20 ml toluenu po dobu 24 hodin a 5 x . ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu po dobu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je mírně pozitivní. Pryskyřice se promyje (stupně 13 až 16 podle předpisu 2) a za vakua vysuší.

0,8 g (0,05 mmol) část této pryskyřice se zbaví chránících skupin pomocí fluorovodíku způsobem popsaným v příkladu 3. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a třikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 429 mg pryskyřičné pevné látky.

Tato surová látka se přečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine způsobem popsaným v přikladu 3. Získá se 107 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC, způsobem popsaným v příkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 10 až 40% lineárního gradientu v průběhu 3 hodin. Látka hlavního píku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizuji. Získá se 17,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složeni aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 263,7; nalezeno 3 264,1.

-28CZ 281818 B6

Přiklad 6

Příprava Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂J při nichž , Boc-Thr(Bzl) , Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol),

0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4

1,0 g (0,1 mmol) část produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyřice z příkladu 3 se podrobí 12 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol) (124 mg, 0,4 mmol) (102 mg, Boc-Thr(Bzl) Boc-Val (87 Boc-Asp(OcHx) a Boc-His(Bom) peptid-pryskyřice se působí 0,5 ml acetanhydridu a 35 ml DIPEA ve 20 po dobu 30 a suší přes

Boc-Asn mmol), mmol), mmol), (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) Získaný produkt potom se na něj ml dichlormethanu (stupně 10 až 14) (150 mg, 0,4 mmol). podrobí stupňům 1 až 8 a minut. Potom se pryskyřice promyje noc. Získá se 1,2 g produktu.

g (0,066 mmol) h skupin (stupně s BOP (58 ormamidu, po je negativní.

mg, ' dobu této 1 až 0,13 pryskyřice podle mmol) ve hodin. Kaiserova

Pryskyřice se promyje (stupně se selektivně zbaví předpisu 2) a nechá 20 ml destilovaného ninhydrinová 13 až 16

Tato pryskyřice se zbaví chránících skupin pomocí fluorovodíku způsobem popsaným v příkladu 3. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a třikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se pryskyřičná pevná látka.

Tato surová látka se přečistí gelovou filtraci na náplni Sephadex G-25 fine způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 43,8 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC, způsobem popsaným v příkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 10 až 40% lineárního gradientu v průběhu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 7,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,4.

Příklad 7

Příprava Ac-[Glu⁸,0rn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂]

Zesíťovaná benzhydrylaminová pryskyřice na bázi kopolymeru styrenu s 1 % divinylbenzenu (25,0 g, 17,5 mekv. o zrnění 200 - 400 mesh, tj. 38 až 75 μπι, výrobek firmy Bachem) se nabotná ve 160 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použití stupňů 7 až 8 předpisu 1. Pryskyřice se resuspenduje ve 160 ml dichlormethanu a nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmol)

-29CZ 281818 B6 a dicyklohexylkarbodiimidem (5,4 g, 26,2 nunol). Vzniklá směs se 6 hodin třepe při teplotě místnosti, potom se přefiltruje a provedou se stupně 10 až 14 podle předpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Případné nezreagované aminoskupiny se blokují 60minutovým působením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA ve 150 ml dichlormethanu na pryskyřici. Pryskyřice se odfiltruje a provedou se promývací stupně 13 a 14. Pryskyřice se za vakua suší přes noc. Získá se 29,6 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice. Vzorek této pryskyřice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjistí se, že se navázalo 0,21 mmol Thr na 1 g pryskyřice.

Produkt z odstavce 1 použití stejného předpisu, jako v příkladu kondenzačních cyklů, (5,9

Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice se (14,0 g, 2,94 mmol) podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za 2. Provede se celkem jednotlivě používá Boc-Leu 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g, (10,3 g, 23,5 mmol), mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 > mmol), Boc-Ala (4,4 g mmol). Získá se 26 při nichž se g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB)

Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 a Boc-Nle (5,4 g, 23,5 Boc-dekapeptid-pryskyřice.

, 23,5 mmol) g produktu

5,5 g (0,61 mmol) této pryskyřice se postupně v 4 cyklech jednotlivě kondenzuje s Boc-Gln (655 mg, 2,7 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) a Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol). Po vakuovém vysušení se získá 6,12 g produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyřice.

2,0 g (0,2 začním cyklům, mg, 0,2 mmol), (352 mg, 0,8 (340 mg, 0,8 mmol) této pryskyřice se podrobí dvanácti kondenpři nichž se jednotlivé použije Boc-Orn(Fmoc) (91 Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OFm) mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 peptid-pryskyřice se podrobí stupňům 1 až se na něj působí 0,5 ml acetanhydridu a dichlormethanu po dobu 180 minut. Potom (stupně 10 až 14) a za vakua vysuší. Získá (236 mmol). Získaný produkt 8 z předpisu 1 a potom 38 ml DIPEA ve 30 ml se pryskyřice promyje se 2,4 g produktu.

Potom se část (1,15 g, 0,1 mmol) této pryskyřice selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2) a nechá reagovat dvakrát s BOP (58 mg, 0,13 mmol) a 400 ml DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v průběhu 24 hodin a 6 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje (stupně 13 až 16 podle předpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,05 g produktu.

Tato pryskyřice se zbaví chránících skupin působením 9 ml fluorovodíku, 1 ml anisolu a 100 ml ethandithiolu po dobu 1 hodiny při 0 ’C. Potom se reakční směs odpaří a zbytek se promyje dvakrát 15 ml diethyletheru a dvakrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyřice se extrahuje 4 x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 385 mg světle žluté pevné látky.

-30CZ 281818 B6

Tato surová látka se přečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine způsobem popsaným v příkladu 3. Získá se 134 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC, způsobem popsaným v příkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 26 až 36% lineárního gradientu v průběhu 3 hodin. Látka hlavního píku se oddělí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 23,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní podle HPLC a podle analýzy vykazuje správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,3.

Příklad 8

Příprava Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂J

Zesíťovaná benzhydrylaminová pryskyřice na bázi kopolymeru styrenu s 1 % divinylbenzenu (30 g, 21,4 mekv. o zrnění 200

- 400 mesh, tj . 38 až 75 μιη, výrobek firmy Bachem) se zpracovává způsobem popsaným v příkladu 22, s tím rozdílem, že se použije 19,9 g Boc-Thr(Bzl) (64,3 mmol) a 6,6 g dicyklohexylkarbodiimidu (32,1 mmol). Vzniklá směs se 18 hodin třepe při teplotě místnosti, potom se přefiltruje a provedou se stupně 10 až 14 podle předpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Případné nezreagované aminoskupiny se blokují 60minutovým působením 8 ml acetanhydridu a 8 ml DIPEA ve 200 ml dichlormethanu na pryskyřici. Pryskyřice se odfiltruje a provedou se promývací stupně 13 a 14 podle předpisu 1. Pryskyřice se za vakua suší přes noc. Získá se 34,2 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice. Vzorek této pryskyřice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjistí se, že se navázalo 0,47 mmol Thr na 1 g pryskyřice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice (0,85 g, 0,4 mmol) z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A. Všechny kondenzace se provádějí za použití předem připravených symetrických anhydridů, které byly připraveny z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-arginin(tosyl) se obvyklým způsobem kondenzují ve formě příslušných HOBT-aktivovaných esterů. Provede se celkem 11 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě používá aminokyselin, Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol). Získá se produkt Boc-dodekapeptid-pryskyřice.

Tato pryskyřice se postupně v 5 cyklech kondenzuje způsobem popsaným v příkladu 2, přičemž se jednotlivě používá Boc-Glu(OFM) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (664 mg, 1,6 mmol),

Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol). Produkt se vysuší za vakua. Získá se 2,12 g produktu Boc-heptadekapeptid-pryskyřice.

-31CZ 281818 B6

Potom se část (1,06 g, 0,2 mmol) této pryskyřice selektivně zbaví chránících skupin (stupně 1 až 11 podle předpisu 2) a pryskyřice se nechá reagovat dvakrát s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v průběhu 2 hodin a 8 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je mírné pozitivní. Nezreagované aminoskupiny se blokují lOminutovým působením 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v dichlormethanu na pryskyřici. Pryskyřice se odfiltruje a provedou se promývací stupně 13 až 16 podle předpisu 2. Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použití Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol) a potom znovu převede do syntetizátoru peptidů Applied Biosystems 430A. Provede se 10 kondenzačních cyklů, v nichž se jednotlivě používá Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu a 100 ml DIPEA, ve 20 ml methylenchloridu po dobu 30 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14) a za vakua vysuší.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 340 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 35 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 15,6 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 276,67; nalezeno 3 278,0.

Příklad 9

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴ Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

0,42 g (0,2 mmol) produktu Boc-Thr(Bzl)-pryskyřice z příklakondenzačním cyklům, při mg, 0,8 mmol), Boc-Val 0,8 mmol), Boc-Asp(OFm) mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, nichž se jednotlivě (174 mg, 0,8 mmol), (329 mg, 0,8 mmol), (352 mg, 0,8 mmol), 0,8 du 8 se podrobí 9 používá Boc-Leu (200 Boc-Ser(Bzl) (236 mg, Boc-Leu (200 mg, 0,8 Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mmol) a Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol).

Získaná pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin tím, že se provedou stupně 1 až 11 podle předpisu 2 a potom se nechá reagovat s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a 200 ml DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu po dobu 6 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní.

Tato pryskyřice se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použiti syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak jako v příkladu 8. Provede se celkem 17 kondenzačních cyklů,

-32CZ 281818 B6 při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu s Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 30 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,94 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici (0,97 chránících skupin způsobem popsaným získá 265 mg surového peptidu. Tento filtrací způsobem popsaným v příkladu poločistého produktu. Tato látka se HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, k eluci použije 25 až 35% lineárního bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: ΜΗ vypočteno 3 278,6; nalezeno 3 278,8.

g, 0,1 mmol) se zbaví v příkladu 7, přičemž se peptid se přečistí gelovou 3, přičemž se získá 149 mg dále přečistí preparativní pouze s tím rozdílem, že se gradientu. Získá se 28,1 mg

Příklad 10

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]

Zesilovaná styrenu s 1 % <

- 400 mesh, tj. nabotná ve 50 ml tí stupňů 7 až 8 dichlormethanu a a dicyklohexylkarbodiimidem (774 mg, 4 hodin třepe při teplotě místnosti, vedou se stupně 10 až 14 podle předpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza blokuji v 50 ml dichlormethanu a provedou se promývací stupně 13 řiče se za vakua suší přes noc. Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice. Vzorek analýze na aminokyselinu. Zjistí se, Thr na 1 g pryskyřice.

benzhydrylaminová pryskyřice na bázi kopolymeru divinylbenzenu (5,0 g, 2,6 mekv. o zrnění 200 3 8 až 75 μιη, výrobek firmy Vega Biochem) se . methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použi; předpisu 1. Pryskyřice se resuspenduje ve 60 ml . nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmol) 3,75 mmol). Vzniklá směs se potom se přefiltruje a prose ml DIPEA odfiltruje

1. Pryskyg produktu se podrobí 0,276 mmol je negativní. Případné nezreagované aminoskupiny 60minutovým působením 5 ml acetanhydridu a na pryskyřici. Pryskyřice se a 14 podle předpisu Získá se 5,8 této pryskyřice že se navázalo

0,4 mmol) za

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyřice (1,44 g, z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi použití předpisu 1, tak jako v příkladu 2. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije aminokyselin

-33CZ 281818 B6

Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg, 1,6 mmol) a Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol). Jedna polovina této pryskyřice (0,2 mmol) se podrobí 4 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol).

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (177 mg, 0,4 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní.

Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačními cyklu s Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmol) a potom syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak jako v příkladu 8. Provede se 19 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 30 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 210 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 93 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 26,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 305,8; nalezeno 3 305,8.

Příklad 11

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyřice (o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) , se podrobí syntéze v pevné fázi za použití výše uvedeného předpisu. Všechny kondenzace se provádějí za použití stejných molárné ekvivalentních množství Boc-aminokyseliny a diisopropylkarbodiimidu. Boc-asparagin a Boc-glutamin se zavádějí ve formě reaktivních esterů tím, že se ke kondenzační směsi přidá l,5molární

-34CZ 281818 B6 nadbytek HOBT. Reakční doba, v průběhu stupeň do konce, činí přibližně 2 až 18 9 kondenzačních cyklů, při nichž Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Val

Boc-Asn

Boc-Tyr(2,6-DCB), (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 10 mmol).

činí přibližně 2 cyklů, při (309 mg, (217 mg, 1,0 mmol), (232 mg, 1,0 mmol), , (4 4 0 mg, 1,0 níž proběhne kondenzační hodin. Provede se celkem se jednotlivě

Boc-Leu (249 Boc-Asp(OFm) (206 Boc-Leu (249 mg, 1,0 mg, 0,5

1,0 mg, použije mmol), mmol), mmol), 0,5 mg,

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (88 mg, 0,2 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní.

Provede se 19 jednotlivé použije mmol), Boc-Ala (189 a Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol) Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) 1,0 mmol), Boc-Phe mmol), Boc-Ala (189 mmol) a Boc-Ser(Bzl) 1,0 mmol). Získaný stupňům 1 až 8 z hydridu v 10 ml 6% minut. Pryskyřice vakua vysuší.

kondenzačních cyklů, při nichž těchto aminokyselin: Boc-Ala mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg , Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, mmol), Boc-Asn (232 mg, (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (295 mg, 1,0 mmol) a peptid navázaný na předpisu 1 a nechá reagovat s roztoku DIPEA v methylenchloridu po se promyje (stupně 10 se postupně (189 mg, 1,0 , 1,0 mmol)

1,0 mmol), mmol),

1,0

1,0 mg, 1,0 1,0 mg, mg, (315 mg, Boc-His(Tos) (409 pryskyřici se podrobí

0,5 ml acetandobu 30 až 14 předpisu 1) a za

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 304 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 215 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 26 až 36% lineárního gradientu. Získá se 20,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjisti, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,6; nalezeno 3 277,7.

Příklad 12

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyřice (o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) se podrobí syntéze v pevné fázi, podobně jako v příkladu 11. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 9 kondenzačních cyklů a cyklizace, způsobem podle příkladu 11. Následuje 19 kondenzačních cyklů, jako v příkladu 11,

-35CZ 281818 B6 pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 10. cyklu nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol, Boc-Tyr(2,6-DCB) v 19. cyklu se nahradí Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol) a Boc-Phe ve 23. cyklu se nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 345 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 215 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 30 až 40% lineárního gradientu. Získá se 16,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 574,7; nalezeno 3 575,1.

Příklad 13

Příprava Ac-[Glu⁸,0rn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂] se

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyřice (o zrnění 100 podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) syntéze v pevné fázi, podobné jako v příkladu 11. celkem 9 kondenzačních cyklů a cyklizace, jako a dále následuje 19 kondenzačních cyklů, jako pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 10. cyklu , Boc-Lys(2-C1-Z) v 17. cyklu se mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21. 1,0 mmol).

až 200 mesh se podrobí Provede se v příkladu v příkladu 11, nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol nahradí Boc-Orn(Z) (366 mg, 1,0 cyklu se nahradí Boc-Glu(Bzl) (337 mg,

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 255 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 200 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 28 až 38% lineárního gradientu. Získá se 30,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 305,8; nalezeno 3 305,5.

Příklad 14

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyřice (o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) se podrobí syntéze v pevné fázi, podobně jako v příkladu 11. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 9 kondenzačních cyklů a cyklizace, způsobem podle

-36CZ 281818 B6 příkladu 11. Následuje 19 kondenzačních cyklu, jako v příkladu 11, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Phe ve 23. cyklu nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 268 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 165 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 28,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 5584,1; nalezeno 3 584,0.

Příklad 15

Příprava Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (1,5 g, 0,4 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, podobné jako v příkladu 11. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OFm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (938 mg, 2,0 mmol).

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (356 mg, 0,8 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje za použití stupňů 13 až 16 podle předpisu 2 a vysuší za vakua. Získá se 1,9 g produktu Boc-oktapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (0,95 syntetickému postupu v pevné fázi dů Applied Biosystems Model 430A, de se 18 kondenzačních cyklů, těchto aminokyselin: Boc-Lys(2-C1-Z) (830 (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 2,0 mmol), mg, 2,0 mmol), mmol), Boc-Ala mmol). Získá se g, 0,2 mmol) se znovu podrobí za použití syntetizátoru peptitak, jako v příkladu 11. Provepři nichž se jednotlivě použije mg, 2,0 mmol), Boc-Ala mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (61S mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) mg, mg, 2,0 mg, mg, Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 1,54 g produktu Boc-hexakosapeptid-pryskyřice.

Část této v pevné fázi za pryskyřice (0,77 g, 0,1 mmol) se podrobí syntéze použití předpisu uvedeného v příkladu 2. Provedou

-37CZ 281818 B6 se 2 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,74 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 172 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 110 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 37% lineárního gradientu. Získá se 40,0 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 261,7; nalezeno 3 261,8.

Příklad 16

Příprava Ac-EN-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]

0,77 g (0,1 mmol) produktu Boc-hexakosapeptid-pryskyřice z příkladu 15 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití předpisu uvedeného v příkladu 2. Provedou se 2 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0, mmol). Potom se peptid navázaný na pryskyřici zpracuje stupni 1 až 8 podle předpisu 1 a dále se na něj působí BOP (442 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml, 3,0 mmol) ve 20 ml dimethylformamidu po dobu 6 hodin a potom 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14) a za vakua vysuší. Získá se 0,73 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 191 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtraci způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 138 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 37% lineárního gradientu. Získá se 28,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 225,4; nalezeno 3 225,8.

Příklad 17

Příprava Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (4,0 g, 1,08 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM)

-38CZ 281818 B6 se podrobí jako v příkladu nichž se Boc-Thr(Bzl) Boc-Val Boc-Asn Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,9 mmol).

syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně

2. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklů, při jednotlivé použije následujících aminokyselin (1,34 g, 4,3 mmol), Boc-Leu (925 (938 mg, 4,3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 (557 mg, 2,4 mmol), Boc-Leu (925 g, 4,3 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) mg, mg, mg,

4,3

2,1

4,3 (1,1 mmol), mmol), mmol),

4,3

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (885 mg, 2,0 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje za použití stupňů 13 až 16 podle předpisu 2.

Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použiti Boc-Lys(2-CI-Z) (1,79 g, 4,3 mmol) a za vakua vysuší. Získá se 6,3 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice·

Část této pryskyřice (1,89 g, 0,3 mmol) se podrobí 9 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol) a Boc-Gln (325 mg, 1,32 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol) a Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol). Získá se 2,06 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice.

0,68 g (0,1 mmol) této pryskyřice se podrobí 10 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-2-Nal (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,82 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 261 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 186 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 30 až 40% lineárního gradientu. Získá se 60,1 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 296,8; nalezeno 3 295,6.

-39CZ 281818 B6

Příklad 18

Příprava Ac-[O-Me-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂]

0,68 g (0,1 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice z příkladu 17 se podrobí 10 kondenzačním cyklům, podobně jako v příkladu 17, pouze s tím rozdílem, že se Boc-2-Nal v 19. cyklu nahradí Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol). Získá se 0,61 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 175 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 136 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 28 až 38% lineárního gradientu. Získá se 42,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 276,7; nalezeno 3 276,0.

Příklad 19

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH2-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2]

0,625 g (0,09 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice z příkladu 17 se podrobí 10 kondenzačním cyklům, podobně jako v příkladu 17, pouze s tím rozdílem, že se Boc-2-Nal v 19. cyklu nahradí Boc-p-NH(Z)-Phe (166 mg, 0,4 mmol) a Boc-Phe ve 23. cyklu se nahradí Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmol). Získá se 0,84 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 182 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 160 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 47,2 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 279,7; nalezeno 3 279,8.

Příklad 20

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (1,25 g, 1,0 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 p.m, výrobek firmy BACHEM)

-40CZ 281818 B6 se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (937 mg, 2,0 mmol).

Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použití Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol) a za vakua vysuší. Získá se 2,7 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (0,54 g, 0,2 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v příkladu 8. Provede se celkem 18 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získá se 1,16 g produktu Boc-heptakosapeptid-pryskyřice.

0,54 g (0,1 mmol) této pryskyřice se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu, při němž se použije Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,5 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, pouze s tím rozdílem, že se použije 5 ml fluorovodíku a 0,5 ml anisolu. Získá se 127 mg surového peptidú. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladů 3, přičemž se získá 74,6 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 17,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 333,8; nalezeno 3 333,4.

-41CZ 281818 B6

Příklad 21

Příprava Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]—VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵ [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂1

0,58 g (0,1 mmol) produktu Boc-heptakosapeptid-pryskyřice z příkladu 20 se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu s Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s BOP (443 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml, 3,0 mmol) ve 20 mlO dimethylformamidu, po dobu 6 hodin a potom s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,4 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 20, přičemž se získá 165 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 101 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 19,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 281,8; nalezeno 3 281,9.

Příklad 22

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂J

0,54 g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak jako v příkladu 8. Provede se celkem 18 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(O-Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg,

2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získá se 0,58 g produktu Boc-heptakosapeptid-pryskyřice.

Tato pryskyřice se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu, při němž se použije Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Prys

-42CZ 281818 B6 kyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,53 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, pouze s tím rozdílem, že se použije 5 ml fluorovodíku a 0,5 ml anisolu. Získá se 151 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 110 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23,5 až 33,5% lineárního gradientu. Získá se 22,8 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 347,9; nalezeno 3 347,0.

Příklad 23

Příprava Ac-[0-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]

1,84 g (0,3 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak, jako v příkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,2 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice.

0,73 g (0,1 mmol) této pryskyřice se podrobí 10 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,77 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 187 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 131 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 26 až 36% lineárního gradientu. Získá se 5,3 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 291,8; nalezeno 3 291,7.

-43CZ 281818 B6

Příklad 24

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸Ala²⁹ ³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (1,1 g, 0,5 mmol o zrnění 200 až 400 mesh podle ASTM, tj. 38 až 75 μη, výrobek firmy BIOMEGA) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol).

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (443 mg, 1,0 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 1 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje za použití stupňů 13 až 16 podle předpisu 2a za vakua vysuší. Získá se 2,02 g produktu Boc-tridekapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (0,8 g, 0,2 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak, jako v příkladu 8. Provede se celkem 16 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,2 g produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyřice.

0,6 g (0,1 mmol) této pryskyřice se podrobí 2 kondenzačním cyklům, při nichž se použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,72 g pryskyřice.

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,645 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 280 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 160 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použi-44CZ 281818 B6 je 22 až 32% lineárního gradientu. Získá se 23,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 561,1; nalezeno 3 560,8.

Příklad 25

Příprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸, Ala²⁹ ³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyřice z příkladu 24 se podrobí dvěma kondenzačním stupňům, způsobem popsaným výše, při nichž se jednotlivě použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg), 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,68 g produktu.

navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve

Získaný peptid až 8 z předpisu 1 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,56 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 160 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 70 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 21,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 545,1; nalezeno 3 545,3.

Příklad 26

Příprava Ac-CN-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

1,1 g (0,4 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak jako v příkladu 8. Provede se celkem 17 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol),

Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,24 g produktu Boc-hexakosapeptid-pryskyřice.

Tato pryskyřice (1,1 g, 0,2 mmol) se podrobí 2 kondenzačním cyklům, při nichž se použije Boc-Ser(Bzl) (238 mg, 0,8 mmol)

-45CZ 281818 B6 a Boc-N-Me-Ala (163 mg, 0,8 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s BOP-C1 (100 mg, 0,2 mmol), kyselinou octovou (23 ml, 0,2 mmol) a DIPEA (140 ml, 0,4 mmol) ve 20 ml dimethylformamidu po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,95 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se 245 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 165 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 33,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 295,8; nalezeno 3 294,5.

Příklad 27

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵ ,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (2,49 g, 2,0 mmol o zrněni 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 um, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 6 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselin: Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Leu (1,85 g, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (1,02 g, 4,4 mmol) a Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmol). Získaná pryskyřice se vysuší a oddělí se z ní 0,4 mmol. Následují 3 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije Boc-Tyr(2,6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (1,87 g, 6,4 mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (2,65 g, 6,4 mmol).

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (1,42 g, 3,2 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 4,5 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje za použití stupňů 13 až 16 podle předpisu 2 a vysuší. Získá se 6,56 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice.

(1,64 g, 0,4 mmol) se podrobí synteticza použiti syntetizátoru peptidů Applitak, jako v příkladu 8. Provede se použije (378 mg, (856 (830

430A, tak, jako v příkladu 8.

kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) mg, (464 mg,

Část této pryskyřice kému postupu v pevné fázi ed Biosystems Model celkem 13 těchto aminokyselin:

2,0 mmol), Boc-Nle mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn mg,

2,0 mg, mg,

2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB)

2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx)

-46CZ 281818 B6 (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,56 g produktu Boc-dokosapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (0,64 g, 0,1 mmol) se podrobí 6 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,69 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 224 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 213 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 70,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 365,9; nalezeno 3 365,6.

Přiklad 28

Příprava Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂J

1,28 g (0,2 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-pryskyřice z příkladu 27 se podrobí 6 kondenzačním cyklům, tak jako v příkladu 27, pouze s tím rozdílem, že se Boc-p-F-Phe v prvním cyklu nahradí Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,41 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v přikladu 7, přičemž se získá 420 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 305 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečisti preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 66,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 398,0; nalezeno 3 398,8.

-47CZ 281818 B6

Příklad 29

Příprava Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

1,64 g (0,4 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 27 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi z použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, tak, jako v přikladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivé použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,2 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (1 g, 0,2 mmol) se podrobí 10 kondenzačním cyklům, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (510 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,45 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se 580 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 400 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 32% lineárního gradientu. Získá se 60,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 346,9; nalezeno 3 346,8.

Příklad 30

Příprava Ac-[Glu⁸,O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

1,1 g (0,2 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice z přikladu 29 se podrobí 10 kondenzačním cyklům, tak, jako v přikladu 29, pouze s tím rozdílem, že se Boc-p-NH(CBZ)-Phe v prvním cyklu nahradí Boc-O-Me-Tyr (14 mg), 0,5 mmol.

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Prysky

-48CZ 281818 B6 řiče se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,45 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se 555 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 460 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 152,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 361,9; nalezeno 3 361,7.

Příklad 31

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]

1,2 g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi z použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v příkladu 8. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Bo-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,3 g produktu Boc-dokosapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (0,65 g, 0,1 mmol) se podrobí 6 kondenzačním cyklům, tak jako v příkladu 27.

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,856 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se 550 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 225 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 80,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 295,7; nalezeno 3 296,2.

-49CZ 281818 B6

Příklad 32

Příprava Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:50)-NH₂J

0,65 g (0,1 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-pryskyřice z příkladu 31 se podrobí 6 kondenzačním cyklům, tak, jako v příkladu 27, s tím rozdílem, že se Boc-p-F-Phe v 1. cyklu nahradí Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,801 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se 250 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 188 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 28,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjisti, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 327,8; nalezeno 3 328,5.

Příklad 33

Příprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:51)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (1,1 g, 0,5 mmol o zrnění 200 až 400 mesh podle ASTM, tj. 38 až 75 μπι, výrobek firmy BIOMEGA) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 24, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 1. cyklu nahradí Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala ve 2. cyklu se nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala ve 3. cyklu se nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,03 g produktu Boc-tridekapeptid-pryskyřice.

Část této pryskyřice (1,22 g, 0,3 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v příkladu 8. Provede se celkem 16 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 24, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Asp(OcHx) v 11. cyklu nahradí Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,95 g produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyřice.

0,975 g (0,15 mmol) této pryskyřice se podrobí 2 kondenzačním cyklům, při nichž se použije Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,05 g pryskyřice.

-50CZ 281818 B6

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,897 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 270 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 28,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 547,1; nalezeno 3 546,9.

Příklad 34

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]

0,975 g (0,15 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyřice z příkladu 33 se podrobí 2 kondenzačním cyklům, tak jako v příkladu 33, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 1. cyklu nahradí Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,915 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 303 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 180 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 42,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 563,1; nalezeno 3 562,6.

Příklad 35

Příprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]

0,27 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z příkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v příkladu 8. Provede se celkem 19 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivé použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol),

Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(0-Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0

-51CZ 281818 B6 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,57 g produktu Boc-oktakosapeptid-pryskyřice.

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,506 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 160 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 17,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjisti, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 331,9; nalezeno 3 332,0.

Příklad 36

Příprava Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyřice z přikladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v příkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 23, přičemž se získá 0,72 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyřice. Tato pryskyřice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu s Boc-p-NH(CBZ)-Phe (166 mg, 0,4 mmol). Získá se 0,79 g produktu Boc-nonadekapeptid-pryskyřice.

Tato pryskyřice se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v příkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, jako v příkladu 23, přičemž se získá 0,72 g produktu Boc-oktadeka-peptid-pryskyřice. Tato pryskyřice se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 430A, jako v přikladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: (464 mg, Boc-Thr(Bzl) Boc-Val (435 Boc-Asp(OcHx) a Boc-His(Tos) jednotlivě použije následujících

2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) mg, 2,0 mmol). Získá se 0,91 mmol), (618 mg, mg, (630 (819

2,0 mg, 2,0

2,0

2,0 mg, (590, g produktu.

Boc-Asn mmol), mmol), mmol), mmol)

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,85 g produktu.

-52CZ 281818 B6

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 350 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 138 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k elucí použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 25,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 276,8; nalezeno 3 276,2.

Příklad 37

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (212 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Tato pryskyřice se selektivně zbaví chránících skupin za použití stupňů 1 až 11 podle předpisu 2 a nechá reagovat s BOP (132 mg, 0,3 mmol) v 10 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 3,5 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se promyje za použití stupňů 13 až 16 podle předpisu 2.

Provede se celkem 19 kondenzačních cyklů, při nichž se jednotlivé použije těchto aminokyselin: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyřici se podrobí stupňům 1 až 8 z předpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu v 10 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minut. Pryskyřice se promyje (stupně 10 až 14 předpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,814 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 265 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem

-53CZ 281818 B6 popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23 až 33% lineárního gradientu. Získá se 8,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 307,8;, nalezeno 3 306,8.

Příklad 38

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až

BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi podobně jako v příkladu 2. Provede se cyklů, tak, jako v příkladu 37, pouze Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) v 7. cyklu nahradí g, 0,1 mmol o zrnění

150 μη, výrobek firmy s využitím předpisu 1, celkem 28 kondenzačních s tím rozdílem, že se Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol). Získá se 0,754 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 254 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 114 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 15,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjisti, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 295,7; nalezeno 3 295,5.

Příklad 39

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃~Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 37, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Thr(Bzl) v 1. cyklu nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu ve 2. cyklu se nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Val ve 3. cyklu se nahradí Boc-Leu (268 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,90 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 270 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 155 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem

-54CZ 281818 B6 popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 29,6 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 377,9; nalezeno 3 377,9.

Příklad 40

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶ , Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂J

100 až BACHEM) podobně cyklů,

Benzhydrylaminová pryskyřice ASTM, tj. pevné fázi Provede se 39, pouze

200 mesh podle se podrobí syntéze v jako v příkladu 2.

tak jako v příkladu Boc-m-OCH-j-Tyr (Bzl) v (78 mg, 0,2 mmol). Získá

7.

(0,125 až g, 0,1 mmol o zrnění

150 μη, výrobek firmy s využitím předpisu 1, celkem 28 kondenzačních s tím rozdílem, že se cyklu nahradí Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) se 0,83 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 240 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 37,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 365,9; nalezeno 3 365,8.

Příklad 41

Příprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID N0:59)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až

BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi podobně jako v příkladu 2. Provede se cyklů, tak jako v příkladu 39, pouze Boc-Asn v 5. cyklu nahradí Boc-Ala Boc-m-OCH-j-Tyr(Bzl) v 7. cyklu se nahradí g, 0,1 mmol o zrnění

150 μιη, výrobek firmy s využitím předpisu 1, celkem 28 kondenzačních s tím rozdílem, že se (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2 DCB) (440 mg,

1,0 mmol) a Boc-Glu (OBzl) v 21. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,85 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 255 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 112 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 12,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou

-55CZ 281818 B6 se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 246,8; nalezeno 3 246,7.

Příklad 42

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶’¹⁷·¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂J

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 41, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 5. cyklu nahradí Boc-Asn (256 mg, 1,1 mmol), Boc-Nle ve 12. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln ve 13. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ala ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,80 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 254 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 115 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 20 až 30% lineárního gradientu. Získá se 32,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 248,7; nalezeno 3 248,3.

Příklad 43

Příprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 41, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Gln ve 13. cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,93 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 250 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 23,6 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 189,8; nalezeno 3 189,9.

-56CZ 281818 B6

Příklad 44

Příprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID NO:62)-NH₂J

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak, jako v příkladu 43, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Nle ve 12. cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,762 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 240 mg surového peptidů. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 32% lineárního gradientu. Získá se 55,3 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 147,7; nalezeno 3 148,0.

Příklad 45

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 42, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 12. cyklu nahradí Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,775 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 203 mg surového peptidů. Tento peptid se přečisti gelovou filtraci způsobem popsaným v přikladu 3, přičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 40,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 290,8; nalezeno 3 290,5.

Příklad 46

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷·¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Ly_S ²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂]

-57CZ 281818 B6

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobné jako v přikladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklů, tak, jako v příkladu 43, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 21. cyklu nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,837 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 178 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 126 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v přikladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 20 až 30% lineárního gradientu. Získá se 24,9 mg bílého amorfního prásku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 205,7; nalezeno 3 205,2.

Příklad 47

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provedou se 3 kondenzační cykly, při nichž se jednotlivě použije následujících aminokyselin: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 28 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 37, pouze s tím rozdílem, že se Boc-m-OCHg-Tyr(Bzl) v 7. cyklu nahradí Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,895 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 440 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 120 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 27,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 506,9; nalezeno 3 205,8.

Příklad 48

Příprava Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj . 75 až 150 μιη, výrobek firmy

-58CZ 281818 B6

BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobně jako v příkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačních cyklů, tak, jako v příkladu 47, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 13. cyklu nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Phe ve 26. cyklu se nahradí Boc-p-F~Phe (142 mg, 0,5 mmol). Získá se 0,754 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 280 mg surového peptidú. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 152 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 38% lineárního gradientu. Získá se 53,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 553,0; nalezeno 3 552,2.

Příklad 49

Příprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂)

BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobné jako v příkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačních cyklů, tak jako v příkladu 47, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Thr(Bzl) ve 4. cyklu nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cyklu se nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 6. cyklu se nahradí Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala ve 13. cyklu se nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) ve 13. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,838 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 370 mg surového peptidú. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 196 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23 až 33% lineárního gradientu. Získá se 48,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 575,1; nalezeno 3 574,0.

Přiklad 50

Příprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸ Gly²⁹'³⁰Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyřice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnění 100 až 200 mesh podle ASTM, tj. 75 až 150 μιη, výrobek firmy

BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím předpisu 1, podobné jako v příkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačních

-59CZ 281818 B6 cyklů, tak, jako v příkladu 49, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 13. cyklu nahradí Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,913 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 378 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 240 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 28,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 591,1; nalezeno 3 590,3.

Příklad 51

Příprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸

Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂)

Ben zhydry1aminová

200 mesh podle se podrobí syntéze v jako v příkladu 2.

tak, (0,125 až jako v

2.

.

ve v příkladu 1. cyklu cyklu se cyklu se 4. cyklu pryskyřice ASTM, tj.

pevné fázi Provede se

47, pouze nahradí nahradí nahradí se nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) g, 0,1 mmol o zrnění 150 um, výrobek firmy s využitím předpisu 1, celkem 31 kondenzačních s tím

Boc-Ala

Boc-Ala rozdílem, že se (189 mg, 1,0 mmol), (189 mg, 1,0 mmol), (189 mg, 1,0 mmol), (414 mg, r Boc-Val v 6. cyklu se nahradí Boc-Leu (249 mg, Boc-Glu(OBzl) ve 24. cyklu se nahradí Boc-Asp(OcHx) mmol). Získá se 0,844 g produktu.

100 až

BACHEM) podobně cyklů,

Boc-Thr(Bzl)

Boc-Gly ve

Boc-Thr(Bzl)

1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cyklu se nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (414 mg

1,0

1,0 mmol) a (315 mg, 1,0 mmol),

Peptid navázaný na pryskyřici se zbaví chránících skupin způsobem popsaným v příkladu 7, přičemž se získá 360 mg surového peptidu. Tento peptid se přečistí gelovou filtrací způsobem popsaným v příkladu 3, přičemž se získá 115 mg poločistého produktu. Tato látka se dále přečistí preparativní HPLC způsobem popsaným v příkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 34,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podle HPLC homogenní a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselin. FAB-MS: MH vypočteno 3 547,1; nalezeno 3 546,0.

Příklad 52

Účinnost analogů VIP na relaxaci průdušnice

Relaxační účinnost analogů VIP se studuje na modelu, při němž se používá průdušnice morčete [Wasserman M. A. a další, v publikaci Vasoactive Intestinal Peptide, red. S. I. Said, Raven Press, N. Y. 1982, str. 177 až 184]. Všechny tkáně se odebírají ze samců albínských morčat o hmotnosti 400 až 600 g, anestetizovaných urethanem (2 g/kg i.p.). Po exanguinaci se vyjme průdušni

-60CZ 281818 B6 ce a rozdělí na 4 kruhové segmenty, z nichž každý má délku 3 mm. Každý kroužek se zavěsí za použití drátů z nerezové oceli o tloušťce 76 p.m do 10 ml nádoby s duplikátorovým pláštěm pro tkáňové lázně a pomocí hedvábné nitě 4-0 připojí k zařízení pro měření napětí Grass Force Displacement Transducer, Model FTO3C, výrobek firmy Grass Instruments Co., Quincy, MA), za účelem izometrického měření a zaznamenávání napětí. Hladký sval se máčí v lázni obsahující modifikovaný Krebsův roztok následujícího složení: chlorid sodný, 120 mM; chlorid draselný, 4,7 mM; chlorid vápenatý, 2,5 mM; heptahydrát síranu hořečnatého, 1,2 mM; hydrogenuhličitan sodný, 25 mM; hydrogenfosforečnan didraselný, monobazický, 1,2 mM; a dextróza, 10 mM. Tkáňová lázeň se udržuje při teplotě 37 °C a průběžně probublává směsí 95 % kyslíku a 5 % oxidu uhličitého. Odpověď se zaznamenává na 8-kanálovém a 4-kanálovém zapisovači Hewlett-Packard (Model 7702B a 7754A), což jsou výrobky firmy Hewlett-Packard, Paramus, NJ). Průdušnicové kroužky se umísti pod klidové napětí 1,5 g, o němž bylo zjištěno, že je optimální nebo blízké optimálnímu v předchozích pokusech. V průběhu šedesátiminutové stabilizační periody, která následuje, je zapotřebí napětí znovu upravovat. Tkáně se oplachují v 15 minutových intervalech.

Křivky závislosti odpovědi na kumulativní koncentraci pro každou tkáň se získají postupným zvyšováním koncentrace VIP nebo analogů VIP přidáváním mikrolitrových množství těchto látek do lázně podle postupu popsaného v VanRossum, Arch. Ind. Pharmacodyn., 143, 299 až 330 (1963). Pro jednu tkáň se získá pouze jedna křivka odpovědi na kumulativní dávku. Pro minimalizaci rozdílů mezi tkáněmi se relaxační odpověď vyjádří jako procentický podíl získané maximální odpovědi na VIP (10~⁶ M = 100 %), přidaný na závěr každého experimentu, při němž se měří závislost odpovědi na koncentraci. Sečtou se odpovědi ze tří tkání a lineární regresí se stanoví hodnoty EC_5Q.

Výsledky, které jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1 ukazují relaxační účinnost analogů VIP na průdušnici, ve srovnání s účinností nativního VIP.

Tabulka I

Relaxační účinnost analogů VIP na tracheální hladký sval morčete sloučenina

VIP[(Seq ID NO:1)-NH₂J

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂J

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ J-VIP cyklo (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂J

Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys^{12 *},Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ J-VIP cyklo (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂J

-61CZ 281818 B6

Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]40

Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂J38

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂]16

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ J-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂J37

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Va1²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp24) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]5,3

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]3,1

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]0,70

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:30)-NH₂]1,3

Ac-[Glu⁸,0rn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂]2,2

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]0,44

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]1,2

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]0,71

Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]4,2

Ac-[0-CH₃-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂]0,84

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂~Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵)

-62CZ 281818 B6 [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH₂]4,4

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂10,13

Ac-tN-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:39)-NH₂]0,95

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂J0,45

Ac-[O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]2,6

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]0,61

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Ala^29_31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0,55

Ac-fN-Me-Ala^jGlu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0,36

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]0,47

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]0,26

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]0,32

Ac-[Glu⁸,O-CH₃-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]0,41

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂J0,39

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:50)-NH₂J2,9

-63CZ 281818 B6

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰ Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]0,92

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]0,35

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]0,78

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]0,96

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂]0,31

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂]0,52

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]0,29

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]0,31

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]—VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]1,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]0,26

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]2,4

Ac-Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂]0,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID NO:63)-NH₂]0,9

-64CZ 281818 B6

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷·¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂]0,22

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]0,88

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]—VIP cyklo Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂]0,57

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:67)-NH₂]0,19

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂]0,43

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu^2S,Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]VIP cyklo (Lys—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]0,42

Příklad 53

Bronchodilatační účinnost analogů VIP

Bronchodilatační účinnost VIP a jeho analogů in vivo se stanovuje instilačním podáváním do průdušnice. Při této technice se používá samců morčete (kmen Hartley, Charles River) o hmotnosti 400 až 600 g. Zvířata se anestetizuji urethanem (2 g/kg i.p.) a do jejich jugulární vény se vloží polyethylenová kanyla pro intravenózní podáváni léčiva.

Zvířata se tracheotomizují a do místa průdušnice, vzdáleného 3/4 délky od carina tracheae, se pipetou dávkuje roztok destilované vody nebo zkoušené sloučeniny v destilované vodě. Koncentrace dávkovaného roztoku se nastaví tak, aby se dodával konstantní objem 100 ml. Zvířata se na 1 minutu umísti do vertikální polohy, hlavou nahoru, aby se usnadnila dodávka léčiva do plic. Po jedné minuté se zastaví spontánní dýchání intravenózním podáním chloridu sukeinylcholinu (1,2 mg/kg) a pomocí malého respirátoru pro zvířata Harvard Model 680, nastaveného na dechovou frekvenci 40 min^-1 a zdvihový objem 4,0 cm³ se zavede umělá ventilace. Zvířatům se podá maximální konstrikční dávka histaminu (50 mg/kg

i.v.) a za použití převaděče tlaku Statham Pressure Transducer (P 32 AA) se zaznamenává tlak v průdušnici (v cm vodního sloupce ) .

Vypočítá se průměrný tlak v průdušnici z údajů od nejméně 3 kontrolních zvířat a 3 zvířat ošetřených léčivem a inhibice

-65CZ 281818 B6 v procentech. Relativní síla sloučenin podávaných instilační cestou se stanovuje tak, že se zvířatům podávají různé dávky zkoušených sloučenin a vypočítá se střední účinná dávka (hodnota ED₅₀). Hodnoty ED^q se stanoví z logaritmických křivek závislosti odpovědi na dávce, které byly sestrojeny za použití alespoň tří dávek, jejichž inhibiční účinek leží v rozmezí od 10 do 90 %. Korelační koeficienty pro regresní přímku všech sloučenin jsou vždy .vyšší než 0,95.

Pro stanovení časového průběhu inhibice u různých sloučenin se mění doba mezi podáním sloučeniny a podáním provokační dávky histaminu. Časový průběh účinnosti se vyjádří vypočtenou hodnotou času, během něhož inhibice poklesne na 40 %.

Výsledky, které jsou souhrnně uvedeny v tabulce II, ukazuji bronchodilatační účinnost in vivo analogů VIP, ve srovnání s účinností nativního VIP.

Tabulka II

Bronchodilatační účinnost analogů VIP u morčete sloučenina ed₅(μ-g

VIP[(Seq ID NO:1)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂]

2,3

1,2

0,34

0,90

0,19

0,6

-66CZ 281818 B6

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]1,0

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂]0,09

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:39)-NH₂]0,06

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂]0,022

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸,

Ala²⁹“³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]0,072

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷·²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:43)-NH₂]0,14

Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]0,097

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]0,026

Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]0,036

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:47)-NH₂]0,075

Ac-[Glu⁸,O-CH₃-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]0,094

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]0,26

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]0,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵)

-67CZ 281818 B6 [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]0,1

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP _cyklo (_Lys21—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]0,14

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]0,35

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃~Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁸,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂]0,14

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁸,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂]7,2

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁸,Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]0,019

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]0,03

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]0,17

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸ ]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]0,17

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁸,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:61)-NH₂]0,045

Ac-Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁸'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:62)-NH₂]0,24

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁸'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [AC-(SEQ ID NO:64)-NH₂]0,13

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵,Val²⁸,Thr²⁸,

Giy²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂]0,84

-68CZ 281818 B6

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Ac-[Ala^{2 3 4 5},Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly29,3O,Thr31j_VIp cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2]

0,12

0,077

0,04

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂]0,04

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Cyklický peptid obecného vzorce I

II

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asn-Tyr-Thr-R₁₂-Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-(I) [X-(SEQ ID NO:2)-Y]

-Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y kde R₈ představuje Asp, Glu, nebo Lys; R₁₂ představuje Arg, Lys, Orn nebo Asp; R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceuticky vhodné soli.
2. Cyklický peptid podle nároku 1, kde R₁₇ představuje Nle, R₂₆představuje Val a R₂₈ představuje Thr.
3. Peptid podle nároku 2, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N0:20)-NH₂].
4. Peptid podle nároku 2, kterým je Ac-Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂],
5. Peptid podle nároku 2, kterým je Ac-[0rn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>0rn¹²) [Ac—(SEQ ID NO:23)-NH₂].

-69CZ 281818 B6
6. Peptid podle nároku 2, kterým je Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂].
7. Peptid podle nároku 2, kterým je Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂].
8. Cyklický peptid obecného vzorce II

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Rg-Asp-Tyr-Thr-Lys(II) -Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇~Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:4)-Y]

-Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂g-Y kde Rg představuje Asp nebo Asn; R₁₇ představuje Met nebo Nle;

R₂₆ představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr;

X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceuticky vhodné soli.
9. Peptid podle nároku 8, kterým je Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹², Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂].
10.Cyklický peptid obecného vzorce III

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysI-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Leu-Arg-Lys-Glu-R₁₇~Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID

-Leu-Asp-Ser-R₂g-Leu-R₂₈-Y (III)

NO:6)-Y] kde R₁₇ představuje Met nebo Nle; R_2g představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceuticky vhodné soli.
11. Peptid podle nároku 10, kterým je Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶, Nle¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂].
12. Cyklický peptid obecného vzorce IV

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R₁₂i

-Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇~Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID (IV)

NO:8)-Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y

-70CZ 281818 B6 kde R₁₂ představuje Arg nebo Lys; R₁₇ představuje Met nebo Nle; R₂₆ představuje Ile nebo Val; R₂₈ představuje Asn nebo Thr; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceuticky vhodné soli.
13. Peptid podle nároku 12, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle^{16 17}, Asp²⁴, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂].
14. Cyklický peptid obecného vzorce V

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-Rg-Asn-R₁Q-Thr-R₁₂ |

-Leu-Arg-Lys-R₁₆~R₁₇-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂₂I

-Leu-R₂₄-Asp-R₂₆-R₂₇-R₂₈-Y (V) [X-(SEQ ID NO:10)-Y] kde R-[_ představuje His, N-CH₃-Ala; R₂ představuje Ser nebo Ala; R₆ představuje

H u O kde Q představuje nižší alkylcyklohexyl R_g představuje Asp, Glu nebo Ala; R₁₀ nebo nižší alkylaryl; představuje Tyr nebo

Rg; R₁₂ představuje Arg nebo

Ala; R₁₇ představuje Met, Nle

Lys; ^R16 představuje Gin nebo nebo Ala; R_ig představuje Val nebo Ala; R₂₂ představuje Tyr nebo R₆;

R₂₄ představuje Asn nebo Ala; R₂₆ představuje Ile, Val nebo Leu; R₂₇ představuje Leu nebo Lys; R₂g představuje Asn, Thr, nebo Lys; X představuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; nebo skupinu vzorce ^R29^-R30^-R31^-z' kde

R_2g představuje Gly nebo Ala; R₃₀ představuje Gly nebo Ala;

R₃₁ představuje Ala, Met, Cys(Acm), nebo Thr; Z představuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceuticky vhodné soli.
15. Cyklický peptid podle nároku 14, kde Q představuje methylcyklohexylskupinu.
16. Cyklický peptid podle nároku 14, kde Q představuje alkylarylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku.

-71CZ 281818 B6 skupiny vzorců OH, n(ch₃)₂, nhcoch₃,
17.Cyklický peptid podle nároku 16, kde Q představuje alkylfenylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, v níž je fenylový kruh popřípadě substituován jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru zahrnujícího och₃, F, Cl, i, ch₃, cf₃, no₂, NHCOC₆H₅ a C(CH₃)₃.

nh₂,
18.Cyklický peptid podle nároku 16, naftylskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku je naftylový kruh popřípadě substituován substituenty zvolenými ze OH, OCH₃, f, Cl, i, ch₃, NHCOC₆H₅ a C(CH₃)₃.

představuje alkylv níž kde Q v alkylovém zbytku, jedním nebo více souboru zahrnujícího skupiny vzorců cf₃, no₂, nh₂, n(ch₃)₂, nhcoch₃,
19.Peptid podle nároku vuje Thr [X-(SEQ ID

14, kde R₂₆ představuje Val a R₂₈NO:11)-Y].

předsta-
20. Peptid podle nároku 14, kde R₁₇ představuje Nle, R₂₆ představuje Val a R₂₈ představuje Thr [X-(SEQ ID NO:12)-Y].
21. Peptid podle nároku 20, kterým je Ac-[Glu⁸,Orn¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂].
22. Peptid podle nároku 20, kde R-^₂ představuje Leu, R₁₇ představuje Nle, R_ig představuje Ala, R₂₆ představuje Val a R₂₈ představuje Thr [X-(SEQ ID NO:13)-Y].
23. Peptid podle nároku 22, kterým je Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cykl (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂].
24. Peptid podle nároku 22, kterým je Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Leu¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂].
25. Peptid podle nároku 22, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH2~Phe¹⁰, Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:37)-NH2].
26. Peptid podle nároku 20, kde R₁₂ představuje Lys, R₁₇ předsta-

vuje Nle, R₂₆ představuje Val a R₂₈ představuje Thr [X-(SEQ ID NO:14)-Y]. 27.Peptid podle nároku 26, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷ Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]. cyklo (Lys²¹— ->Asp²⁵)

-72CZ 281818 B6
28. Peptid podle nároku 26, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VlP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH2].
29. Peptid podle nároku 20, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂].
30. Peptid podle nároku 20, kde R₁₂ představuje Lys, R₁₇ představuje Nie, Rj_9 představuje Ala, R₂₆ představuje Val a R₂₈ představuje Thr [X-(SEQ ID NO:15)-Y].
31. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:29)-NH₂].
32. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH2J.
33. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[Ala²,Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂].
34. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂].
35. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂].
36. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂].
37. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:50)-NH₂].
38. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂].
39. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-OCH3-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH2].

-73CZ 281818 B6
40. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂],
41. Peptid podle nároku 30, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂].
42. Peptid podle nároku 14, kde R_2g představuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈ je Lys [X-(SEQ ID NO:16)-Y].
43. Peptid podle nároku 42, kde R₁₂ představuje Lys, R₁₇ představuje Ala, R_ig představuje Ala, R_2g představuje Leu a R₂₇a R₂₈ oba představují Lys [X-(SEQ ID NO:17)-YJ.
44. Peptid podle nároku 43, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:60)-NH₂].
45. Peptid podle nároku 43, kterým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂).
46. Peptid podle nároku 43, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala^16,17'¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH₂).
47. Peptid podle nároku 42, kde R₁₂ představuje Lys, R₁₇ představuje Nle, R_2g představuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈ představuje Lys [X-(SEQ ID NO:18)-Y].
48. Peptid podle nároku 47, kterým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH₂].
49. Peptid podle nároku 47, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH₂].
50. Peptid podle nároku 47, kde R₁₂ představuje Lys, R₁₇ představuje Nle, R-j__g představuje Ala, R₂₆ představuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈ představuje Lys [X-(SEQ ID NO:19)-Y].
51. Peptid podle nároku 50, kde R₁₂ představuje Lys, R_lg představuje Gin, R₁₇ představuje Nle, R₁₉ představuje Ala, R_2g představuje Leu a jak R₂7, tak R₂₈ představuje Lys

-74CZ 281818 B6 [X-(SEQ ID N0:70)-Y].
52. Peptid podle nároku 51, kde R₂ představuje Ser, R₁₂ představuje Lys, R_lg představuje Gin, R^₇ představuje Nle, R^g představuje Ala, R₂₆ představuje Leu a jak ^27' ^tak ^R28 Představuje Lys [X-(SEQ ID NO:71)-Y].
53. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂].
54. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-fN-Me-Ala¹, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂].
55. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:40)-NH₂].
56. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Ala^29-31J-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂J.
57. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-CN-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂).
58. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂).
59. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:46)-NH₂].
60. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, p-NH2~Phe¹⁰,Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47-NH2J.
61. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂).
62. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹²,

Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂].
63. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-(Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo

-75CZ 281818 B6 (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂].
64. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂)
65. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂J.
66. Peptid podle nároku 52, kterým je Ac-[Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂).
67. Peptid podle nároku 51, kde R₂ představuje Ala, R₁₂ představuje Lys, Rj_g představuje Gin, R₁₇ představuje Nle, R₁₉ představuje Ala, R₂₆ představuje Leu a každý ze symbolů R₂₇ a R₂₈představuje Lys [X-(SEQ ID NO:72)-Y],
68. Peptid podle nároku 67, kterým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]
69. Peptid podle nároku 67, kterým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂).
70. Peptid podle nároku 67, kterým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂J.
71. Peptid podle nároku 50, kde R₁₂ představuje Lys, R_lg předsta- vuje Ala, R₁₇ představuje Nle, R_ig představuje Ala, R_2g představuje Leu a každý ze symbolů R->-, a R_OQ představuje Lys [X-(SEQ ID NO:73)-Y]. ^{27 28}
72. Peptid podle nároku 71, kterým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nle¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂].
73. Peptid podle nároku 71, kterým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nle¹, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH₂J.
74. Cyklický peptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, 10, 12 nebo 14, jako terapeutické činidlo.

-76CZ 281818 B6
75. Cyklický peptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, 10, 12 nebo 14, jako bronchodilatační činidlo.
76. Cyklický peptid Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys^27,28, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ

ID NO:52)-NH₂1, jako terapeutické činidlo.
77. Cyklický peptid Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂J, jako bronchodilatační činidlo.
78. Způsob výroby cyklického peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, 10, 12 nebo 14, vyznačující se tím, že se

a) chráněný peptid s odpovídající sekvencí aminokyselin, který je vázán k pryskyřici, selektivně zbaví chránících skupin, za vzniku volné aminoskupiny v postranním řetězci a volné karboxyskupiny v postranním řetězci;

b) volná aminoskupina v postranním řetězci a volná karboxyskupina v postranním řetězci se spojí kovalentní vazbou za použití vhodného amidotvorného činidla; a

c) cyklizovaný peptid se zbaví chránících skupin a odštěpí od pryskyřice za použití vhodného deprotekčního a štěpícího činidla, popřípadě za přítomnosti dalších vhodných přísad, jako jsou látky zachycující kationty a získaný cyklický peptid se popřípadě převede na farmaceuticky vhodnou sůl.
79. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje cyklický peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 73 a netoxickou inertní terapeuticky vhodnou nosičovou látku.
80. Farmaceutický přípravek pro léčbu bronchotracheálních konstrukčních poruch, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství cyklického peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 73 a netoxický farmaceuticky vhodný kapalný nebo pevný nosič.
81. Cyklický peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 73 pro použití při léčbě různých poruch.
82. Cyklický peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 73 pro použití při léčbě bronchotracheálních konstrukčních poruch.