SK279399B6

SK279399B6 - Cyklický peptid, spôsob jeho výroby a farmaceutick

Info

Publication number: SK279399B6
Application number: SK3086-92A
Authority: SK
Inventors: David R. Bolin; Margaret O'donnell
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1998-11-04
Also published as: NO304523B1; FI924580A0; DK0536741T3; IL103396A0; KR930007972A; JP2515473B2; NO980377L; DE69207138T2; JPH05213996A; NO923929L; FI20002041A; GR3019326T3; UY23488A1; EP0536741B1; US5677419A; NO975023L; CN1225473C; TW305846B; IL103396A; NO980377D0

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka cyklických peptidov, ktoré sú analógmi vazoaktívnych peptidov (VIP), spôsobu ich výroby a farmaceutických prípravkov, obsahujúcich tieto cyklické peptidy. Tieto farmaceutické prípravky sa hodia na liečbu bronchotracheálnych konštrikčných porúch.

Doterajší stav techniky

Vazoaktívny črevný peptid (VIP) bol prvýkrát objavený, izolovaný a purifikovaný z čriev ošípaných (U. S. patent č. 3 879 371). Tento peptid obsahuje dvadsať (28) aminokyselín a vykazuje v rozsiahlej miere homológii proti sekretínu a glukagónu [Carlquist a ďalšie, Horm. Metab. Res., 14, 28 29 (1982)]. VIP má nasledujúcu sekvenciu aminokyselín

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NHj [(SEQ ID No.: 1 j-NHJ

Je známe, že VIP vykazuje široké spektrum biologických účinností v gastrointestinálnom trakte a obehovom systéme. Vďaka tomu, že je VIP podobný gastrointcstinálnym hormónom, ako bolo zistené, stimuluje sekréciu slinivky brušnej a žlčníka, glykogenolýzu v pečeni, sekréciu glukagónu a inzulínu a aktivuje uvoľňovanie hydrogénuhličitanu v slinivke brušnej [Kerrins. C. a Said, S. I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014 - 1017 (1972); Domschke, S. a ďalšie, Gastroenterology, 73, 478 - 480 (1977)].

Neuróny, obsahujúce VIP, boli lokalizované imunostanovením v bunkách endokrinného a exokrinného systému, čriev a hladkého svalstva. [Polak J. M. a ďalšie, Gut, 15, 720 - 724 (1974)]. Zistilo sa, žc VIP je neurofaktorom, ktorý spôsobuje uvoľňovanie niekoľkých hormónov, vrátane prolaktínu [Frawley L. S. a ďalšie, Neuroendocrinology, 33, 79 - 83 (1981)], tyroxínu [Ahren B. a ďalšie, Náture, 287, 343 - 345 (1980) a inzulínu a glukagónu [Schcbalin M. a ďalšie, Am. J. Physiology E., 232, 197 - 200 (1977)]. Tiež sa zistilo, že VIP stimuluje uvoľňovanie renínu z obličiek in vivo a in vitro [Porter J. P. a ďalšie, Neuroendocrinology, 36, 404 - 408 (1983)]. Bolo zistené, že VIP je prítomný v nervoch a nervových zakončeniach dýchacích ciest rôznych druhov zvierat a človeka [Dey R. D. a Said S. I., Fed. Proc., 39, 1062 (1980); Said S. I. a ďalšie, Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103 - 114 (1974)].

Kardiovaskulárne a bronchopulmonáme účinky VIP sú predmetom záujmu, pretože sa zistilo, žc VIP je silný vazodilatant a účinný relaxant hladkého svalu, ktorý pôsobí na periférne pulmonánne a koronárne vaskuláme lôžko [Said S. I. a ďalšie, Clin, Res., 20, 29 (1972)]. Zistilo sa, že VIP má vazodilatačný účinok na mozgové cievy [Lee T. J. a Berszin I., Science, 224, 898 - 900 (1984)]. Štúdie in vitro ukázali, že vazoaktívny črevný peptid, aplikovaný exogénnym spôsobom na mozgové tepny, indukuje vazodilatáciu, čo ukazuje, že VIP je možným mediátorom (transmiterom) cerebrálnej vazodilatácie [Lee T. a Saito A., Science, 224, 898 - 901 (1984)]. Tiež v oku sa VIP ukázal byť silným vazodilatantom. [Nilson S. F. E. a Bili A., Acta Physiol. Scand., 121,385 -392 (1984)].

VIP snáď má tiež regulačné účinky na imunitný systém. O' Dorisio a ďalšie ukázali, že VIP môže modulovať proliferáciu a migráciu lymfocytov [J. Immunol., 135 792 s až 796 s (1985)].

Pretože VIP spôsobuje relaxáciu hladkého svalu a je normálne prítomný v tkanivách dýchacích ciest, ako už bolo uvedené, bola postavená hypotéza, že je endogénnym mediátorom relaxácie bronchiálneho hladkého svalu [Dey

R. D. a Said S. I. Fed. Proc., 39, 1962 (1980)]. Potvrdilo sa, že tkanivá astmatických pacientov neobsahujú žiadny imunoreaktívny VIP, v porovnaní s tkanivami normálnych pacientov. To môže ukazovať na stratu VIP alebo VIP-ergických nervových vláken, spojenú s ochorením astmou [Ollerensahw S. a ďalšie New England J. Med., 320, 1244 -

- 1248 (1989)]. Pri skúšaní in vitro a in vivo sa ukázalo, že VIP relaxuje tracheálny hladký sval a poskytuje ochranu pred bronchokonstrikčnými činidlami, ako je histamín a prostaglandín F_2a [Wasserman M. A. a ďalšie Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. Said, red., Raven Press, N. Y., 1982, str. 177 - 184: Said S. I. a ďalšie Ann. N. Y. Acad. Sci., 221, 103 - 114 (1974)]. Pri intravenóznom podávaní poskytuje VIP ochranu proti bronchokonstrikčným činidlám, ako je histamín, prostaglandín F_2a, leukotriény, faktor, aktivujúci krvné doštičky, a proti bronchokonstrikciám, ktoré sú vyvolané antigénom [Said S. I. a ďalšie pozri Hoee (1982)]. Bolo tiež preukázané, že VIP inhibuje in vitro sekréciu slizu v tkanivách dýchacích ciest človeka [Coles S. J. a ďalšie, Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531 - 536 (1981)].

Pri podaní vo forme intravenóznej infúzie humánnym astmatickým pacientom spôsobuje VIP zvýšenie maximálneho prietoku pri výdychu a zaisťuje ochranu pred bronchokonstrikciou, vyvolanou histamínom [Morice A. H. a Sever P. S., Peptides, 7, 279 - 280 (1986); Morice A. a ďalšie, The Lancet, II 1225 - 1227 (1983)]. Pulmonáme účinky, pozorované pri tejto intravenóznej infúzii VIP, sú však sprevádzané kardiovaskulárnymi vedľajšími účinkami, najmä hypotenziou a tachykardiou a tiež sčervenaním tvare. Pri podávaní vo forme intravenóznych dávok, ktoré nespôsobovali kardiovaskulárne účinky, nebol VIP schopný meniť špecifickú priechodnosť dýchacích ciest [Palmer J. B. D. a ďalšie, Thorax, 41, 663 - 666 (1986)]. Chýbajúca účinnosť bola vysvetľovaná nízkou úrovňou podanej dávky a pravdepodobne rýchlou degradáciou zlúčeniny.

Pri podaní vo forme aerosólu človeku je natívny VIP len málo účinný pri ochrane proti bronchokonstrikcii, vyvolanej histamínom [Altieri a ďalšie, Pharmacologist, 25, 123 (1983)]. Bolo zistené, že VIP nemá podstatný účinok na základné parametre dýchacích ciest, ale naproti tomu vykazuje ochranný účinok proti bronchokonstrikcii, vyvolanej histamínom, pri inhalačnom podaní ľuďom [Bames P. J. a Dixon C/M. S., Am. Rev. Respir. Dis., 130, 162 - 166 (1984)]. Pri podávaní vo forme aerosólu VIP údajne nespôsobuje tachykardiu ani hypotenziu v spojení s bronchodilatáciou [Said S. I. a ďalšie Vasoactive Intestinal Peptide,

S. 1. Said. red., Raven Press, N. Y., 1928, str. 185 - 191].

S ohľadom na zaujímavé a potenciálne klinicky využiteľné biologické účinnosti VIP, stala sa táto látka cieľom niekoľkých publikovaných syntetických programov, ktorých cieľom bolo posilniť jednu alebo viaceré vlastností tejto molekuly. Takeyama a ďalšie publikovali analóg VIP, v ktorom je v polohe 8 kyselina aspartová nahradená kyselinou glutámovou. Bolo zistené, že táto látka je menej účinná ako natívny VIP [Chem. Pharm. Bull., 28, 2265 -

- 2269 (1980)]. Wendlberger a ďalšie opísali prípravu analógu VIP, v ktorom je v polohe 17 metionín nahradený norleucínom [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290 -

- 295 (1980)]. Bolo zistené, že tento peptid je rovnako účinný ako natívny VIP, pretože je schopný vytesňovať VIP, značený rádioizotopom jódu, z preparátov pečeňovej membrány. Watts a Wooton publikovali sériu lineárnych a cyklických fragmentov VIP, ktoré obsahujú 6 až 12 zvyškov natívnej sekvenete (EP 184 309, EP 325 044, US 4 73 7487 a US 4 866 039). Turner a ďalšie oznámili, že fragment

SK 279399 Β6

VIP (10 - 28) je antagonistom VIP [Peptides, 7, 849 - 854 (1986)]. Tiež pri substituovanom analógu [4-Cl-D-Phe⁶, Leu¹⁷]-VIP bolo zistené, že sa viaže k receptorom VIP a antagonizuje účinnosť VIP [Pandol S. a ďalšie, Gastrointest. Liver Physiol, 13, G553 - G557 (1986)]. Gozes a ďalšie oznámili, že analóg [Lys¹, Pro2) Arg³, Arg⁴, Pro⁵, Tyr6]-VIP je kompetitívnym inhibítorom VIP, ktorý sa viaže k jeho receptorom na gliových bunkách. [Endocrinology, 125, 2945 - 2949 (1989)]. Robberecht a ďalšie publikovali niekoľko analógov VIP s D-zvyškami, substituovanými v N-konci natívneho VIP [Peptides, 9, 339 - 345 (1988)]. Všetky tieto analógy sa viažu menej pevne k receptorom VIP a vykazujú nižšiu účinnosť ako natívny VIP pri c-AMP aktivácii. Tachibana a Ito publikovali niekoľko analógov VIP prekurzorovej molekuly v Peptide Chem., T. Shiba a S. Sakakibara, red., Prot. Res. Foundation, 1988, str. 481 - 486, JP 1 083 012, US 4 822 774], Bolo zistené, že tieto zlúčeniny sú raz- až trojnásobne silnejšie bronchodilatanty ako VIP a vykazujú raz- až dvojnásobne vyššiu úroveň hypotenznej účinnosti. Musso a ďalšie tiež publikovali nie-	R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny: X-His-Ser-Asp-Ala-V al-Phe-Thr-R_g-AÍp-Tyr-Ly s- (II) Leu-Atg-LysGln-R₁₇-AlarVal-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID No.: 4)Y] Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y, kde R₈ predstavuje Asp alebo Asn; R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr: X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny; n X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys-
koľko analógov VIP so substitúciami v polohách 6 - 7, 9 - 13, 15 - 17 a 19 - 28 [Biochemistry, 27, 8174 - 8181 (1988); EP 8 271 141, US 4 835 252], Pri týchto zlúčeninách bola zistená rovnaká alebo nižšia účinnosť ako pri VIP pri väzbe na receptory VIP a pri biologickej odpovedi. Bartfai a ďalšie publikovali sériu niekoľkonásobne substituovaných analógov [Lcu¹⁷]-VIP [W089/05 857].	Leu-Arg-Lys-Glu-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (III) Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y [X-(SEQ ID No.: 6)n kde R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₈ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr: X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminosku-
Podstata vynálezu	piny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny
Predmetom vynálezu sú cyklické vazoaktívne peptidové analógy. Pod označením „cyklický peptid“ sa rozumie peptid, v ktorom je karboxylový koniec v postrannom reťazci jednej aminokyseliny v peptidovom reťazci kovalentne viazaný k amínovému koncu postranného reťazca inej aminokyseliny v peptidovom reťazci, za vzniku amidovej väzby. Kovalentným spojením dvoch zvyškov aminokyselín v peptidovom reťazci vzniká kruhová štruktúra. Biologická účinnosť cyklických peptidov sa môže podstatne líšiť od účinnosti rodičovských lineárnych analógov. Cyklické peptidy sú z hľadiska konformácie rigidnejšie a obsahujú viac dobre definovaných štruktúr. Tieto zmeny sa odrážajú v biologickom profile cyklických peptidov. Cyklizácia peptidového analógu môže predĺžiť čas účinnosti peptidu vďaka zvýšenej rigidite, ktorá ho robí menej citlivý na chemickú a enzymatickú degradáciu. Tiež biologická dostupnosť cyklických peptidov sa môže zvýšiť vďaka zmenám fyzikálnych vlastností peptidu, ktoré sú dôsledkom spevnenia štruktúry. Dobre definovaný tvar cyklického peptidu môže tiež zvýšiť špecifickosť cieľového receptora, v porovnaní so špecifickosťou lineárneho peptidu a tým sa môže znížiť sklon k nežiaducim biologickým účinnostiam, ktoré sprevádzajú žiaducu účinnosť. Predmetom vynálezu je cyklický peptid, zvolený zo súboru analógov vazoaktívnych peptidov všeobecného vzorca (I)až(V)	X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-Gln-R\|₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (IV) Leu-Asp-Ser-R₂6-Leu-R₂₈-Y [X-(SEQ ID No.: 8)Y], kde R₁₂ predstavuje Arg alebo Lys; R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R_2S predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny; X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R₈-Asn-R₁₍₎-Thr-R₁₂i----------------------------------Leu-Arg-Lys-R₁₆-R₁₇-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂₂- (V) Leu-R₂4-Asp-R₂₆-R₂₇-R₂₈-Y [X-(SEQ ID No.: 10)Y] kde R, predstavuje His, N-CH₃-Ala; R₂ predstavuje Ser alebo Ala; R₆ predstavuje Q

h A

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R_g-Asn-Tyr-Thr-Ŕ₁₂- (I)	kde Q predstavuje nižší alkylcyklohexyl alebo nižší alkyla-
Leu-Aig-LysOln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID No.: 2)YJ	ryl; R_g predstavuje Asp, Glu alebo Ala; R_lo predstavuje Tyr alebo R<,; Ri₂ predstavuje Arg alebo Lys; R\|₆ predstavuje Gin alebo Ala; R₁₂ predstavuje Met, Nie alebo Ala; R₁₉
Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y,	predstavuje Val alebo Ala; R₂₂ predstavuje Tyr alebo R^ R₂4 predstavuje Asn alebo Ala; R₂6 predstavuje íle, Val a-
kde R₈ predstavuje Asp, Glu, alebo Lys; R₁₂ predstavuje Arg, Lys, Om alebo Asp; R_l7 predstavuje Met alebo Nie;	lebo Leu; R₂₇ predstavuje Leu alebo Lys: R₂₈ predstavuje Asn, Thr; alebo Lys; X predstavuje vodík alebo hydrolyzo-

SK 279399 Β6 vateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny alebo skupinu vzorca R29-R30-R31-Z, kde R₂₉ predstavuje Gly alebo Ala; R₃₀ predstavuje Gly alebo Ala; R₃₁ predstavuje Ala, Met, Cys(Acm) alebo Thr; Z predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli.

Predmetom vynálezu teda sú cyklické peptidy všeobecného vzorca (I)

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-Ri₂- (I)

Leu-Aig-LysGln-R₁₇-Ala-Va 1-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID No.: 2ý

Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y, kde R₈ predstavuje Asp, Glu, alebo Lys: R₁₂ predstavuje Arg, Lys, Om alebo Asp: R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny a ich farmaceutický vhodné soli.

Prednosť sa pritom venuje peptidom všeobecného vzorca

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Ŕ₈-Asn-Tyr-Thr-Ŕ₁₂Leu-Aig-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID No.: 3ý Y]

Leu-Asp-Ser-V al-Leu-Thr-Y, kde X a Y majú rovnaký význam ako vo všeobecnom vzorci (I)·

Predmetom vynálezu sú tiež cyklické peptidy všeobecného vzorca (II)

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asp-Tyr-Lys- (II)

Leu-Aig-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X4SEQ ID No.: 4ý Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y, kde R_s predstavuje Asp alebo Asn; R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny, a ich farmaceutický vhodné soli.

Prednosť sa pritom venuje peptidu všeobecného vzorca

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-LysLeu-Aig-LysGln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tvr- [X-(SEQ ID No.: 5ý Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y, kde X a Y majú rovnaký význam ako vo všeobecnom vzorci (II).

Predmetom vynálezu sú tiež cyklické peptidy všeobecného vzorca (III)

ΓΊ

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (III)

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y [X-(SEQ ID No.: 6)Y]>

kde R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₃ predstavuje íle alebo Val; R_2s predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny a ich farmaceutický vhodné soli.

Prednosť sa pritom venuje peptidu všeobecného vzorca

Γ“Ι

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys1

Leu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y [X-(SEQ ID No.: 7)Y], kde X a Y majú rovnaký význam ako vo všeobecnom vzorci (III).

Predmetom vynálezu sú tiež cyklické peptidy všeobecného vzorca (IV)

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (IV)

I

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y [X-(SEQ ID No.: 8)Y], kde R₁₂ predstavuje Arg alebo Lys; R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny a ich farmaceutický vhodné soli.

Prednostnými peptidmi tohto typu sú peptidy vzorca

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y [X- ( SEQ ID No.: 9) Y], kde X a Y majú rovnaký význam ako vo všeobecnom vzorci (IV).

Predmetom vynálezu sú tiež cyklické peptidy všeobecného vzorca (V)

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R₈-Asn-R_]0-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-Ri₆-R₁₇-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R₂₂- (V)

Leu-R₂₄-Asp-R₂₆-R₂₇-R₂g-Y [X-(SEQ ID No.: 10)Y], kde R, predstavuje His, N-CH₃-Ala; R₂ predstavuje Ser alebo Ala; R6 predstavuje

kde Q predstavuje nižší alkylcyklohexyl alebo nižší alkylaryl; R_K predstavuje Asp, Glu alebo Ala; R₁₍₎ predstavuje Tyr alebo R₆; R₁₂ predstavuje Arg alebo Lys; R₁₆ predstavuje Gin alebo Ala; R_]7 predstavuje Met, Nie alebo Ala; R₁₉predstavuje Val alebo Ala; R₂₂ predstavuje Tyr alebo R₆; R₂₄ predstavuje Asn alebo Ala; R₂₆ predstavuje íle, Val alebo Leu; R₂₇ predstavuje Leu alebo Lys; R₂₈ predstavuje Asn, Thr alebo Lys; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny alebo skupinu vzorca R₂₉-R₃₀-R₃i-Z, kde R₂₉ predstavuje Gly alebo Ala; R₃₁ predstavuje Gly alebo Ala: R₃₁ predstavuje Ala, Met, Cys(Acm) alebo Thr; Z predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny a ich farmaceutický vhodné soli.

Symbol Q predstavuje prednostne skupinu vzorca í¹ -CH, kde n predstavuje číslo 1 alebo 2 a každý zo symbolov Xi a X₂ nezávisle predstavuje vodík alebo skupinu vzorca OH, 0CH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO_2j CH₂, N(CH₃)2, NHC0CH₃, NHCOC₆H₅ alebo C(CH₃)₃.

Výhodne predstavuje Q benzyl, p-fluórbenzyl, p-aminobezyl, p-hydroxybenzyl, o-metyl, 1-metylnaftyl alebo 2-metylnaňyl. Najvýhodnejšie predstavuje Q benzyl.

Prednostnými peptidmi sú peptidy všeobecných vzorcov:

X*RvR2'AsPAla*VäkR^“Thr-Rg’Asn*Rio*Thr*R|2·

X-Rt-Az-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Ra-Mn-Ruj-Thr-RuLeu-Arg-LyS’R₁₆’Ri7-Ala-Ri9-Lys-Lys-fl2r

Leu-RírAsp-Leu-Lys-Ľys-Y [X-(SEQ ID NO:16)-Y]

X-RpRj-Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Re'Asn-RiQ-Thr-Lys·

Leu-Arg-LyS’RirAla-Ala-Ala-Lys-Lys-Rzž·

Leu-R₂4-Asp-Leu-lys-Lys-Y

X-Ri-Rz-Asp-Ala-VaľRg-Tlir-Ra-Asn-Ru/rfir-LysLeu-Arg-Lys-Rte-NIe-Ala-Rw-Lys-Lys-Rar

Leu-RarAsp-LeU’Lys-Lys-Y [X-(SEQ ID NO:17)-Y] [X-(SEQ IC NO:L8)-Y]

X-RrR^Asp-Ala-Val-Re-Oír-Re-Asn-Rjo-Thr-ĽysLeu-Arg-Lys-Rie-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-Rar

CX-(S£Q ID N0:L9)-Yj

Ľeu-fl24-Asp-Leu-ly5-Lys-Y

X-Ri-Rz'Asp-Ala-Val’Re-Thr-Rj-Asn-RjQ'Thr-LysĽeu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-Rj^

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SZQ ID N0:70-Y]

Leu-Arg-Lys-Rie-RirAla-Rig-Lys-LyS’R22·	[X-(SEQ ID NO;11)-Y]
1 Leu-R24-Asj>Val’R2rThr«Y
X-Rj-R^Asp-Ala-Val-Rg-Ihr-Rg-Asn-Rjo-Thr-Ri^
1 Leu-Arg-Lys-Rje-NIe-AJa-Rja-Lys-Lys-Rgj-	[X-(SEQ ID NO:12)-Y]
1 “ Leu-R24-Asp-Val-R27-Th^r'Y
X-RrR2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-Rio-Tlv-Leu-
I Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-A]a’Lys-Lys-R22-	[X-(SEQ ID NO:13)-Y]
I Leu-R2<Asp-Val-R27“71ir-Y
X-RrRj-Asp-Ala-Val-Re-TtU'Rg-Asn-Rig-Thr-Lys·
1 Leu-Arg-Lys-Ri6’Nle-Ala-Ri9-Lys-Lys-R22·	(X-(SEQ ID N0:14)-Y]
1 Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y
X-R₁-R2-Asp-Ala*Val-R5-Thr-R_B-Asn-R₁o-T?ir-Lys-
1 Lsu’Arg'ĽyS’RiG-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22-	[X-(SEQ ID NO:13)-Yj

Leu-R24-Asp-Val-R27-TDr-Y

X-R₁-Ser-Asp-Ala-Val-R€-Thr-R₉-Asn-R_lc-'rbr-LysLeu-Aig-Lys-Gin-Nie-Ala-Aia-LyS’lys-Rsr

Leu'R24-A5p-LeU’Lys-Lys-Y [X-SEQ ID No:71-Y)

X-RvAla-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Ra-Asn-Rto-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-Rír I

Leu-R2*-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Rj-RrAsp-Ala-Val-Re-Thr-Re-Asa-Rjo-Thľ-Lys1—

Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Rjr

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Ly$-Y [X-SEQ ID NO:72-Y] [X-SEQ ID NO:73-Y] kde X, Y, Ri, R2, Re» Rg, Rio, Rn, Ri6, Rn, R19, R22, R24 a R₂₇ majú rovnaký význam ako vo všeobecnom vzorci (V).

Najvýhodnejší cyklický peptid podľa vynálezu má štruktúru Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thŕ’j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 52)-NHJ.

Peptidy podľa vynálezu poskytujú predĺženú relaxáciu tracheobronchiálneho hladkého svalu bez kardiovaskulárnych vedľajších účinkov, a preto sú účinné pri liečbe bronchokonstrikčných porúch, ako je astma.

Predmetom vynálezu sú nové analógy vazoaktívneho intestinálneho peptidu (VIP), ktoré vykazujú zvýšenú a predĺženú bronchodilatačnú aktivitu, bez toho, aby mali pozorovateľné vedľajšie účinky.

SK 279399 Β6

Pod označením „nižší alkyl“ sa v tomto opise rozumejú alifatické uhľovodíkové skupiny s priamym alebo rozvetveným reťazcom, ktoré obsahujú 1 až 6 atómov uhlíka. Prednostnou nižšou alkylskupinou je metyl.

Pod označením „aryl“ sa v tomto opise rozumejú jednojadrové aromatické uhľovodíkové skupiny, ako je fenyl, ktoré môžu byt nesubstituované alebo substituované v jednej alebo viacerých polohách nižšou alkylskupinou, nižšou alkoxyskupinou, aminoskupinou, nitroskupinou, mono- alebo di-nižšou alkylaminoskupinou, nižšou alkylamidoskupinou alebo fenylamidoskupinou. Pod označením „aryl“ sa tiež rozumejú viacjadrové arylové skupiny, ako je naftyl, ktoré sú prípadne substituované jedným alebo viacerými z uvedených zvyškov. Prednostnou arylskupinou je fenyl, ktorý je prípadne substituovaný jedným atómom fluóru, alebo nesubstituovaný naftyl.

Symbolom X je v tomto opise označovaný substituent na amínickom dusíku amino-terminálnej aminokyseliny a symbolom Y substituent na karbonylovej skupine karboxyterminálnej aminokyseliny. X môže predstavovať atóm vodíka alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny. Y môže predstavovať hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny.

Ako „hydrolyzovateľné chrániace skupiny aminoskupiny“ a „hydrolyzovateľné chrániace skupiny karboxyskupiny“ sa môžu používať akékoľvek konvenčné chrániace skupiny, ktoré je možné odštepovať hydrolýzou. Ako príklady takých skupín, ktoré je možné podľa vynálezu použiť, je možné uviesť nasledujúce skupiny.

Prednostnými chrániacimi skupinami aminoskupiny sú skupiny vzorca o o

kde X₃ predstavuje nižšiu alkylskupinu alebo halogenovanú nižšiu alkylskupinu. Z týchto chrániacich skupín sa venuje prednosť najmä skupinám, v ktorých X₃ predstavuje alkylskupinu s 1 až 3 atómami uhlíka alebo halogénalkylskupinu s 1 až 3 atómami uhlíka.

Prednostnými chrániacimi skupinami karboxyskupiny sú skupiny nižších alkylesterov, skupina NII₂ a skupiny nižších alkylamidov. Prednosť sa venuje najmä alkylesterovým skupinám s 1 až 3 atómami uhlíka, skupine NH₂ a alkylamidovým skupinám s 1 až 3 atómami uhlíka.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob výroby definovaných peptidov, farmaceutické prípravky na báze týchto peptidov a použitie týchto peptidov v kombinácii s netoxickým inertným terapeuticky vhodným nosičom na liečbu bronchotracheálnych konštrikčných porúch.

Spôsob výroby cyklických polypeptidov podľa vynálezu sa vyznačuje tým, že sa

a) chránený peptid so zodpovedajúcou sekvenciou aminokyselín, ktotý je viazaný k živici, selektívne zbaví chrániacich skupín za vzniku voľnej aminoskupiny v postrannom reťazci a voľné karboxyskupiny v postrannom reťazci;

b) voľná aminoskupina v postrannom reťazci a voľná karboxyskupina v postrannom reťazci sa spoja kovalentnou väzbou pri použití vhodného amidotvorného činidla a

c) cyklizovaný peptid sa zbaví chrániacich skupín a odštiepi od živice pri použití vhodného deprotekčného a štepiaceho činidla, prípadne v prítomnosti ďalších vhodných prísad, ako sú látky zachytávajúce katióny, a získaný cyklický peptid sa prípadne premení na farmaceutický vhodnú soľ.

Predmetom vynálezu je tiež použitie týchto cyklických peptidov pri výrobe farmaceutického prípravku, ktorý sa hodí na liečbu bronchotracheálnych konštrikčných porúch.

V tomto opise sa používa bežné názvoslovie z odboru peptidov, pri ktorom sa aminoskupina na N-konci znázorňuje naľavo a karboxyskupina na C-konci napravo. Pod pojmom „prírodné aminokyseliny“ sa rozumejú aminokyseliny, ktoré sa vyskytujú v prírodných proteínoch, tzn. Gly, Ala, Val, Leu, Íle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Ak sa môže aminokyselina vyskytovať v izomémych formách, rozumie sa, že znázornená aminokyselina je v L-forme, ak to nie je výslovne uvedené inak.

Okrem uvedených skratiek sa v tomto opise na označenie aminokyselín, chrániacich skupín, rozpúšťadiel, reakčných činidiel a pod. používajú nasledujúce skratky:

symbol	význam
Ac	acetyl
Om	Omitín
Nie	norleucín
Fmoc	9-fluórenylmetyloxykarbonyl
Fm	9-fluórenylmetyl
Boe	t-butyloxykarbonyl
Bom	benzyloxymetyl
CH₂C1₂	metylénchlorid
CH₃CN	acetonitril
DMF	dimetylformamid
DIPEA	N,N-diizopropyletylamín
TFA	trifluóroctová kyselina
HOBT	N-hydroxybenzotriazol
DCC	N,N'-dicyklohexylkarbodiimid
DIC	N,N'-diizopropykarbodiimid
BOP	benzotriazol-1 -yloxy-tri(dimetylamino) fosfóniumhexafluórfosfát

N-Me-Ala

2-Nal p-F-Phe

FAB-MS = hmotnostná spektrometria „Fast Atóm Bombardment“

Analógy natívnej peptidovej sekvencie VIP sa označujú tak, že sa pred označením „VIP“ uvedie v zátvorkách nahradená aminokyselina. Derivatizácia N-terminálnej aminoskupiny, tzn. derivatizácia, ktorá sa prejavuje vo význame symbolu X, je označovaná naľavo od substitúcií, vyznačených v zátvorkách. Sekvenčné čísla, ktoré sú uvedené v zátvorkách napravo od označenia „VIP“, označujú delécie a adície aminokyselín a uvádzajú sa vzhľadom na číslovanie natívnej sekvencie. Tak napríklad, Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Gly²⁹]-VlP(l-29)-NH₂ označuje polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín zodpovedá sekvencii natívneho humánneho VIP, v ktorej však bol acetylskupinou nahradený atóm vodíka na N-konci, lyzínom bol nahradený arginín v polohe 12 a norleucínom bol nahradený metionín v polohe 17. Okrem toho, karboxyskupina asparagínu v polohe 28 bola kondenzovaná s giycínom za vzniku polohy 29. Označenie ,-OH“ a ,,-NH₂“, ktoré nasleduje po výrazu „VIP“ alebo po výraze v zátvorkách, sa vzťahuje na voľnú kyselinovú alebo amidovú formu polypeptidu. V prípade, že tieto označenia chýbajú, rozumie sa, že výraz zahŕňa obidve tieto formy.

Ako už bolo uvedené, cyklickým peptidom podľa vynálezu je peptid, v ktorom je karboxy-koniec jednej aminokyseliny v postrannom reťazci peptidu kovalentne viazaný k amino-koncu inej aminokyseliny v postrannom reťazci peptidu za vzniku amidovej väzby. Na znázornenie cyklického peptidu sa používa niekoľko názvoslovných variantov a niekoľko symbolov. Ich príklady sú uvedené ďalej.

Ac-His-Ser-Asp-AIa-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-V at-Lys-Lys-T yr- a

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH[Ac-(SEQ ID No.: 20)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (8 12) b.

[Ac-(SEQ IDNo.: 20)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thď'l-VIP cyklo (Asp⁸-» Lys¹²) c.

[Ac-(SEQ ID No.: 20)-NH₂]

Tri uvedené štruktúry (a - c) a sprievodná reprezentácia, používajúca identifikačné číslo sekvencie (SEQ ID No.:) a odvolávajúca sa na ďalej uvedený zoznam sekvencií, všetky predstavujú a definujú rovnaký polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín zodpovedá sekvencií natívneho humánneho VIP, v ktorej však bol atóm vodíka na N-konci substituovaný acetylskupinou, v polohe 12 bol arginín nahradený lyzínom, v polohe 17 bol metionín nahradený norleucínom, v polohe 26 bol izoleucín nahradený valínom a v polohe 28 bol asparagín nahradený treonínom. Okrem toho bola medzi postrannou karboxyskupinou aspartovej kyseliny v polohe 8 a postrannou aminoskupinou lyzínu v polohe 12 vytvorená amidová väzba za vzniku cyklického peptidového analógu. Uvedené reprezentácie štruktúry peptidu sa považujú za ekvivalentné a vzájomne zameniteľné.

Označenie „R_n“ aminokyseliny v polohe n v jednej z uvedených štruktúr a označenie „Xaa“ aminokyseliny v polohe n v zodpovedajúcej sekvencií v zozname sekvencií, uvedenom ďalej, sú ekvivalentné a vzájomne zameniteľné v tých prípadoch, kedy Xaa predstavuje výber z dvoch alebo viacerých aminokyselín.

V cyklických peptidoch podľa vynálezu platí nasledujúca konfigurácia, ak to nie je uvedené inak:

Aminokyselina v reťazci Viazaný koniec aminokyseliny na vytvorenie cyklického peptidu

Lys

ORn

Asp

Glu ε-amino (ε = epsilon) δ-amino (δ = delta) β-karboxy (β = beta) γ-karboxy (y = gama)

Reprezentatívne zlúčeniny podľa vynálezu zahŕňajú peptidy s nasledujúcimi sekvenciami aminokyselín:

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²’]-VIP cyklo (Asp⁸Lys¹²) [Ac-(SEQ IDNo.: 20)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie, Val²⁶, Thr”|-VIP cyklo (Glu⁸-» Lys¹²) [Ac-(SEQ IDNo.: 21)-NH₂]

Ac-[Asn⁸, Asp’, Lys¹², Nie, Val²⁶, Thďj-VlP cyklo (Asp’-»Lys¹²) [Ac-(SEQ IDNo.: 22)-NH₂]

Ac-[ORn¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thŕ’j-VIP cyklo (Asp⁸-»ORn¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 23)-NH₂]

Ac-[Lys⁸, Asp¹², Nie¹², Val²⁶, Thr“]-VIP cyklo (Lys⁸ -» Asp¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 24)-NH₂]

Ac-[Glu^s, ORn¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸-»ORn¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 25)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Glu¹⁶, Nie, Val²⁶, Thr^2B]-VIP cyklo (Lys¹²-»Glu¹⁶) [Ac-(SEQ IDNo.: 26)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie, Asp²⁴, Val²⁶', Thr“]-VIP cyklo (Lys²⁰.-» Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID No.: 27)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie, Asp²⁵, Val²⁶, Th^j-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 28)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nlc¹⁷, Ala¹’, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^J-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:29)-NHJ

Ac-[p-F-Phe⁶, 2-Nal¹, Lys¹² Nie, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸, Gly²’ ^M, Meť'J-VIP evklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 30)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, ORn¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, ΤΤιΡΊ-νίΡ cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 31)-NHí]

Ac-[P-F-Phe⁶, Lys¹², Nie, Ala¹’, Asp²⁵, Val“, Thr²⁸

Gly²’·³⁰, Cys(Acm)³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 32)-NHJ

Ac-[Ala², Lys¹², Nie, Ala¹’, Asp²⁵, Val²⁶, ThE’j-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp”) [Ac-(SEQ ID No.:33)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala‘, Lys¹², Nie, Ala¹’, Asp²⁵, Val²⁶, Thŕ⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 34)-NH₂]

Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹², Nie¹⁷, Ala¹’, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^J-VIP cyklo (Lys²¹-» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 35)-NH₂]

Ac-fO-Cft-Tyr¹⁰, Leu¹², Nie, Ala¹’, .Asp²⁵, Val²⁶, Thr⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo : 36)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH₂-Phe‘°, Leu, Nie¹⁷, Ala¹’, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp”) [Ac-(SEQ IDNo.: 37)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie¹’, Ala¹’. Asp²⁵, Leu“, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-( SEQ ID No.: 38)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala‘, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹’, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-» Asp²⁵).

[Ac-(SEQ IDNo.: 39)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nlc, Ala¹’, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 40)-NH₂]

Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nie, Ala¹’, Asp”, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -v Asp²⁵).

[Ac-(SEQ IDNo.: 41)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹’, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸· Ala²⁹'³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 42)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸, Ala²⁹'³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-( SEQIDNo.: 43)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala‘, Glu⁸, Lys¹², Nie, Ala¹’, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-» Asp”) [Ac-(SEQ IDNo.:44)-NH₂],

Ac-fp-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu“, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 45)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 46)-NH_ľ]

Ac-[Glu⁸, p-NH₂-Phe¹⁰ Lys¹², Nie¹⁷, Ala, Asp²⁵ Leu“ Lys²⁷' ^-V1P cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:47)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, O-CH₃-Tyr', Lys, Nie, Ala, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 48)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val“, Thr²⁸]-VIP cyklo

Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 49)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nie”, Ala”, Asp²⁵, Val²⁶, Thrí’j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-( SEQ ID No.: 50)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹’, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹·³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-( SEQID No.: 51)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly²⁹'³⁰, Thr³']-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 52)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQID No.: 53)-NH₂]

Ac-[p-NF2-Phe¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶ Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.: 54)-NH,] Ac-[Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, m-OCHj-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 55)-NH₂] Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Tht^J-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ 1D No.: 56)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala”, m-OCHj-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 57)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala”, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 58)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Ala24, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 59)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶· ”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 60)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nie”, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²ⁱ]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 61)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶· ”· ”, Ala²⁴, Asp²³, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 62)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶,Nie”, Ala”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'28J-VIP cyklo (Lys²¹ Asp²³) [Ac-(SEQ IDNo.: 63)-NH₂] Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶· ”' ”, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 64)-NHJ

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala”, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹·³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys 21 -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 65)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²’'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-( SEQ IDNo.: 66)-NH₂]

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28, Gly²’·³⁰, Thr^3l]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:67)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸, Gly²⁹·³⁰, Thr³¹ -VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-( SEQID No.: 68)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Ala^2M1]-VIP cyklo (Lys²¹-> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 69)-NH₂]

Zlúčeniny podľa vynálezu je možné ľahko syntetizovať akýmkoľvek konvenčným postupom, ktorý sa hodí na tvorbu peptidovej väzby medzi aminokyselinami. Také konvenčné postupy zahŕňajú napríklad všetky postupy vykonávané v roztoku, ktoré umožňujú kondenzáciu voľnej a-aminoskupiny aminokyseliny alebo jej zvyšku, v ktorej alebo v ktorom je karboxyskupina alebo iná reaktívna skupina chránená, s voľnou primárnou karboxyskupinou inej aminokyseliny alebo jej zvyšku, v ktorej alebo v ktorom je aminoskupina alebo iná reaktívna skupina chránená.

Spôsob syntézy zlúčenín podľa tohto vynálezu sa môže uskutočňovať postupom, pri ktorom sa každá aminokyselina v požadovanom slede pridáva po jednej postupne k inej aminokyseline alebo jej zvyšku alebo postupom, pri ktorom sa najskôr konvenčným spôsobom syntetizujú peptidové fragmenty s požadovanou sekvenciou aminokyselín, a potom sa tieto fragmenty kondenzujú za vzniku požadovaného peptidu.

Také konvenčné postupy syntetizácie nových zlúčenín podľa vynálezu zahŕňajú tiež napríklad všetky postupy syntézy peptidov vykonávané v pevnej fáze. Pri takých postupoch sa nové zlúčeniny podľa vynálezu môžu syntetizovať tak, že sa k rastúcemu peptidovému reťazcu postupne, po jednom, viažu požadované zvyšky aminokyselín, v súlade s všeobecnými princípmi metód syntézy v pevnej fáze [Merrifield R. B., J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 - 2154 (1963); Barany a ďalšie, The Peptides, Análysis, Synthesis and Biology, zv. 2, Gross E. a Meinhofer J. vyd. Academic Press 1 - 284 (1980)].

Pre rôzne chemické spôsoby syntézy peptidov je spoločná ochrana postranných reaktívnych skupín rôznych zvyškov aminokyselín vhodnými chrániacimi skupinami, ktoré zabraňujú aby na týchto miestach prebehla chemická reakcia, kým nie sú tieto chrániace skupiny nakoniec odstránené. Obvyklá je tiež ochrana α-aminoskupiny na aminokyseline alebo jej fragmente v priebehu reakcie tejto kyseliny alebo fragmentu, ktorá prebieha na karboxylovej skupine. Po nej nasleduje selektívne odstránenie chrániacej skupiny α-aminoskupiny, čím sa umožní, aby nasledujúca reakcia prebiehala na tomto mieste. Pri postupoch, vykonávaných syntézou v pevnej fáze, boli síce publikované špecifické chrániace skupiny, je však potrebné zdôrazniť, že každá aminokyselina môže byť chránená chrániacou skupinou bežne používanou pri tejto aminokyseline pri syntetických postupoch, robených v roztokovej fáze.

α-aminoskupiny sa môžu chrániť vhodnými chrániacimi skupinami, ktoré sú zvolené zo súboru, zahŕňajúceho chrániace skupiny, ktoré vytvárajú s aminoskupinou zoskupenie typu aromatického uretánu, ako je benzyloxykarbonyl (Z) a substituovaný benzyloxykarbonyl, ako je p-chlórbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brómbenzyloxykarbonyl, p-bifenylizopropyloxykarbonyl, 9-fluórenylmetyloxykarbonyl (Fmoc) a p-metoxybenzyloxykarbonyl (Moz); chrániacej skupiny typu alifatického uretánu, ako je terc, butyloxykarbonyl (Boe), diizopropylmetyloxykarbonyl, izopropyloxykarbonyl a alyloxykarbonyl. Z chrániacich skupín α-aminoskupiny sa najväčšia prednosť venuje Boe.

Karboxylové skupiny môžu byť chránené vhodnou chrániacou skupinou, ktorá je zvolená zo súboru aromatických esterových skupín, ako je benzylesterová (OBzl) alebo benzylesterová skupina, substituovaná nižšou alkylskupinou, halogénom, nitroskupinou, tioskupinou alebo substituovanou tioskupinou, napríklad alkyltioskupinou obsahujúcou 1 až 7 atómov uhlíka v alkylovom reťazci; alifatických esterových skupín, ako je nižšia alkylesterová, terc.butylesterová (Ot-Bu), cyklopentylesterová, cyklohexylesterová (OcHx), cyklopentylesterová a 9-fluórenylmetylesterová skupina (OFm). Pri glutámovej kyseline (Glu) sa najväčšia prednosť venuje skupine OBzl a OFm a pri aspartovej kyseline (Asp) sa venuje najväčšia prednosť skupine OChx, OBzl a OFm.

Hydroxylové skupiny môžu byť chránené vhodnou chrániacou skupinou, ktorá je zvolená zo súboru skupín, ktoré s hydroxyskupinou vytvárajú éterové zoskupenie, ako je napríklad benzyl (Bzl) alebo benzyl, substituovaný nižšou alkylskupinou, halogénom [ako je 2,6-dichlórbenzyl (DCB)], nitroskupinou alebo metoxyskupinou; terc.butyl (t-Bu), tetrahydropyranyl a trifenylmetyl (trityl). Pri seríne (Ser) a treoníne (Thr) sa venuje najväčšia prednosť skupine

Bzl a pri tyrozíne (Tyr) sa venuje najväčšia prednosť skupinám Bzl a DCB.

Postranné aminoskupiny je možné chrániť vhodnými chrániacimi skupinami, ktoré sú zvolené zo súboru zahŕňajúceho chrániace skupiny, ktoré s aminoskupinou vytvárajú zoskupenie typu aromatického uretánu, ako je benzyloxykarbonyl (Z) a substituovaný benzyloxykarbonyl, ako je p-chlórbenzyloxykarbonyl, 2-chlórbenzyloxykarbonyl (2-C1-Z), p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brómbenzyloxykarbonyl, p-bifenylizopropyloxykarbonyl, 9-fluórenylmetyloxykarbonyl (Fmoc) a p-metoxybenzyloxykarbonyl (Moz); alebo zoskupenie typu alifatického uretánu, ako je terc.butyloxykarbonyl (Boe), diizopropylmetyloxykarbonyl, izopropyloxykarbonyl a alyloxykarbonyl. Pri omitíne (Om) sa venuje najväčšia prednosť skupine Z a pri lyzine (Lys) sa venuje najväčšia prednosť skupine 2-C1-Z a Fmoc.

Guanidinoskupiny môžu byť chránené vhodnou chrániacou skupinou, ktorá je zvolená zo súboru zahŕňajúceho nitro, p-toluénsulfonyl (Tos), Z, adamantyloxykarbonyl a Boe. Pri arginíne (Arg) sa venuje najväčšia prednosť skupine Tos.

Postranné amidoskupiny môžu byť chránené xantylovou skupinou (Xan). Pri asparagíne (Asn) a glutamíne (Gin) sa prednostne nepoužíva žiadna ochrana.

Imidazolové skupiny môžu byť chránené vhodnou chrániacou skupinou, zvolenou zo súboru zahŕňajúceho p-toluénsulfonyl (Tos), 9-fluórenylmetyloxykarbonyl (Fmoc), trifenylmetyl (trityl), 2,4-dinitrofenyl (Dnp), Boe a benzyloxymetyl (Bom). Pri histidíne sa venuje najväčšia prednosť skupinám Tos a Bom.

Ak to nie je uvedené inak, sú percentuálne údaje pri pevných látkach v pevných zmesiach uvádzané v percentách hmotnostných, pri kvapalných látkach v kvapalných zmesiach v percentách objemových a pri pevných látkach v kvapalných zmesiach v percentách „hmotnosť/objem“, ktoré po vynásobení faktorom 10 zodpovedajú koncentračným údajom „gram/liter“. Ak to nie je uvedené inak, rozumie sa tiež, že dodávatelia reakčných činidiel a prístrojov, ktorí sú uvedení ďalej, nie sú obligatórni a odborníci v tomto odbore si môžu zvoliť obdobné reakčné činidlá alebo prístroje od iných dodávateľov.

Všetky rozpúšťadlá, tzn. izopropylalkohol (iPrOH), metylénchlorid (CH₂C1₂) a dimetylformamid (DMF) boli zakúpené od firmy Fisher alebo Burdick & Jackson a boli používané bez prídavnej destilácie. Kyselina trifluóroctová bola zakúpená od firmy Halocarbon a bola používaná bez ďalšieho čistenia. Diizopropyletylamín (DIPEA) bol zakúpený od firmy Pfaltz a Bauer a pred použitím bol predestilovaný v prítomnosti oxidu vápenatého a ninhydrínu. Dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a diizopropylkarbodiimid (DIC) boli zakúpené od firmy Fluka a boli používané bez ďalšieho čistenia. Hydroxybcnzotriazol (HOBT) a 1,2-etánditiol (EDT) boli zakúpené od firmy Sigma Chemical Co. a boli používané bez ďalšieho čistenia. Chránené aminokyseliny boli všeobecne v konfigurácii L a boli zakúpené od firmy Chemical Dynamics Corp. alebo Bachem. Čistota týchto látok bola pred použitím potvrdená chromatografiou na tenkej vrstve, NMR a teplotou topenia. Zlúčeniny Boc-O-Me-Tyr, Boc-2-Nal a Boc-p-F-Phe boli pripravené podľa citácie Bolin D. R., US patentová prihláška č. 374 503. Zlúčeniny Boc-Asp(OFm) a Boc-Glu(OFm) boli pripravené podľa citácie Bolin D. R. a ďalšie, Org. Prep. Proc. Int., 21, 67 - 74 (1989). Benzhydrylaminová živica (BHA) je kopolymérom styrénu s 1 % divinylbenzénu (zrnenie 100 až 200 alebo 200 až 400 mesh, tzn. 75 až 150 alebo 38 až 75 pm) a bola zakúpená od firmy Biomega, Bachem, Omni alebo Advanced Chemtech. Celkový obsah dusíka v týchto živiciach bol obyčajne v rozmedzí od 0,3 do 1,2 mekv./g.

Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) bola vykonávaná na sklenených doskách s nánosom silikagélu (dosky 60 F254 od firmy Merck) pri použití vhodných rozpúšťadlových systémov. Detekcia zlúčenín bola uskutočnená pomocou UV-fluorescencie (absorpcia pri 254 nm), farbenie jódom alebo postrekom ninhydrínom (v prípade primárnych a sekundárnych amínov).

Pri analýze zloženia aminokyselín sa peptidy hydrolyzujú v 6N kyseline chlorovodíkovej, obsahujúcej 1 až 4 mg fenolu, pri teplote 115 °C, počas 22 až 24 hodín, v uzatvorenej evakuovanej hydrolytickej rúre. Analýzy sa vykonávajú buď pri použití analyzátoru aminokyselín Beckman 12IM, alebo analytického systému pre aminokyseliny na báze HPLC (Waters), pričom sa používa buď živica Waters Cat Ex, alebo stĺpce Pierce AA511 a ninhydrínová detekcia.

Vysoko výkonná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa robí pri použití zariadenia LDC, ktoré obsahuje čerpadlá Constametric I a III, programovacieho zariadenia na riadené zloženie rozpúšťadla Gradient Master a mixéru a detektoru s meniteľnou vlnovou dĺžkou UV žiarenia Spectromonitor III. Analytická HPLC sa vykonáva na reverznej fáze pri použití stĺpcov Waters pBondapak C₁₈ (0,4 x 30 cm). Preparatívne separácie pomocou HPLC sa vykonávajú na kolónach Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 (2 x 25 cm alebo 2 x 50 cm), ktoré sú opatrené predkolónou Waters Guard-Pak C₁₈. Gélová chromatografia sa vykonáva na kolóne s rozmermi 2 x 85 cm pri použití peristaltického čerpadla LKB varioperpex a detektora s meniteľnou vlnovou dĺžkou UV žiarenia (IBM).

Peptidy sa prednostne pripravujú syntetickým postupom v pevnej fáze pri použití metódy, ktorú všeobecne opísal Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), i keď je možné použiť, ako bolo uvedené, iné ekvivalentné syntetické metódy, ktoré sú známe v tomto odbore. Syntéza v pevnej fáze sa zahajuje na C-konci peptidu kondenzáciou chránenej α-aminokyseliny s vhodnou živicou. Takú východiskovú látku je možné pripraviť pripojením ct-aminochránenej aminokyseliny esterovou väzbou k chlórmetylovanej živici alebo hydroxymetylovanej živici alebo amidovou väzbou k benzhydrylaminovej živici (BHA) alebo pmctylbenzhydrylamínovej živici (MBHA). Príprava hydroxymetylovanej živice je dobre známa v tomto odbore. Chlórmetylované živice sú obchodne dostupné a ich výroba je v tomto odbore tiež dobre známa. Nosičové živice BHA a MBHA sú obchodne dostupné a obyčajne sa používajú, keď má požadovaný syntetizovaný peptid na C-konci skupinu nesubstituovaného amidu.

Prvá aminokyselina, ktorá sa má kondenzovať s živicou BHA, sa obyčajne pridáva vo forme symetrického anhydridu Boc-aminokyseliny pri použití dvoch až desiatich ekvivalentov aktivovanej aminokyseliny na ekvivalent dusíka živice. Po kondenzácii sa živica premyje a za vákua vysuší. Zakotvenie aminokyseliny na živici sa môže stanoviť analýzou alikvotnej vzorky Boc-aminokyselina-živica na aminokyselinu. Stupeň naviazania aminokyseliny na živicu predstavuje obyčajne 0,2 až 0,4 mmol/g. Všetky nezreagované aminoskupiny je možné blokovať reakciou živice s acetanhydridom a diizopropyletylamínom v metylénchloride.

Po adícii Boc-aminokyseliny sa živica podrobí niekoľkým opakovaným cyklom, pri ktorých sa postupne adujú aminokyseliny. Chrániaca skupina Boe α-aminoskupiny sa odstráni za kyslých podmienok. Na tento účel sa môže použiť kyselina trifluoroctová (TFA) v metylénchloride, kyselina chlorovodíková v dioxáne alebo zmes kyseliny mravčej s kyselinou octovou. Prednostne sa používa roztok kyseliny trifluoroctovej v metylénchloride s koncentráciou 50 % objemových. Tento roztok môže tiež obsahovať 1 až 5 % objemových EDT alebo dimetylsulfidu, ako látky, zachytávajúcej terc, butylkarbóniové ióny. Môžu sa tiež použiť iné štandardné štiepiace činidlá, ktorá sú známe v tomto odbore.

Po odstránení chrániacej skupiny cc-aminoskupiny sa postupne kondenzáciou pripojujú ďalšie chránené aminokyseliny v požadovanom poradí, aby sa získal medziprodukt, ktorým je kondenzačný produkt chráneného peptidu a živice. Aktivačné činidlá, ktoré sa používajú pri kondenzácii aminokyselín syntetickým postupom výroby peptidov v pevnej fáze, sú dobre známe v tomto odboru. Ako vhodné reakčné činidlá na také syntézy je napríklad možné použiť benzotriazol-1 -yloxytri(dimetylamino)fosfóniumhexafluórfosfát (BOP), dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a diizopropylkarbodiimid (D1C). Prednostne sa používa DCC a D1C. Iné aktivačné činidlá, ktoré je možné použiť, sú opísané v citácii Barany a Merrifield, The Peptidcs, zv. 2, J. Meienhofer, vyd. Academic Press, 1979, str. 1 - 284. Na optimalizáciu syntetických cyklov sa môžu ku kondenzačným zmesiam pridávať rôzne činidlá, ako je 1-hydroxybenzotriazol (HOBT), N-hydroxysukcínimid (HOSu) a 3,4-dihydro-3 -hydroxy-4-oxo-1,2,3 -benzotriazin (HOOBT). Prednosť sa venuje HOBT.

Predpis pre typický syntetický cyklus je možné opísať nasledujúcim spôsobom:

Predpis 1

stupeň	reakčné činidlo	čas
1	CH₂C1₂	2 x 30 s
2	50 % TFA/CH₂C1₂	1 min
3	50 % TFA/CH₂C1₂	15 min
4	CH₂C1₂	2 x 30 s
5	iPrOH	2 x 30 s
6	CH₂C1₂	4 x 30 s
7	6 % DIPEA/CH₂C1₂	3x2 min
8	ch₂ci₂	3 x 30 s
9	kondenzácia	10 min - 18 h
10	CH₂C1₂	2 x 30 s
11	iPrOH	1 x 30 s
12	CH₂C1₂	1 x 30 s
13	DMF	2 x 30 s
14	CH₂C1₂	3 x 30 s

Rozpúšťadlá pre všetky premývacie a kondenzačné (kopulačné) stupne sa používajú v množstve 10 až 40 ml/g živice. Kondenzácie sa vykonávajú buď pri použití vopred vytvorených symetrických anhydridov Boc-aminokyselín, alebo derivátov O-acylizomočoviny. Obyčajne sa pridáva 2 až 10 ekvivalentov aktivovanej Boc-aminokyseliny na ekvivalent aminoživice pri použití metylénchloridu ako rozpúšťadla. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) a BocHis(Bom) sa kondenzujú v 20 až 25 % dimetylformamide v dichlórmetáne. Boc-Asn, Boc-Gln a Boc-His(Bom) sa kondenzujú vo forme HOBT-aktivovaných esterov s cieľom minimalizácie známych vedľajších reakcií.

Peptidy sa obyčajne cyklizujú pri použití známych metód v tomto odbore nasledujúcim spôsobom. Na miestach aminokyseliny v peptide, kde majú byť pripojené postranné reťazce, sa používajú rôzne chrániace skupiny. Pre aminokyseliny s amínovým miestom, Lys a ORn, sa do peptidového reťazca zabudujú Ν^ε- a Ν'’-Fmoc-deriváty. Pre aminokyseliny s karboxylovým miestom, Asp a Glu, sa zabudujú O^p- a CF-Fm-deriváty. Na peptid, ktorý je stále ešte viazaný k živici, sa pôsobí 20 až 40 % piperidínom v dimetylformamide, aby sa selektívne odstránili chrániace skupiny Fmoc a Fm. Voľná postranná aminoskupina a karboxyskupina sa potom intramolekuláme kovalentne spoja pôsobením vhodného amidotvomého činidla, ako je dife nylfosforylazid (DPPA), DCC, DIC alebo BOP. Prednosť sa venuje použitiu DCC a BOP.

Predpis pre typický cyklizačný postup zahŕňa nasledujúce stupne:

Predpis 2

stupeň	reakčné činidlo	čas
1	DMF	1 x 30 s
2	20 - 40 % piperidín/DMF	1 min
3	DMF	1 x 30 s
4	20-40% piperidín/DMF	20 min
5	iPrOH	1 x 30 s
6	DMF	1 x 30 s
7	iPrOH	2 x30 s
8	DMF	2 x 30 s
9	6 % DIPEA/CH,C1₂	2x2 min
10	ch₂ci₂	1 x 30 s
11	DMF	1 x 30 s
12	kondenzácia	1 -24 h
13	iPrOH	1 x 30 s
14	CH₂C1₂	1 x 30 s
15	DMF	2 x 30 s
16	CH₂C1₂	3 x 30 s

Kondenzačné reakcie sa v priebehu syntézy monitorujú Kaiserovým ninhydrínovým testom, aby sa zistil stupeň konverzie [Kaiser a ďalšie, Anál. Biochem., 34, 595 - 598 (1970)]. Pri Boc-Arg(Tos), Boc-Asn a Boc-Gln bola pozorovaná pomalá reakčná kinetika. Ak je kondenzácia neúplná, vykoná sa buď nová kondenzácia s čerstvo pripravenou aktivovanou kyselinou, alebo sa reakčný produkt blokuje pôsobením acetanhydridu na kondenzačný produkt peptidu s živicou, ako to bolo opísané. Úplne zostavené produkty peptid-živica sa niekoľko hodín sušia za vákua.

V prípade každej zlúčeniny sa odstraňovanie blokovacích skupín a odštiepovanie peptidu od živice uskutočňuje nasledujúcim spôsobom. Obyčajne sa na 1 g produktu peptidživica pôsobí 25 až 100 μΐ etánditiolu, 1 ml anizolu a 9 ml kvapalného fluorovodíka, pri 0°C počas 45 až 60 minút v zariadení na prácu s fluorovodíkom, ktoré je zhotovené z teflonu (Peninsula). Alternatívne sa používa modifikovaný dvojstupňový štiepiaci postup [Tam a ďalšie, Tetrahedron Letters, 23, 293 - 940 (1982)], pri ktorom sa na produkt peptid-živica pôsobí 3 ml dimetylsulfidu a 1 ml fluorovodíka, počas 2 hodín pri 0 °C, potom sa prchavé látky odparia a na produkt sa pôsobí 90 % fluorovodíkom. Prchavé látky sa za vákua odparia pri teplote ľadového kúpeľa. Zvyšok sa premyje 2 alebo 3 20 ml dávkami dietyléteru a etylacetátu a potom sa odfiltruje. Peptidy sa oddelia od živice premytím produktu 3 alebo 4 20 ml dávkami 10 % kyseliny octovej, po ktorom sa premývacie lúhy prefiltrujú. Spojené vodné filtráty sa lyofúizujú, čím sa získa surový produkt.

Surové peptidy sa najskôr prečistia gélovou chromatografiou na náplni Sephadex G-25 fine, aby sa oddelili monoméme látky od oligomémych látok. Peptidy sa rozpustia v minimálnom objeme 10 % kyseliny octovej a nanesú na stĺpec gélu. Stĺpec sa eluuje 10 % kyselinou octovou pri prietoku 0,5 až 1,5 mml/min. Eluát sa monitoruje pri 254 nm a frakcie, obsahujúce požadovaný pás sa spoja a lyofilizujú. Tak sa získajú napolo prečistené produkty.

Čistenie napolo prečistených peptidov sa obyčajne vykonáva preparatívnou HPLC. Peptid sa nanáša na stĺpec v minimálnom objeme buď 1 % kyseliny octovej, alebo 0,1 % kyseliny trifluóroctovej. Gradientová elúcia sa začne s 10 % tlmivým roztokom B v tlmivom roztoku A, gradient od 10 % do 25 % tlmivého roztoku B trvá 10 minút a gradient od 25 % do 35 % tlmivého roztoku B trvá 3 hodiny (tlmivý roztok A: 0,1 % roztok kyseliny trifluóroctovej vo vode, tlmivý roztok B: 0,1 % roztok kyseliny trifluoroctovej v acetonitrile). Prietoková rýchlosť pri elúcii je 8,0 ml/min. Detekcia UV žiarením sa uskutočňuje pri 220 nm. Frakcie sa odoberajú v intervaloch 1,5 až 2,5 minúty a ich zloženie sa kontroluje analytickou HPLC. Frakcie s vysokou čistotou sa spoja a lyofílizujú.

Čistota výsledných produktov sa kontroluje analytickou HPLC na stĺpci s reverznou fázou (pozri hore). Obyčajne sa používa gradientová elúcia s gradientom od 20 % do 40 % tlmivého roztoku B v tlmivom roztoku A (tlmivý roztok A: 0,022 % kyselina trifluoroctová vo vode, tlmivý roztok B: 0,022 % kyselina trifluoroctová v acetonitrile) v trvaní 15 minút pri prietoku 2,0 ml/min. Detekcia UV žiarením sa vykonáva pri 210 nm. Čistota všetkých produktov je približne 97 až 99 %. Vykonajú sa analýzy aminokyselín v jednotlivých peptidoch a namerané hodnoty ležia v prijateľnom rozmedzí. Všetky konečné produkty sa tiež obyčajne podrobia hmotnostnej spektrometru FAB-MS. Všetky produkty vykazujú očakávaný rodičovský' M + H ión v prijateľných medziach.

Nové zlúčeniny podľa vynálezu vykazujú cenné farmakologické vlastnosti. Majú tracheálny relaxačný účinok a sú silnými bronchodilatátormi. Tieto zlúčeniny tiež nemajú žiadny vedľajší kardiovaskulárny účinok. Účinnosť týchto nových peptidov pri bronchodilatácii môže byť dlhšia ako 2 hodiny. Vďaka týmto účinným vlastnostiam predstavujú zlúčeniny podľa vynálezu farmaceutický cenné látky na liečbu bronchokonstrikčných porúch, napríklad astmy.

Nové zlúčeniny všeobecného vzorca (I) až (V) je možné miešať s rôznymi typickými farmaceutickými nosičmi, prednostne netoxickými inertnými terapeuticky vhodnými nosičovými látkami, za vzniku prípravkov, ktoré sa hodia na liečbu bronchokonstrikčných porúch, ako je astma. Dávkovanie týchto zlúčenín v galenických aplikačných formách je závislé od rôznych faktorov, ako je druh konkrétne použitej zlúčeniny a druh použitého prípravku. Účinnú dávku môžu odborníci v tomto odbore určiť na základe uvedených hodnôt účinnej koncentrácie (EC₅₀). Typické dávkovanie pre humánnych pacientov leží v rozmedzí od 0,01 do 100 pg/kg. Pri zlúčeninách s nízkou hodnotou ED₅₀, ako napríklad 0,1 pg, leží typické dávkovanie pre humánnych pacientov v rozmedzí od asi 0,02 do asi 20 pg/kg.

Nové zlúčeniny všeobecného vzorca (I) až (V) tvoria farmaceutický vhodné adičné soli s kyselinami s rôznymi anorganickými a organickými kyselinami, ako je kyselina sírová, fosforečná, chlorovodíková, bromovodiková, jodovodíková, dusičná, amidosulfónová, citrónová, mliečna, pyrohroznová, šťaveľová, maleínová, jantárová, vínna, škoricová, octová, trifluoroctová, benzoová, salicylová, glukónová, askorbová a pod.

Zlúčeniny podľa vynálezu je možné pacientom podávať parenterálne, buď intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, orálne, alebo intranazálne. Prednostný spôsob parenterálneho podávania spočíva v podávaní aerosólu orálnou alebo intranazálnou cestou.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA živica

Zasieťovaná benzhydrylaminová živica na báze kopolyméru styrénu s 1 % divinylbenzénu (9,5 g, 3,6 mekv. zr nenie 200 - 400 mesh, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy Vega Biochem) sa napúča v 100 ml metylénchloridu, odfiltruje a premyje pri použití stupňov 7 až 8 predpisu 1. V 50 ml dichlórmetánu sa nechá reagovať Boc-Thr(Bzl) (3,35 g, 10,8 mmol) s dicyklohexylkarbodiimidom (1,12 g, 5,42 mmol), počas 1 hodiny, zmes sa prefiltruje a v 50 ml dichlórmetánu pridá k napúčanej živici. Vzniknutá zmes sa 18 hodín trepe pri teplote miestnosti. Potom sa pridá DIPEA (630 ml, 3,6 mmol) a zmes sa ďalšiu 1 hodinu trepe, potom sa prefiltruje a vykonajú sa stupne 10 až 14 podľa predpisu 1. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Prípadné nezreagované aminoskupiny sa blokujú 30-minútovým pôsobením 1 ml acetanhydridu a 1 ml DIPEA v 50 ml dichlórmetánu na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 a 14 podľa predpisu L Živica sa za vákua suší cez noc. Získa sa 9,8 g, produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA živica. Vzorka tejto živice sa podrobí analýze na aminokyselinu. Zistí sa, že sa naviazalo 0,17 mmol Thr na 1 g živice.

Príklad 2

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle'⁷,Val²⁶,Tht²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸ -> Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N220)-NII₂]

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA živica (9,8 g, 1,7 mmol) z príkladu 1 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití predpisu 1, uvedeného hore. Všetky kondenzácie sa uskutočňujú pri použití symetrických anhydridov, ktoré boli pripravené z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagín, Boc-glutamin a Boc-histidin(benzyloxymetyl) sa kondenzujú vo forme príslušných HOBT-aktivovaných esterov. Reakčný čas dokončenia kondenzačného stupňa je obyčajne 1 až 18 hodín. Uskutoční sa celkom 5 kondenzačných cyklov, postupne s 5 aminokyselinami, Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol) a Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol). Potom sa živica za vákua vysuší. Tak sa získa 12,2 g produktu Bochexapeptid-živica.

8,2 g (1,13 mmol) tejto živice sa postupne v 6 cykloch kondenzuje so 6 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-ClZ) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol) a Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol). Získa sa 10,2 g produktu Bocdodekapeptid-živica.

1,26 g (0,139 mmol) tejto živice sa podrobí dvom kondenzačným cyklom a to pri použití Boc-Gln (205 mg, 0,93 mmol) a Boc-Lys(2-Cl-Z) (627 mg, 15 mmol). Jedna polovica tejto živice (0,069 mmol) sa postupne podrobí 14 kondenzačným cyklom pri použití 14 aminokyselín: Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OFm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0, 76 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) a Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol). Získaný produkt peptid-živica sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu L a potom sa na nej pôsobí 1,0 ml acetanhydridu a 66 ml DIPEA (0,38 mmol) v 20 ml dichlórmetánu počas 30 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14).

Potom sa živica selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a nechá 7 x reagovať s DCC (49 mg, 0,24 mmol) a HOBT (32 mg, 0,24 mmol) v 20 ml destilovaného dimetylformamidu, v priebehu 24 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 16 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší. Získa sa 0,72 g produktu.

Na živicu sa pôsobí 6 ml dimetylsulfídu a 2 ml kvapalného. fluorovodíka počas 2 hodín pri 0 °C. Reakčná zmes sa odparí a k zvyšku sa pridá 0,7 ml anizolu a 6 ml kvapalného fluorovodíka, potom sa reakčná zmes 45 minút udržuje pri 0 °C. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje raz 15 ml dietyléteru a tri razy 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 3 x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofilizujú. Získa sa 227 mg bielej pevnej látky.

Táto surová látka sa prečistí preparatívnou HPLC na stĺpci Whatman Magnum-20 ODS-3 (2 x 25 cm), pričom elúcia sa vykonáva lineárnym gradientom 10 % až 40 % tlmivého roztoku B v tlmivom roztoku A (tlmivý roztok A: 0,1 % roztok kyseliny trifluoroctovej vo vode, tlmivý roztok B: 0,1 % roztok kyseliny trifluoroctovej v acetonitrile) počas 4 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC a po spojení vhodných frakcií a lyofilizácii sa získa 26,7 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa opäť nanesie na stĺpec Magnum-20 ODS-3 (2 x 50 cm) a eluuje rovnakým koncentračným gradientom. Látka hlavného piku sa oddelí a lyofilizuje. Získa sa 9,5 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 277,8; nájdené: 3 276,1.

Príklad 3

Príprava Ac-Glu⁸,Lys¹²,Nle^l7,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu^8_>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID Λ»21)-ΝΗ₂]

Zasieťovaná benzhydrylamínová živica na báze kopolyméru styrénu s 1 % divinylbenzénu (17,7 g, 2,6 mekv. zrnenie 200 - 400 mesh, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy Vega Biochem) sa napúča v 160 ml metylénchloridu, odfiltruje a premyje pri použití stupňov 7 až 8 predpisu 1. Živica sa resuspenduje v 160 ml dichlórmetánu a nechá reagovať s Boc-Thr(Bzl) (6,25 g, 20,2 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidom (2,10 g, 10,1 mmol). Vzniknutá zmes sa 8 hodín trepe pri teplote miestnosti, potom sa prefiltruje a vykonajú sa stupne 10 až 14 podľa predpisu 1. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Prípadné nezreagované aminoskupiny sa blokujú 60 minútovým pôsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA v 150 ml dichlórmetánu na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 a 14 podľa predpisu 1. Živica sa za vákua suší cez noc. Získa sa 18,0 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA živica. Vzorka tejto živice sa podrobí analýze na aminokyselinu. Zistí sa, že sa naviazalo 0,17 mmol Thr na 1 g živice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA živica (18,0 g, 3,06 mmol) z odseku 1 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití predpisu 1, uvedeného hore. Všetky kondenzácie sa uskutočňujú pri použití symetrických anhydridov, ktoré boli pripravené z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagín, Boc-glutamín a Boc-histidín(benzyloxymetyl) sa kondenzujú vo forme príslušných HOBT-aktivovaných esterov. Uskutoční sa celkom 5 kondenzačných cyklov, postupne s 5 aminokyselinami, BocLeu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), BocSer(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) a Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). Potom sa živica za vákua vysuší. Tak sa získa 22,9 g produktu Boc-hexapeptid-živica.

7,48 g (1,0 mmol) tejto živice sa postupne v 10 cykloch kondenzuje s 10 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol), Boc-LyS(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-ClZ) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg,

4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 40 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) a Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol). Získa sa 9,6 g produktu Bochcxadekapeptid-živica.

7,68 g (0,8 mmol) tejto živice sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu pri použití Boc-Lys(Fmoc) (1,5 g, 3,2 mmol). Získa sa 8,32 g produktu Boc-heptadekapeptid-živica.

6,24 g (0,6 mmol) tejto živice sa podrobí dvom kondenzačným cyklom pri použití Boc-Thr(Bzl) (742 mg,

2,4 mmol) a Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol). Získa sa 6,28 g produktu Boc-nonadekapeptid-živica.

2,09 g (0,2 mmol) tejto živice sa podrobí 9 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa postupne jednotlivo použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), BocThr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). Získaný produkt peptidživica sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1, a potom sa na ňu pôsobí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA v 20 ml dichlórmetánu počas 20 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14).

Potom sa živica selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2). Tri štvrtiny tejto živice (0,15 mmol) sa nechajú reagovať s DCC (77 mg, 0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) v 20 ml destilovaného dimetylformamidu v priebehu 72 hodín, a potom v 20 ml toluénu v priebehu 24 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 16 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší. Získa sa 1,72 g produktu.

1,14 g, (0,099 mmol) časť tejto živice sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 2, s tým rozdielom, že sa v druhom stupni použije 1 ml anizolu a 9 ml fluorovodíka. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje jedenkrát 15 ml dietyléteru a trikrát 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 3x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofilizujú. Získa sa 535 mg bielej pevnej látky.

Táto surová látka sa prečistí gélovou filtráciou na náplni Sephadex G-25 fme (kolóna s rozmermi 2 x 100 cm) pri použití elúcie 10 % kyselinou octovou. Monomér hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a po spojení vhodných frakcií a lyofilizácii sa získa 83,5 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa prečistí preparatívnou HPLC spôsobom,opísaným v príklade 2, s tým rozdielom, že sa použije 20 až 40 % gradient v priebehu 3 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a získané frakcie sa spoja a lyofilizujú. Získa sa 18,9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 292,0; nájdené: 3 291,8*

Príklad 4

Príprava Ac-[AsnB,Asp⁹,Lys¹²,Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁹ -> Lys¹²) [Ac-(SEQ ID N1-22J-N1 [₂]

Časť produktu Boc-nonadekapeptid-živica (1,55 g, 0,15 mmol) z príkladu 3 sa podrobí deviatim kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo používa Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0,66 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc

-Ala (113 mg, 0,6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) a Boc-His(Bom) (248 mg, 0,66 mmol). Získaný produkt peptid-živica sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1, a potom sa na ňu pôsobí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA v 20 ml dichlórmetánu počas 30 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14).

Potom sa živica selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a nechá reagovať dvakrát s DCC (77 mg, 0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) v 20 ml destilovaného dimetylformamidu, počas 24 hodín a 72 hodín, a potom dvakrát v 20 ml toluénu počas 24 hodín a 48 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 15 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší. Získa sa 1,54 g produktu.

1,26 g (0,122 mmol) časť tejto živice sa zbaví chrániacich skupín pomocou fluorovodíka spôsobom,opísaným v príklade 3. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje jedenkrát 15 ml dietyléteru a trikrát 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 3 x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofílizujú. Získa sa 485 mg bielej pevnej látky.

Táto surová látka sa prečistí gélovou filtráciou na náplni Sephadex G-25 fine spôsobom, opísaným v príklade 3. Získa sa 83,5 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, s tým rozdielom, že sa použije 20 až 45 % gradient v priebehu 3 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a získané frakcie sa spoja a lyofílizujú. Získa sa 11,5 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 277,8; nájdené: 3 277,6.

Príklad 5

Príprava Ac-[ORn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Th?⁸]-VIP cyklo (Asp⁸ -> ORn¹²) [Ac-(SEQIDNo.:23)-NH₂]

1,92 g, (0,2 mmol) časť produktu Boc-hexadekapeptidživica z príkladu 3 sa podrobí 12 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použije Boc-ORn(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), BocThr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102mg, 0,44mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). Získaný produkt peptidživica sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1, a potom sa na nej pôsobí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA v 20 ml dichlórmetánu počas 30 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14) a suší cez noc. Získa sa 2,38 g, produktu.

1,38 g (0,11 mmol) tejto živice sa selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a nechá reagovať s DCC (55 mg, 0,27 mmol) a HOBT (37 mg, 0,27 mmol) v 20 ml destilovaného dimetylformamidu počas 24 hodín, a potom v 20 ml toluénu počas 24 hodín a 5 x v 20 ml destilovaného dimetylformamidu počas 24 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je mierne pozitívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 16 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší.

0,8 g, (0,05 mmol) časť tejto živice sa zbaví chrániacich skupín pomocou fluorovodíka spôsobom, opísaným v príklade 3. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje raz 15 ml dietyléteru a trikrát 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 3 x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofílizujú. Získa sa 429 mg živicovej pevnej látky.

Táto surová látka sa prečistí gélovou filtráciou na náplni Sephadex G-25 fine spôsobom, opísaným v príklade 3. Získa sa 107 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC, spôsobom, opísaným v príklade 3, s tým rozdielom, že sa použije 10 až 40 % lineárneho gradientu v priebehu 3 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a získané frakcie sa spoja a lyofílizujú. Získa sa 17,5 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 263,7: nájdené: 3 264 1.

Príklad 6

Príprava Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸ -> Asp¹²) [Ac-(SEQID No.: 24)-NH₂]

1,0 g (0,1 mmol) časť produktu Boc-hexadekapeptidživica z príkladu 3 sa podrobí 12 kondenzačným cyklom, pri ktoiých sa jednotlivo použije Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). Získaný produkt peptid-živica sa podrobí stupňom 1 až 8, a potom sa na nej pôsobí 0,5 ml acetanhydridu a 35 ml DIPEA v 20 ml dichlórmetánu počas 30 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14) a suší cez noc. Získa sa 1,2 g, produktu.

0,8 g (0,066 mmol) tejto živice sa selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a nechá reagovať s BOP (58 mg, 0,13 mmol) v 20 ml destilovaného dimetylformamidu počas 24 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 16 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší.

Táto živica sa zbaví chrániacich skupín pomocou fluorovodíka spôsobom, opísaným v príklade 3. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje jedenkrát 15 ml dietyléteru a trikrát 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 3x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofílizujú. Získa sa živicová pevná látka.

Táto surová látka sa prečistí gélovou filtráciou na náplni Sephadex G-25 fine spôsobom, opísaným v príklade 3. Získa sa 43,8 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, s tým rozdielom, že sa použije 10 až 40 % lineárneho gradientu v priebehu 3 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a získané frakcie sa spoja a lyofílizujú. Získa sa 7,5 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 277,8; nájdené: 3 276,4.

Príklad 7

Príprava Ac-[Glu⁸,ORn¹²,Nle^l7Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸ -> ORn¹²) [Ac-(SEQ IDNo.:25)-NH₂]

Zasieťovaná benzhydrylamínová živica na báze kopolymcru styrénu s 1 % divinylbenzénu (25,0 g, 17,5 mekv. zrnenie 200 - 400 mesh, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy Bachem) sa napúča v 160 ml metylénchloridu, odfiltruje a premyje pri použití stupňov 7 až 8 predpisu 1. Živica sa re13

SK 279399 Β6 suspenduje v 160 ml dichlórmetánu a nechá reagovať s Boc-Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidom (5,4 g, 26,2 mmol). Vzniknutá zmes sa 6 hodín trepe pri teplote miestnosti, potom sa prefiltruje a vykonajú sa stupne 10 až 14 podľa predpisu 1. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Prípadné nezreagované aminoskupiny sa blokujú 60-minútovým pôsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA v 150 ml dichlórmetánu na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 a 14. Živica sa za vákua suší cez noc. Získa sa 29,6 g produktu BocThr(Bzl)-BHA živica. Vzorka tejto živice sa podrobí analýze na aminokyselinu. Zistí sa, že sa naviazalo 0,21 mmol Thr na 1 g živice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA živica (14,0 g, 2,94 mmol) z odseku 1 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití rovnakého predpisu ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 11 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo používa Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (10,3 g, 23,5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmol) a Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmol). Získa sa 26 g produktu Boc-dekapeptid-živica.

5,5 g (0,61 mmol) tejto živice sa postupne v 4 cykloch jednotlivo kondenzuje s Boc-Gln (655 mg, 2,7 mmol), BocLys(2-Cl-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) a Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol). Po vákuovom vysušení sa získa 6,12 g, produktu Boc-hexadekapeptid-živica.

2,0 g (0,2 mmol) tejto živice sa podrobí dvanástim kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použije BocORn(Fmoc) (91 mg, 0,2 mmol), Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). Získaný produkt peptid-živica sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1, a potom sa na ňu pôsobí 0,5 ml acetanhydridu a 38 ml DIPEA v 30 ml dichlórmetánu počas 180 minút. Potom sa živica premyje (stupne 10 až 14) a za vákua vysuší. Získa sa 2,4 g produktu.

Potom sa časť (1,15 g, 0,1 mmol) tejto živice selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a nechá reagovať dvakrát s BOP (58 mg, 0,13 mmol) a 400 ml DIPEA v 20 ml destilovaného dimetylformamidu v priebehu 24 hodín a 6 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje (stupne 13 až 16 podľa predpisu 2) a za vákua vysuší. Získa sa 1,05 g produktu.

Táto živica sa zbaví chrániacich skupín pôsobením 9 ml fluorovodíka, 1 ml anizolu a 100 ml etánditiolu počas 1 hodiny pri 0°C. Potom sa reakčná zmes odparí a zvyšok sa premyje dvakrát 15 ml dietyléteru a dvakrát 15 ml etylacetátu. Živica sa extrahuje 4 x 20 ml 10 % kyseliny octovej a spojené vodné filtráty sa lyofilizujú. Získa sa 385 mg svetlej žltej pevnej látky.

Táto surová látka sa prečistí gólovou filtráciou na náplni Sephadex G-25 fine spôsobom, opísaným v príklade 3. Získa sa 134 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, s tým rozdielom, že sa použije 26 až 36 % lineárneho gradientu v priebehu 3 hodín. Látka hlavného piku sa oddelí analytickou HPLC spojených frakcií a získané frakcie sa spoja a lyofilizujú. Získa sa 23,2 mg bieleho amorfného prášku.

Táto zlúčenina je homogénna podľa HPLC a podľa analýzy vykazuje správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 277,8; nájdené: 3 276,3.

Príklad 8

Príprava Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²-> Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID No.: 26)-NH₂]

Zasieťovaná benzhydrylamínová živica na báze kopolyméru styrénu s 1 % divinylbenzénu (30 g, 21,4 mekv. zrnenie 200 - 400 mesh, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy Bachem) sa spracováva spôsobom, opísaným v príklade 22 s tým rozdielom, že sa použije 19,9 g Boc-Thr(Bzl) (64,3 mmol) a 6,6 g dicyklohexylkarbodiimidu (32,1 mmol). Vzniknutá zmes sa 18 hodín trepe pri teplote miestnosti, potom sa prefiltruje a vykonajú sa stupne 10 až 14 podľa predpisu L Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Prípadné nezreagované aminoskupiny sa blokujú 60 minútovým pôsobením 8 ml acetanhydridu a 8 ml DIPEA v 200 ml dichlórmetánu na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 a 14 podľa predpisu 1. Živica sa za vákua suší cez noc. Získa sa 34,2 g produktu BocThr(Bzl)-BHA živica. Vzorka tejto živice sa podrobí analýze na aminokyselinu. Zistí sa, že sa naviazalo 0,47 mmol Thr na 1 g živice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA živica (0,85 g, 0,4 mmol) z odseku 1 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A. Všetky kondenzácie sa uskutočňujú pri použití vopred pripravených symetrických anhydridov, ktoré boli pripravené z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagín, Boc-glutamín a Boc-arginín(tosyl) sa obvyklým spôsobom kondenzujú vo forme príslušných HOBT-aktivovaných esterov. Uskutoční sa celkom 11 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo používajú aminokyseliny, Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol). Získa sa produkt Boc-dodekapeptid-živica.

Táto živica sa postupne v 5 cykloch kondenzuje spôsobom, opísaným v príklade 2, pričom sa jednotlivo používa Boc-Glu(OFM) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (664 mg, 1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol). Produkt sa vysuší za vákua. Získa sa 2,12 g produktu Boc-heptadekapeptid-živica.

Potom sa časť (1,06 g, 0,2 mmol) tejto živice selektívne zbaví chrániacich skupín (stupne 1 až 11 podľa predpisu 2) a živica sa nechá reagovať dvakrát s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a DIPEA v 20 ml destilovaného dimetylformamidu v priebehu 2 hodín a 8 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je mierne pozitívna. Nezreagované aminoskupiny sa blokujú 10-minútovým pôsobením 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v dichlórmetáne na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 až 16 podľa predpisu 2. Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu pri použití Boc-Thr(Bzl) (495 mg,

1,6 mmol), a potom opäť prenesie do syntetizátora peptidov Applied Biosystems 430A. Vykoná sa 10 kondenzačných cyklov, v ktorých sa jednotlivo používa Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg,

SK 279399 Β6

2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2, Ommol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu a 100 ml DIPEA v 20 ml metylénchloridu počas 30 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14) a za vákua vysuší.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 340 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 35 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 15,6 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3276,67; nájdené: 3278,0.

Príklad 9

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Asp^24, Val²⁶, Thr^j-VIP cyklo (Lys20 -v Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID No.: 27)-NH₂]

0,42 g (0,2 mmol) produktu Boc-Thr(Bzl)-živica z príkladu 8 sa podrobí 9 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo používa Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Scr(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) a Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol).

Získaná živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín tým, že sa vykonajú stupne 1 až 11 podľa predpisu 2, a potom sa nechá reagovať s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a 200 ml DIPEA v 20 ml destilovaného dimetylformamidu počas 6 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna.

Táto živica sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 17 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2, 0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu s Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol). Získaný peptid, naviazaný na živicu, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 30 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 1,94 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici (0,97 g, 0,1 mmmol), sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 265 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 149 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 278,6; nájdené:

278,8.

Príklad 10

Príprava aAc-[Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 28)-NH₂]

Zasieťovaná benzhydrylamínová živica na báze kopolyméru styrčnu s 1 % divinylbenzénu (5,0 g, 2,6 mekv. zrnenie 200 - 400 mesh, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy Vega Biochem) sa napúča v 50 ml metylénchloridu, odfiltruje a premyje pri použití stupňov 7 až 8 predpisu L Živica sa resuspenduje v 60 ml dichlórmetánu a nechá reagovať s Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidom (774 mg, 3,75 mmol). Vzniknutá zmes sa 4 hodiny trepe pri teplote miestnosti, potom sa prefiltruje a vykonajú sa stupne 10 až 14 podľa predpisu 1. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Prípadné nezreagované aminoskupiny sa blokujú 60-minútovým pôsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA v 50 ml dichlórmetánu na živici. Živica sa odfiltruje a vykonajú sa premývacie stupne 13 a 14 podľa predpisu L Živica sa za vákua suší cez noc. Získa sa 5,8 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA živica. Vzorka tejto živice sa podrobí analýze na aminokyselinu. Zistí sa, že sa naviazalo 0,276 mmol Thr na 1 g živice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA živica (1,44 g, 0,4 mmol) z odseku 1 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití predpisu 1, tak ako v príklade 2. Vykonajú sa celkom 3 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použijú aminokyseliny Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg, 1,6 mmol) a Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol). Jedna polovina tejto živice (0,2 mmol) sa podrobí 4 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (177 mg, 0,4 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamide počas 2 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna.

Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu s BocLys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmol), a potom syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa 19 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), BocTyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 30 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 210 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 26,2 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3305,8; nájdené: 3305,8.

Príklad 11

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²³) [Ac-(SEQ ID No.: 29)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) bcnzhydrylamínovej živice (zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy Bachem), sa podrobí syntéze v pevnej fáze pri použití uvedeného predpisu. Všetky kondenzácie sa uskutočňujú pri použití rovnakých moláme ekvivalentných množstiev Boc-aminokyseliny a diizopropylkarbodiimidu. Boc-asparagín a Boc-glutamín sa zavádzajú vo forme reaktívnych esterov tým, že sa ku kondenzačnej zmesi pridá 1,5 molámy nadbytok HOBT. Reakčný čas, v priebehu ktorého prebehne kondenzačný stupeň do konca, robí približne 2 až 18 hodín. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použije Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB), (440 mg, 1,0 mmol), Boc- (415 mg, 10 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (88 mg, 0,2 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamide počas 2 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna.

Uskutoční sa 19 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa postupne jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala ( 189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), BocAsp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol). Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 10 ml 6 % roztoku DI -PEA v metylénchloride počas 30 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 304 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 215 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 26 až 36 % lineárneho gradientu. Získa sa 20,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FABMS: MH vypočítané: 3277,6; nájdené: 3277,7.

Príklad 12

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, 2-Nal¹⁰, Lys¹²,Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹·³⁰, Meť’j-VIP (1-31)-NH₂ cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 30)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylamínovej živice (zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy Bachem) sa podrobí syntéze v pevnej fáze, podobne ako v príklade 11. Vykonajú sa celkom 3 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Ďalej sa uskutoční 9 kondenzačných cyklov, a cyklizácia, spôsobom podľa príkladu 11. Nasleduje 19 kondenzačných cyklov, ako v príklade 11, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v 10. cykle nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol, Boc-Tyr(2,6DCB) v 19. cykle sa nahradí Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol) a Boc-Phe v 23. cykle sa nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 345 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 215 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 30 až 40 % lineárneho gradientu. Získa sa 16,4 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3 574,7; nájdené: 3 575,1.

Príklad 13

Príprava Ac-[Glu⁸, ORn¹², Nie¹⁷, Asp²³, Val²⁶, Thr²⁵]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 31)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylamínovej živice (zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy Bachem) sa podrobí syntéze v pevnej fáze, podobne ako v príklade 11.

Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov a cyklizácia ako v príklade 11 a ďalej nasleduje 19 kondenzačných cyklov ako v príklade 11, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v 10. cykle nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol, Boc-Lys(2-Cl-Z) v 17. cykle sa nahradí Boc-ORn(Z) (366 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) v 21. cykle sa nahradí Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol).

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 255 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 200 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným, v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 28 až 38 % lineárneho gradientu. Získa sa 30,7 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3305,8; nájdené 3305,5.

Príklad 14

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹’³⁰, Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH₂ cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 32)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylamínovej živice (zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn, 75 až 150 pm, výrobok firmy Bachem) sa podrobí syntéze v pevnej fáze, podobne ako v príklade 11. Vykonajú sa celkom 3 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Ďalej sa uskutoční 9 kondenzačných cyklov a cyklizácia, spôso bom podľa príkladu 11. Nasleduje 19 kondenzačných cyklov ako v príklade 11, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Phe v 23. cykle nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 268 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 165 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným, v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3584,1; nájdené: 3584,0.

Príklad 15

Príprava Ac-[Ala², Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 33)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (1,5 g, 0,4 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy Bachem) sa podrobí syntéze v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, podobne ako v príklade 11. Uskutočni sa celkom 8 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OFm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (938 mg, 2,0 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (356 mg, 0,8 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamide počas 2 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje pri použití stupňov 13 až 16 podľa predpisu 2 a vysuší za vákua. Získa sa 1,9 g produktu Boc-oktapeptid-živica.

Časť tejto živice (0,95g, 0,2 mmol) sa opäť podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 11. Uskutoční sa 18 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol) a Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), BocTyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získa sa 1,54 g, produktu Boc-hexakosapeptid-živica.

Časť tejto živice (0,77 g, 0,1 mmol) sa podrobí syntéze v pevnej fáze pri použití predpisu, uvedeného v príklade 2. Vykonajú sa 2 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použije Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (328 mg, 0,8 mmol). Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,74 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 172 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečisti gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 110 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 22 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 40,0 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3261,7; nájdené: 3261,8.

Príklad 16

Príprava Ac-fN-Me-Ala¹, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQID No.: 34)-NHJ

0,77 g (0,1 mmol) produktu Boc-hexakosapeptid-živica z príkladu 15 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití predpisu, uvedeného v príklade 2. Vykonajú sa 2 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použije BocSer(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol). Potom sa peptid, naviazaný na živici, spracuje stupňami 1 až 8 podľa predpisu 1 a ďalej sa na nej pôsobí BOP (442 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml, 3,0 mmol) v 20 ml dimetylformamidu počas 6 hodín, a potom 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14) a za vákua vysuší. Získa sa 0,73 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 191 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 138 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 22 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,0 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3225,4; nájdené: 3225,8.

Príklad 17

Príprava Ac-[2-Nal'°, Leu¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 35)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (4,0 g, 1,08 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 8 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny Boc-Thr(Bzl) (1,34 g, 4,3 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Val (938 mg, 4,3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 mg, 2, 1 mmol), Boc-Asn (557 mg, 2,4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,9 g, 4,3 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (1,1 g, 4,3 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (885 mg, 2,0 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamide počas 2 hodín. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje pri použití stupňov 13 až 16 podľa predpisu 2.

Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu pri použití Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,79 g, 4,3 mmol) a za vákua vysuší. Získa sa 6,3 g, produktu Boc-nonapeptid-živica.

Časť tejto živice (1,89 g, 0,3 mmol) sa podrobí 9 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol) a Boc-Gln (325 mg, 1,32 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol) a Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol). Získa sa 2,06 g, produktu Boc-oktadekapeptid-živica.

0,68 g (0,1 mmol) tejto živice sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-2-Nal (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164, 0,4 mmol).

Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,82 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 261 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 186 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 30 až 40 % lineárneho gradientu. Získa sa 60,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FABMS: MH vypočítané: 3296,8; nájdené: 3295,6.

Príklad 18

Príprava Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Leu¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 36)-NH₂]

0,68 g (0,1 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-živica z príkladu 17 sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, podobne ako v príklade 17, iba s tým rozdielom, že sa Boc-2-Nal v 19. cykle nahradí Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol). Získa sa 0,61 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 175 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 136 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 28 až 38 % lineárneho gradientu. Získa sa 42,4 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3276,7: nájdené: 3276,0.

Príklad 19

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH2-Phe¹⁰, Leu¹², Nlc¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 37)-NH2]

0,625 g (0,09 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-živica z príkladu 17 sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, podobne ako v príklade 17, iba s tým rozdielom, že sa Boc-2-Nal v 19. cykle nahradí Boc-p-NH(Z)-Phe (166 mg, 0,4 mmol) a Boc-Phe v 23. cykle sa nahradí Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmol). Získa sa 0,84 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 182 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtrá ciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 160 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 47,2 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3279,7; nájdené: 3279,8.

Príklad 20

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 38)-NHJ

Benzhydrylaminová živica (1,25 g, 1,0 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 8 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (937 mg, 2,0 mmol).

Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu pri použití Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol) a za vákua vysuší. Získa sa 2,7 g, produktu Boc-nonapeptid-živica.

Časť tejto živice (0,54 g, 0,2 mmol) sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 18 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získa sa 1,16 g produktu Boc-heptakosapeptid-živica.

0,54 g (0,1 mmol) tejto živice sa podrobí 1 kondenzačnému cyklu, pri ktorom sa použije Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút.

Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,5 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, iba s tým rozdielom, že sa použije 5 ml fluorovodíka a 0,5 ml anizolu. Získa sa 127 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 74,6 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v prí

SK 279399 Β6 klade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 24 až 34% lineárneho gradientu. Získa sa 17,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3333,8; nájdené: 3333,4.

Príklad 21

Príprava Ac-fN-Me-Ala¹, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -► Asp²⁵ [Ac-(SEQ ID No.: 39)-NH₂]

0,58 g (0,1 mmol) produktu Boc-heptakosapeptid-živica z príkladu 20 sa podrobí 1 kondenzačnému cyklu s Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s BOP (443 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml, 3,0 mmol) v 20 ml dimetylformamidu počas 6 hodín, a potom s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,4 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 20, pričom sa získa 165 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 101 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí prcparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 24 až 34 % lineárneho gradientu. Získa sa 19,8 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FABMS: MH vypočítané: 3281,8; nájdené: 3281,9.

Príklad 22

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 28}]-VlP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 40)-NH₂]

0,54 g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 20 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 18 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Lcu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg,

2,0 mmol), Boc-Glu(O-Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 minol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získa sa 0,58 g produktu Boc-heptakosapeptid-živica.

Táto živica sa podrobí 1 kondenzačnému cyklu, pri ktorom sa použije Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,53 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, iba s tým rozdielom, že sa použije 5 ml fluorovodíka a 0,5 ml anizolu. Získa sa 151 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa zís ka 110 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 23,5 až 33,5 % lineárneho gradientu. Získa sa 22,8 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3347,9; nájdené: 3347,0.

Príklad 23

Príprava Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thi^J-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:41)-NH₂]

1,84 g (0,3 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 17 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutočni sa celkom 9 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a BocGln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získa sa 2,2 g produktu Boc-oktadekapeptid-živica.

0,73 g (0,1 mmol) tejto živice sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,77 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 187 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 131 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 26 až 36 % lineárneho gradientu. Získa sa 5,3 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3291,8; nájdené: 3291,7.

Príklad 24

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 28}· Ala²⁹'^3l]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 42)-NH₂]

Benzhydrylaminová živica (1,1 g, 0,5 mmol zrnenie 200 až 400 mesh podľa ASTM, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy BIOMEGA) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 13 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol).

SK 279399 Β6

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (443 mg, 1,0 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetyIformamide počas 1 hodiny. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje pri použití stupňov 13 až 16 podľa predpisu 2 a za vákua vysuší. Získa sa 2,02 g produktu Boc-tridekapeptid-živica.

Časť tejto živice (0,8 g, 0,2 mmol) sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 16 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), BocLys(2-C 1 -Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získa sa 1,2 g, produktu Boc-nonakosapeptid-živica.

0,6 g (0,1 mmol) tejto živice sa podrobí 2 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získa sa 0,72 g živice.

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,645 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 280 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 160 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 22 až 32 % lineárneho gradientu. Získa sa 23,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3561,1; nájdené: 3560,8.

Príklad 25

Príprava Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie’¹, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸, Ala²⁹'³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 43)-NH₂]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-živica z príkladu 24 sa podrobí dvom kondenzačným stupňom, spôsobom, opísaným, pri ktorých sa jednotlivo použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg), 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získa sa 0,68 g produktu.

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,56 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 160 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 70 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 21,8 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3545,1; nájdené: 3545,3.

Príklad 26

Príprava Ac-fN-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 44)-NH₂]

1,1 g (0,4 mmol) produktu Boc-nonapcptid-živica z príkladu 20 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 17 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: BocAla (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2, 0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,o mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získa sa 2,24 g, produktu Boc-hexakosapeptid-živica.

Táto živica (1,1 g, 0,2 mmol) sa podrobí 2 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa použije Boc-Ser(Bzl) (238 mg, 0,8 mmol) a Boc-N-Me-Ala (163 mg, 0,8 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s BOP-C1 (100 mg, 0,2 mmol), kyselinou octovou (23 ml, 0,2 mmol) a DIPEA (140 ml, 0,4 mmol) v 20 ml dimetylformamidu počas 1 hodiny. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,95 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7. Získa sa 245 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 165 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 33,7 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zisti, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3295,8; nájdené: 3294,5.

Príklad 27

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:45)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (2,49 g, 2,0 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 6 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Lys(2-Cl-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Leu (1,85 g, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (1,02 g, 4,4 mmol) a Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmol). Získaná živica sa vysuší a oddelí sa z nej 0,4 mmol. Nasledujú 3 kondenzačné cykly, pri ktoiých sa jednotlivo použije Boc-Tyr(2,6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol), BocLys(Fmoc) (1,87 g, 6,4 mmol) a Boc-Lys(2-Cl-Z) (2,65 g, 6,4 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (1,42 g, 3,2 mmol) v 20 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamidu počas 4,5 hodiny. Kaiserova ninhydri nová analýza je negatívna. Živica sa premyje pri použití stupňov 13 až 16 podľa predpisu 2 a vysuší. Získa sa 6,56 g, produktu Boc-nonapeptid-živica.

Časť tejto živice (1,64 g, 0,4 mmol) sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 13 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získa sa 2,56 g, produktu Boc-dokosapeptidživica.

Časť tejto živice (0,64 g, 0,1 mmol) sa podrobí 6 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), BocVal (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), BocAsp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku D1PEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,69 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 224 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gólovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 213 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 70,5 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MII vypočítané:

Príklad 28

Príprava Ac-[1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 46)NH₂]

1,28 g, (0,2 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-živica z príkladu 27 sa podrobí 6 kondenzačným cyklom, tak ako v príklade 27, iba s tým rozdielom, že sa Boc-p-F-Phe v prvom cykle nahradí Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 1,41 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 420 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 305 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 66,9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3398,0; nájdené: 3398,8.

Príklad 29

Príprava Ac-[Glu⁸, p-NH2-Phe'°, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 47)NH2]

1,64 g, (0,4 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 27 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, tak ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získa sa 2,2 g, produktu Boc-oktadekapeptid-živica.

Časť tejto živice (1 g, 0,2 mmol) sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseíiny: Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (510 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 1,45 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7. Získa sa 580 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 400 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparativnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 22 až 32 % lineárneho gradientu. Získa sa 60,9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS; MH vypočítané: 3346,9; nájdené: 3346,8.

Príklad 30

Príprava Ac-[Glu⁸, O-Me-Tyr¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 48)-NH₂]

1,1 g (0,2 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-živica z príkladu 29 sa podrobí 10 kondenzačným cyklom, tak ako v príklade 29, iba s tým rozdielom, že sa Boc-p-NH(CBZ)-Phe v prvom cykle nahradí Boc-O-Me-Tyr (14 mg), 0,5 mmol.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7. Získa sa 555 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 460 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 152, 9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3361,9; nájdené: 3361,7.

Príklad 31

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, Lys'², Nie¹⁷, Ala'⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 49)-NH₂] l>2g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 17 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 13 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: BocAla (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2, 0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Bo-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získa sa 1,3 g, produktu Boc-dokosapeptid-živica.

Časť tejto živice (0,65 g, 0,1 mmol) sa podrobí 6 kondenzačným cyklom, tak ako v príklade 27.

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,856 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7. Získa sa 550 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 225 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 80,9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3295,7; nájdené: 3296,2.

Príklad 32

Príprava Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala'⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^VlP cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 50)-NHJ

0,65 g (0,1 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-živica z príkladu 31 sa podrobí 6 kondenzačným cyklom, tak ako v príklade 27, s tým rozdielom, že sa Boc-p-F-Phe v L cykle nahradí Boe-1 -Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,801 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7. Získa sa 250 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 188 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,0 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3327,8; nájdené: 3328,5.

Príklad 33

Príprava Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie'⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹’³⁰Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 51)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (1,1 g, 0,5 mmol zrnenie 200 až 400 mesh podľa ASTM, tzn. 38 až 75 pm, výrobok firmy BIOMEGA) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 13 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 24, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v L cykle nahradí Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala v 2. cykle sa nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala v 3. cykle sa nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol). Získa sa 2,03 g produktu Boc-tridekapeptid-živica.

Časť tejto živice (1,22 g, 0,3 mmol) sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 16 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 24, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Asp(OcHx) v 11. cykle nahradí Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol). Získa sa 1,95 g produktu Boc-nonakosapeptid-živica.

0,975 g (0,15 mmol) tejto živice sa podrobí 2 kondenzačným cyklom, pri ktorých sa použije Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získa sa 1,05 g živice.

Získaný peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,897 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 270 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečisti gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 150 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 24 až 34 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,7 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3547,1: nájdené: 3546,9.

Príklad 34

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala'⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷’ 28

Gly²⁹'^3t>, Thr³']-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 52)NH₂]

0,975 g (0,15 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-živica z príkladu 33 sa podrobí 2 kondenzačným cyklom, tak ako v príklade 33, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v 1. cykle nahradí Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Získa sa 0,915 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 303 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 180 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 42,8 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zlož.enie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3563,1 :;nájdené: 3562,6.

Príklad 35

Príprava Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,2S]-VIP cyklo (Lys²¹ —> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 53)-NH₂]

0,27 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 20 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 19 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(O-Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol). Získa sa 0,57 g produktu Boc-oktakosapeptid-živica.

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,506 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 160 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 100 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 17,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3331,9; nájdené: 3332,0.

Príklad 36

Príprava Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 54)-NH₂]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-živica z príkladu 17 sa podrobí syntetickému postupu v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 23, pričom sa získa 0,72 g produktu Boc-oktadekapeptid-živica. Táto živica sa podrobí jednému kondenzačnému cyklu s Boc-p-NH(CBZ)-Phe (166 mg, 0,4 mmol). Získa sa 0,79 g produktu Boc-nonadekapeptid-živica.

Táto živica sa podrobí syntéze v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, ako v príklade 23, pričom sa získa 0,72 g produktu Boc-oktadeka-peptid-živica. Táto živica sa podrobí syntéze v pevnej fáze pri použití syntetizátora peptidov Applied Biosystems Model 430A, ako v príklade 8. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získa sa 0,91 g produktu.

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 20 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,85 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 350 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečisti gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 138 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 25,2 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3276,8; nájdené: 3276,2.

Príklad 37

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-OCHj-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr^2S]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 55)-NH₂]

Benzhydrylaminová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 9 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0mmol), Boc-Leu (267mg, l,0mmol), Boc-Val (217mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (212 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) a Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Táto živica sa selektívne zbaví chrániacich skupín pri použití stupňov 1 až 11 podľa predpisu 2 a nechá reagovať s BOP (132 mg, 0,3 mmol) v 10 ml 1 % roztoku DIPEA v dimetylformamidu počas 3,5 hodiny. Kaiserova ninhydrínová analýza je negatívna. Živica sa premyje pri použití stupňov 13 až 16 podľa predpisu 2.

Uskutoční sa celkom 19 kondenzačných cyklov, pri ktorých sa jednotlivo použijú tieto aminokyseliny: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, l,0mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, l,0mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Scr(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol).

Získaný Peptid, naviazaný na živici, sa podrobí stupňom 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 10 ml 6 % roztoku DIPEA v metylénchloride počas 60 minút. Živica sa premyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vákua vysuší. Získa sa 0,814 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 265 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 150 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 23 až 33 % lineárneho gradientu. Získa sa 8,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zisti, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3307,8; nájdené: 3306,8.

Príklad 38

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thŕ^J-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 56)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 37, iba s tým rozdielom, že sa Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) v 7. cykle nahradí Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol). Získa sa 0,754 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 254 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 114 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 15,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa IIPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3295,7; nájdené: 3295,5.

Príklad 39

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, m-OCH₃-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:57)NHJ

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 37, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Thr(Bzl) v 1. cykle nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 2. cykle sa nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 3. cykle sa nahradí Boc-Leu (268 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) v 21. cykle sa nahradí BocGlu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,90 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 270 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 155 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 29,6 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3377,9; nájdené: 3377,9.

Príklad 40

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ ->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:58)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 39, iba s tým rozdielom, že sa Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) v 7. cykle nahradí Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol). Získa sa 0,83 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 240 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 100 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 37,2 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3365; nájdené: 3365,8.

Príklad 41

Príprava Ac-[Ala⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No.: 59)-NH₂]

Benzhydiylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 39, iba s tým rozdielom, že sa Boe-Asn v 5. cykle nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) v 7. cykle sa nahradí Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) a Boc-Glu (OBzl) v 21. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,85 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 255 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 112 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 12,0 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3246,8; nájdené: 3246,7.

Príklad 42

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala^16, ’^{7, 19}, Asp^25, Leu²⁶, Lys^{27, 28}]-VIP cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 60)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 41, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v 5. cykle nahradí Boc-Asn (256 mg, 1,1 mmol), Boc-Nle v 12. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Bo-Gln v 13. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ala v 21. cykle sa nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,80 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 254 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečisti gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 115 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 20 až 30 % lineárneho gradientu. Získa sa 32,1 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3248,7; nájdené: 3248,3.

Príklad 43

Príprava Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nie¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ^Z8]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:61)-NHJ

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 41,

SK 279399 Β6 iba s tým rozdielom, že sa Boc-Gln v 13. cykle nahradí Boe-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,93 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 250 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 100 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 23,6 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3189,8; nájdené: 3189,9.

Príklad 44

Príprava Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala^16,17,19, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No.: 62)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutočni sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 43, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Nle v 12. cykle nahradí Boe-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,762 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 240 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 150 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 22 až 32 % lineárneho gradientu. Získa sa 55,3 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3147,7; nájdené: 3148,0.

Príklad 45

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -b Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:63)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 42, iba s tým rozdielom, že sa Boe-Ala v 12. cykle nahradí Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,775 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 203 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečisti gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 100 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 37 % lineárneho gradientu. Získa sa 40,0 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané 3290,8; nájdené 3290,5.

Príklad 46

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala^{16, ,7}’¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:64)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s vyu žitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutočni sa celkom 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 43, iba s tým rozdielom, že sa Boe-Ala v 21. cykle nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,837 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 178 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 126 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 20 až 30 % lineárneho gradientu. Získa sa 24,9 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3205,7; nájdené: 3205,2.

Príklad 47

Príprava Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:65)NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 um, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Vykonajú sa 3 kondenzačné cykly, pri ktorých sa jednotlivo použijú nasledujúce aminokyseliny: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Ďalej sa uskutoční 28 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 37, iba s tým rozdielom, že sa Boc-m-OCIIj-Tyr(Bzl) v 7. cykle nahradí Boc-Tyr(2,6DCB) (440 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) v 21. cykle sa nahradí Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,895 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 440 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 120 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 27,7 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3506,9; nájdené: 3205,8.

Príklad 48

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gl y²⁹’³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 66)NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 31 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 47, iba s tým rozdielom, že sa Boe-Ala v 13. cykle nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Phe v 26. cykle sa nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). Získa sa 0,754 g, produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 280 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 152 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 27 až 38 % lineárneho gradientu. Získa sa 53,4 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analý zou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3553,0; nájdené: 3552,2.

Príklad 49

Príprava Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ^2S, Gly²⁹'³⁰, Thr^3l]-VIP cyklo (Lys²¹ —> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 67)NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 31 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 47, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Thr(Bzl) v 4. cykle nahradí Boc-Lys(2-C 1-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cykle sa nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 6. cykle sa nahradí Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala v 13. cykle sa nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) v 13. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,838 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 370 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 196 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 23 až 33 % lineárneho gradientu. Získa sa 48,4 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3575,1; nájdené: 3574,0.

Príklad 50

Príprava Ac-[Glu^s, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 28}, Gly^29,30, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 68)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 31 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 49, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Ala v 13. cykle nahradí BocSer(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,913 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 378 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 240 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 25 až 35 % lineárneho gradientu. Získa sa 28,8 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3591,1; nájdené: 3590,3.

Príklad 51

Príprava Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸A la²⁹'³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 69)-NH₂]

Benzhydrylamínová živica (0,125 g, 0,1 mmol zrnenie 100 až 200 mesh podľa ASTM, tzn. 75 až 150 pm, výrobok firmy BACHEM) sa podrobí syntéze v pevnej fáze s využitím predpisu 1, podobne ako v príklade 2. Uskutoční sa celkom 31 kondenzačných cyklov, tak ako v príklade 47, iba s tým rozdielom, že sa Boc-Thr(Bzl) v 1. cykle nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly v 2. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly v 3. cykle sa nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol),

Boc-Thr(Bzl) v 4. cykle sa nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cykle sa nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 6. cykle sa nahradí Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol) a Boc-Glu(OBzl) v 24. cykle sa nahradí Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol). Získa sa 0,844 g produktu.

Peptid, naviazaný na živici, sa zbaví chrániacich skupín spôsobom, opísaným v príklade 7, pričom sa získa 360 mg surového peptidu. Tento peptid sa prečistí gélovou filtráciou spôsobom, opísaným v príklade 3, pričom sa získa 115 mg napolo čistého produktu. Táto látka sa ďalej prečistí preparatívnou HPLC spôsobom, opísaným v príklade 3, iba s tým rozdielom, že sa na elúciu použije 24 až 34 % lineárneho gradientu. Získa sa 34,7 mg bieleho amorfného prášku. Táto zlúčenina je podľa HPLC homogénna a analýzou sa zistí, že má správne zloženie aminokyselín. FAB-MS: MH vypočítané: 3547,1; nájdené: 3546,0.

Príklad 52

Účinnosť analógov VIP na relaxáciu priedušnice

Relaxačná účinnosť analógov VIP sa študuje na modeli, pri ktorom sa používa priedušnica morčaťa [Wasserman M. A. a ďalšie, v publikácii Vasoactive Intestinal Peptide, red.

S. I. Said, Raven Press, N. Y. 1982, str. 177 až 184], Všetky tkanivá sa odoberajú zo samcov albínskych morčiat s hmotnosťou 400 až 600 g anestetizovaných uretánom (2 g/kg i. p.). Po exanguinácii sa vyberú priedušnice a rozdelia na 4 kruhové segmenty, z ktorých každý má dĺžku 3 mm. Každý krúžok sa zavesí pri použití drôtov z nehrdzavejúcej ocele s hrúbkou 76 pm do 10 ml nádoby s duplikátorovým plášťom na tkanivové kúpele a pomocou hodvábnej nite 4-0 pripojí k zariadeniu na meranie napätia Grass Force Displacement Transducer, Model FT03C, výrobok fimy Quincy, MA), s cieľom izometrického merania a zaznamenávania napätia. Hladký sval sa máča v kúpeli, obsahujúcom modifikovaný Krebsov roztok nasledujúceho zloženia: chlorid sodný, 120 mM; chlorid draselný, 4,7 mM; chlorid vápenatý, 2,5 mM; heptahydrát síranu horečnatého, 1,2 mM; hydrogenuhličitan sodný, 25 mM: hydrogénfosforečnan didraselný, monobázický, 1,2 mM; a dextróza, 10 mM. Tkanivový kúpeľ sa udržuje pri teplote 37 °C a priebežne prebubláva zmesou 95 % kyslíka a 5 % oxidu uhličitého. Odpoveď sa zaznamenáva na 8-kanálovom a 4-kanálovom zapisovači Hewlett-Packard (Model 7702B a 7754A), čo sú výrobky firmy Hewlett-Packard, Paramus, NJ). Priedušnicové krúžky sa umiestnia pod pokojové napätie 1,5 g, o ktorom bolo zistené, že je optimálne alebo blízke optimálnemu v predchádzajúcich pokusoch. V priebehu 60-minútovej stabilizačnej periódy, ktorá nasleduje, je potrebné napätie opäť upravovať. Tkanivá sa oplachujú v 15 minútových intervaloch.

Krivky závislosti odpovede na kumulatívnu koncentráciu pre každé tkanivo sa získajú postupným zvyšovaním koncentrácie VIP alebo analógov VIP pridávaním mikrolitrových množstiev týchto látok do kúpeľa podľa postupu opisaného v VanRossum, Árch. Ind. Pharmacodyn., 143, 299 až 330 (1963). Pre jedno tkanivo sa získa iba jedna krivka odpovedi na kumulatívnu dávku. Na minimalizáciu rozdielov medzi tkanivami sa relaxačná odpoveď vyjadri ako percentuálny podiel získanej maximálnej odpovedi na VIP (10-6 M - 100%), pridaný na záver každého experimentu, pri ktorom sa mení závislosť odpovedi na koncentráciu. Zrátajú sa odpovedi z troch tkanív a lineárnou regresiou sa stanovia hodnoty EC₅₀.

Výsledky, ktoré sú súhrnne uvedené v tabuľke 1 ukazujú relaxačnú účinnosť analógov VIP na priedušnici v porovnaní s účinnosťou natívneho VIP,

Tabuľka I

Relaxačná účinnosť analógov VIP na tracheálny hladký sval morčaťa zlúčenina (nM)

Tabuľka I - pokračovanie

VIP ((Seq ID NO:1)-NH2110

Ac- [Lys¹2,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr2⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—iLys¹^) (Ac- (SEQ ID HO:20)-NH₂11«

Ac- [Glu⁸,Lys⁷·²,Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ J-VIP cyklo (Glu^a-H.ys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂134

Ac- [Asn⁸, Asp⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸1 -VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) (AC-(SEQ ID NO:22)-NH₂117

Ac- (Orn¹²,Nie¹⁷, Val^{2 6},Thr²⁸1 -VIP cyklo (Asp⁸-»0rn¹²) (Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂140

Ac- [Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys⁸-»Asp¹²) [AC-ISEQ ID NO:24)-NH₂138

Ac- [Glu⁸,Orn¹², Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸ ] -VIP cyklo (Glu⁸-KJrn¹²) [Ac-ÍSEQ ID NO:25)-NH2)16

Ac- [Lys¹², Glu¹⁶,Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys¹²—4Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]37

Ac- [Lys¹², Nie¹⁷, Asp² Val²⁶, Thr²⁸] -VI? cyklo (Lys²⁸->Asp²⁴) (Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂13,3

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH213,1

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp^2s, Val²⁸,Thr²⁸l -VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:2S)-NH₂10,70

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁸-³⁸,Met³¹]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂11,3

Ac- [Glu⁸,Orn¹², Nie¹⁷, Asp²⁵,Val^{2 6},Thr²⁸] -VIE cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:3I)-NH₂J2,2

Ac-(p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸,

Gly^{2 8},³⁸, Cys (Acm) ³¹1 -VI? cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-(SZQ ID NO:32)-NH₂)0,44

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸ J-VI? cyklo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂11,2

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁸, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂10,71

Ac-[2-Nal¹⁸,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]VI? cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-ISEQ ID NO: 3S) -NH₂14,2

Ac-[O-CH3-Tyr¹⁸,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂!0,84

Ac- [p-F-Fhe⁶, p-NH₂-Phe^1Q, Leu¹², Nie¹⁷, Ala ¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:37)-NH21	4,4
Ac-(Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo \|Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID N0:38)-NH₂]	0,13
Ac- (N-Me-Ala¹, Lys¹², Nie¹⁷ , Ala¹⁹, Asp25, Leu² 6 _f Lys²⁷'²⁰]-VIP cyklo (Lys²¹-4Asp25j (Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂]	0,95
Ac-(GLu3,Lys¹²,Nle¹⁷rAla¹3,Asp²5/ieu²⁵,Lys²⁷'²⁸)VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂)	0,45
Ac-(O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nl.e¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁵, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]	²/⁶
Ac-(Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹,Asp25,Leu²⁵, Lys^{2 7},28, Ala^29_21]-VIP cyklo (Lys²¹-4Asp²⁵) [Ac-(SSQ ID NO:42)-NH₂]	0_;61
Ac- [Ala^Glu^Lys^Nie¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, _Ly_S27,28_/Ai_a29-31j__{VIP cy}Ki₀ (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]	0,55
Ac-(N-He-Ala¹,Glu⁸,Ly5¹²/Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵/Leu^2S, _Lys27, 28]-viP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID N0:44)-NH₂]	0,36
Ac-(p-š-?he⁶;Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸,Leu²’_/ Lys²⁷'28) __VIp _Cykl_o (Lys²¹-*Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO;45)-NH₂]	0,47
Ac-[l-Nal⁵,Glu⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁵, Ly_S27,28]_viP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]	0,26
Ac-[Glu⁸,p-NH₂-?he¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²®,Lys²⁷*23]_vip cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]	0,32
Ac-(Glu⁸,O“CH3-TyrI0,Lys¹²,Nlel7/Xia19_/Aap25_/ Leu²⁵,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—?Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]	0,41
Ac-(p-F-Phe⁵,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁵,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]	0,39
Ac-(l-Nal⁵,Ly3¹2,Nle¹⁷,Ala¹⁹/Asp²⁵,Val²⁶,Thr28]VIP cyklo (Lys²¹-»Asp25) (Ac-(SEQ ID N0:50)-NH2]	2,9
Ac- (Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁹, Leu²⁵, Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'30,Thr⁹¹]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵\| (AC-ÍSEQ ID NO:51)-NH₂]	0^92
Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lvs²⁷'2S_f _G1y29,30_/Thr31]__Vi_? cykloLys²¹-»Asp25) (Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂]	0,35
Ac-[Ala²,Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷»²®]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp^2S) (Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂\|	0,78
Ac-(p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VI? cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-ISEQ ID NO:54)-NH₂]	0.96

Tabuľka I - pokračovanie

Xc- [Ly3¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-0CH3-Tyr²²,Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁰l-VIP cyklo (Lys²¹-4Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:55|-NH21

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp² S, y_a22 6,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—/Asp²⁵) [Ac-(SEQ XD NO:56)-NH₂10 52

Ac- (Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, m-OCH3-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸)-VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-(SEQ XD NO:57)-NH₂J

Ac-tGlu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,AlalS,_m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-Vie cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) (Ac- (SEQ XD NO:58)-NH₂]

Ac- [Aia⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²S, Leu²⁶,

Lys²⁷/²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac—(SEQ XD NO:59)-NH₂]1 1

Ac- [Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶/¹⁷ /19, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷,²⁹ j VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NE₂]0,26

Ac- [Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, NieI⁷, Ala¹⁹,Ala²4,Asp²⁵, leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIp cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-ESEQ ID NO:61)-NH212,4

Ac-Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁶/¹⁷/¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷ · 28 j -vxp cyklo (Lys²⁷-/Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂]0,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Mlel⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²6,

Lys²⁷»²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—/Asp25) [Ac-SEQ ID NO:63)-NH₂J

Ac- (Glu⁸, Lys¹², Ala⁷⁶/¹⁷/¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸l-vip cyklo (Lys²⁷-4Asp²⁵) (Ac—(SEQ XD NO:64)-NK₂]0,22

Ac- [Glu⁸, Lys⁷², Nie⁷⁷, Ala⁷⁹Asp²⁵, Val.²⁶, Thr²⁸,

Gly²S,30,Thr⁸¹]-VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-(SEQ XD NO:65)-NH₂10,88

Ac-tp-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, _G1y2S,30_tlhr31]__VIp _cykLo Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH210,57

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu^{2 6},Lys²⁷/ ²⁸,

Gly²⁹,30,Thr⁵¹J-viP cyklo Lys²¹-»Asp²⁵| [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH210,19

Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷/ ²⁸,

Gly²⁹/²⁸,Thr⁸¹]-Vlp cyklo Lys²¹—/Asp²⁵>

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH210,43

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸'Ala²⁹* ²¹1VIP cyklo (Lvs-/Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69|-NE₂10,42

Príklad 53

Bronchodilatačná účinnosť analógov VIP

Bronchodilatačná účinnosť VIP a jeho analógov in vivo sa stanovuje instilačným podávaním do priedušnice. Pri tejto technike sa používajú samčí morčaťa (kmeň Ilartley, Charles River) s hmotnosťou 400 až 600 g. Zvieratá sa anestetizujú uretánom (2 g/kg i. p.) a do ich jugulámej vény sa vloží polyetylénová kanyla na intravenózne podávanie liečiva.

Zvieratá sa tracheotomizujú a do miesta priedušnice, vzdialeného 3/4 dĺžky od carina tracheae, sa pipetou dávkuje roztok destilovanej vody alebo skúšanej zlúčeniny v destilovanej vode. Koncentrácia dávkovaného roztoku sa nastaví tak, aby sa dodával konštantný objem 100 ml. Zvieratá sa na 1 minútu umiestnia do vertikálnej polohy, hlavou hore, aby sa uľahčila dodávka liečiva do pľúc. Po jednej minúte sa zastaví spontánne dýchanie intravenóznym podaním chloridu sukcinylcholínu (1,2 mg/kg) a pomocou malého respirátoru pre zvieratá Harvard Model 680, nastaveného na dychovú frekvenciu 40 min'¹ a zdvihový objem 4,0 cm³ sa zavedie umelá ventilácia. Zvieratám sa podá maximálna konštrikčná dávka histamínu (50 mg/kg i. v.) a pri použití prevádzača tlaku Statam Pressure Transducer (P 32 AA) sa zaznamenáva tlak v priedušnici (v cm vodného stĺpca).

Vypočíta sa priemerný tlak v priedušnici z údajov od najmenej 3 kontrolných zvierat a 3 zvierat, ošetrených liečivom, a inhibícia v percentách. Relatívna sila zlúčenín, podávaných instilačnou cestou, sa stanovuje tak, že sa zvieratám podávajú rôzne dávky skúšaných zlúčenín a vypočíta sa stredná účinná dávka (hodnota ED₅o). Hodnoty ED_J0 sa stanovia z logaritmických kriviek závislosti odpovede od dávky, ktoré boli zostrojené pri použití aspoň troch dávok, ktorých inhibičný účinok leží v rozmedzí od 10 do 90 %. Korelačné koeficienty regresnej priamky všetkých zlúčenín sú vždy vyššie ako 0,95.

Na stanovenie časového priebehu inhibície pri rôznych zlúčeninách sa mení čas medzi podaním zlúčeniny a podaním provokačnej dávky histamínu. Časový priebeh účinnosti sa vyjadri vyrátanou hodnotou času, počas ktorého inhibícia poklesne na 40 %.

Výsledky, ktoré sú súhrnne uvedené v tabuľke II, ukazujú bronchodilatačnú účinnosť in vivo analógov VIP, v porovnaní s účinnosťou natívneho VIP.

Tabuľka II

Bronchodilatačná účinnosť analógov VIP u morčaťa zlúčenina ED_J0 (pg)

VIP[(Seq 10 NO:1)-KK₂)	7,3
Ac-(Lys¹²,Glu¹⁶, Nie¹⁷,Val²⁶, Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys¹²—/Glu¹⁶) (Ac-(SEQ ID NO:26)-M₂1	39
Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸)-VIP cyklo (lys²⁰-/Asp²⁴) (Ac-ISEQ ID KO:27)-NH₂)	2/3
Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-ISZQ ID NO:2B)-NB₂)	1/2
Ac- (Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁸,Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸1 -VI? cyklo (Lys²¹-7Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-SH₂]	0/34
Ac- (p-F-?he⁶,2-Nal¹⁰,iys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁸'²⁸,Met⁵¹]-VIP cyklo (Lys²¹-/Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID KO:30)-Níí₂)	0,90
Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-Vi? cyklo tLys²¹->A_!p25) (Ac-(SEQ ID NO:31)-NE₂1	0,19
Ac-[p-F-9)ie⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala^ls,Asp²⁵,Val²⁶,Thr^í8, Gly29,30_f cys (Acm)⁵¹]-VI? cykl.o (Lys²¹-/Asp²⁵) (Ac-ISEQ ID NO:32)-NH₂)	0.19

Tabuľka II - pokračovanie zlúčeninaED __________________________________________________(Mg) Ac- [Ale²,Lysí·²,Nie¹¹, Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁹,Th_t2S]__VIfcyklo (Lys²¹-»Asp¹³) (Ac-|SEQ ID NO:33)-NH21o

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²³,Val³⁶,

Thr²⁹)-VIP cyklo ILys²¹-4Asp²³) [Ac-ISEQ ID NO:34)-NK₂J1 o

Ac-(Lys¹²,Nle¹²,ALa¹⁹, Asp²3,L_eu26_íLy_s21,28]_vjp cyklo (Lys²¹—*Asp²⁵) |Ac-(SEQ ID NO;38)-NE₂10,03

Ac- (N-Me-Ala¹, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²³,Leu²⁶,

Lys²⁷'^2a)-VIP cyklo <t,ys²¹-»sp²³) (Ac-ISEQ ID NO:3S)-NH₂10,06

Ac-[Glu®, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²³,Leu²⁶, Lys²⁷' ^2a] VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵| (Ac-(SEQ ID NO:40)-NH210,022

Ac- [Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²³, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁶,

Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²³) (Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂10,072

Ac- [Ala²,Glu®, Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁹, Leu²⁹,

Lys²⁷'^2a,Ala^29_31)-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac-ISEQ ID ΝΟ:43)-ΝΕ₂10,14

Ac-[N-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²³,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸!-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-ISEQ ID NO:44)-NH₂]0,097

Ac-(p-F-She⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala^ls,Asp²³,Leu²⁵, _Ly_S27,28j._VIp _cykl0 (Lye21-»Asp²⁵) (Ac-ISEQ ID ΝΟ:45)-ΝΚ₂10,026

Ac- [1-Nal⁶, Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷,^2a]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-ISEQ ID NO:46)-N8₂10,036

Ac-|Glu⁸,p-NK2-Phe¹⁰,Lys¹²,Nle¹¹,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-XH₂10,075

Ac-(Glu⁸,0-CH₃-Tyr¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹³, Asp²⁵,

Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-9Asp²³) [Ac-ISEQ ID KO:48)-NH₂10,094

Ac-(p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²³,Val²⁶,Thr²⁸)VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-ISEQ ID NO:49| -NB₂10,26

Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²³, Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹-³⁰,Tta³¹|-VIP cyUo (Lys²¹-4Asp²³) (Ac-ISEQ ID NO:51)-NK2)0,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²³, Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹l-VIP cyklu Lys²¹-»Äsp²³) (Ac-ISEQ ID NO;52)-NE210'

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²³,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-9Asp²⁸) (Ac-(SEQ ID NC:53)-N?.₂l0,14

Ac-[p-NH2-Phe^1D,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²³,Val²⁶,

Thr²⁸l-VI? cyklo (Lys²¹HAsp²³) [Ac-ISEQ ID NO:54)-NH₂10,35

Tabuľka II - pokračovanie zlúčeninaED (Mg)

Ac- (Lys ¹², Nie¹⁷ ,Ala¹⁹, m-OC^-Tyr²², Asp²⁵, y_ai26 _f

Thr²⁸l-VlP cyklo (Lys²¹-4Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂]0,14

Ac- (Lys¹² _f Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-7yr²², Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹->Ä3p²⁵) (Ac-[SEQ ID NO:S6)-NH₂)7,2

Ac-(Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁵,Lys²⁷*²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹-*Asp²⁵) (AC-(SEQ ID NO:57)-NH₂]0,01?

Ac-(Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, tn-F-L-Tyr²², Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷/2S]-VIP cyklo (Lys²¹-*Asp^2S) (Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂]0,03

Ac-(Ala⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁹,Leu²⁶,

Lys²⁷/²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]0,17

Ac-[Glu⁸zLys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁵,Lvs²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹->A5O^2S) (Ac-(SEQ ID NO:60]-NSjl0,

Ac-(Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸)-VIP cyklo (Lys²¹-*Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2)0,045

Ac-Äla⁸,Lys¹²,Ala¹⁸'¹⁷ /¹⁹,Äla²^,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]~VI? cykLo (Lys²¹->Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO:52)-NH210,24

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Äla¹⁶«17,19, Ala²⁴, Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷' ²⁸1-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) (Ac—(SEQ ID NO:64)-NH2)0,13

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁹,

Gly^{2 9}'³⁰, Thr³¹ ] -VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac~(SEQ ID NO;6S)-NH₂]0,84

Ac-(p-F-Phe⁶,Glu⁸,Ly3¹²,Nle¹⁷,Asp^2S,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo Lys²¹—»Asp²⁵) (Ac-(SEQ ID NO.-66J-NH2)0,12

Ac-(Ale²,Glu⁸,Lys¹²,Kle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷» ²⁸, _GLy29,30_|Thr31)__{VIP C}yki₀ Lys²¹^Asp²⁵] (Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]0,077

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly^29,38, Thr³¹ j -VIP cyklo Lys²¹—»Asp²⁵)

Ac—(SEQ ID NO;68)-NH₂]0,04

Ac-[Lvs¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹,Asp²S,Leu^{2 6},Lys²⁷' ²⁸'Ala²⁹“ ³¹1-VI? cyklo (Lys->Asp²⁵)

Ac—(SEQ IĎ NO:69}-NH₂]0,04

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Cyklický peptid, zvolený zo súboru analógov vazoaktívnych peptidov všeobecného vzorca (I) až (V)

II

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-R₁₂- (I)

Lcu-Aig-Lys-Gln-R^Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID No.: 2> Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y kde R₈ predstavuje Asp, Glu, alebo Lys; R_n predstavuje Arg, Lys, ORn alebo Asp: R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo

Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny;

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asp-Tyr-Lys- (II)

Leu-Arg-LysrGln-RjT-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (X-fSEQ IDNo.: 4> Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y kde R₈ predstavuje Asp alebo Asn; R_l7 predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R_2S predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny: Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny; ___

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lyš-”

I

Leu-Arg-Lys-Glu-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr (III)

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂₈-Y [X-( SEQ ID No.: 6)Y] kde R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₈ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny;

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R|₂Leu-Arg-Lys-Gln-R|₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- (IV)

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R->_s-Y [X-(SEQ ID No.: 8)YJ kde R₁₂ predstavuje Arg alebo Lys; R₁₇ predstavuje Met alebo Nie; R₂₆ predstavuje íle alebo Val; R₂₈ predstavuje Asn alebo Thr; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny;

X-R i -R₂-Asp-Ala-V al-R₆-Thr-R₈-A sn-R ₁₀-Thr-R|₂·

Leu-Arg-Lys-R₁₆-R₁₇-Ala-Ri9-Lys-Lys-R₂₂- (V)

Leu-R₂₄-Asp-R26-R₂7-R₂s-Y [X-(SEQ ID No.: 10)Y] kde R, predstavuje His, N-CH₃-Ala; R₂ predstavuje Ser alebo Ala; R_Ď predstavuje kde Q predstavuje nižší alkylcyklohexyl alebo nižší alkylaryl; R₈ predstavuje Asp, Glu alebo Ala; R_lo predstavuje Tyr alebo R₆; R₁₂ predstavuje Arg alebo Lys; R_]6 predstavuje Gin alebo Ala; R₁₇ predstavuje Met, Nie alebo Ala; R₁₉predstavuje Val alebo Ala; R22 predstavuje Tyr alebo R₆; R₂₄ predstavuje Asn alebo Ala; R₂₆ predstavuje íle, Val alebo Leu; R₂7 predstavuje Leu alebo Lys; R₂₈ predstavuje Asn, Thr, alebo Lys; X predstavuje vodík alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny; alebo skupinu vzorca R₂₉-Rjo-R3i-Z; kde R29 predstavuje Gly alebo Ala; R₃₀ predstavuje Gly alebo Ala; R,, predstavuje Ala, Met, Cys(Acm), alebo Thr: Z predstavuje hydroxyskupinu alebo hydrolyzovateľnú chrániacu skupinu karboxyskupiny;

a jeho farmaceutický vhodné soli.
2. Cyklický peptid všeobecného vzorca (I), podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.
3. Cyklický peptid podľa nároku 2, kde R₁₇ predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr.
4. Peptid podľa nároku 3, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸ ->Lys¹²) [Ac-(SEQ IDNo.:20)-NH₂J.
5. Peptid podľa nároku 3, ktorým je Ac-Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thŕ⁸]-VIP cyklo (Glu⁸ -► Lys¹²) [Ac-(SEQ IDNo.: 21)-NH₂],
6. Peptid podľa nároku 3, ktorým j e Ac-[ORn¹², Nie¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸ -> ORn¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 23)-NH₂J.
7. Peptid podľa nároku 3, ktorým je Ac-[Lys⁸,Asp¹², Nie¹⁷, Val²⁵.Thr^2S]-VIP cyklo (Lys⁸ -> Asp¹²) [Ac-(SEQ ID No.:24)-NH₂].
8. Peptid podľa nároku 3, ktorým je Ac-[Glu⁸, ORn¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr^j-VIP cyklo (Glu⁸-> ORn¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 25)-NH₂].
9. Cyklický peptid všeobecného vzorca (II), podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.
10. Peptid podľa nároku 9, ktorým je Ac-[Asn⁸, Asp⁹, Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thŕ’j-VIP cyklo (Asp⁹->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No.: 22)-NH₂].
11. Cyklický peptid všeobecného vzorca (III), podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.
12. Peptid podľa nároku 11, ktorým je Ac-[Lys¹², Glu¹⁶, Nie¹⁷, Val“, Thŕ’j-VIP cyklo (Lys¹²-> Glu¹⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 26)-NH₂J.
13. Cyklický peptid všeobecného vzorca (IV), podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.
14. Peptid podľa nároku 13, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁴,Val²⁶, Thŕ’j-VIP cyklo (Lys²⁰ -> Asp²⁴) [Ac-(SEQ IDNo.:27)-NH₂],
15. Cyklický peptid všeobecného vzorca (V), podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.
16. Cyklický peptid podľa nároku 15, kde Q predstavuje metylcyklohexylskupinu.
17. Cyklický peptid podľa nároku 15, kde Q predstavuje alkylarylskupinu s 1 až 2 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku.
18. Cyklický peptid podľa nároku 17, kde Q predstavuje alkylfenylskupinu s 1 až 2 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, v ktorej je fenylový kruh prípadne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi, zvolenými zo súboru, zahŕňajúceho skupiny vzorcov OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, NO₂, NH₂, N(CH₃),, NHCOCH₃, NHCOC₆H₅ a C(CH₃)₃.
19. Cyklický peptid podľa nároku 17, kde Q predstavuje alkylnaftylskupinu s 1 až 2 atómami uhlíka v alkylovom zvyšku, v ktorej je naftylový kruh prípadne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi, zvolenými zo súboru, zahŕňajúceho skupiny vzorcov OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CFj, NO₂, NH₂. N(CHj)₂, NHCOCHj, NHCOC₆H₅ a C(CH₃)₃.
20. Peptid podľa nároku 15, kde R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID No.: 11)-Y].
21. Peptid podľa nároku 15, kde R_I7 predstavuje Nie, R_2(i predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID No.: 12)-Y],
22. Peptid podľa nároku 21, ktorým je Ac-[Glu⁸, ORn¹², Nie'⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Th^j-VIP cyklo (Lys²¹-> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 31)-NH₂J.
23. Peptid podľa nároku 21, kde R₁₂ predstavuje Leu, R₁₇ predstavuje Nie, R₁₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID No.: 13)-Y].
24. Peptid podľa nároku 23, ktoiým je Ac-[2-Nal¹⁰, Leu¹² Nie¹⁷, Ala”, Asp²⁵, Val²⁶,Thi^j-VfP cyklo(Lys²¹ ->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 35)-NH₂],
25. Peptid podľa nároku 23, ktorým je Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Leu¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:36)-NH₂],
26. Peptid podľa nároku 23, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, pNH₂-Phe¹⁰, Leu¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr“]-VIP cyklo (Lys²¹ —> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 37)-NH₂j.
27. Peptid podľa nároku 21, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₇ predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID No.: 14)-Y],
28. Peptid podľa nároku 27, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 28)-NH₂],
29. Peptid podľa nároku 27, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, 2Nal¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly^{25 30}, Met³¹]-VIP (1-31)-NH₂ cyklo (Lys²¹ Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 30)-NH₂],
30. Peptid podľa nároku 21, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹’³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 66)-NH₂].
31. Peptid podľa nároku 21, kde R_]2 predstavuje Lys, R₁₇ predstavuje Nie, R₁₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Val a R_2g predstavuje Thr [X-(SEQ ID No.: 15)-Y].
32. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thŕ’j-VIPcyklo (Lys²Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:29)-NH₂].
33. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹’ ³⁰, Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH₂ cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 32)-NHJ.
34. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[Ala², Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thŕ^s]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:33)-NH₂],
35. Peptid podľa nároku 31. ktorým je Ac-|N-Me-Ala', Lys¹², Nie” ,Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^j-VIP cyklo (Lys²¹-> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 34)-NH₂].
36. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[O-MeTyr¹⁰, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 41)-NH₂].
37. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, Lys¹², Nie¹⁷, A1 a¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 49)-NH₂].
38. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[1-Nal⁶, Lys¹², Nie¹⁷, Ala”, Asp²⁵, Val²⁶, Thrt'j-VlP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 50)-NH₂].
39. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr^J-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 54)-NH₂],
40. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, m-OCHj-Tyr²², Asp^2S, Val²⁶, Th^j-VTP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 55)-NH₂].
41. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Val²⁶, Thr^2S]-VIP cyklo (Lys²¹ -» Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 56)-NH₂j.
42. Peptid podľa nároku 31, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹· ³⁰, Thr³¹)-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 65)-NH₂].
43. Peptid podľa nároku 15, kde R₂₆ predstavuje Leu a ako R₂₇, tak R₂₈ je Lys [X-(SEQ ID No.: 16)-Y].
44. Peptid podľa nároku 43, kde R,₂ predstavuje Lys, R₁₇ predstavuje Ala, R_lg predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a R₂₇ a R_2S obidva predstavujú Lys [X-(SEQ ID No.: 17)-Y],
45. Peptid podľa nároku 44, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶· ”· ”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^J-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 60)-NHJ.
46. Peptid podľa nároku 44, ktorým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶·¹⁷·”, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VI? cyklo (Lys²¹^ Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.:62)-NH₂J.
47. Peptid podľa nároku 44, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶· ”· ¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, lys²⁷’ 28]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 64)-NH₂],
48. Peptid podľa nároku 43, kde R₁₂ predstavuje Lys, Ri₇ predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Leu a ako R₂₇, tak R₂₈predstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 18)-Y].
49. Peptid podľa nároku 48, ktorým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸, Gly²⁹·³⁰, Thri’j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 67)-NH₂].
50. Peptid podľa nároku 48, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸· Gly²⁹·³⁰, Thŕ’j-VIP cyklo (Lys²¹ -^· Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 68)-NH₂].
51. Peptid podľa nároku 48, kde R₁₂ predstavuje Lys, Rj7 predstavuje Nie, R₁₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a ako R₂₇, tak R₂₈ predstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 19)-Y],
52. Peptid podľa nároku 51, kde R₁₂ predstavuje Lys, Ri₆ predstavuje Gin, R₁₇ predstavuje Nie, R]₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a ako R₂₇, tak R₂₈ predstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 70)-Y],
53. Peptid podľa nároku 52, kde R₂ predstavuje Ser, R₁₂ predstavuje Lys, R_1Ď predstavuje Gin, R₁₇ predstavuje Nie, R₁₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a ako R₂₇, tak Rj₈ predstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 71)-Y].
54. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala”, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^27,28]-VIP cyklo (Lys²¹ ->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 38)-NH₂J.
55. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[N-Me-Ala’, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,’Lys²⁷' ^2S]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 39)-NH₂],
56. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'^a]-VÍP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 40)-NH₂).
57. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ^2S, Ala²⁹-³¹]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.:42)-NH₂],
58. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-fN-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQIDNo.:44)-NH₂J.
59. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷ Al a¹⁹, Asp^2S, Leu²⁶' Lys²⁷· ²⁸)-VIP cyklo (Lys²¹-> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 45)-NH₂],
60. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ * Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 46)-NH₂],
61. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, p-NH₂Phe¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys^{27, 2S}]-VIP cyklo (Lys²¹ —> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 47)-NH₂],
62. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, OMeTyr¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 48)-NH₂J.
63. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸, Gly²⁹· “Thú'j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 52)-NH₂).
64. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-OCHj-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 57)-NH₂J.
65. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²², Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 58)-NH₂J.
66. Peptid podľa nároku 53, ktorým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 59)-NH₂].
67. Peptid podľa nároku 53, ktotým je Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸, A’la^2M1]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 69)-NH₂].
68. Peptid podľa nároku 52, kde R₂ predstavuje Ala, R₁₂ predstavuje Lys, R₁₆ predstavuje Gin, R₁₇ predstavuje Nie, R|₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a každý zo symbolov R₂₇ a R₂₈ predstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 72)-Y].
69. Peptid podľa nároku 68, ktorým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸, Ala²⁹’³¹]-VIP cyklo (Lys²¹“* Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 43)-NH₂].
70. Peptid podľa nároku 68, ktorým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸, Gly²⁹’ ³⁰, Thr^3,]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 51)-NHJ.
71. Peptid podľa nároku 68, ktorým je Ac-[Ala², Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ¹⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -* Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 53)-NH₂).
72. Peptid podľa nároku 51, kde Ri₂ predstavuje Lys, R₁₆ predstavuje Ala, R₁₇ predstavuje Nie, R|₉ predstavuje Ala, R₂6 predstavuje Leu a každý zo symbolov R₂₇ a R_2gpredstavuje Lys [X-(SEQ ID No.: 73)-Y].
73. Peptid podľa nároku 72, ktorým je Ac-[Ala⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nie”, Ala¹⁹, Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.:61)-NHJ.
74. Peptid podľa nároku 72, ktorým je Ac-[Glu⁸, Lys¹², Ala¹⁶, Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,' Lys²⁷’ ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ IDNo.: 63)-NH₂].
75. Cyklický peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2, 9, 11, 13 alebo 15 ako terapeutické činidlo.
76. Cyklický peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1,

2, 9,11,13 alebo 15 ako bronchodilatačné činidlo.
77. Cyklický peptid Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷’²⁸, Gly²⁹’³⁰, ThP’j-VIP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 52)-NH₂] ako terapeutické činidlo.
78. Cyklický peptid Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie”, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lys27,28, G1 y²⁹’³⁰, Thr”]-VlP cyklo (Lys²¹ -> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No.: 52)-NH₂] ako bronchodilatačné činidlo.
79. Spôsob výroby cyklického peptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2, 9, 11, 13 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že sa

a) chránený peptid so zodpovedajúcou sekvenciou aminokyselín, ktorý je viazaný k živici, selektívne zbaví chrániacich skupín, za vzniku voľnej aminoskupiny v postrannom reťazci a voľnej karboxyskupiny v postrannom reťazci;

b) voľná aminoskupina v postrannom reťazci a voľná karboxyskupina v postrannom reťazci sa spoja kovalentnou väzbou pri použití vhodného amidotvomého činidla; a

c) cyklizovaný peptid sa zbaví chrániacich skupín a odštiepi od živice pri použití vhodného deprotekčného a štepiaceho činidla, prípadne v prítomnosti ďalších vhodných prísad, ako sú látky, zachytávajúce katióny, a získaný cyklický peptid sa prípadne premení na farmaceutický vhodnú soľ.
80. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje cyklický peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 74 a netoxickú inertnú terapeuticky vhodnú nosičovú látku.
81. Farmaceutický prípravok na liečbu bronchotracheálnych konštrikčných porúch, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo cyklického peptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 74 a netoxický farmaceutický vhodný kvapalný alebo pevný nosič.
82. Cyklický peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 74 na použitie pri liečbe rôznych porúch.
83. Cyklický peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 74 na použitie pri liečbe bronchotracheálnych konštrikčných porúch.